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Patent Searching and Data


Title:
PROCESS FOR DE NOVO MICROBIAL SYNTHESIS OF TERPENES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2016/142503
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to microbial production of terpenes. Known processes of microbial production of terpenes are based mostly on direct conversion of sugars. It was therefore desirable to have alternative substrates, and especially alternative carbon sources, for use in microbial production of terpenes. The invention relates to a methylotrophic bacterium with recombinant DNA encoding at least one polypeptide having enzymatic activity for heterologous expression in the stated bacterium, the said at least one polypeptide having enzymatic activity being selected from the group consisting of an enzyme of a heterologous mevalonate pathway, a heterologous terpene synthase and optionally a heterologous synthase of a prenyl diphosphate precursor. The invention also relates in particular to a process for de novo microbial synthesis of sesquiterpenes or diterpenes from methanol and/or ethanol.

Inventors:
SCHRADER JENS (DE)
BUCHHAUPT MARKUS (DE)
SONNTAG FRANK (DE)
KRONER CORA (DE)
BRUESER HEIKE (DE)
SCHROEDER HARTWIG (DE)
PELZER RALF (DE)
Application Number:
PCT/EP2016/055239
Publication Date:
September 15, 2016
Filing Date:
March 11, 2016
Export Citation:
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Assignee:
BASF SE (DE)
International Classes:
C12N9/04; C12N1/21; C12N9/10; C12N9/12; C12N9/88; C12P5/00; C12R1/01; C12R1/26
Domestic Patent References:
WO2013180584A12013-12-05
WO2008039499A22008-04-03
WO2014138419A12014-09-12
WO2014089436A12014-06-12
WO2014014339A22014-01-23
Foreign References:
US20080274523A12008-11-06
US20030148479A12003-08-07
US20110229958A12011-09-22
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Attorney, Agent or Firm:
Herzog Fiesser & Partner Patentanwälte PartG mbB (DE)
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Claims:
entansprüche

Ein methylotrophes Bakterium aufweisend eine heteroioge Terpensynthase und rekombinante DNA kodierend für wenigstens ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität zur Expression in dem genannten Bakterium, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte wenigstens eine Polypeptid mit enzymatischer Aktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

wenigstens ein Enzym eines heterologen Mevalonatweges ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxymethylgiutaryl-CoA-Synthase (HMG-CoA- Synthase), Hydroxymethylglutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA- Reduktase), Mevalonat-Kinase, Phosphomevaionat-Kinase, Pyrophosphomevalonat- Decarboxylase und Isopentenyipyrophosphat-Isomerase; und

eine Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe.

Ein methylotrophes Bakterium aufweisend eine heteroioge Hydroxymethylgiutaryl-CoA- Synthase (HMG-CoA-Synthase) und eine Hydroxymethylglutaryl-CoA-Reduktase (HMG- CoA-Reduktase) als Enzyme eines heterologen Mevalonatweges sowie rekombinante DNA kodierend für wenigstens ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität zur Expression in dem genannten Bakterium, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte wenigstens eine Polypeptid mit enzymatischer Aktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

wenigstens ein weiteres Enzym eines heterologen Mevalonatweges ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mevalonat-Kinase, Phosphomevaionat-Kinase, Pyrophosphomevalonat-Decarboxylase und Isopentenylpyrophosphat- Isomerase;

eine heteroioge Terpensynthase und

eine Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe.

Das Bakterium nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Enzym des heterologen Mevalonatweges eine Peptidsequenz aufweist mit einer Identität von jeweils wenigstens 60% zur Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 bzw. SEQ ID NO. 6.

Das Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die heteroioge Terpensynthase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Sesquiterpen-Synthase und einer Diterpen-Synthase.

Das Bakterium nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die heteroioge

Terpensynthase eine Sesquiterpen-Synthase ist, wobei die Sesquiterpen-Synthase ein Enzym zur Synthese eines zyklischen Sesquiterpens ist, das Sesquiterpen

insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a-Humulen und Epimeren des Santalens, wie α-Santalen, ß-Santalen, epi-ß-Santalen oder α-exo-Bergamoten, und Bisabolenen, wie b-Bisabolen.

6. Das Bakterium nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe

Terpensynthase eine Diterpen-Synthase ist, insbesondere ein Enzym zur Synthese eines Diterpens ist, das Diterpen insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sclareo!, Cis-Abienol, Abitadien, Isopimaradien, Manool und Larixol.

7. Das Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Farnesyldiphosphat-Synthase (FPP-Synthase) und

Geranylgeranyldiphosphat-Synthase (GGPP-Synthase) ist.

8. Das Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe eine heterologe FPP-Synthase ist, wobei es sich bei der heterologen FPP-Synthase um eine eukaryotische oder prokaryotische

FPP-Synthase handelt.

9. Das Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe eine heterologe GGPP-Synthase ist, wobei es sich bei der heterologen GGPP-Synthase um ein Enzym aus einem Organismus handelt, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Pflanzen und Pilzen.

10. Das Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinante DNA zur heterologen Expression der genannten Enzyme mit einem gemeinsamen induzierbaren Promotor oder mehreren unabhängig voneinander induzierbaren Promotoren versehen ist.

11. Das Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinante DNA jeweils unabhängig voneinander plasmidständig oder chromosomal exprimierbar ist.

12. Das Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bakterium um ein methylotrophes Proteobakterium, insbesondere um ein Bakterium der Gattung Methylobacterium oder der Gattung Methylomonas,

vorzugsweise um das Bakterium Methylobacterium extorquens, handelt.

13. Das Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium ein Stamm mit fehlender Carotinoid-Biosynthese Aktivität, insbesondere mit fehlender Diapoiycopin-Oxidase Aktivität, ist.

14. Ein Verfahren zur mikrobiellen de novo Synthese von Sesquiterpenen oder Diterpenen aus Methanol und/oder Ethanol, umfassend die folgenden Schritte:

Bereitstellen eines Methanoi und/oder Ethanol enthaltenden wässrigen Mediums, Kultivierung eines methylotrophen Bakteriums gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 in dem genannten Medium in einem Bioreaktor, wobei Methanol und/oder Ethanol durch das Bakterium zu einem Terpen umgesetzt wird,

Abtrennung des im Bioreaktor gebildeten Sesquiterpens oder Diterpens.

Das Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass in dem genannten Medium Methanol und/oder Ethanol als einzige Kohlenstoff-Quelle(n) für die Kultivierung des genannten Bakteriums enthalten ist/sind.

Verwendung eines Methanol und/oder Ethanol enthaltenden Mediums zur Kultivierung eines rekombinanten methylotrophen Bakteriums nach einem der Ansprüche 1 bis 13 für die mikrobielle de novo Synthese von Sesquiterpenen oder Diterpenen aus Methanol und/oder Ethanol.

Verwendung eines methylotrophen Bakteriums nach einem der Ansprüche 1 bis 13 für die mikrobielle de novo Synthese von Sesquiterpenen oder Diterpenen aus Methanol und/oder Ethanol.

Description:
Verfahren zur mikrobieilen de novo Synthese von Terpenen

Die Erfindung betrifft ein methylotrophes Bakterium, ein Verfahren zur mikrobieilen de novo Synthese von Sesquiterpenen oder Diterpenen aus Methanol und/oder Ethanol sowie die Verwendung des methylotrophen Bakteriums für die mikrobie!le de novo Synthese von

Terpenen aus Methanol und/oder Ethanol. Die Erfindung betrifft das Gebiet der weißen

Biotechnologie.

Die mikrobielie Synthese von Terpenen als umweltfreundliche Möglichkeit der Produktion von Aroma-, Riech- und Kosmetikstoffen sowie Biokraftstoffen wurde bereits für verschiedene

Mikroorganismen wie Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae beschrieben (Martin et al., 2003, Nature biotechnology 21 , 796-802; Asadoilahi et al., 2008, Biotechnology and

Bioengineering 99, 666-677; Chandran et al., 2011, Process Biochemistry 46, 1703-1710). Dabei wird der mikrobieilen Terpen Produktion in den nächsten Jahren ein erhebliches

Wachstumspotential zugesprochen, was sich vor allem aus Verknappung fossiler Ressourcen und der wachsenden Weltbevölkerung gekoppelt mit der Notwendigkeit einer

umweltfreundlichen Synthese von chemischen Substanzen ergibt (Peralta-Yahya et al., 2010, Btotechnol J 5, 147-62; Ajikumar et al., 2008, Molecular pharmaceutics 5, 167-90). Bekannte Verfahren zur mikrobieilen Produktion von Terpenen basieren zumeist auf der direkten Umsetzung von Zuckern, insbesondere Glukose, oder von Substraten die in

Konkurrenz zur Nahrungsmittelproduktion stehen, wie Glycerin, oder komplexen Substraten wie Proteinhydrolysaten (Yoon et al., 2009, Journal of Biotechnology, 140, 218-226; Sarria et al., 2014, ACS Synthetic Bioiogy 3 (7), 466-475). Die Nutzung solcher Substanzen als Substrate für die Biotechnologie geht mit diversen Nachteilen einher, die neben der ethischen Komponente vor allem schwankende und ein in Zukunft vermutlich steigendes Preisniveau sowie regionale und saisonale Abhängigkeiten betreffen. Zudem geht die Verwendung von komplexen oder zuckerhaltigen Medien immer mit erhöhtem Aufwand bei der Produktaufarbeitung sowie den Sterilitätsanforderungen einher. Daher sind alternative Substrate, insbesondere alternative Kohlenstoffquellen, für den Einsatz in der Biotechnologie erstrebenswert, die möglichst viele der oben genannten Nachteile kompensieren.

Die mikrobielie Produktion von Terpenen, insbesondere Amorpha-4,1 -diene, oder

Terpengemischen wird in US 2008/0274523 A1 beschrieben. Allerdings wird danach als Kohlenstoffquelle lediglich das Monosaccharid Glukose eingesetzt. Insbesondere wird darin keine alternative Kohlenstoffquelle zur Fermentation vorgeschlagen. Weiterhin ist nach US 2008/0274523 A1 die heterologe Expression einer Acetoacetyl-CoA Synthase (Acetoacetyl-CoA Thiolase) erforderlich. Nach US 2003/0148479 A1 wird eine mikrobielie Biosynthese von Isopentenylpyrophosphat (IPP) in E. coli vorgeschlagen, wobei eine Kultivierung in LB Medien erfolgt. Eine heterologe Expression einer Acetoacetyl-CoA Synthase (Acetoacetyl-CoA Thiolase) ist hierbei erforderlich und weiterhin wurden verschiedene intermediate des Mevalonatweges dem Medium zugegeben. Eine alternative Kohlenstoffquelle zur Fermentation wird nicht vorgeschlagen.

Die US 201 1/0229958 A1 zeigt Mikroorganismen zur Produktion von isoprenverbindungen in E. coli. Eine heterologe Expression einer Acetoacetyl-CoA Synthase (Acetoacetyl-CoA Thiolase) ist wiederum erforderlich und Mevalonat wurde dem Medium zugegeben. Eine kostengünstige alternative Kohlenstoffquelle zur Fermentation wird nicht vorgeschlagen.

Mit der WO 2014/014339 A2 werden rekombinante Rhodobacter Wirtszellen zur

Monoterpensynthese beschrieben. Als Kohlenstoffquelle wird ein nicht näher charakterisierter Zucker vor- geschlagen. Eine alternative Kohlenstoffquelle zur Fermentation wird nicht erwähnt.

Eine de novo Herstellung des Monoterperns Geraniumsäure in Pseudomonas putida wurde vorgeschlagen (Mi et al., 2014, Microbial Cell Factories 13:170). Allerdings wird danach als Kohlenstoffquelle lediglich Glycerin in einem LB enthaltenden Medium eingesetzt. Insbesondere wird darin keine alternative Kohlenstoffquelle zur Fermentation vorgeschlagen.

Die Verwendung komplexer oder in ihrer Zusammensetzung nicht ausreichend charakterisierter Fermentationsmedien erschwert eine einfache und kostengünstige Aufarbeitung des

gewünschten Produktes.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand nach einem ersten Aspekt somit darin, die Nachteile der bekannten rekombinanten Mikroorganismen in Bezug auf die Biosynthese von Terpenen zu überwinden. Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung sollen Bakterien bereitgestellt werden, die eine mikrobielle de novo Synthese von Terpenen aus einer alternativen Kohlenstoffquelle, ermöglichen. Die Bakterien sollten dabei idealerweise auf der alternativen Kohlenstoffquelle als einziger Kohlenstoffquelle wachsen können, insbesondere soll eine Zugabe von kostenintensiven Substratzusätzen, wie Acetoacetat oder D,L-Mevalonat, nicht erforderlich sein. Nach einem weiteren Aspekt soll ein Fermentationsverfahren zur mikrobiellen de novo Synthese von Terpenen aus einer alternativen Kohienstoffquelle, bereitgestellt werden, dass eine einfache downstream-Aufreinigung der gewonnenen Terpenprodukte ermöglicht. Insbesondere sollen Sesquiterpene und Diterpene mit hoher Ausbeute herstellbar sein. Nach einem weiteren Aspekt sollen Umsatz und Ausbeute des Verfahrens sowohl im Schüttelkolben als auch im Fermenter beim Up-Scaling für die biotechnologische Anwendung vielversprechend oder ausreichend sein.

Die Aufgaben werden durch die in den Ansprüchen und hiernach beschrieben

Ausführungsformen gelöst.

Eine erste Ausführung der Erfindung betrifft ein methylotrophes Bakterium aufweisend rekombinante DNA kodierend für wenigstens ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität zur Expression in dem genannten Bakterium, wobei das genannte wenigstens eine Polypeptid mit enzymatischer Aktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

wenigstens ein Enzym eines heterologen Mevalonatweges ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxymethylglutaryl-CoA-Synthase (HMG-CoA-Synthase),

Hydroxymethyl- glutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase), Mevalonat-Kinase,

Phosphomevalonat- Kinase, Pyrophosphomevalonat-Decarboxylase und

Isopentenylpyrophosphat-Isomerase;

eine heterologe Terpensynthase und

eine Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe.

Insbesondere betrifft die Erfindung auch ein methylotrophes Bakterium aufweisend eine heteroSoge Terpensynthase und rekombinante DNA kodierend für wenigstens ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität zur Expression in dem genannten Bakterium, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte wenigstens eine Polypeptid mit enzymatischer Aktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

wenigstens ein Enzym eines heterologen Mevalonatweges ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxymethylglutaryl-CoA-Synthase (HMG-CoA-Synthase),

Hydroxymethylglutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase), Mevalonat-Kinase, Phosphomevalonat-Kinase, Pyrophosphomevalonat-Decarboxylase und

Isopentenylpyrophosphat-Isomerase; und

eine Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe.

Ebenso betrifft die Erfindung auch ein methylotrophes Bakterium aufweisend eine heterologe Hydroxymethylglutaryl-CoA-Synthase (HMG-CoA-Synthase) und eine Hydroxymethylglutaryl- CoA-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase) als Enzyme eines heterologen Mevalonatweges sowie rekombinante DNA kodierend für wenigstens ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität zur Expression in dem genannten Bakterium, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte wenigstens eine Polypeptid mit enzymatischer Aktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

wenigstens ein weiteres Enzym eines heterologen Mevalonatweges ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mevalonat-Kinase, Phosphomevalonat-Kinase,

Pyrophosphomevalonat-Decarboxylase und Isopenteny!pyrophosphat-lsomerase;

eine heterologe Terpensynthase und

eine Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe.

Besonders bevorzugt weist das erfindungsgemäße Bakterium mindesten folgende Enzyme auf: heterologe Hydroxymethylglutary!-CoA-Synthase (HMG-CoA-Synthase) und

Hydroxymethyl- glutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase) sowie mindest ein Enzym ausgewählt aus Mevalonat-Kinase, Phosphomevalonat- Kinase, Pyrophosphomevalonat- Decarboxylase und Isopentenylpyrophosphat-Isomerase und besonders bevorzugt alle diese Enzyme; und

eine heterologe Terpensynthase, Am meisten bevorzugt weist das Bakterium zusätzlich noch eine Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe auf. Unter„heterolog" ist im Sinne der Erfindung ein Enzym oder eine Gruppe von Enzymen, beispielsweise die des Mevalonatweges, zu verstehen, das/die natürlicherweise nicht in einem Organismus vorkommen, der das Enzym oder die Gruppe von Enzymen nun erfindungsgemäß aufweisen soll. So sollen also die heteroioge Terpensynthase oder die Enzyme des heterologen Mevalonatweges nicht im erfindungsgemäßen methylotrophen Bakterium vorkommen, sondern aus einer oder mehreren anderen Spezies stammen.

Das erfindungsgemäße Bakterium ermöglicht überraschend eine mikrobielle de novo Synthese von Terpenen aus einer alternativen Kohlenstoffquelle, wie Methanol und/oder Ethanol. Das genannte Bakterium kann bei heterolog exprimierten Enzymen des ansonsten natürlich in diesem Bakterium nicht vorkommenden Mevalonatweges (MVA Weges) auf Methanol und/oder Ethanol als einziger Kohlenstoffqueile wachsen und gewünschte Terpene de novo mit hoher Ausbeute synthetisieren.

Eine Besonderheit des verwendeten methylotrophen Bakteriums besteht in dem Vorhandensein des Moleküls Acetoacetyl-CoA im Primärstoffwechsei, hier dem Ethylmalonyl-CoA Weg

(EMCP). Acetoacetyl-CoA ist das erste Molekül im Meva!onatweg. Die Überlebensfähigkeit des erfindungsgemäßen rekombinanten methylotrophen Bakteriums war keineswegs erwartbar. So kann bei einem Abzug von Metaboliten des Primärstoffwechsels durchaus von erheblichen Flux- Imbaiancen ausgegangen werden. Insofern ist das hier festgestellte Wachstum des

erfindungsgemäßen Bakteriums mit wenigstens einem heterolog exprimierten Enzym des ansonsten natürlich in diesem Bakterium nicht vorkommenden Mevalonatweges auf Methanol und/oder Ethanol überraschend. Weiterhin macht das Vorhandensein des Moleküls Acetoacetyl- CoA im Primärstoffwechsei eine heteroioge Expression einer Acetoacetyl-CoA-Synthase überflüssig. Nach einer weiteren bevorzugten Abwandlung der Erfindung weist das

methylotrophe Bakterium keine rekombinante DNA kodierend für eine heteroioge Expression einer Acetoacetyl-CoA-Synthase (Acetoacetyl-CoA-Thiolase) auf.

Die Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe im Sinne der vorliegenden Erfindung setzt insbesondere Isopentenyldiphosphat (IPP) und Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) enzymatisch zu einer Prenyldiphosphat-Vorstufe um, wobei die Prenyldiphosphat-Vorstufe vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Farnesyldiphosphat (FPP) (C15) und Geranyl- geranyldiphosphat (GGPP) (C20)-

Die gebildeten azyklischen Prenyldiphosphate (synonym hier zu Isoprenyldiphosphate) - FPP und GGPP - sind die Vorstufen einer Vielzahl von Terpenen. Die Substrate der heterologen Terpensynthase sind vorzugsweise aus den genannten Prenyidiphosphat-Vorstufen

ausgewählt. Gemäß einer bevorzugten Ausführung weist das erfindungsgemäße methy!otrophe Bakterium rekombinante DNA kodierend für Polypeptide mit enzymatischer Aktivität zur heterologen Expression in dem genannten Bakterium auf, wobei die Polypeptide mit enzymatischer Aktivität die folgenden Enzyme umfassen:

die Enzyme eines heterologen Mevaionatweges (MVA-Weges), nämlich Hydroxymethyl- glutaryl-CoA-Synthase (HMG-CoA-Synthase), Hydroxymethylglutaryl-CoA-Reduktase (HMG- CoA-Reduktase), evalonat-Kinase, Phosphomevalonat-Kinase,

Pyrophosphomevalonat- Decarboxylase und Isopentenylpyrophosphat-Isomerase; - eine heterologe Terpensynthase und

eine, insbesondere heteroioge, Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe.

Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Bakterium zeichnet sich dadurch aus, dass das wenigstens eine Enzym des heterologen Mevaionatweges - nämlich ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxymethylglutaryl-CoA-Synthase (HMG-CoA-Synthase), Hydroxy- methylglutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase), Mevalonat-Kinase,

Phosphomevalonat- Kinase, Pyrophosphomevalonat-Decarboxylase und

Isopentenylpyrophosphat-Isomerase eine Peptidsequenz aufweist mit einer Identität von jeweils wenigstens 60% zur Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 bzw. SEQ ID NO. 6 oder durch Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die mit der entsprechenden, für die spezifischen Peptidsequenzen kodierenden Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren.

Unter Enzymen, die eine Peptidsequenz aufweist mit einer Identität von jeweils wenigstens 60% zur Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ iD NO. 5 bzw. SEQ ID NO. 6 aufweisen ist bevorzugt zu verstehen, dass die Enzyme eine Peptidsequenz aufweisen, die jeweils zumindest 65%, zumindest 70%, zumindest 75%, zumindest 80%, zumindest 85%, zumindest 90%, zumindest 95%, zumindest 96%, zumindest 97%, zumindest 98% oder zumindest 99% identisch ist mit einer der spezifischen

Peptidsequenzen gemäß SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 bzw. SEQ ID NO. 6. Es versteht sich, dass solche Varianten der Enzyme mit spezifischer Peptidsequenz ebenfalls bevorzugt im Wesentlichen die biologische Aktivität der zuvor genannten Enzyme mit spezifischer Peptidsequenz aufweisen sollen. Ob dies der Fall ist, kann mit Aktivitätstests für die biologische Aktivität, die im Stand der Technik bekannt sind oder in den Ausführungsbeispielen beschrieben werden, leicht überprüft werden. Die

Peptidsequenzidentität wird hierbei typischerweise mit einem Sequenzvergleichsaigorithmus bestimmt. Hierzu werden zwei Sequenzen miteinander entweder über ihre gesamte Länge oder über die Länge eines zuvor definierten Segmentes verglichen, das mindestens die Hälfte der Aminosäuren einer der beiden Sequenzen ausmacht. Innerhalb des Vergleichsfensters, d.h. des Bereiches der beiden Sequenzen, der verglichen werden soll, wird die Zahl an identischen Aminosäuren an identischen oder vergleichbaren Positionen bestimmt. Hierzu kann es nötig sein, Lücken in eine Sequenz einzuführen. Im Rahmen der Erfindung soll ein Aminsäuresequenz besonders bevorzugt mit einem im Stand der Technik bekannten

Algorithmus durchgeführt werden, insbesondere mit einem der folgenden Algorithmen, die auf der Homepage des NCBi zur Verfügung gestellt werden: BLASTp, PS!-BLAST, PHI-BLAST oder DELTA-BLAST (siehe auch Johnson 2008, Nucleic Acids Res 36 (Web Server issue):W5- 9; Boratyn 2012, Biol Direct. 17(7):12; Ye 2012, BMC Bioinformatics 13:134; Ye 2013, Nucleic Acids Res 41 : (Web Server issue):W34-40; Marchler-Bauer 2009, Nucleic Acids Res 37

(Database issue):D205-10; und Papadopoulos 2007, Bioinformatics 23(9):1073-9.) Bevorzugt sind hierbei die vorgegebenen Standard-Einstellungen zu verwenden. Bevorzugt Varianten der erfindungsgemäß einzusetzenden Enzyme können zudem durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die mit den für die spezifischen Peptidsequenzen kodierenden Nukleinsäuresequenzen in der Lage sind, unter stringenten

Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren. Stringente Hybridisierungsbedingungen im Sinne der vorliegen Erfindungen sind beschrieben in Southern 1975, J. Mol. Biol. 98(3): 503-517. Auch hier versteht es sich, dass solche Varianten der Enzyme im Wesentlichen die biologische Aktivität der zuvor genannten Enzyme mit spezifischer Peptidsequenz aufweisen sollen.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung weist ein methyiotrophes Bakterium rekombinante DNA kodierend für wenigstens ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität zur heterologen Expression in dem genannten Bakterium auf, wobei die Polypeptide mit enzymatischer Aktivität die folgenden Enzyme umfassen:

die Enzyme eines heterologen Mevalonatweges (MVA-Weges), nämlich

Hyd roxymethylg I utaryl-CoA-Synthase (H MG-CoA-Synthase) , Hyd roxymethylg iutaryl- CoA-Reduktase (HMG- CoA Reduktase), Mevalonat-Kinase, Phosphomevalonat-Kinase, Pyrophosphomevalonat- Decarboxylase und Isopentenylpyrophosphat-Isomerase, wobei die Enzyme eine Peptidsequenz mit einer Identität von jeweils wenigstens 60% zur Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, SEQ iD NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 bzw. SEQ ID NO. 6 aufweisen oder durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die mit den entsprechenden, für die spezifischen Peptidsequenzen kodierenden Nukleinsäuresequenzen in der Lage sind, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren.

eine heterologe Terpensynthase und

eine, insbesondere heterologe, Synthase einer Prenyldiphosphat- Vorstufe. Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Bakteriums weisen die Enzyme des heterologen Mevalonatweges, nämlich Hydroxymethy!g!utaryl-CoA-Synthase (HMG-CoA- Synthase), Hydroxymethylglutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase), Mevalonat-Kinase, Phosphomevalonat-Kinase, Pyrophosphomevaionat-Decarboxylase und Isopentenylpyrophos- phat-lsomeraseeine, eine Peptidsequenz mit einer Identität von jeweils unabhängig voneinander wenigstens 65%, wenigstens 70%, wenigstens 75%, wahlweise wenigstens 80%, insbesondere wenigstens 85%, weiter insbesondere wenigstens 90%, vorzugsweise wenigstens 95%, weiter bevorzugt wenigstens 98% und besonders bevorzugt wenigstens 99% zur Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 1, SEQ !D NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 bzw. SEQ ID NO. 6 auf.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Bakteriums handelt es sich bei den Enzymen des heterologen Mevalonatweges um die Hydroxymethylglutaryl-CoA- Synthase (HMG-CoA-Synthase), die Hydroxymethyiglutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA-

Reduktase), die Mevalonat-Kinase, die Phosphomevalonat-Kinase, die Pyrophosphomevalonat Decarboxylase und die Isopentenylpyrophosphat-Isomeraseeine aus Myxococcus xanthus, jeweils aufweisend eine Peptidsequenz gemäß SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 bzw. SEQ ID NO. 6.

Nach einem weiteren Aspekt eines erfindungsgemäßen Bakteriums umfasst die rekombinante DNA, kodierend für die genannten Enzyme des heterologen Mevalonatweges, die folgenden Polynukleotide mit einer Identität von jeweils unabhängig voneinander wenigstens 60%, wenigstens 65%, wenigstens 70%, wenigstens 75%, wahlweise wenigstens 80%, insbesondere wenigstens 85%, weiter insbesondere wenigstens 90%, vorzugsweise wenigstens 95%, weiter bevorzugt wenigstens 98% und besonders bevorzugt wenigstens 99% zu einer

Nukieotidsequenz gemäß SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 1 bzw. SEQ ID NO. 12. oder Polynukleotide, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die mit einer Nukieotidsequenz gemäß SEQ ID NO. 7, SEQ !D NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 oder SEQ ID NO. 12 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren.

Die Nukleinsäuresequenzidentität wird hierbei typischerwetse mit einem

Sequenzvergleichsalgorithmus bestimmt. Hierzu werden zwei Sequenzen miteinander entweder über ihre gesamte Länge oder über die Länge eines zuvor definierten Segmentes verglichen, das mindestens die Hälfte der Nukleotide einer der beiden Sequenzen ausmacht. Innerhalb des Vergleichsfensters, d.h. des Bereiches der beiden Sequenzen, der verglichen werden soll, wird die Zahl an identischen Nukleotiden an identischen oder vergleichbaren Positionen bestimmt. Hierzu kann es nötig sein, Lücken in eine Sequenz einzuführen. Im Rahmen der Erfindung soll ein Aminosäuresequenz besonders bevorzugt mit einem im Stand der Technik bekannten

Algorithmus durchgeführt werden, insbesondere mit einem der folgenden Algorithmen, die auf der Homepage des NCBI zur Verfügung gestellt werden: BLASTn, megablast oder

discontiguous blast (siehe Johnson 2008, Nucleic Acids Res. 1 ;36(Web Server issue):W5-9). Bevorzugt sind hierbei die vorgegebenen Standard-Einstellungen zu verwenden.

Insbesondere handelt es sich bei den erfindungsgemäß eingesetzten Polynukleotiden um die Gene hmgs (SEQ ID NO. 7), hmgr (SEQ !D NO. 8), mvaK1 (SEQ ID NO. 9), mvaK2 (SEQ !D NO. 10), mvaD (SEQ ID NO. 11 ) und fni (SEQ iD NO.12) aus Myxococcus xanthus. Die Enzyme des heterologen Mevalonatweges eines Bakteriums nach dieser Ausführungsvariante weisen die Pepttdsequenzen gemäß SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 bzw. SEQ ID NO. 6 auf. Die Verwendung prokaryotischer MVA Gene, insbesondere aus Myxococcus xanthus, ist mit Vorteilen verbunden. Der vergleichbare GC-Gehalt, wie aus Myxococcus xanthus von ca. 70%, resultiert in einem sehr guten Codonanpassungsindex (Codon Adaptation Indices, CAI), beispielsweise zwischen etwa 0,7 und etwa 0,9, für die MVA Gene.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die rekombinante DNA, kodierend für die genannten Enzyme des heterologen Mevalonatweges, in einem einzigen Operon angeordnet. Dies ermöglicht eine bessere Co-Regulation der Expression mit Hilfe eines einzigen Promotors. Bei Bedarf können weitere heterologe Gene in ein solches Operon mit integriert werden.

Die rekombinante DNA, kodierend für die genannten Enzyme des heterologen

Mevalonatweges, wird hier synonym auch mit MVA Gene bezeichnet.

Nach einer vorteilhaften Weiterentwicklung ist die Ribosomenbindungsstelle (RBS) wenigstens eines der genannten MVA Gene im Hinblick auf die Translationsinitiation für die heterologe Expression in dem Bakterium optimiert.

Nach einer vorteilhaften Ausführung ist die RBS des Gens für die heterologe

Isopentenylpyrophosphat-Isomerase im Hinblick auf die Translationsinitiation optimiert. Eine solche RBS- optimierte Variante des Gens, insbesondere des Gens fni aus Myxococcus xanthus, weist eine TIR (translation Initiation rate nach Salis 2011) von 50 bis 200.000, vorzugsweise von 50 bis 100.000, besonders bevorzugt 50.000 bis 100.000, auf.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausführung ist die RBS des Gens für die heterologe

Hydroxymethylglutaryl-CoA Synthase (HMG-CoA Synthase) im Hinblick auf die

Translationsinitiation optimiert. Eine solche RBS-optimierte Variante des Gens, insbesondere des Gens hmgs aus Myxococcus xanthus, weist eine TIR von 50 bis 100.000, vorzugsweise von 50 bis 50.000, besonders bevorzugt 1.000 bis 50.000, auf. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kodiert die rekombinante DNA des Bakteriums weiterhin für wenigstens eine heterologe Terpensynthase, wobei die

Terpensynthase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Sesquiterpen-Synthase und Di- terpen-Synthase. Man erkennt, dass die von den genannten Terpensynthasen gebildeten Sesquiterpene bzw. Diterpene biotechnologisch wertvolle Produkte sind.

Nach einer Abwandlung handelt es sich bei der wenigstens einen heterologen Terpensynthase um eine Sesquiterpen-Synthase. Die Sesquiterpen-Synthase ist vorzugsweise ein Enzym zur Synthese eines zyklischen Sesquiterpens, wobei die Sesquiterpene insbesondere ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus α-Humulen, verschiedenen Epimeren des Santalens, wie α-Santalen, ß-Santalen, epi-ß-Santalen oder α-exo-Bergamoten, und Bisabolenen, wie ß- Bisabolen. Die Sesquiterpen-Synthase ist weiter vorzugsweise eine α-Humulen-Synthase oder eine Santalen-Synthase. Hierbei ist festzustellen, dass insbesondere die Santalen-Synthase ein sehr breites Produktspektrum besitzt und somit eine große Vielfalt an verschiedenen Sesquiterpen des Santa!en-Typs erhältlich ist.

Die Sesquiterpen-Synthase ist vorzugsweise eine Sesquiterpen-Synthase pflanzlichen

Ursprungs. Vorzugsweise ist die Sesquiterpen-Synthase ein Enzym aus einem Organismus, wobei der Organismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Gattung Zingiber und Santaium. Sesquiterpen-Synthasen aus anderen Organismen können bei entsprechender Eignung ebenfalls verwendet werden.

Die Sesquiterpen-Synthase umfasst nach einem weiteren Aspekt eine Peptidsequenz mit einer Identität von wenigstens 60% zu einem Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polypeptid der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 15, einem Polypeptid der

Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 45 und einem Polypeptid der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 46.

Sesquiterpen-Synthasen im Sinne der Erfindung können ebenfalls Enzyme mit entsprechender Aktivität sein, die von Polynukleotiden kodiert werden, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die mit einer Nukleottdsequenz, die eines der Polypeptide nach SEQ ID NO: 15, 45 oder 46 kodiert, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren.

Die genannte Peptidsequenz einer Sesquiterpen-Synthase besitzt weiter vorzugsweise eine Identität von wenigstens 65%, wenigstens 70%, wenigstens 75%, wahlweise wenigstens 80%, insbesondere wenigstens 85%, weiter insbesondere wenigstens 90%, vorzugsweise wenigstens 95%, weiter bevorzugt wenigstens 98% und besonders bevorzugt wenigstens 99%, zu einem Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polypeptid der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 5, einem Polypeptid der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 45 und einem Polypeptid der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 46.

Vorzugsweise ist die Sesquiterpen-Synthase ein Enzym aufweisend ein Polypeptid mit entsprechender Aktivität aus Zingibe rzerumbet, Santaium album oder Santaium spicatum.

Bei der Sesquiterpen-Synthase handelt es sich insbesondere um die α-Humulen-Synthase aus Zingiber zerumbet, welche ein Polypeptid gemäß der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 15 aufweist. Nach einer Weiterentwicklung wird die α-Humulen-Synthase, die ein Polypeptid gemäß der Peptidsequenz nach SEQ iD NO. 15 aufweist, von einer rekombinanten DNA umfassend eine Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 16 kodiert. Bei der genannten Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 16 handelt es sich um das Gen zssl aus Zingiber zerumbet, welches für die Expression in Methyiobacterium extorquens AM1 Codon-optimiert wurde. Bei der Sesquiterpen-Synthase handelt es sich nach einer alternativen Ausführung insbesondere um die Santalen-Synthase SsaSSy aus Santalum album, welche ein Polypeptid gemäß der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 45 aufweist. Bei der Sesquiterpen-Synthase handelt es sich nach einer weiteren alternativen Ausführung vorzugsweise um die Santalen-Synthase SspiSSy aus Santalum spicatum, weiche ein

Polypeptid gemäß der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 46 aufweist.

Nach einer alternativen Abwandlung handelt es sich bei der wenigstens einen heterologen Ter- pensynthase um eine Diterpen-Synthase. Die Diterpen-Synthase ist vorzugsweise ein Enzym zur Synthese eines Diterpens, wobei das Diterpen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sclareol, Cis-Abienol, Abitadien, Isopimaradien, Manool und Larixol. Vorzugsweise ist die Diterpen-Synthase pflanzlichen Ursprungs insbesondere aus den Gattungen Salvia oder Abies. Die Diterpen-Synthase umfasst nach einem weiteren Aspekt eine Peptidsequenz mit einer Identität von wenigstens 40% zu einem Polypeptid der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 47.

Diterpen-Synthasen im Sinne der Erfindung können ebenfalls Enzyme mit entsprechender Aktivität sein, die von Polynukleotiden kodiert werden, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die mit einer Nukleotidsequenz, die das Polypeptid nach SEQ ID NO: 47 kodiert, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren.

Die genannte Peptidsequenz einer Diterpen-Synthase besitzt weiter vorzugsweise eine Identität von wenigstens 45%, wenigstens 50%, wenigstens 55%, wenigstens 60%, wenigstens 65%, wenigstens 70%, wenigstens 75%, wahlweise wenigstens 80%, insbesondere wenigstens 85%, weiter insbesondere wenigstens 90%, vorzugsweise wenigstens 95%, weiter bevorzugt wenigstens 98% und besonders bevorzugt wenigstens 99%, zu einem Polypeptid der

Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 47. Die Diterpen-Synthase ist weiter vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den beiden monofunktionaien Typ I und Typ II Diterpensynthasen SsLPS, die Salvia sclarea LPP Synthase und SsSCS, die S. sclarea Sclareol Synthase (Caniard et al., BMC Plant Biol 2012 Jul 26;12:119), die co-exprimiert werden, die bifunktionelie TypI/TypII Diterpensynthase cis-Abienol- Synthase AbCAS, aus Abies baisamea (Zerbe et al., J Biol Chem 2012 Apr 6;287(15):12121-31), die LPP-Synthase NtCPS2 und die cis-Abienol-Synthase NtABS aus Nicotiana tabacum

(Sallaud et al., Plant J 2012 Oct;72(1):1 -17)

Bei der Diterpen-Synthase handelt es sich nach einem Aspekt insbesondere um die die bifunktionelle TypI/TypII Diterpensynthase cis-Abienol-Synthase AbCAS aus Abies baisamea, welche ein Polypeptid gemäß der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 47 aufweist.

Besonders bevorzugt wird die cis-Abienol-Synthase von einem für M. extorquens AM1 Codon- optimierten Polynukleotid kodiert, ganz besonders bevorzugt von einem Polynukleotid, das eine Sequenz mit SEQ ID NO: 50 aufweist.

Wie bereits oben ausgeführt, bilden die Prenyldiphosphat- Vorstufen - wie FPP oder GGPP - die jeweiligen Substrate der Terpensynthasen. Somit erkennt der Fachmann, dass bei Auswahl einer bestimmten Terpensynthase die geeignete Synthase für die Bereitstellung der passenden Prenyldiphosphat-Vorstufe ausgewählt werden muss.

Nach einer vorteilhaften Weiterentwicklung ist die RBS des Gens für die Sesquiterpen-Synthase im Hinblick auf die Translationsinitiation optimiert. Eine solche RBS-optimierte Variante des Gens weist eine TIR (translation initiation rate) von mindestens 50.000, insbesondere 50.000 bis 400.000, vorzugsweise von 200.000 bis 300.000, besonders bevorzugt 210.000 bis 250.000, auf.

Das Bakterium nach einer weiteren Ausführungsform weist zusätzlich zur rekombinanten DNA kodierend für wenigstens ein Enzym eines heterologen Mevalonatweges weiterhin bei Bedarf rekombinante DNA kodierend für wenigstens eine Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe auf.

Die Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe ist entweder ein endogenes oder ein heterologes Enzym. Im Falle einer endogenen Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe ist das dafür kodierende Gen vorzugsweise mit Hilfe eines geeigneten Promotors überexprimierbar.

Nach einer bevorzugten Ausführung weist das Bakterium zusätzlich zur rekombinanten DNA kodierend für wenigstens ein Enzym eines heterologen Mevalonatweges weiterhin

rekombinante DNA kodierend für wenigstens eine heterologe Synthase einer Prenyldiphosphat- Vorstufe auf. Bei Bedarf kann eine heterologe Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe zusätzlich zu einem entsprechenden endogenen Enzym exprimierbar sein.

Die Synthase der Prenyldiphosphat-Vorstufe ist ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Farnesyldiphosphat-Synthase (FPP-Synthase) und Geranylgeranyldiphosphat- Synthase (GGPP-Synthase). Man erkennt, dass die von den genannten Synthasen gebildeten Prenyldiphosphat-Vorstufen, FPP bzw. GGPP, wichtige Vorläufermoleküle für eine Synthese von biotechnoiogisch wertvollen Sesquiterpenen bzw. Diterpenen sind. Gemäß einer Abwandlung ist die Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe eine heterologe FPP-Synthase, wobei es sich um eine eukaryotische oder prokaryotische heterologe FPP- Synthase handeln kann. Die heterologe FPP-Synthase kann beispielsweise bakteriellen Ursprungs sein oder aus einem Pilz stammen. Die heterologe FPP-Synthase ist insbesondere ein Enzym aus einem Pilz, vorzugsweise aus einer Hefe, wie der Gattung Saccharomyces. Die FPP-Synthase umfasst nach einem weiteren Aspekt eine Peptidsequenz mit einer Identität von wenigstens 60% zur Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 13. Die FPP-Synthase ist insbesondere eine eukaryotische FPP-Synthase. FPP-Synthasen im Sinne der Erfindung können ebenfalls Enzyme mit entsprechender Aktivität sein, die von Polynukleotiden kodiert werden, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die mit einer Nukleotidsequenz, die das Polypeptid nach SEQ ID NO: 13 kodiert, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Die genannte Peptidsequenz einer FPP-Synthase besitzt nach einer weiteren Ausführung vorzugsweise eine Identität von wenigstens 65%, wenigstens 70%, wenigstens 75%, wahlweise wenigstens 80%, insbesondere wenigstens 85%, weiter insbesondere wenigstens 90%, vorzugsweise wenigstens 95%, weiter bevorzugt wenigstens 98% und besonders bevorzugt wenigstens 99%, zur SEQ ID NO. 13 auf.

Nach einem weiteren Aspekt eines erfindungsgemäßen Bakteriums umfasst die rekombinante DNA, kodierend für die FPP-Synthase, ein Polynukleotid mit einer Identität von wenigstens 60%, wenigstens 65%, wenigstens 70%, wenigstens 75%, wahlweise wenigstens 80%, insbesondere wenigstens 85%, weiter insbesondere wenigstens 90%, vorzugsweise wenigstens 95%, weiter bevorzugt wenigstens 98% und besonders bevorzugt wenigstens 99% zu einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO 14.

Die FPP-Synthase ist vorzugsweise eine FPP-Synthase aus Saccharomyces cerevisiae. FPP- Synthasen aus anderen Organismen können bei entsprechender Eignung ebenfalls verwendet werden. Bei der FPP-Synthase handelt es sich insbesondere um die FPP-Synthase ERG20 aus Saccharomyces cerevisiae, welche einem Polypeptid nach SEQ ID NO. 13 aufweist.

Gemäß einer Ausführung wird die FPP-Synthase ERG20 aus Saccharomyces cerevisiae aufweisend ein Polypeptid nach SEQ I D NO. 13 insbesondere vom einem Poiynukieotid mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 14 kodiert.

Gemäß einer weiteren Abwandlung ist die Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe eine heterologe Geranylgeranyldiphosphat-Synthase (GGPP-Synthase). Die heterologe GGPP- Synthase ist insbesondere ein entsprechendes Enzym aus einem Bakterium, einer Pflanze oder einem Pilz. Vorzugsweise ist die GGPP-Synthase ein Enzym aus einem Organismus, wobei der Orga nismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Bakterium der Familie der Enterobacteriaceae, einer Pflanze der Gattung Taxus und einem Pilz der Gattung

Saccharomyces. Geeignete GGPP-Synthasen aus Bakterien der Familie der

Enterobacteriaceae können beispielsweise entsprechende Enzyme aus Bakterien der Gattung Pantoea sein.

Die GGPP-Synthase umfasst nach einem weiteren Aspekt eine Peptidsequenz mit einer Identität von wenigstens 60% zu einem Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polypeptid der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 43, einem Polypeptid der

Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 44 und einem Polypeptid der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 42.

GGPP-Synthasen im Sinne der Erfindung können ebenfalls Enzyme mit entsprechender Aktivität sein, die von Polynukleotiden kodiert werden, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die mit einer Nukleotidsequenz, die eines der Polypeptide nach SEQ ID NO: 43, 44 oder 42 kodiert, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren.

Die genannte Peptidsequenz einer GGPP-Synthase besitzt weiter vorzugsweise eine Identität von wenigstens 65%, wenigstens 70%, wenigstens 75%, wahlweise wenigstens 80%, insbesondere wenigstens 85%, weiter insbesondere wenigstens 90%, vorzugsweise wenigstens 95%, weiter bevorzugt wenigstens 98% und besonders bevorzugt wenigstens 99%, zu einem Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polypeptid der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 43, einem Polypeptid der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 44 und einem Polypeptid der Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 42.

Vorzugsweise ist die GGPP-Synthase ein Enzym aufweisend ein Polypeptid mit entsprechender Aktivität aus Pantoea aggiomerans oder Pantoea ananatis, Taxus canadensis oder

Saccharomyces cerevisiae.

Nach einem weiteren Aspekt ist die GGPP-Synthase ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der GGPP-Synthase crtE aus Pantoea aggiomerans aufweisend eine

Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 43, der GGPP-Synthase aus Taxus canadensis aufweisend eine Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 44 und der GGPP-Synthase BTS1 aus Saccharomyces cerevisiae aufweisend eine Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 42. GGPP-Synthasen aus anderen Organismen können bei entsprechender Eignung ebenfalls verwendet werden. Nach einer vorteilhaften Weiterentwicklung ist die RBS der rekombinanten DNA, also des Gens für die heterologe Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe, wie FPP-oder GGPP-Synthase, im Hinblick auf die Transtationsinitiation optimiert. Eine solche RBS-optimierte Variante des Gens weist eine TIR (transiation Initiation rate) von 500 bis 100.000, vorzugsweise von 10.000 bis 50.000, besonders bevorzugt 20.000 bis 40.000, auf.

Nach einer vorteilhaften Ausführung der Erfindung werden die RBS für die Gene kodierend für die heterologe Terpensynthase und die heterologe Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe dahingehend angepasst, dass der TIR-Wert für die heterologe Terpensynthase höher ist als der TIR-Wert für die heterologe Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe. Damit kann vermieden werden, dass sich Prenyldiphosphat-Vorstufen, mit unter Umständen toxischen Effekten, akkumulieren. Erforderlichenfalls ist die rekombinante DNA Codon-optimiert für eine Expression in dem erfindungsgemäßen Bakterium. Beispielsweise ist das Gen kodierend für die heterologe Terpensynthase Codon-optimiert für das erfindungsgemäße Bakterium. Somit kann die

Expression in dem methylotrophen Bakterium verbessert werden.

Nach einer weiteren Ausführungsvariante des Baktertums kodiert die rekombinante DNA für die FPP-Synthase die ERG20 FPP-Synthase aus Saccharomyces cerevisiae und kodiert die rekombinante DNA für die Sesquiterpen-Synthase die α-Humu!en-Synthase aus Zingiber zerumbet.

Das Bakterium nach einer der Ausführungen ist vorzugsweise dahin weiterentwickelt, dass die rekombinante DNA zur heterologen Expression der genannten Enzyme mit einem

gemeinsamen Promotor oder mehreren unabhängig voneinander tnduzierbaren Promotoren versehen ist. Dies kann für die jeweiligen Gene unterschiedlich ausgestaltet sein. Die induzierbaren Promotoren können dabei unterschiedlicher Natur sein, sodass sie unabhängig voneinander regulierbar sind. Vorzugsweise werden alle Gene zur Expression der hier genannten Enzyme mit dem gleichen gemeinsamen induzierbaren Promotor versehen.

Induzierbare Promotor-Systeme sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Vorzugsweise wird hier ein sehr„dichtes" Promotor-System genutzt. Auf diese Weise lässt sich die Expression der rekombinannten Gene gezielt erst zu einem gewünschten Zeitpunkt der Kultivierung

einschalten. Insbesondere für die Regulation der Expression der MVA Weg Gene ist ein besonders„dichtes" Promotor- System von Vorteil, da ansonsten wachstumsbeeinflussende Effekte auftreten können. Besonders bevorzugt ist ein Cumat-induzierbares System.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung des Bakteriums ist die rekombinante DNA jeweils plasmidständig oder chromosomal exprimierbar. Auch dies kann für die jeweiligen Gene unterschiedlich ausgestaltet sein. Geeignete chromosomale Stellen und Techniken zur stabilen Integration in das Genom sind dem Fachmann bekannt. Zum Zweck einer plasmidständigen Expression werden geeignete Plasmide mit der rekombinanten DNA in das Bakterium durch Transformation eingebracht. Das erfindungsgemäße Bakterium wird somit vorzugsweise durch Transformation mit einem oder mehreren Plasmid(en), welche(s) die entsprechende

rekombinante DNA trägt bzw. tragen, erhalten.

Nach einer bevorzugten Ausführungsvariante weist das erfindungsgemäße Bakterium wenigstens ein durch Transformation eingebrachtes Plasmid auf, wobei das wenigstens eine Plasmid folgende rekombinante DNA umfasst:

rekombinante DNA kodierend für wenigstens ein wie oben genanntes Enzym eines heterologen Mevalonatweges, wobei das Enzym des Mevalonatweges ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxymethylglutaryl-CoA-Synthase (HMG-CoA- Synthase), Hydroxymethyl- glutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase), Mevalonat- Kinase, Phosphomevaionat-Kinase, Pyrophosphomevalonat-Decarboxylase und Isopentenyipyrophosphat-Isomerase;

gegebenenfalls rekombinante DNA kodierend für wenigstens eine wie oben genannte heterologe Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe; und

- rekombinante DNA kodierend für wenigstens eine wie oben genannte heterologe

Terpensynthase.

Das methy!otrophe Bakterium im Sinne der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein Proteobakterium. Ein bevorzugtes methylotrophes Proteobakterium ist ausgewählt aus den Gattungen Methylobacterium und Methylomonas. Weiter vorzugsweise ist das methylotrophe Prote- obakterium ein Stamm der Gattung Methylobacterium, insbesondere ein Stamm von Methylobacterium extorquens. Besonders bevorzugt ist der Stamm Methylobacterium extorquens AM1 oder der Stamm Methylobacterium extorquens PA1. Weiterhin wird bevorzugt ein Stamm des methylotrophen Bakteriums, insbesondere der Gattungen Methylobacterium und Methylomonas, vorzugsweise von Methylobacterium extorquens AM1 oder PA1 , mit fehlender Carotenoid-Biosynthese Aktivität, vorzugsweise mit einem Defekt im Gen crtNb (Diapolycopin-Oxidase) (Van Dien et al., 2003, Appl Environ Microbiol 69, 7563-6.). Ein solcher Stamm weist keine Carotenoid-Biosynthese Aktivität auf, insbesondere fehlt eine Diapolycopin-Oxidase Aktivität. Dadurch ist eine weitere Verbesserung der Terpensyntheserate möglich.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen de novo Synthese von Sesquiterpenen oder Diterpenen aus Methanol und/oder Ethanol, umfassend die folgenden Schritte:

Bereitstellen eines Methanol und/oder Ethanol enthaltenden wässrigen Mediums, Kultivierung eines methylotrophen Bakteriums gemäß einem der oben dargestellten Ausführungsvarianten in dem genannten Medium in einem Bioreaktor, wobei Methanol und/oder Ethanol durch das Bakterium zu einem Terpen umgesetzt wird,

Abtrennung des im Bioreaktor gebildeten Sesquiterpens oder Diterpens.

Das eingesetzte wässrige Medium kann Methanol, Ethanol oder eine Mischung aus Methanol und Ethanol aufweisen. Bei Bedarf können weitere Substrate hinzugesetzt sein. Von Vorteil kann es sein, dass ausschließlich Methanol oder Ethanol im wässrigen Medium enthalten ist, also die mikrobielle de novo Synthese von Sesquiterpenen oder Diterpenen entweder aus Methanol oder aus Ethanol erfolgt.

Die Verwendung von Methanol bringt zahlreiche Vorteile mit sich: Methanol kann sowohl petrochemisch als auch aus nachwachsenden Rohstoffen oder zukünftig sogar aus CO2 hergestellt werden. Es gibt weder saisonale (Wetter und Jahreszeit) noch regionale

Abhängigkeiten, was eine langfristige Produktionsplanung ermöglicht. Außerdem ist es wahrscheinlich, dass der Preis von Methanol im Gegensatz zu dem des Zuckers in Zukunft sinkt, aufgrund von vielen geplanten oder in Bau befindlichen Produkttonsanlagen. Es handelt sich bei Methanol um eine Kohlenstoffquelle in Alternative zu den ansonsten häufig

eingesetzten Zuckersubstraten.

Im Methanol, wie auch im Ethanol hat der Kohlenstoff im Vergleich zu Kohlenhydraten/Zuckern eine niedrigere Oxidationsstufe. Damit können in der Oxidation von Methanol zu CO2 mehr Elektronen freigesetzt werden, als im Fall der vollständigen Oxidation von Zucker zu CO2. Für die Synthese von stark reduzierten Verbindungen wie Terpenen ist es deshalb vorteilhaft möglichst Kohlenstoffquellen einzusetzen, die eine niedrige Oxidationsstufe aufweisen.

Methanol und Ethanol erfüllen diese Voraussetzungen besser als Kohlenstoff aus Zuckern. Damit ist der Einsatz von Methanol/Ethanol vorteilhafter für die Herstellung von Terpenen als ausgehend von Kohlenhdyraten. Die Verwendung von Ethanol bringt ebenfalls zahlreiche Vorteile mit sich: Ethanol steht beispielsweise aus Biomassevergärung, also Bio-Ethanol, als„natürliches" Substrat zur Verfügung.

Weiterhin ermöglicht insbesondere der Einsatz von Bio-Ethanol zur mikrobiellen de novo Synthese von Sesquiterpenen oder Diterpenen eine vorteilhafte Deklaration der gebildeten Sesquiterpen- und Diterpen-Produkte als„natürliche Aromastoffe". Es handelt sich bei Ethanol um eine alternative Kohlenstoffquelle zu den ansonsten häufig eingesetzten Zuckersubstraten.

Die erfindungsgemäßen Bakterien wachsen bei Bedarf sowohl auf Methanol als auch auf Ethanol als jeweils einziger Kohlenstoffquelle. Bei einer Weiterentwicklung des Verfahrens ist in dem genannten Medium Methanol und/oder Ethanol als einzige Kohlenstoff-Quelle für die Kultivierung des genannten Bakteriums enthalten. Darunter wird insbesondere verstanden, dass keine weitere Kohienstoffqueile zielgerichtet dem Medium zugesetzt wird bzw. in größeren Anteilen enthalten ist. Es ist ersichtlich, dass Spuren von weiteren Kohlenstoffquellen nicht immer vermeidbar sind und enthalten sein können, ohne den Rahmen der genannten erfindungsgemäßen Weiterentwicklung des Verfahrens zu verlassen.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführung des Verfahrens wird eine Methanol- und/oder Ethanol- limitierte Fed-batch Fermentation durchgeführt.

Im Sinne einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens erfolgt eine prozessbegleitende Abtrennung des Sesquiterpens oder Diterpens aus dem Bioreaktor, also insbesondere ein in situ-product-removal (ISPR) im Fermenter. Ein wichtiger Aspekt der industriellen

Biotechnologie, ist neben der eigentlichen Produktsynthese auch dessen Aufarbeitung. Eine prozessbegleitende Produktabtrennung (In situ product-removal, ISPR) reduziert sowohl die toxischen Effekte des Produktes auf den Mikroorganismus als auch die Kosten des Prozesses. Das ISPR erfolgt hier insbesondere durch ein Stripping des Terpens. Dabei wird das Terpen vorzugsweise in den Abgasstrom überführt und anschließend in einem organischen Lösungsmittel gelöst. Besonders vorteilhaft ist, dass die genannten methylotrophen Bakterien aufgrund des reduzierten Substrates Methanol oder Ethanol im Gegensatz zu konventionellen Mikroorganismen, die mit Zucker wachsen, mit deutlich höherer Belüftungsrate kultiviert werden und dadurch gleichzeitig das Stripping flüchtiger Fermentationsprodukte, insbesondere der gebildeten Sesquiterpene oder Diterpene, wesentlich begünstigt wird.

Bei einer Weiterentwicklung des Verfahrens erfolgt die Kultivierung in einem wässrig- organischen Zweiphasen System, wobei die organische Phase insbesondere durch eine aliphatische Kohlenwasserstoffverbindung, insbesondere ein Alkan, vorzugsweise Dodekan oder Dekan, ausgebildet ist. Die gebildeten Terpene weisen eine gute Lösüchkeit in der genannten organischen Phase auf.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführung des Verfahrens wird die Kultivierung bei im Wesentlichen konstantem pH durchgeführt. Insbesondere wird das Verfahrens bei einem gelösten Sauerstoff Level von > 30% und/oder einer Methanol oder Ethanol Konzentrationen von etwa 1 g/L durchgeführt.

Bei einer Weiterentwicklung des Verfahrens wird eine Terpenkonzentration von mehr als 0,75, 0,8, 0,9, vorzugsweise mehr als ,0 g/l, weiter bevorzugt mehr als ,5 g/l, bezogen jeweils auf das Volumen der wässrigen Phase, erreicht.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Methanol oder Ethanol enthaltenden Mediums zur Kultivierung eines rekombinanten methylotrophen

Bakteriums nach einem der oben beschriebenen Ausführungsformen für die mikrobielie de novo Synthese von Terpenen aus Methanol und/oder Ethanol. Die Verwendung eines Methanol oder Ethanol Minimalmediums reduziert sowohl das Kontaminationsrisiko, da Methanol und Ethanol für viele Mikroorganismen toxisch oder wachstumshemmend ist, als auch den Aufwand bei der Produktaufarbeitung, da keine Komplexbestandteile vom eigentlichen Produkt abgetrennt wer- den müssen.

Zahlreiche Fakten sprechen für eine vorteilhafte Verwendung von Methanol und/oder Ethanol gegenüber Zuckern: i) Zucker ist nicht nur Glukose, deren Aufreinigung zur Gewährleistung der Ausbeuten regelmäßig notwendig ist, wobei eine evaluierte Aufreinigung mit Kosten verbunden ist, ü) es ist mit einem Anstieg der Zuckerpreise in den nächsten Jahren zu rechnen, wohingegen die Methanol- und Ethanol Preise aufgrund wesentlich erweiterter

Produktionskapazitäten voraussichtlich sinken werden, iii) Methanol und Ethanol reduzieren wesentlich Kontaminationsrisiken im Vergleich zu Zucker-basierten Fermentationen, was den Sterilisierungsaufwand reduziert, iv) Methanol oder Ethanol Minimal Medium enthält keine komplexen chemischen Verbindungen im Gegensatz zu Medium mit Glukose oder anderen Zuckerquellen (wie Maisquellwasser oder Lignocellulose) als Kohlenstoffquelle, was

Aufreinigungsprozesse vereinfacht. Ein geeignetes Fermentationsmedium kann beispielsweise folgende Zusammensetzung aufweisen: Wasser, Methanol oder Ethanol sowie weitere Komponenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus PI PES, NaH2P04, K2HPO4, MgCl2, (NH4)2S04, CaCl2, Natriumeitrat , ZnS04, MnCl2, FeS04, (ΝΗ4)6Μθ7θ24, CuS04 und CoCl2-

Eine weitere Steigerung der Terpen Bildung kann durch Blockierung der Carotenoid-Synthese beim eingesetzten Proteobacterium erreicht werden. Dazu werden vorteiihafterweise die genannten Stämme der Gattung Methyiobacterium oder der Gattung Methytomonas mit fehlender Carotinoid-Biosynthese Aktivität, insbesondere mit fehlender Diapolycopin-Oxidase Aktivität, eingesetzt. Eine maximale Terpen Konzentration von über 1 ,5 g/l, insbesondere von etwa 1 ,65 g/l, bezogen jeweils auf das Volumen der wässrigen Phase, kann somit erreicht werden. Die bereits genannte erfindungsgemäße Mutante von Methyiobacterium extorquens AM1 mit fehlender Carotenoid-Biosynthese Aktivität, insbesondere mit fehlender Diapolycopen Oxidase Aktivität, weist eine gesteigerte Terpen Produktion auf. Insbesondere wurde eine maximale a- Humulen Konzentration von über 1 ,5 g/l, insbesondere etwa 1 ,65 g/l, von einer Mutante von Methyiobacterium extorquens AM1 mit fehlender Carotenoid-Biosynthese Aktivität gebildet.

Bemerkenswert hierbei ist, dass die oben genannten Konzentrationen an Terpenen,

erfindungsgemäß bereits erreicht werden, ohne dass beispielsweise teures Lithiumacetoacetat oder DL-Mevalonat extern zugesetzt werden müssen. Weiterhin sind dazu insbesondere keine weiteren aufwändigen Maßnahmen zur Stammoptimierung zwingend erforderlich. Bereits daraus ergibt sich das erhebliche Potential der erfindungsgemäßen methylotrophen Bakterien sowie des genannten Verfahrens für die biotechnologische Produktion von Terpenen. Vorteilhaft ist weiterhin, dass die oben genannten Konzentrationen bereits unter Einsatz von

preisgünstigem Methanol oder Ethanol Minimal Medium erreicht werden. Im Gegensatz zum Stand der Technik ist kein Fermentationsmedium auf TB oder LB-Basis erforderlich. Daraus ergibt sich ein weiterer Vorteil in der Vereinfachung der Aufreinigung der gewonnenen

Terpen produkte, da ein klar definiertes Minimalmedium verwendet werden kann. Aufwändige Entfernung von Nebenprodukten kann minimiert werden. Darüber hinaus eröffnen die hier beschriebenen Stämme die Verwendung von Methanol oder Ethanol als einziger

Kohlenstoffquelle zum Wachstum.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines methylotrophen Bakteriums nach einem der oben beschriebenen Ausführungsformen für die mikrobielie de novo Synthese von Terpenen aus Methanol und/oder Ethanol

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildeten Terpene sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sesquiterpenen (C 5) und Dtterpenen (C20).

Terpene im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens sind einerseits Sesquiterpene. Zu den biotechnologisch interessanten Sesquiterpenen gehören demnach beispielsweise

Sesquiterpene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus α-Humulen, verschiedene Epimere des Santalens wie α-Santalen, ß-Santalen, epi-ß-Santalen und α-exo-Bergamoten. Auch Bisabolene, wie das ß-Bisabolen, sind Sesquiterpene, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. Geeignete Sesquiterpen-Synthasen sind dem Fachmann

grundsätzlich bekannt. Die oben genannten methylotrophen Bakterien können somit mit den entsprechenden rekombinanten Genen kodierend für die geeigneten Sesquiterpen-Synthasen wahlweise ausgestattet sein. Insbesondere weist das methyiotrophe Bakterium dazu neben den heterolog exprimierten Genen des MVA Weges auch eine FPP-Synthase im oben genannten Sinne auf, Terpene im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens sind andererseits Diterpene. Zu den biotechnologisch interessanten Diterpenen gehören danach beispielsweise Diterpene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sclareol, Cis-Abienol, Abitadien, Isopimaradien, Manooi und Larixol. Geeignete Diterpenen-Synthasen sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Die oben genannten methylotrophen Bakterien können somit mit den entsprechenden rekombinanten Genen kodierend für die geeigneten Diterpenen-Synthasen wahlweise ausgestattet sein. Insbesondere weist das methyiotrophe Bakterium dazu neben den heterolog exprimierten Genen des MVA Weges auch eine GGPP-Synthase im oben genannten Sinne auf. Nach einer besonders bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Sesquiterpen α-Humulen der Formel I

de novo aus Methanol und/oder Ethanol synthetisiert.

Nach weiteren bevorzugten Ausführungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden

Sesquiterpene des Santalen-Typs ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus α-Santalen der Formel II, ß-Santalen der Formel Iii, epi-ß-Santalen der Formel IV, und α-exo-Bergamoten der Formel V

de novo aus Methanol und/oder Ethanol synthetisiert. Hierbei ist festzustellen, dass die Santalen-Synthase ein sehr breites Produktspektrum besitzt und somit eine große Vielfalt an verschiedenen Sesquiterpen des Santalen-Typs erhältlich ist.

Nach weiteren bevorzugten Ausführungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Diterpene Sclareo! der Formel VI und Cis-Abienoi der Formel VII

de novo aus Methanol und/oder Ethanol synthetisiert. Ein Bioreaktor im Sinne der vorliegenden Erfindung kann jedes geeignete Gefäß zur

Kultivierung von Bakterien sein. Im einfachsten Falle wird darunter ein Schüttelkolben verstanden. Ins- besondere wird darunter ein Fermenter verstanden. Der Bioreaktor kann für den kontinuierlichen Betrieb, den diskontinuierlichen Betrieb, den Fed-Batch-Betrieb oder die Batch Produktion geeignet sein.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die genannten Sesquiterpene (C15) und Diterpene (C20) erhältlich nach einem Verfahren gemäß einer der dargestellten Ausführungen.

Nachfolgend sind weitere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Bakterien, Verfahren und Verwendungen beschrieben: 1. Ein methylotrophes Bakterium aufweisend rekombinante DNA kodierend für wenigstens ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität zur Expression in dem genannten Bakterium, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte wenigstens eine Polypeptid mit enzymatischer Aktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

- wenigstens ein Enzym eines heterologen Mevalonatweges ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxymethy!glutaryl-CoA-Synthase (H G-CoA-Synthase),

Hydroxymethylglutaryl-CoA- eduktase (HMG-CoA-Reduktase), Mevaionat-Kinase,

Phosphomevalonat-Kinase, Pyrophosphomevalonat-Decarboxylase und

Isopentenylpyrophosphat-Isomerase;

- eine heterologe Terpensynthase und

gegebenenfalls eine Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe.

2. Das Bakterium nach Ausführungsform 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine Enzym des heterologen Mevalonatweges eine Peptidsequenz aufweist mit einer Identität von jeweils wenigstens 60% zur Peptidsequenz nach SEQ ID NO. 1 , SEQ ID NO, 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 bzw. SEQ ID NO. 6.

3. Das Bakterium nach Ausführungsform 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Terpensynthase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Sesquiterpen- Synthase und einer Diterpen-Synthase.

4. Das Bakterium nach Ausführungsform 3, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Terpensynthase eine Sesquiterpen-Synthase ist, wobei die Sesquiterpen-Synthase ein Enzym zur Synthese eines zyklischen Sesquiterpens ist, das Sesquiterpen insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a-Humulen und Epimeren des Santalens, wie α-Santalen, ß- Santalen, epi-ß-Santalen oder α-exo-Bergamoten, und Bisabolenen, wie b-Bisaboien.

5. Das Bakterium nach Ausführungsform 3, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Terpensynthase eine Diterpen-Synthase ist, insbesondere ein Enzym zur Synthese eines Diterpens ist, das Diterpen insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sclareol, Cis-Abienol, Abitadien, Isopimaradien, Manool und Larixol.

6. Das Bakterium nach einer der Ausführungsformen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Farnesyldiphosphat-Synthase (FPP-Synthase) und Geranylgeranyldiphosphat-Synthase (GGPP-Synthase) ist.

7. Das Bakterium nach einer der Ausführungsformen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe eine heterologe FPP-Synthase ist, wobei es sich bei der heterologen FPP-Synthase um eine eukaryotische oder prokaryotische FPP-Synthase handelt. 8. Das Bakterium nach einer der Ausführungsformen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthase einer Prenyldiphosphat-Vorstufe eine heterologe GGPP-Synthase ist, wobei es sich bei der heterologen GGPP-Synthase um ein Enzym aus einem Organismus handelt, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Pflanzen und Pilzen.

9. Das Bakterium nach einer der Ausführungsformen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinante DNA zur heterologen Expression der genannten Enzyme mit einem

gemeinsamen induzierbaren Promotor oder mehreren unabhängig voneinander induzierbaren Promotoren versehen ist.

10. Das Bakterium nach einer der Ausführungsformen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinante DNA jeweils unabhängig voneinander plasmidständig oder chromosomal exphmierbar ist. 1 . Das Bakterium nach einer der Ausführungsformen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bakterium um ein methylotrophes Proteobakterium, insbesondere um ein Bakterium der Gattung Methy!obacterium oder der Gattung Methylomonas, vorzugsweise um das Bakterium Methylobacterium extorquens, handelt. 12. Das Bakterium nach einer der Ausführungsformen 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium ein Stamm mit fehlender Carotinoid-Biosynthese Aktivität, insbesondere mit fehlender Diapolycopin-Oxidase Aktivität, ist.

13. Ein Verfahren zur mikrobiellen de novo Synthese von Sesquiterpenen oder Diterpenen aus Methanol und/oder Ethanol, umfassend die folgenden Schritte:

Bereitstellen eines Methanol und/oder Ethanol enthaltenden wässrigen Mediums, Kultivierung eines methyiotrophen Bakteriums gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 12 in dem genannten Medium in einem Bioreaktor, wobei Methanol und/oder Ethanol durch das Bakterium zu einem Terpen umgesetzt wird,

- Abtrennung des im Bioreaktor gebildeten Sesquiterpens oder Diterpens.

14. Das Verfahren nach Ausführungsform 13, dadurch gekennzeichnet, dass in dem genannten Medium Methanol und/oder Ethanol als einzige Kohlenstoff-Quelle(n) für die Kultivierung des genannten Bakteriums enthalten ist/sind.

15. Das Verfahren nach Ausführungsform 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine Methanol- und/oder Ethanol-Iimitierte Fed-batch Fermentation durchgeführt wird.

16. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung in einem wässrig-organischen Zweiphasen System erfolgt, wobei die organische Phase insbesondere durch eine aliphatische Kohlenwasserstoffverbindung, vorzugsweise Dodekan oder Dekan, ausgebildet ist. 17. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 3 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine prozessbegleitende Abtrennung des Sesquiterpens oder Diterpensaus dem Bioreaktor erfolgt, also ein in situ product removal (ISPR). 18. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung bei im wesentlichen konstantem pH, gelöstem Sauerstoff Level von > 30% und/oder Methanol oder Ethanol Konzentrationen von etwa 1 g/L durchgeführt wird.

19. Das Verfahren nach einer der Ausführungsformen 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine Terpenkonzentration von mehr als 1 g/I, vorzugsweise mehr als 1 ,5 g/l, bezogen jeweils auf das Volumen der wässrigen Phase, erreicht wird.

20. Verwendung eines Methanol und/oder Ethanol enthaltenden Mediums zur Kultivierung eines rekombinanten methylotrophen Bakteriums nach einer der Ausführungsformen 1 bis 12 für die mikrobielle de novo Synthese von Sesquiterpenen oder Diterpenen aus Methanol und/oder Ethanol.

21. Verwendung eines methylotrophen Bakteriums nach einer der Ausführungsformen 1 bis 12 für die mikrobielle de novo Synthese von Sesquiterpenen oder Diterpenen aus Methanol und/oder Ethanol.

Die Erfindung ist nicht auf eine der vorbeschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern in vielfältiger Weise abwandelbar. Der Fachmann erkennt, dass die erfindungsgemäßen Ausführungsvarianten, insbesondere die beschriebenen Bakterienstämme und

Fermentationsbedingungen ohne Weiteres angepasst werden können ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. So sind einfache Adaptationen denkbar zur Herstellung von beliebigen Sesquiterpenen aus Methanol oder Ethanol. Die Erfindung ermöglicht die Bioproduktion von Terpenen aus der nicht mit Lebensmitteln konkurrierenden Kohlenstoff-Quelle Methanol oder Ethanol. Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut der Ansprüche sowie aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnungen.

Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstel!en ist hiermit durch Bezugnahme auf den jeweiligen speziellen Offenbarungsgehalt und in ihrer Gesamtheit aufgenommen. FIGUREN

Fig. 1 zeigt eine schematische Übersicht des zentralen Stoffwechseis von Methylobacterium extorquens A 1 einschließlich der endogenen Terpensynthese über den DesoxyxyIu!ose-5- phosphat Weg (DXP), den heterolog integrierten Mevaionatweg (gekennzeichnet durch die zwei Umrahmungen), eine heterologe α-Humulen-Synthase zssl sowie eine heterologe FPP- Synthase ERG20. M. extorquens besitzt keine IPP-lsomerase (fni). Die heterolog integrierten MVA Gene betreffen eine Hydroxymethylglutaryl-CoA Synthase (hmgs), Hydroxymethylglutaryl- CoA Reduktase (hmgr), Mevalonat Kinase (mvaK), Phosphomevalonat Kinase (mvaK2), Pyrophosphomevalonat Decarboxylase (mvaD) und Isopentenylpyrophosphat-lsomerase (fni). Weitere Gene: dxs: 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase, dxr: 1-Desoxy-D-xy!ulose-5- phosphat Reductase, hrd: HMB-PP Reductase, ispA: endogene FPP Synthase;

M iekülabkürzungen: 2PG: 2-Phosphoglycerat, 3PG: 3-Phosphoglycerat, 1,3-DPG: 1 ,3- Bisphosphoglycerat, GA3P: Glycerina!dehyde-3-phosphat, PEP: Phosphoenolpyruvat, H GCoA: Hydroxymethyl- glutaryl-CoA, DXP: 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat, EP: 2-C-Methyl-D- erythriol-4-phosphat, HMB-PP: (E)-4-Hydroxy-3-mehtyl-but-2-enyl pyrophosphat, !PP:

Isopentenylpyrophposphat, GPP Geranylpyrophosphat, FPP: Farnesylpyrophosphate.

Fig. 2 zeigt einen chromatographischen Vergleich von α-Humu!en Standard (oberes Panel, schwarze Linie) und einer Probe von M. extorquens aufweisend pFS33 (pCM80-zssl, oberes Panel, hellgraue Linie). Der interne Standard Zerumbone eluiert nach 11,5 Minuten. a-Humulen in der pFS33 Probe wurde durch Vergleich der unter dem Chromatogramm dargestellten Massen spektren identifiziert. Fig. 3 zeigt die Toleranz von Methylobacterium extorquens AM1 gegenüber α-Humulen direct in der wässrigen Phase gelöst oder gelöst in der Dodekan-Phase als zweiter organischer Phase. Maximale Wachstumsraten in entsprechendem Medium ohne α-Humulen (Mmax) sind

Wachstums- raten (μ) bei unterschiedlichen α-humulene Konzentrationen gegenübergestellt. Es ist erkenn- bar, dass α-Humulen nur minimale wachstumsinhibierende Effekte auf M.

extorquens aufweist, selbst bei Konzentrationen von 1 g/l., α-Humulen in der Dodekan-Phase hat einen geringfügig geringeren Einfluss als in der wässrigen Phase, da es weniger Kontakt mit den Zellen hat.

Fig. 4 zeigt die α-Humulen Production von M. extorquens AM1 tragend die Plasmide pFS33 (pCM80- zssl), pFS34 (pCM80-zssl-ERG20), pFS45 (pHC1 15-zssi), pFS46 (pHC115-zssl- ERG20), pFS49 (pQ2148F-zssl) and pFS50 (pQ2148F-zssl-ERG20). Schwarze Balkenanteile zeigen die Produktion ohne Induktion, wohingegen die grauen Balkenanteile die Produktion mit Induktion darstellen. pCM80 trägt einen konstitutiven Promotor. Die Konzentrationen wurden 48 Stunden nach Kultivierung (pFS33, 34) bzw. nach Induktion (pFS45, 46, 49 50) verglichen;

Fig. 5 zeigt die α-Humulen Produktion von M. extorquens tragend die Plasmide mit optimierten Ribosomenbindungsstel!en (ribosome binding site) (RBS) für α-Humulenynthase (zssl), FPP- Synthase (ERG20) und IPP-lsomerase (fni) in verschiedenen Kombinationen. Die Translationsinitiations- raten für die Gene sind auf der y-Achse in Klammern angegeben. Die Konzentrationen sind durchschnittliche Produktkonzentrationen von drei 3 Transformanten, wobei jede in zwei ge- trennten Kulturen angezogen wurde. Schwarze Balken: Plasmide (pFS49, pFS57), die nur zssl enthalten, schraffierte Balken: Plasmide (pFS50, pFS58, pFS60a, pFS60b), die zssl und ERG20 enthalten, graue Balken: Plasmide (pFS61b, pFS62a, pFS62b) enthaltend zssl, ERG20 und die sechs Gene des Mevalonatweges.

Fig. 6 A: Chromatogramme (n= 502 nm) nichtverseifter (unsaponified) Carotinoid Extrakt von E. coli exprimierend die Diapophytoen Synthase und Diapophytoen Desaturase aus S. aureus via pACCRT-MN (A1) und von M. extorquens Carotinoid Biosynthese defizientem Stamm CM502 (A2). Die theoretische Retentionszeit von Lycopen ist mit dem Pfeil gekennzeichnet. B: a- Humuien Produktion von M. extorquens AM1 and CM502 tragend Plasmid pFS62b (pQ2148F- zssl 225k -ERG20 22k -fni 65k -MVA) in Schüttelkolben 48 Stunden nach Induktion (n=3).

Fig. 7: Zeiltrockengewicht (cell dry weight) und gebildete α-Humulen Konzentration des Stamms CM502 tragend pFS62b in Fermentation 5(nach Tablle 3). Der Zeitpunkt 0 gibt den

Induktionszeitpunkt mit Cumat an, dargestellt durch die gepunktete vertikale Linie.

Standardabweichungen der α-Humulen Konzentrationen wurden aus der gleichen Probe durch dreimalige Analyse ermittelt. Schwarze Quadrate: α-Humulen Konzentration, graue Kreise: Zelltrockengewicht (cell dry weight).

Fig. 8 zeigt den chromatographischer Vergleich von cis-Abienol Standard (oberes Panel, markierte Linie) und einer Probe von . extorquens aufweisend ppjo16 (pQ2148F-AbCAS- ERG20F96C-MVA, oberes Panel, markierte Linie). Der interne Standard Zerumbon eluiert nach 11 ,3 Minuten. Cis-Abienol in der 6s6 Probe wurde durch Vergleich der unter dem Chromatogramm dargestellten assenspektren identifiziert.

Fig. 9 zeigt einen chromatographischen Vergleich von Sandelholzöl (oberes Panel (a), dunkelgraue Linie) und einer Probe von M. extorquens aufweisend ppjo03 (pQ2148F-SanSyn- ERG20-1V1VA), oberes Panel (a), schwarze Linie). α-Santalen in der ppjo03 Probe wurde durch Vergleich der unter dem Chromatogramm dargestellten Massenspektren identifiziert (b, c). BEISPIELE

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung. Sie dürfen im Hinblick auf den Schutzumfang nicht in einschränkender Weise ausgelegt werden.

Beispiel 1 : Rekombinante α -Humulen Herstellung . Material und Methoden 1.1 Chemikalien, Medien und Bakterienstämme

Methylobacterium extorquens AM1 (Peel und Quayle, 1961. Biochem J. 81 , 465-9) wurde kultiviert bei 30°C in Minimalmedien, wobei für die Kultivierung im Schüttelkolben das Medium nach Kiefer et al., 2009 (PLoS ONE. 4, e7831) verwendet wurde. Das Fermentationsmedium enthält eine Endkonzentration von 30 mM PIPES, 1 ,45 mM NaH 2 P0 4 , 1 ,88 mM K 2 HP0 4 , 1 ,5 mM MgCI 2 , 1 ,36 mM (NH 4 ) 2 S0 4 , 20 μΜ CaCI 2 , 45,6 μΜ Natriumeitrat (Na 3 C6H 5 0 7 *2H 2 0), 8,7 μΜ ZnS0 4 * 7H 2 0, 15,2 μΜ MnCI 2 *4H 2 0, 36 μΜ FeS0 4 *7H 2 0, 1 μΜ (NH 4 ) B Mo 7 0 24 *4H 2 0, 0,3 μΜ CuS0 4 *5H 2 0 und 12,6 μΜ CoCI 2 *6H 2 0.

Escherichia coli Stamm DH5D (Gibco-BRL, Rockville, USA) wurde in lysogeny broth (LB) medium (Bertani, 1951. J. Bacteriol. 62, 293-300) bei 37 X kultiviert. Tetracyclin-hydrochlorid wurde in Konzentration 0 pg/ml für E. coli und M. extorquens verwendet. Cumat (4- Isopropylbenzoesäure) wurde als Induktor verwendet mit Endkonzentration von 100 μΜ verdünnt von einer 100 mM Stammlösung gelöst in Ethanol (Kultivierung im Schüttelkolben) oder Methanol (Kultivierung im Bioreaktor).

Cumat, Tetracycline-hydrochlorid, α-Humulen, Zerumbon and ( ?S)-Mevalonsäure Lithtumsalz wurden von Sigma-Aldrich (Steinheim, DE) bezogen. Dodekan wurde von VWR (Darmstadt, DE) bezogen. 1.2 Genetische Manipulationen und Plasmidkonstruktion

Die Standard Klonierungstechniken wurden nach der dem Fachmann bekannten

Vorgehensweise ausgeführt. Die Transformation von Plasmiden in M. extorquens AM1 oder CM502 wurde ausgeführt wie in Toyama et al. (Toyama et al., 1998, FEMS Microbiol. Lett. 166, 1-7) beschrieben.

Ribosomen-Bindungsstellen (ribosome binding sites, RBS) wurden mit Hilfe des Ribosomen- Bindungsstellen-Calculators (Salis, 201 1 , Methods in Enzymology, ed. V. Christopher, 19-42. Academic Press) gestaltet. Der Codon Anpassungsindex (Codon adaptation index, CAl) wurde durch den CAI-Calculator (Puigbo et al., 2008, BMC Bioinformatics. 9, 65) bestimmt.

1.3 Klonierung von Mevalonatweg (MVA)-Genen von Myxococcus xanthus Genomische DNA von Myxococcus xanthus DSM 16525 wurde vom DSMZ (Braunschweig, DE) bezogen. Die FcoRI-Restriktionsstelle von hmgs, kodierend für HMG-CoA-Synthase, wurde entfernt durch Overlap extension PCR unter Einfügung einer stillen Mutation (gaattc zu gagttc). Dazu wurde der erste Teil des Gens amplifiziert mit Hilfe der Primer HMGS-fw und HMGS-over- rev; während HMGS-over-fw und HMGS-rev für den zweiten Teii verwendet wurden. Die resultierenden PCR-Produkte wurden als "mega"-Primer zusammen mit HMGS-fw und HMGS- rev für die finale Amplifikation von hmgs (SEQ ID NO 7) ohne die coRI-Restriktionssteiie genutzt. Das Mevalonatweg-Operon von M. xanthus- aufweisend die Gene hmgr (SEQ ID NO 8), mvaKI (SEQ ID NO 9), mvaKZ (SEQ ID NO 10), mvsD (SEQ I D NO 1 1) und fni (SEQ ID NO 12) kodierend für HMG-CoA-Reduktase, Mevalonat-Kinase, Phosphomevalonat-Kinase, Pyrophosphomevalonat-Reduktase bzw. Isopentenyl-pyrophosphat-lsomerase - wurde aus dem Plasmid pUC18-mva-op (Mi et al., 2014, Microbial cel! factories. 13, 170) ausgeschnitten.

1 .4 Klonierung von Plasmiden enthaltend die α-Humuien Synthase

Die multiple Klonierungsstelie (multiple cloning site) von Plasmid pQ2148 (Kaczmarczyk et al., 2013, Appl. Environ. Microbioi. 79, 6795-802) wurde zur erhöhten Klonierungsflexibilität modifiziert. Dazu wurden Primer pQF-MCS-fw und pQF-MCS-rev angelagert {annealed) durch Erhitzen von 100 μΙ Annealing-Puffer (10 mM TRIS pH7,5, 50 mM NaCi, 1 mM EDTA) beinhaltend je 10 μΜ der Primer für 15 min gefolgt von langsamen Abkühlen auf

Raumtemperatur für drei Stunden. Die zusammengelagerten Primer wurden in pQ2148 ligiert, welches mit Spe\ und Xh geschnitten wurde, ergebend Plasmid pQ2148F. Das α -Humulen Synthase Gen zss\, ursprünglich stammend aus Z/ngiberzerumbet(Yu et al. , 2008, Planta. 227, 1291-9) (Accession number AB263736.1 ), wurde Codon-optimiert für M. extorquens AM 1 unter Erhalt der DNA-Sequenz nach SEQ ID NO 16. Das Codon-optimierte Gen gemäß SEQ iD NO 16 wurde ampHfiziert für die Insertion in pCM80 (Marx und Lidstrom, 2001 , Microbiology. 147, 2065-2075) und pHC1 15 (Chou und Marx, 2012, Ceti reports. 1 , 133- 40) unter Verwendung der Primer ZSSi-fw und ZSSI-rev. Eine RBS-optimierte Variante

(translation Initiation rate (TIR) von 221.625) für pQ2148F wurde bei Verwendung der Primer ZSSI-RBS-fw und ZSSI-rev amplifiziert. Die RBS-optimierte Variante von zssl mit einer TIR von 221 .625 weist die Nukleinsäuresequenz AGCTTAAGGATAAAGAAGGAGGTAAAAC (SEQ ID NO 41 ) auf. Das Gen für die FPP-Synthase ERG20 aus Saccharomyces cerevisiae wurde von genomischer DNA amplifiziert mit den Primern ERG20-fw und ERG20-rev. RBS-optimierte Varianten wurden amplifiziert mit Primern ERG20-RBS35k-fw oder ERG20-RBS20k-fw in Kombination mit ERG20-rev-2 resuitierend in zwei ERG20 PCR Produkten, aufweisend je eine RBS mit einer TIR von 36.800 oder 22.000. Die RBS-optimierte Variante von ERG20 mit einer TIR von 22.000 weist die Nukleinsäuresequenz

AC ATC AAAC C AAAG G ACTTT AC AG GTAGTAG AA (SEQ ID NO 39) auf. Die RBS-optimierte Variante von ERG20 mit einer TIR von 36.800 weist die Nukleinsäuresequenz

G AG AAG AG C AG ACTCG ATC ATAAC AG GG G ACTAG (SEQ ID NO 40) auf. Das zssi PCR Produkt wurde mit Sphl und Xba\ verdaut und in gleichverdautes Plasmid pCM80 inseriert, ergebend Plasmid pFS33. Cla\ und SnaB1 verdautes PCR Produkt von ERG20 wurde anschließend in die gleichen Restriktionsstelien von pFS33 kioniert resultierend in pFS34. Das hrngs Gen ohne die EcoRi-Restriktionsstelle (siehe oben) wurde hinter ERG20 inseriert unter Verwendung der Restriktionsschnittstellen Xba\ und Ba W . Das M. xanthus Mevalonat-

Operon wurde mit BamH'l und EcoRI aus pUC18-mva-op ausgeschnitten und wiedereingesetzt in gleichverdautes pFS34-bmgs ergebend pFS44.

Die Plasmide pFS45 (pHC 1 15-zssl), pFS46 (pHC1 5-zssl-ERG20) und pFS47 (pHC1 15-zssl- ERG20- 7mö i s-MVAop) wurden konstruiert durch Ausschneiden von zssi aus pFS33, von zssl- ERG20 aus pFS34 und von zssl-ERG20-/7/77ö's-MVAop aus pFS44 mit AM und EccR\ gefolgt von deren Insertion in gleich verdautes pHC1 15,

Die Plasmide pFS49 (pQ2148F-zssl) und pFS50 (pQ2148F-zssl-ERG20) wurden konstruiert durch Ausschneiden von zssi und zssl-ERG20 mit A \ und Xba\ aus pFS33 bzw. pFS34 gefolgt von deren Insertion in gleich verdautes pQ2148F. Hrngs und VAop wurden ausgeschnitten aus pFS44 durch Xba\ und EccR\ und anschließende Insertion in die gleichen

Restriktionsstellen von pFS50 resultierend in pFS52 (pQ2148F-zssl-ERG20-ft/77S's-MVAop). Das PCR Produkt des α -Humulen-Synthase-Gens zssi mit optimierter RBS wurde verdaut mit Spä und Xba\ und ligiert in gleich verdautes pQ2148F ergebend pFS57. Das PCR Produkt von ERG20 mit optimierter RBS wurde hinter zssi von pFS57 kioniert mit Cia\ und Xba\ resultierend in pFS58 (pQ2148F-zssl RBS °p>-ERG20). Hmgs-MVAop wurde inseriert in pFS58 wie für pFS52 beschrieben ergebend pFS59. RBS Varianten für ERG20 (TIR = 35000 und 20000) wurden verdaut mit Cla\ und Xbä und in entsprechend geschnittenes pFS57 eingesetzt ergebend pFS60a (zssl RBS °P 1 -ERG20 35k ) bzw. pFS60b (zssl RBS °P t -ERG20 20lt ). Insertion von hmgs- V Aop in pFS60a und pFS60b resultierte in Plasmiden pFS61 a (zssl RBS °P t -ERG20 35k -/j/775fs-MVAop) bzw. pFS61 b (zssl RBSi:i P t -ERG20 35k - 7/77^s-MVAop). Die RBS des IPP-lsomerase Gens /fr/wurde optimiert für pFS61 a und pFS61 b durch Insertion von anfänglich zusammengelagerten Primern fni-RBSopt-fw und fni-RBSopt-rev (Annealing-Methode siehe oben) in Restriktionsstelien Hpa\ und BamM . Die resultierenden Plasmide pFS62a und pFS62b weisen eine TIR von 65.000 für die fh RBS auf. Die optimierte RBS für das Gen fni weist hierbei die Nukleotidsequenz gttctaggaggaataata (SEQ ID NO 48) auf. Die optimierte RBS für das Gen hrngs weist in

Plasmiden pFS61 a und pFS61 b sowie pFS62a und pFS62b die Nukleotidsequenz SEQ ID NO 90 mit einer TIR von 189 auf.

Ein Überblick über die verwendeten Primer, Plasmide und Stämme geht aus Tabelle 1 hervor.

Tabelle : Verwendete Primer, Plasmide und Stämme. Unterstrichene und kursive Sequenzen (alle 5' - > 3') kennzeichnen Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme. Fette Buchstaben geben Sequenzen von Ribosomen Bindungsstellen (RBS) an. au: Translationsinitiationsrate (translation initiation rate, TIR) gemäß Salis Lab RBS calculaior; op: Operon, MVA:

Mevafonatweg.

Name Beschreibung Referenz

Primer

HMGS-fw AGTCTAGAGAGGAGCGCAGGATGAAGAAGCGCGTGGGAAT

(SEQ ID NO 17)

HMGS-rev ATCTG GA TCCGTTT AAAC CCTGCA GGACCGGT G TTAA CTC AG

TTCCCTTCGGCGTAC (SEQ ID NO 18)

H GS- GCTGCGCGGCCGAGTTCTACTCCGGCACG (SEQ ID NO 19)

over-fw

HMGS- CGTGCCGGAGTAGAACTCGGCCGCGCAGC (SEQ ID NO 20)

over-rev

MVA1_fw ATCTGGATCCTAGGAGGAATAATATGGGCGACGACATCACTG

(SEQ ID NO 21)

MVA- AACACCATG G CG AGCTCTC (SEQ ID NO 22)

SaclA-rev

MVA- GAGAGCTCGCCATGGTGTT (SEQ ID NO 23)

SaclA-f

MVA- GTGCCCGTTGAGCTCCACCT (SEQ ID NO 24)

SaclB-rev

MVA- AGGTGGAGCTCAACGGGCAC (SEQ ID NO 25)

SaclB_fw

MVA2_rev ATCGAATTCA4GC7TTCAGCTCAGCGCGCGCACC (SEQ ID

NO 26)

pQFJVICS- CTAGTCTG C AGCTTAAGC ATG CTCTAG AAG ATC (SEQ ID NO

fw 27)

pQF_MCS- TC G AG ATCTTCTAG AGC ATGCTTAAG CTG C AG A (SEQ ID NO

rev 28)

ZSSl-f TAGC4 rG< TTAAGAAGGATCAGTCATAATGGAACGCCAGTCG

ATGG (SEQ ID NO 29)

ZSSI-RBS- ATACACTAGTAGCTTAAGGATAAAGAAGGAGGTAAAACATGG

fw AACGCCAGTCGATGG (SEQ ID NO 30)

ZSSI-rev AG TCTAGATACGTAA TCGA 7TCAGATGAGGAACGACTCGA

(SEQ ID NO 31)

ERG20J ATCGTATCGATAGGAGCGCAGGATGGCTTCAGAAAAAGAAAT

TAG (SEQ ID NO 32)

ERG20-RB ATCGTATCGATGAGAAGAGCAGACTCGATCATAACAGGGGA

S(35k)-fw CTAG ATG G CTTC AG AAAAAG AAATTAG (SEQ ID NO 33)

ERG20-RB ATC GTATCG ATACATCAAACC AAAGGACTTTACAG GTAGTAG

S(20k)-fw AAATGG CTTC AG AAAAAG AAATTAG (SEQ ID NO 34)

ERG20 rev atcgtacgtaCTATTTG CTTCTCTTGT AAACT (SEQ ID NO 35) ERG20_rev ACT ATCT AG ATAA AGT AG AG G AG G ATT AATCT ATTTG CTTCTC -2 TTGTAAACT (SEQ ID NO 36)

fni-RBSopt- AACCTAAAATTAACGAGGAAAGAGGGAGGTTACAG (SEQ ID

fw NO 37)

fni-RBSopt- G ATCTGTAAC CTC C CTCTTTC CTC GTT AATTTTAG GTT (SEQ

rev ID NO 38)

Plasmide

pUC18 Expressionsvektor für Escherichia colr, Amp R , lacZ Promotor, Norrander pBR322ori 1983 pACCRT- Plasmid, zur Expression von Diapophytoen Synthase und Sandman MN Desaturase in Escherichia colr, Amp R ; enthält Gene für n

Diapophytoen Synthase (crtM) und Diapophytoen Desaturase

(crtN) aus Staphylococcus aureus unter Kontrolle eines lacZ

Promotors

pC 80 Konstitutiver Expressionsvektor für Methyiobacterium Marx extorquens, Tet R , pmxaF, oriT, pBR322ori 2001 ,

Microbiolo gy. 147,

2065-

2075. pHC115 Expressionsvektor für Methyiobacterium extorquens mit Cumat Chou induzierbarer pmxaF Promotorvariante; Kan R , oriT, pBR322ori 2012, Cell reports. 1 ,

133-40. pQ2148 Expressionsvektor für Methyiobacterium extorquens mit Cumat Kaczmarc induzierbarem Promotor 2148; Tet R , oriT, pBR322ori zyk 2013,

Appl.

Environ.

Microbiol.

79, 6795-

802.

PQ2148F pQ2148 mit angepassier MCS

pUC18- pUC18 mit Myxococcus xanthus MVA Operon (hmgr, mvaK,

MVAop mvaK2, vaD, fni)

pCM80- pCM80 mit Hydroxymethylglutaryl-Synthase hmgs

HMGS

pCM80- pCM80 mit vollständigem evalonat (MVA) Weg

MVA

pCM80- pCM80 mit vollständigem Mevalonat Weg und FPP Synthase

MVA- ERG20

ERG20

pFS33 pCM80 mit alpha-Humulen-Synthase zssl pFS34 pCM80 mit a!pha-Humulene Synthase zssl und FPP Synthase

ERG20

pFS44 pFS34-/7/?7öfs-MVAop

pFS45 pHC115 mit afpha-Humulen Synthase zssl

pFS46 pHC1 15 mit aipha-Humulen Synthase zssl und FPP Synthase

ERG20

pFS47 pFS46-/?/77#s-MVAop

pFS49 pQ2148F mit alpha-Humulen Synthase zssl

pFS50 pQ2148F mit alpha-Humulen Synthase zssl und FPP Synthase

ERG20

pFS52 pFS50- hmgs-MVAop

pFS57 pQ2148F mit alpha-Humulen Synthase zssl mit optimierter RBS

pFS58 pFS57-ERG20

pFS59 pFS58- hmgs-MVAop

pFS60a pFS57-ERG20 35k (RBS with au von 35000)

pFS60b pFS57-ERG20 20k (RBS with au von 35000)

pFS61a pFS60a-/j/77 s-MVAop

pFS61 b pFS60b- 7/77örs- VAop

pFS62a pFS61a mit optimierter RBS der IPP isomerase fni

pFS62b pFS61b mit optimierter RBS der IPP isomerase fni

Stämme

£ coli F , <J>80dlacZAM15, A(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1 , endA1 , ATCC

DH5a hsdR1 (rK- mK + ), phoA, supE44, A " , thi-1

M. Fakultativ methyiotrophes, obligatorisch aerobes, gram-negatives, Peel & extorquens Pink pigmentiertes α-Proteobakterium, Cm R Quayle A 1 1961 ,

Biochem

J, 81 , 465-

9.

DSM 1338

M. Carotenoid Biosynthese defizienter Stamm Van Dien extorquens et a!., C 502 2003,

Appl. Environ. Microbiol, 69, 7563- 6.

Saccharom M ATa; ura3-52; trpl -289; leu2-3, 112; his3A ; MAL2-8 C ; SUC2 Entian & yces Kotier cerevisiae 1998, CEN.PK2- Academic Press Ltd.

San

Diego, pp. 431-449.

1.5 α-Humulen Produktion in wässrig-organischer Zweiphasen Schüttelkolben-Kultivierung Methylobacterium extorquens AM1 oder CM502, aufweisend die a-Humulen

Gewinnungsplasmide, wurden kultiviert in Methanol Minimalmedium beinhaltend Tetracyclin- hydrochlorid (siehe oben). Vorkulturen wurden von Agarplatten in Reagenzgläsern mit 5 ml Medium inokuliert und für 48-72 h bei 30°C und 180 rpm geschüttelt. Hauptkulturen mit 12 mi Medium in 100 ml Schikaneschüttelkolben wurden mit einer Vorkultur inokuliert zu einer D von 0,1. Nach Kultivierung für 16 h bei 30°C und 120 rpm erreichten die Hauptkulturen die frühe exponentielle Wachstumsphase (Οϋβοο 0,3-0,6). Anschließend wurde zur Induktion Cumat hinzugesetzt sowie 3 mi Dodekan als organische Phase zugefügt. Nach 48 h Inkubation wurde ein Gesamtkulturvolumen von 15 ml dekantiert und für 10 min bei 3220 g zentrifugiert. 1 ml der oberen Dodekanschicht wurde für die α-Humu!en-Analyse verwendet. Das Zellpeilet wurde in 1 ml dH 2 0 resuspendiert für intrazelluläre a-Humulen-Analyse. 1.6 Dodekan und α-Humulen Toleranz von M. extorquens AM1

M. extorquens AM1 Vorkulturen wurden kultiviert in Reagenzgläsern mit 5 ml Methanol Minimalmedium (MM) für 48 h. Die Toleranz von M. extorquens AM1 gegenüber 20 % (v/v) Dodekan wurde durch Wachstumsvergleich untersucht (ODeoo) von Kulturen enthaltend 15 ml MM und Kulturen mit 12 ml MM und 3 ml Dodekan. Die Kulturen für den Wachstumsvergleich mit und ohne Dodekan wurden aus einer Vorkultur inokuliert.

Die α -Humuien Toleranz wurde auf zwei Wegen getestet: Toleranz gegenüber direkt in die wässrige Phase zugesetztem α -Humuien und Toleranz gegenüber α -Humuien gelöst in der organischen Dodekanschicht. Für das erstere Experiment wurde reines α -Humuien gelöst in Ethanol zu 100ml Schikaneschüttelkolben beinhaltend 15 ml MM mit Endkonzentrationen an α - Humuien von 1000, 500, 250, 100, 50, 25, 10 und 5 mg/L zugesetzt. Entsprechende Mengen an Ethanol wurden dem MM als Negativkontrollen zugesetzt. Die Kolben mit den unterschiedlichen α -Humuien Konzentrationen und die zugehörigen Negativkontrollen wurden mit einer Vorkultur ohne α -Humuien inokuliert zu einer ODeoo von 0,1. Die Οϋεοο wurde über 30 h aufgezeichnet.

Für das zweitgenannte Experiment wurde reines α -Humu!en in Dodekan gelöst und Lösungen mit 1000, 500, 00, 50 und 0 mg/L α -Humuien hergestellt. Je zwei Kulturen mit 2 ml MM und 3 ml Dodekan für jede α -Humulen-Konzentratton wurden zu einer ODeoo von 0,1 aus einer Vorkultur von M. extorquens AM1 ohne Dodekan inokuliert. Kulturen mit Dodekan ohne α - Humuien dienten als Negativkontrolle. ODeoo wurde über 30 h gemessen.

1.7 α-Humulen Analyse 1 m! Dodekan Probe wurde mit NaS0 4 getrocknet. Als interner Standard wurden 25 μΙ von 1 mM Zerumbon gelöst in Dodekan zu 225 μΙ Dodekan Probe zugegeben.

Intrazelluläres α -Humulen wurde folgendermaßen extrahiert: resuspendiertes Zelipellet wurde in ein 4 ml GC-Gefaß zusammen mit ca. 300 mg 0,2 mm Glaskügelchen gegeben. Die Zeilen wurden intensive gevortext 3 x 30 s mit zwischenzeitlicher Eiskühlung. Die lysierten Zellen wurden dreimal mit 1 ml Hexan extrahiert gefolgt von einer Volumenreduktion auf 1 ml durch einen Stickstoffstrom. Als interner Standard wurde 25 μΙ von 1 mM Zerumbon gelöst in Hexan zu 225 μΙ Probe zugegeben. α -Humuien wurde analysiert und quantifiziert mit Hilfe GC-MS (GC17A mit Q5050

Massenspektrometer, Shimadzu, Kyoto, Japan) ausgestattet mit einer Equity 5 Säule (Supelco, 30 m x 0,25 mm x 0,25 μΜ). Messungen wurden wie folgt zweifach durchgeführt: Trägergas: Helium; Splitinjektion (8:1) bei 250X; Fiussrate: 2.2 ml/min; Interface Temperatur: 250°C; Programm: 80°C halten für 3 min, 16 D C/min auf 240°C, halten für 2 min. Die Retentionszeit war 9,3 min für α -Humulen und 11 ,5 min für Zerumbon. α -Humulen in den Proben wurde identifiziert durch Vergleich von drei Hauptfragmentationen der Massenspektren mit einem käuflich erworbenen α -Humulen Standard (rel. Intensität in Klammem): 93 (15,5), 41 ( 1 ,4), 80 (6,7). Für eine Quantifizierung wurde eine Kalibrierungskurve mit den Konzentrationen 4500, 2250, 900, 675, 450, 225, 90, 67,5, 22,5, 9 und 4,5 μΜ α -Humulen mit je 100 μΜ Zerumbon verwendet.

1.8 Carotinoidextraktion und Analyse

Zur Carotinoid Extraktion wurden Zeilen von M. extorquens AM1 oder E. cc/Zdurch

Zentrifugation pelletiert, gewaschen mit ddH2Ü und im Dunkeln lyophilisiert.

Für nichtverseifte (unsaponified) Extrakte wurden 2 ml Methanol zu 50 mg aufgeschlossenen gefriegetrockneten Zellen gegeben mit anschließender Inkubation bei 65°C für 30 min. Nach Zentrifugation (10 min, 4000g, 4°C) wurde der Überstand mit Stickstoff getrocknet und in 0,5 ml eines Petrolether(40-60°C):Diethylether:Acetone:Methanol (40:10:15:5) Gemisches

resuspendiert. Präzipitierte Proteine wurden durch Zentrifugation abgetrennt (5 min, 16000g, 4°C) und der Überstand wurde in 100 μ( Tetrahydrofurane (THF) für die HPLC Analyse nach seiner Trocknung mit Stickstoff aufgenommen. Für verseifte (saponified) Extrakte wurde der Überstand nach der Proteinentfernung mit 10% KOH Lösung (gelöst in Methanol) für 2 h bei RT inkubiert. Die obere organische Phase wurde anschließend mit Stickstoff getrocknet und in 100 μΙ THF für die HPLC Analyse aufgenommen.

Die HPLC Analyse wurde mit einem Shimadzu SCL10 System ausgeführt (SPD10A UV VIS- Detektor, SPD-M10A Diodenarraydetektor, SIL10A Autosampier, CTO-10AC Säulenofen; je Shimadzu, Kyoto, Japan). Carotinoide wurden an einer Reverse-phase C18 Säule (250 mm x 4,5 mm x 5μ; Alltech, Deerfield, USA) aufgetrennt unter Verwendung eines

Gradientenprogramms von Acetonitril:Methanol:2-Propanol (85:10:5) als Lösungsmittel A und 100% 2-Propanol als Lösungsmittel (LM) B. Bei einer Flussrate von 1 ml/min bei 32°C wurde folgendes Elutionsprogramm gefahren: 100% LM A, 0% LM B 0-31 min, 0% LM A, 00% LM B 31-36 min, 100% LM A und 0% LM B 36-45 min. Ein Wellenlängenbereich von 190-600 nm wurde durch Diodenarraydetektor überwacht. Die Retentionszeit von Lycopen war 25,38 min. Diapolycopen wurde über einen Vergleich mit einem Carotenoidextrakt von E. coli identifiziert, weiches Diapophytoen Synthase und Diapophytoen Desaturase aus Staphylococcus aureus via pACCRT-MN exprimiert (siehe Tabelle 1).

1.9 Fermentation

Fed-batch Kulturen wurden in einem 2,4 ί KLF 2000 Fermenter (Bioengineering AG, Wald, Switzerland) durchgeführt mit einer pH und pC>2 Elektrode von Mettier-Toledo (Greifensee, Switzeriand), zwei Sechs-Blatt-Turbinen Rührern und einem abwärts gerichteten Blattrührer. Filter-steriiisierte Luft oder Sauerstoff wurde mit einer Flussrate von 50 l/h bereitgestellt. Alle Experimente wurden bei 30°C und bei einem pH of 6,75, der durch automatische Zufuhr von NH 4 OH (30%) reguliert wurde, durchgeführt. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff

(dissolved oxygen, DO) wurde automatisch reguliert durch Anpassung der Rührgeschwindigkeit beginnend mit 700 rpm. Sauerstoff und Kohlendioxid wurden in der Abluft mit einem

BINOS 1001 Gasanalysator (Rosemount Analytical, Hanau, DE) gemessen. Die Methanol Konzentration wurde online überwacht und mit einem ProcessTRACE 1.21 MT System (Trace Analytics, Braunschweig, DE), ausgestattet mit einer Dialysesonde, halbstündig reguliert. Die Methanoizufuhr wurde wie folgt gestaltet: unterhalb einer Konzentration von 1 g/l, 0,79 g (1 ml) und unterhalb von 0,5 g/l, 1 ,42 g (1 ,8 ml) wurde Methanol über eine Watson-Marlow 505Du Peristaltik Pumpe (Cornwali, England) zugeführt. Anti-Schaum B Emulsion (Sigma-Aldrich) wurde manuell hinzugesetzt zur Reduktion des Schäumens, zusätzlich zu einem sechs-Blatt- Tubinenrührer, der direkt über der flüssigen Phase als mechanischer Schaumbrecher angebracht ist.

Nach in situ Sterilisation von 900 ml Fermentationsmedium (siehe oben) wurde der Fermenter mit einer ODeoo von 0,5-1 inokuliert mit einer Vorkultur, die für 72 h in Schüttelkolben

gewachsen ist. Nach Erreichen einer ODeoo von 5-10 wurden 100 μΜ Cumat einer frisch hergestellten Stammlösung in Methanol sowie 15% Dodekan zugeführt. Die Methanolzufuhrrate wurde nach der Induktion verdoppelt. Die induzierte Kultur wurde für 120 h weiterkultiviert.

Proben wurden manuell entnommen, wovon Zelltrockenmasse und ODeoo aus der wässrigen Phase bestimmt und α -Humulen in der organischen Dodekan-Phase wie oben beschrieben gemessen wurden.

2. Ergebnisse

2.1 α -Humulen Produktion unter Verwendung vom Plasmiden mit konstitutivem Promotor (Vergleichsbeispiel)

Methylobacterium extorquens AM1 produziert endogen einen Farnesylpyrophosphat (FPP)-Pool der allerdings zu Menaquinon, Hopanen und Carotinoiden umgewandelt wird (siehe Fig.1 ). Grundsätzlich könnte dieses Bakterium α -Humuten durch Integration einer heterologen α - Humulen Synthase synthetisieren. Plasmid pCM80 trägt den starken pmxaF Promotor und wurde als Vektor für die Expression des α -Humulen Synthase Gens zss\ gewählt. Eine Codon- optimierte Variante des Gens aus Zingiber zerumbetwwöe in pCM80 eingeführt unter Erhalt von pFS33. Zur wetteren Steigerung der α -Humulen Produktion wurde die FPP Synthase aus Saccharomyces cerevisiae (ERG20) hinter das z$s\ Gen in pFS33 kloniert unter Erhalt von pFS34 (pCM80-zssi-ERG20).

Die Kultivierung erfolgte unter den oben beschriebenen Bedingungen als wässrig-organische Zwei phasen kulturen, wobei Dodekan als organische Phase dient. Die starke Hydrophobizität von α -Humulen führt zu einer vollständigen Akkumulation in der Dodekanphase, da

intrazelluläres α -Humulen nicht nachweisbar war.

Daraus ergeben sich insbesondere zwei Vorteile: α -Humulen Konzentrationen können direkt in der Dodekanphase gemessen werden und eine Verflüchtigung von α -Humulen wird vermindert durch den hohen Siedepunkt von Dodekan. Weiterhin verträgt M. extorquens AM1 20%

Dodekan, ohne dass toxische Wirkungen und eine Wachstumsbeeinflussung zu beobachten sind. M. extorquens AM1 (nachfolgend kurz auch: AM1) aufweisend Plasmid pFS33 war in der Lage, α -Humulen zu produzieren wie der Peak mit ähnlicher Retentionszeit und Massenspektrum im Vergleich zum α -Humulen Standard in Fig. 2 zeigt. Hingegen ist für M. extorquens A 1 mit der leeren Vektorkontrolle kein α -Humulen nachweisbar. Sowohl für A 1_pFS33 als auch AM1_pFS34 wurden 2.3 mg/L α -Humulen gemessen. Die FPP-Synthase ERG20 von pFS34 scheint die σ -Humulen Konzentration nicht zu erhöhen. Die näheren Ursachen hierfür sind nicht bekannt.

2.2 Integration des heterologen Mevalonat Weges (MVA)

Überraschend konnte hier jedoch gefunden werden, dass die heterologe Expression

insbesondere von Enzymen des MVA Weges zu einer verbesserten α -Humulen Bildung führt.

Dies ist umso erstaunlicher, da die MVA Vorstufe, Acetoacetyl-CoA, ein Bestandteil des

Primärstoffwechsels von M. extorquens ist (siehe Fig.1). Durch die Entnahme von Acetoacetyl- CoA für den heterolog eingebrachten MVA Weg war eine erhebliche Imbalance im

Primärstoffwechsel von M. extorquens zu erwarten.

Diese Befürchtung wird durch folgendes Vorexperiment zunächst bestätigt. Die Transformation von pFS44 enthaltend zss\, ERG20 und die M. xanthus IN Gene hmgs, fni, hmgr, mvaK, mvaK2 und mvaD r elektrokompetente M. extorquens AM1 ergab kein erkennbares Wachstum, weder auf Methanol Minimal Medium noch auf Succinat Minimal Medium. Die konstitutive Expression des MVA Weges scheint für M. extorquens nicht gut verträglich zu sein. 2.3 Toxizität von α -Humulen auf M. extorquens AM1

Um festzustellen, ob M, extorquens überhaupt als ein Produktionsstamm für Terpene geeignet ist, wurde zunächst geprüft, ob das Bakterium durch Terpene in höheren Konzentrationen im Wachstum inhibiert wird.

Terpene haben häufig toxische Effekte auf Bakterien. Die Toxizität von α -Humulen auf M. extorquens wurde untersucht durch Wachstumsanalysen in Anwesenheit von verschiedenen α - Humulen Konzentrationen. Eine α -Humulen enthaltende Dodekanschicht wurde zu

M. extorquens Kulturen als zweite Phase gegeben. In einem zweiten Ansatz wurde α -Humulen direkt der wässrigen Phase hinzugesetzt. Die in Fig. 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass M. extorquens als Produktionsplattform für Terpene, insbesondere für das α -Humulen, geeignet ist.

2.4 α-Humulen Produktion bei Verwendung eines Cumat-induzierbaren Promotors

Für die induzierbare Expression der MVA Gene wurde nachfolgend ein geeignetes

Piasmidsystem mit induzierbarem Promotor verwendet. Dazu wurden die Gene für die α - Humulen Synthase allein, in Kombination mit FPP-Synthase ERG20 und in Kombination mit ERG20 und den MVA-Weg Genen in Plasmid pHC115 kloniert, welches einen Cumat induzierbaren Promotor trägt (Chou und Marx, 2012), ergebend die Plasmide pFS45, pFS46 bzw. pFS47.

Nach Transformation wurden für pFS45 und pFS46, aber für pFS47 kaum feststeilbar, Kolonien erhalten. Ohne daran gebunden zu sein, könnten die in Fig. 4 für pFS45 und pFS46 gezeigten Daten dies erklären: mehr als 50% α -Humulen wurde ohne Induktion bereit produziert. Die Genexpression von pHC1 15 ist nicht dicht und verbleibende Expression der MVA Gene wirkt sich negativ auf das Wachstum für M. extorquens. aus.

Plasmid pQ2148 enthält den sehr dichten Cumat induzierbaren 2148 Promotor. Zss\ allein und wiederum in Kombination mit ERG20 sowie mit den MVA Genen wurden in pQ2148F eingeführt unter Erhalt von pFS49 (zsä), pFS50 ( ssl-ERG20) und pFS52 ( ssl -E RG20-M VA) . Kolonien wurden erhalten nach Transformation in M. extorquens für pFS49, pFS50 und auch pFS52, auch wenn die Kolonien für pFS52 auch nach 8 Tagen Wachstum bei 30X sehr klein waren. Die α -Humulen Konzentrationen erreichten 11 mg/L in AM1_pFS49 und 17 mg/L in

AM1_pFS50 (siehe Fig. 4), was eine 6-fache oder 1,6 fache Steigerung des zsst-ERG20 Konstruktes gegenüber pFS34 bzw. pFS46 ist. Im Vergleich zu pHC115 Konstrukten, war die Background-Produktion, also ohne Induktion, nur 5%.

Der Ausgleich von Flux Imbalancen im Stoffwechsel kann durch verschiedenste Maßnahmen erreicht werden. So können beispielsweise die Promotorstärke, die Konzentration des

Induktors, die Plasmidkopienzahl oder deren Kombinationen entscheidend sein. Hier wurde nun überraschend gefunden, dass die Translationsinitiationsrate (translation Initiation rates, TIR) verschiedener Ribosomenbindungsste!len (ribosome binding Sites, RBS) für eine verbesserte Terpensynthese von Bedeutung sind.

Zunächst wurde die TIR der α -Humulen Synthase RBS in den Plasmiden pFS57 (zss 225k ), pFS58 (zssi 225k -ERG20) und pFS59 (zssl 225k -ERG20-MVA) 146-fach erhöht (siehe Tabelle 2).

Tabelle 2: Translationsinitiationsraten (TIR) der nativen und optimierten

Ribosomenbindungsstellen (RBS) der heterologen Mevalonatweg Gene hmgs

(HydroxymethyiglutaryS-CoA-Synthase) und #7/ ' (IPP-lsomerase) aus Myxococcus xanthus, der FPP-Synthase ERG20 und α-Humulen-Synthase zss\ der verschiedenen Plasmide. Wachstum: Koionie Bildung von AM1 auf Methanol Agar nach Transformation: ++++: wie Leervektor (3-4 Tage), +++: 4-5 Tage, ++: 5-6 Tage, +: 6-7 Tage, -: keine Kolonien erkennbar nach 8 Tagen; wt: native FPP Synthase von M. extorquens AM1 mit unbekannter RBS; Intermediate: AAc-CoA: Acetoacetyl-CoA, HMG-CoA: Hydroxymethylglutaryl-CoA, IPP: Isopentenylpyrophosphat, DMAPP: Dimethylallylpyrophosphat, FPP: Farnesylpyrophosphat:

Plasmide Translationsinitiationsrate (TIR) Wachstum

Gen: hmgs fni ERG20 zss

IPP

Interme- AAc- HMG-

—► $ ^ FPP a-Humulen diat: CoA CoA

DMAPP

pFS49 - - wt 1514 +++

pFS50 - - 558 1514 ++

pFS52 1995 87,3 558 1514 -/+ §

pFS57 - - wt 221625 ++

pFS58 - - 558 221625 +++

pFS59 1995 87,3 558 221625 -/+ §

pFS60a - - 36800 221625 ++

pFS60b - - 22000 221625 +++

pFS61 b 6345 87,3 22000 221625 +

pFS62a 6345 65000 36800 221625 +

pFS62b 6345 65000 22000 221625 ++

§ verschiedene Koloniegrößen,

Wie in Fig. 5 zu erkennen ist, führt eine Optimierung der RBS von zss\ allein nicht zu erhöhter α -Humulen Produktion ohne zusätzliche Versorgung mit Vorläufern vom MVA Weg (pFS57 und pFS58). Transformanten mit pFS59 (zssl 25k -ERG20-MVA) wuchsen langsam, vergleichbar zu pFS52 enthaltenden Stämmen ohne zss\ RBS Optimierung (siehe Tabelle 2).

Die TIR der ERG20 RBS wurde im Verhältnis von etwa 1 : 10 (pFS61 b) zur TIR der zssl RBS (siehe Tabelle 2) erhöht. Die RBS Optimierung von ERG20 in Kombination mit zssl RBS Optimierung führte nicht zur Erhöhung der α -Humulen Bildung ohne MVA (pFS60a und pFS60b, siehe Fig. 5).

Die Kombination von RBS optimierter α -Humulen synthase, RBS optimierter FPP Synthase und anwesenden MVA Enzymen führte zu dem Plasmid pFS61 b, das ein gutes Wachstum ermöglicht (TiR von ERG20 beträgt 22000). Konzentrationen von bis zu 60 mg/L α -Humulen wurden von einigen AM1 Transformanten mit pFS61 b erreicht (durchschnittliche Produktion war 35 mg/L), auch wenn hohe Schwankungen zu beobachten waren. Optimierungen der RBS der IPP Isomerase führten zu einer weiteren Steigerung der durchschnittlichen α -Humulen Produktion sowie zu einer Verringerung der hohen

Schwankungen der a -Humulen Produktion zwischen den Transformanten. Die TIR der #7 RBS wurde in Plasmiden pFS62a und pFS62b auf 65000 erhöht (siehe Tabelle 2). Die Stämme AM1_pFS62b und AM1 pFS62a zeigen ein weiter verbessertes Wachstum gegenüber

AM1_pFS61 b.

Mit Stamm AM1_pFS62b wurden Konzentrationen von 58 mg/L α -Humulen gebildet mit signifikant reduzierter Varianz zwischen den Transformanten im Vergleich zu AM1_pFS61 b (siehe Fig. 5). Die optische Dichte war bei etwa 3 nach 48 h Induktion, was einem

Zelltrockengewicht von 1 g/l entspricht.

Die heterologen Expression des MVA Weges in M. extorquens erfolgte gemäß der zuletzt beschriebenen Ausführungsform durch Anpassung der RBS der α -Humulen Synthase, der FPP-Synthase sowie der ΙΡΡ-!somerase. Konzentrationen von 58 mg/L α -Humulen wurden durch M. extorquens aufweisend pFS62b (zssl zz0k -ERG20 20k -//7/ i5k -MVA) erreicht. Dies ist immerhin eine dreifache Steigerung gegenüber einem Stamm mit überexprimierter α -Humulen Synthase und überexprimierter FPP-Synthase in Abwesenheit vom heterologen MVA-Weg.

2.5 α -Humulen Produktion in Carotinoid Biosynthese defizienten M, extorquens Stämmen Die Carotinoid Biosynthese in M. extorquens konkurriert mit der α -Humulen Synthase um den

Präcursor FPP (siehe Fig. 1). Die Verwendung einer Carotinoidsynthese defizienten Mutante könnte nach einem weiteren Ausführungsbeispiel die α -Humulen Produktion noch steigern.

Dazu wurde der farblose M. extorquens AM1 Mutantenstamm CM502 (Van Dien et al. 2003).

Die Carotinoidextraktion und Analyse (siehe oben) von Stamm CM502 zeigten, dass er Diapolycopin produziert, jedoch kein Lycopin, welches ein identisches UV-Spektrum, aber eine andere Retentionszeit besitzt (siehe Fig. 6A). Die Daten deuten darauf hin, dass es sich bei dem Stamm CM502 um eine Diapolycopin-Oxidase Mutante {crtNb) handelt, da sie noch

Diapolycopin herstellt, aber keine veresterten/glykosylierten Derivate. Die α -Humulen Produktion von Stamm AcrtNö mit Plasmid pFS62b war nochmals signifikant erhöht um etwa 30% zu M. extorquens AM1 Wildtyp mit Plasmid pFS62b (siehe Fig. 6B). Ein Produkiionstiter von immerhin 75 mg/i α -Humuien im SchütteSkoiben konnte somit erreicht werden.

Bemerkenswert hierbei ist, dass die oben genannten Konzentrationen, wie beispielsweise 58 mg/L oder 75 mg/L α -Humuien, bereits erreicht werden, ohne dass beispielsweise teures Lithiumacetoacetat oder DL-Mevalonat extern zugesetzt werden müssen. Vorteilhaft ist weiterhin, dass die oben genannten Konzentrationen bereits unter Einsatz von preisgünstigem Methanol Minimal Medium erreicht wurden. Im Gegensatz zum Stand der Technik ist kein Fermentationsmedfum auf TB oder LB-Basis erforderlich. Daraus ergibt sich ein weiterer Vorteil in der Vereinfachung der Aufreinigung der gewonnenen Terpenprodukte, da ein klar definiertes Minimalmedium verwendet werden kann. Aufwändige Entfernung von Nebenprodukten kann minimiert werden. Darüber hinaus eröffnen die hier beschriebenen Stämme die Verwendung von *Methanol als einziger Kohienstoffquelle zum Wachstum. 2.6 α -Humuien Herstellung in Fed-batch Kultivierungen

Um die Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen M, extorquens basierten α -Humuien Produktion zu testen, wurden Methanol-Iimitierte Fed-batch Fermentationen durchgeführt. Die oben beschriebenen wässrig-organischen Zweiphasen Kultivierungen wurden genutzt. M. extorquens AM1 oder Δο/iNb aufweisend das Plasmid pFS62b wurden bis zu einer ODeoo von 5-10 angezogen bevor die Expression des α -Humuien Synthese Weges mit Cumat induziert wurde und eine Dodekan-Phase zugegeben wurde. Die weitere Kultivierung erfolgte bei konstantem pH, gelöstem Sauerstoff Level von > 30% und Methanol Konzentrationen von etwa 1 g/L. Durchschnittliche ODeoo Werte von 80-90 wurden per Fermentation erreicht (siehe Tabelle 3) entsprechend einer Zelldichte von etwa 30 g/l. Wie in Fig. 7 gezeigt, war die α - Humuien Produktion wachtumsabhängig. Hohe α -Humuien Konzentrationen von 0,73 g/l bis 1 ,02 g/l wurden von Stamm M. extorquens AM1 mit Plasmid pFS62b gebildet. Eine maximale α -Humu!en Konzentration von 1 ,65 g/l wurde von Stamm M. extorquens ΔαίΝο mit Plasmid pFS62b gebildet, eine 57% Steigerung verglichen mit der höchsten Konzentration von 1,02 g/l durch Stamm AM1 mit Plasmid pFS62b (siehe Tabelle 3). Die Maximale Produktkonzentration von 1,65 g/l bedeutet eine 22 fache Steigerung verglichen mit der höchsten Konzentration, die durch Kultivierung im Schüttelkolben erreicht wurde, wobei das α -Humulen/ODeoo Verhältnis bei etwa 20 mg * l VOD 6 oo gleichbleibend ist. Die maximal theoretisch mögliche Ausbeute von de novo synthetisierbarem α -Humuien pro Methanol ist 0,26 g/g. Der maximale Ertrag von 0,031 go Humuien/gMeOH, erreicht in Fermentation 5 (siehe Tabelle 3), entspricht 12% der maximalen theoretischen Ausbeute.

Tabelle 3: Prozesseigenschaften von Methanol limitierten Fed-batch Fermentationen

durchgeführt mit den Stämmen AM1 und l\crtNb aufweisend Plasmid pFS62b. Cumat Induktion erfolgte nach Erreichen der frühen exponentiellen Wachstumsphase (OD 6 oo etwa 10). Die gezeigten Werte repräsentieren Messungen bei einem Zeitpunkt nach Induktion, n.b.: nicht bestimmt, cdw: Zelltrockengewicht (cell dry weight), STY: Spezifische Produktleistung (space time yielo):

1 63 0,74 90 30 0,023 1 1 ,7

AM1 2 70,5 1 ,02 148 n.b. 0,024 15

27,

3 93 0,73 84 0,015 7,8

9

28,

4 80 1 ,37 79 0,023 17,1

CM50 4

2

5 104 1 ,65 85 30 0,031 14,6 a: maximaler theorethischer Ertrag (maximum theoretical yield) ist 0,26 g gMeOH

b: durchschnittliche STY nach Induktion (t=0) bis zum Prozessende

Beispiel 2: Rekombinante cis-Abienol Herstellung 1 Matertal und Methoden

1 .1 Chemikalien, Medien und Bakterienstämme

Methylobacterium extorquens AM 1 (Peel and Quayle 1961 , Biochem J, 81 , 465-9) wurde bei 30°C in Minimalmedium nach Kiefer et al. (Kiefer et al. 2009) mit 123 mM Methanol kultiviert. Escherichia coli Stamm DH5a (Gibco-BRL, Rockville, USA) wurde in !ysogeny broth (LB) medium (Bertani 1951 , J Bacterio!, 62, 293) bei 37 °C kultiviert. Tetracyclin-hydrochlorid wurde in einer Konzentration von 10 pg/mi für E. coli und M. extorquens verwendet. Cumat (4- Isopropylbenzoesäure) wurde als Induktor verwendet und ausgehend von einer 100 mM Stammlösung gelöst in Ethanol in einer Endkonzentration von 00 μΜ eingesetzt.

Cumat, Tetracyclin-hydrochlorid und Zerumbon wurden von Sigma-Aldrich (Steinheim, DE) bezogen. Cis-Abienol wurde von Toronto Research Chemicals (Toronto, CA) bezogen.

Dodekan wurde von VWR (Darmstadt, DE) bezogen. .2 Genetische Manipulationen und Plasmidkonstruktion

Die Standard-Klonierungstechniken wurden nach der dem Fachmann bekannten

Vorgehensweise ausgeführt. Die Transformation von M. extorquens AM1 mit Plasmiden wurde ausgeführt wie in Toyama et al. (Toyama, Anthony and Lidstrom 998) beschrieben. Ribosomen-Bindungsstellen (ribosome binding sites, RBS) wurden mit Hilfe des Ribosomen- Bindungsstellen-Calculators (Salis 2011 ) gestaltet.

1.3 Klonierung von Plasmiden zur Produktion von cis-Abienol

Plasmide zur Synthese von cis-Abienol wurden ausgehend von Plasmid pfs62b konstruiert. Zur Konstruktion von ppjo 6 (pQ2148F-AbCAS-ERG20F96C-MVA) wurde das cis-Abienol Synthase Gen AbCAS, ursprünglich stammend aus Abies balsamea (Zerbe et al. 2012, J Biol Chem, 287, 12121-31) (Accession number JN254808.1 ), codon -optimiert für M. extorquens AM unter Erhalt der DNA-Sequenz nach SEQ ID NO 50. Das codon-optimierte Gen gemäß SEQ ID NO 50 wurde ampiifiziert für die Insertion in pfs62b unter Verwendung der Primer pj05 und pj25. Die RBS des AbCAS-Gens weist die Nukleinsäuresequenz

TATT AAT ATT AAG AG GAG GT AAT AA (SEQ ID NO 51) mit einer Translationsinitiationsrate (TIR) von 233.000 auf. Das Gen für die GGPP Synthase ERG20F96C (SEQ ID NO 52) (Ignea et al. 2015, Metabolie Engineering, 27, 65-75) aus Saccharomyces cerevisiae wurde mittels Mutagenese-PCR mit den Primern pj26, pj16, pj17 und pj10 aus ERG20 gewonnen. Die TIR der RBS von ERG20F96C wurde auf 10.000 eingestellt und weist die Nukleinsäuresequenz

CTTAAACTAAC C G AG ATAG G AAC G AATTTT AC AA (SEQ ID NO 53) auf. Plasmid ppjo16 wurde konstruiert durch Insertion der PCR Produkte von AbCAS sowie ERG20F96C mittels Gibsonklonierung in den mit Spei und Xbal geschnittenen Vektor pfs62b. 2

Zur Konstruktion von Plasmid ppjo17 (pQ2148F-Ntl_PPS-NtABS-ERG20F96C-MVA) wurden das LPP Synthase Gen NtLPPS aus Nicotiana tabacum (Sallaud et al. 2012, Plant J, 72, 1-17) (Accession number HE588139.1) sowie das cis-Abienol Synthase Gen NtABS aus Nicotiana tabacum (Sallaud et al. 2012, Plant J, 72, 1-17) (Accession number HE588140.1) codon- optimiert für M. extorquens AM1 unter Erhalt der DNA-Sequenz SEQ ID NO 54

beziehungsweise SEQ ID NO 55. Die entsprechenden RBS weisen für das Gen NtLPPS eine TIR von 145.000 mit der DNA-Sequenz CAACGGCCCTTACAAAAGGAGGTTAATTATT (SEQ ID NO 56) und für das Gen NtABS eine TIR von 130.000 mit der DNA-Sequenz

GATAGAAACCCTTAATTAAGAAGGAGGTCCTTA (SEQ ID NO 57) auf. Das codon-optimierte NtLPPS-Gen gemäß SEQ ID NO 54 wurde mit den Primern pj05 und pj27 ampiifiziert, zur Amplifikation der codon-optimierten NtABS (SEQ ID NO 55) wurden die Primer pj28 und pj29 verwendet. Für Plasmid ppjo17 wurde das Gen ERG20F96C (SEQ ID NO 52) durch

Mutagenese PCR mit den Primern pj30, pj16, pj17 und pj10 gewonnen. Die TIR der RBS von ERG20F96C in ppjo17 wurde auf 9.500 eingestellt und weist die Nukleinsäuresequenz

AACCACTAAGAACACAGACTTATACACAGGAGGAT (SEQ ID NO 58) auf. Plasmid ppjo17 wurde konstruiert durch Insertion der PCR Produkte von NtLPPS, NtABS sowie ERG20F96C mittels Gibsonklonierung in den mit Spei und Xbal geschnittenen Vektor pfs62b.

Ein Überblick über die verwendeten Primer, Plasmide und Stämme geht aus Tabelle 4 hervor.

Tabelle 4:

Verwendete Primer, Beschreibung Referenz Plasmide und Stämme

Name

Primer

pj05 (SEQ ID NO 70) AACAG AC AATCTG GTCTGTTTGT AAC pj10 (SEQ ID NO 71) TCTTCATCCTGCGCTCCTGTCTAGAAA

T ACTCT AATTAATCTATTTG CTTCTCTT GTAAACTTTG

pj16 (SEQ ID NO 72) ATCGGCGACCAAGCAGTAAG

pj17 (SEQ ID NO 73) TT ACTG CTTG GTC G C CG ATG

pj25 (SEQ ID NO 74) CGTTCCTATCTCGGTTAGTTTAAGATC

GATTCAGGTGGC

pj26 (SEQ ID NO 75) CTTAAACTAACCGAGATAGGAACGAAT

TTTACAATATGGCTTCAGAAAAAGAAAT

TAGGAG

pj27 (SEQ ID NO 76) GACCTCCTTCTTAATTAAGGGTTTCTAT

CTACGTATCAGACCTGCTGGAAC

pj28 (SEQ ID NO 77) G AT AG AAAC C CTT AATTAAG AAG G AG G pj29 (SEQ ID NO 78) TATAAGTCTGTGTTCTTAGTGGTTATC

GATTCACGGCGAG

pj30 (SEQ ID NO 79) AACCACTAAGAACACAGACTTATACAC

AGGAGGATATGGCTTCAGAAAAAGAAA

TT AG GAG

Plasmide

PQ2148F Expressionsvektor für Methylobacterium

extorquens mit Cumat induzierbarem

Promotor 2148 und angepasster Multiple Cloning Site (MCS); TetR , oriT,

pBR322ori

pfs62b Expressionsvektor für Methylobacterium

extorquens zur Synthese von a-Humulen ppjo16 Expressionsvektor für Methylobacterium

extorquens zur Synthese von cis-Abienol mit GGPP Synthase ERG20F96C und cis- Abienol Synthase AbCAS

ppjo17 Expressionsvektor für Methylobacterium extorquens zur Synthese von cis-Abienol mit GGPP Synthase ERG20F96C, LPP Synthase NtLPPS und cis-Abienol Synthase NtABS

Stämme

E. coli DH5 F-, O80dlacZAM15, ATCC A(lacZYA-argF)U169, deoR,

recA1 , endA1 , hsdR17(rK- mK+), phoA, supE44, λ-, thi- 1

M. extorquens Fakultativ methyiotrophes, (Peel and Quayle 1961 )

AM1 obligatorisch aerobes, gram- DSMZ133

negatives, Pink

pigmentiertes a-

Proteobakterium, CmR

1.4 cis-Abienol Produktion in wässrig-organischer Zweiphasen Schüttelkolben-Kultivierung Methylobacterium extorquens AM 1 , aufweisend die cis-Abienol Gewinnungsplasmide wurden kultiviert in Methanol Minimalmedium beinhaltend Tetracyclin-5 hydrochlorid (siehe oben).

Vorkulturen wurden von Agarpiatten in Reagenzgläsern mit 5 ml Medium inokuliert und für 48 h bei 30°C und 180 rpm geschüttelt. Hauptkulturen mit 12 ml Medium in 100 ml

Schikaneschüttelkolben wurden mit einer Vorkultur inokuliert zu einer OD600 von 0, 1 . Nach Kultivierung für 16 h bei 30°C erreichten die Hauptkuituren die frühe exponentielle

Wachstumsphase (OD600 0,3-0,6). Anschließend wurde zur Induktion Cumat hinzugesetzt sowie 3 ml Dodekan als organische Phase zugefügt. Nach 48 h Inkubation wurde ein

Gesamtkulturvolumen von 15 ml dekantiert und für 10 min bei 3220 g zentrifugiert. 1 ml der oberen Dodekanschicht wurde für die cis-Abienol-Analyse verwendet. 1 .5 cis-Abienol Analyse

1 ml Dodekan Probe wurde mit NaS04 getrocknet. Als interner Standard wurden 25 μΙ einer Dodekan-Lösung mit 1 mM Zerumbon zu 225 μΙ Dodekan-Probe zugegeben.

Cis-Abienol wurde analysiert und quantifiziert mit Hilfe einer GC-MS (GC17A mit Q5050

Massenspektrometer, Shimadzu, Kyoto, Japan), ausgestattet mit einer Equity 5 Säule (Supeico, 30 m x 0,25 mm x 0,25 μΜ). Messungen wurden wie folgt durchgeführt: Trägergas: Helium; Splitinjektion (2: 1 ) bei 250°C; Flussrate: 2.2 ml/min; Interface Temperatur: 250°5 C; Programm: 80°C halten für 3 min, 16°C/min auf 240°C, halten für 2 min. Die Retentionszeit betrug 14, 1 min für cis-Abienol und 1 1 ,3 min für Zerumbon. Cis-Abienol in den Proben wurde identifiziert durch Vergleich von drei Hauptfragmentionen der Massenspektren mit einem käuflich erworben cis- Abienol Standard (rel. Intensität in Klammern): 1 19 (15,9), 134 (30,3), 191 (6,0). Für eine

Quantifizierung wurde eine Kalibrierungskurve mit den Konzentrationen 100, 50, 20, 10, 5, 2, 1 mg/L cis-Abienol mit je 00 μΜ Zerumbon verwendet

2 Ergebnisse

2.1 Cis-Abienol Produktion unter Verwendung von Plasmiden mit konstitutivem Promotor (Vergleichsbeispiel) Für die Produktion von cis-Abienol mit Methylobacterium extorquens AM1 wurde neben dem Mevalonatoperon aus Myxococcus xanthus die GGPP Synthase ERG20F96C (eine Variante der FPP-Synthase ERG20 aus Saccharomyces cerevisiae) sowie weitere Gene exprimiert. GGPP sollte entweder direkt zu cis-Abienol durch die bifunktionelle cis-Abienol Synthase AbCAS aus Nicotiana tabacum umgesetzt werden oder schrittweise über die Bildung von LPP aus GGPP durch die LPP Synthase NtLPPS aus Nicotiana tabacum, wobei LPP anschließend durch die cis-Abienol Synthase NtABS, ebenfalls stammend aus Nicotiana tabacum, zu cis- Abienol umgesetzt werden soll. Insgesamt wurden zwei Plasmidvarianten (ppjo16 und ppjo17) zur cis-Abienol Synthese konstruiert.

Nach Transformation von Methylobacterium extorquens AM1 mit den Plasmiden ppjo16 oder ppjo17 traten erste Kolonien nach 6 Tagen Inkubation bei 30°C auf. Für AM 1 mit ppjo16 beziehungsweise ppjo17 war zu diesem Zeitpunkt jeweils ein Klon sichtbar; im Vergleich dazu waren weit über 3000 Transformanten mit dem Leervektor pQ2148F erkennbar. Erst nach insgesamt 8 Tagen Inkubation bei 30°C traten auch bei Transformanten mit den cis- Abienoiproduktionsplasmiden weitere, jedoch deutlich kleinere Kolonien auf. Diese

Beobachtungen deuten darauf hin, dass die cis-Abienol Produktionspiasmide, vermutlich durch Akkumulation von für Methylobacterium extorquens toxischen Prenylphosphatintermediaten, das Wachstum des Organismus deutlich beeinträchtigen und es dadurch zur Bildung von Suppressoren kommt.

Die beiden nach 6 Tagen sichtbaren Transformanten von AM 1 mit ppjo16 beziehungsweise ppjo17, sowie jeweils sechs der kleineren Kolonien, wurden auf einer frischen Agarplatte ausgestrichen und für 6 Tage bei 30°C inkubiert. Auch bei den zuvor kleinen Transformanten bildeten sich nach Überstreichen große Kolonien, also Suppressoren. Da somit die selektive Kultivierung von Transformanten mit Plasmid ppjo16 oder ppjo1 ohne Suppressorenbildung nicht möglich war, konnten nur Suppressoren auf Produktbildung untersucht werden. Hierzu wurden die neu aufgetretenen Suppressoren zur Gewinnung von ausreichend Zellmasse auf einer weiteren, frischen Agarplatte ausgestrichen und für 7 Tage bei 30°C inkubiert.

Die Kultivierung erfolgte unter den oben beschriebenen Bedingungen als wässrig-organische Zweiphasenkulturen, wobei Dodekan als organische Phase diente.

Eine Suppressormutante von M. extorquens A 1 aufweisend Plasmid ppjo16 (genannt 16s6) war in der Lage, cis-Abienol zu produzieren wie der Peak mit gleicher Retentionszeit und Massen spektrum im Vergleich zum cis-Abieno! Standard in Abbildung 1 zeigt. Hingegen war für M. extorquens AM1 mit der Leervektorkontrolle (pQ2148F) kein cis-Abienol nachweisbar. Für die Suppressormutante 16s6 von M. extorquens AM1 mit ppjo16 wurden 21 , 1 mg/L cis-Abienol in der Dodekanphase gemessen, was einer Produktkonzentration von 5,3 mg/L cis-Abienol in der Kulturbrühe entspricht. Nach Plasmidisolation von ppjo16 aus der Suppresormutante 16s6 und anschließender Sequenzierung des Plasmids konnte die dem Suppressor zugrunde liegende Mutation identifiziert werden. Im Promotorbereich des Plasmids, genau 1 15 Nukleotide vor dem Startcodon des AbCAS-Gens, wurde eine Sequenz von insgesamt 28 Nukleotiden deletiert. SEQ iD NO 59 repräsentiert die Sequenz des Promotorbereichs im Plasmid ppjo16, während unter SEQ ID NO 60 die mutierte Promotorsequenz in Plasmid ppjo16 aus der Suppressormutante 16s6 hinterlegt ist.

Beispiel 3: Rekombinante Santalen Herstellung

1 Material und Methoden 1 .1 Chemikalien, Medien und Bakterienstämme

Methyiobacterium extorquens A 1 (Peel and Quayie 1961 , Biochem J, 81 , 465-9) wurde bei 30°C in Minimalmedium nach Kiefer et al. (Kiefer et al., PLoS One, e7831) mit 123 mM

Methanol kultiviert.

Escherichia coli Stamm DH5a (Gibco-BRL, Rockville, USA) wurde in lysogeny broth (LB) medium (Bertani 1951 ) bei 37 °C kultiviert. Tetracyclin-hydrochlorid wurde in einer

Konzentration von 10 pg/ml für B. co/i und M. extorquens verwendet. Cumat

(4-lsopropylbenzoesäure) wurde als Induktor verwendet und ausgehend von einer 100 mM Stammlösung gelöst in Ethanol in einer Endkonzentration von 100 μΜ eingesetzt.

Cumat, Tetracyclin-hydrochlo d, Zerumbon und Sandelhoizöl wurden von Sigma-Aldrich (Steinheim, DE) bezogen. Dodekan wurde von VWR (Darmstadt, DE) bezogen.

1 .2 Genetische Manipulationen und Plasmidkonstruktion

Die Standard-Klonierungstechniken wurden nach der dem Fachmann bekannten

Vorgehensweise ausgeführt. Die Transformation von M. extorquens AM1 mit Plasmiden wurde ausgeführt wie in Toyama et a!. (Toyama et al., FEMS Microbiology Letters, 166, 1 -7) beschrieben.

Ribosomen-Bindungsstellen (ribosome binding sites, RBS) wurden mit Hilfe des Ribosomen- Bindungsstellen-Calculators (Salis 201 , Methods in Enzymology, ed. V. Christopher, 19-42. Academic Press) gestaltet.

1 .3 K!onierung von Plasmiden zur Produktion von Santalen

Plasmide zur Synthese von Santalen wurden ausgehend von den Plasmiden pQ2418F, pfs60b und pfs62b konstruiert.

Zur Konstruktion von ppjo01 woMVA (pQ2148F-SSpiSSY-ERG20) und ppjo01 (pQ2148F- SSpiSSY-ERG20-MVA) wurde das Santalen Synthase Gen SSpiSSY, ursprünglich stammend aus Santalum spicatum (Jones et al., 201 1 , Journal of Biological Chemistry, 286, 17445-17454) (Accession number HQ343278.1 ), codon-optimiert für M. extorquens AM 1 unter Erhalt der DNA-Sequenz nach SEQ ID NO 61. Das codon-optimierte Gen gemäß SEQ ID NO 61 wurde amplifiziert für die Insertion in pfsBOb (Sonntag et al. 2015) unter Verwendung der Primer SSpiSSY_RBSopt_fw und SSpiSSYjrev. Das SSpiSSY PCR Produkt wurde mit Spei und Clal verdaut und in g!eichverdautes Plasmid pfs60b inseriert, ergebend Plasmid ppjo01_woM A. Plasmid ppjo01 wurde konstruiert durch Ausschneiden der Gene SSpiSSY und ERG20 aus ppjo01_woMVA mit A&a/und EcoRl, gefolgt von der Insertion in gleich verdautes pfs62b. In beiden Plasmiden, ppjo01 und ppjo01_woMVA, wies SSpiSSY die Nukleinsäuresequenz TGTTACACCCACAGAACAAACCCGAGGTAACT (SEQ ID NO 62) mit einer TIR von 44.000 auf, die TIR der RBS von ERG20 besaß die Nukleinsäuresequenz

ACATCAAACCAAAGGACTTTACAGGTAGTAGAA (SEQ ID NO 63) mit einer TIR von 20.000. Zur Konstruktion von ppjo03 (pQ2148F-SanSyn-ERG20) wurde das Santalen Synthase Gen SanSyn, ursprünglich stammend aus Clausena lansium (Scalcinati et al., 2012, Metabolie Engineering, 14, 91-103; Scalcinati et al., 2012, Microb Cell Fact, 11 , 1 17) (Accession number HQ452480.1), codon-optimiert für M. extorquens AM1 unter Erhalt der DNA-Sequenz nach SEQ ID NO 64. Das codon-optimierte Gen gemäß SEQ ID NO 64 wurde amplifiziert für die Insertion in pfs62b unter Verwendung der Primer pj05 und pj06. Die RBS des SanSyn-Gens wies die Nukleinsäuresequenz G AAG AAG G AG GTAGTC AT AAAG AAG GAG GTAACTA (SEQ ID NO 65) mit einer TIR von 233.000 auf. Plasmid ppjo03 wurde konstruiert durch Insertion des PCR Produktes von SanSyn mittels Gibsonklonierung in den mit Spei und Bsu36l geschnittenen Vektor pfs62b. Die TIR der RBS von ERG20 wird auf 22.000 eingestellt und wies die

Nukleinsäuresequenz TC CCC AG CGCGCCCCC C AATTCAG G AT AAC ATAG (SEQ ID NO 66) auf.

Zur Konstruktion von ppjo04_woMVA (pQ2148F-ERG20fusSSpiSSY) und ppjo04 (pQ2148F- ERG20fusSSpiSSY-MVA) wurde das FPP Synthase Gen ERG20 mit C-terminalem (GGGGS)x2 Linker mit den Primern ERG20-fus_fw und ERG20-fus_rev für die Insertion in pQ2418F

(Sonntag et al., etab Eng, 32, 82-94) amplifiziert. Das Gen SSpiSSY (SEQ ID NO 61) wurde mit den Primern SSpiSSY_RBSopt_fw und SSpiSSY_rev amplifiziert, mit BamHi und EcoRl verdaut und in gieichverdautes Plasmid pQ24 8F-ERG20fus inseriert, ergebend Plasmid ppjo04_woMVA. Plasmid ppjo04 wurde konstruiert durch Ausschneiden des Gens ERG20fus aus ppjo04_woMVA mit Asel und EcoRl, gefolgt von der Insertion in gleich verdautes pfs62b. In beiden Plasmiden, ppjo04 und ppjo04_wo VA, wies ERG20 die Nukleinsäuresequenz

AAAC ATAG C AT ATT AG CAG ATTAAG G ACATACGT (SEQ ID NO 67) mit einer TIR von 53.000 auf. Zur Konstruktion von ppjo05 (pQ2148F-SSpiSSYfusERG20-MVA) wurde das codon-optimierte Santalen Synthase Gen SspiSSY (SEQ ID NO 61) mit den Primern pj01 und pj08 amplifiziert. Das Gen für die FPP Synthase ERG 20 mit N-terminalem (GGGGS)x2 Linker wurde amplifiziert unter Verwendung der Primer pj09 und pj10. Die TIR des Fusionsproteins wurde auf 402.000 eingestellt und wies die Nukleinsäuresequenz

CCCCTTCCCTTATTTAAACCAGAGGAGGTAACAAA (SEQ ID NO 68) auf. Plasmid ppjo05 wurde konstruiert durch Insertion der PCR Produkte von SSpiSSY sowie fusERG20 mittels Gibsonklonierung in den mit Spei und Xbal geschnittenen Vektor pfs62b. Zur Konstruktion von ppjo06 (pQ2148F-SSpiSSY-ERG20_RBSmax) wurde das codon- optimierte Santalen Synthase Gen SSpiSSY (SEQ ID NO 61) mit den Primern pj01 und pj77 amplifiziert. Die optimierte RBS des SSpiSSY-Gens wies die Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO 68 mit einer TIR von 402.000 auf. Das Gen für die FPP Synthase ERG20 wurde amplifiziert unter Verwendung der Primer pj10 und pj78. Die TIR von ERG20 wurde auf 1.344.000 eingestellt und wies die Nukleinsäuresequenz

AACCAAATAGGATTAGCACAGAAGGGGGTAATA (SEQ ID NO 69) auf. Plasmid ppjo06 wurde konstruiert durch Insertion der PCR Produkte von SSpiSSY sowie ERG20 mittels

Gibsonklonierung in den mit Spei und Xbal geschnittenen Vektor pfs62b.

Die TIR der RBS des mgs-Gens wurde bei den Plasmiden ppjoOi , ppjo03 sowie ppjo04 analog zum Humulensyntheseplasmtd pfs62b bei 189 beibehalten. Für die Plasmide ppjo05 und ppjo06 wurde der TIR-Wert der RBS der hmgs auf 6345 eingestellt.

Ein Überblick über die verwendeten Primer, Plasmide und Stämme geht aus Tabelle 5 hervor. Tabelle 5: Verwendete Primer, Plasmide und Stämme

Name Beschreibung Referenz

Primer

SspiSSY_RBSopt_f ACGAACTAGTTGTTACACCCACAGAACAAACCCGA

w (SEQ ID NO 80) GGTAACTATGGACTCGTCGACCGCC

SspiSSY_rev (SEQ ATCGTATCGATTCACTCCTCGCCGAGCGG

ID N0 81)

pj01 (SEQ ID NO G AC AATCTGGTCTGTTTGTAACTAGTC CC CTTCCCT

82) TATTTAAACCAGAGGAGGTAACAAAATGGACTCGTC

GACCGCCAC

pj05 (SEQ ID NO AACAG AC AAT CTG GTCTGTTTGTAAC

70)

pj06 (SEQ ID NO TGGGCATACCAGTCACATGC

83)

ERG20-fusJw (SEQ ACGAACTAGTAAACATAGCATATTAGCAGATTAAGG

!D NO 84) AC ATAC GTATG G CTTC AG AAAAAG AAATTAG

ERG20-fus_rev ACTAGGATCCGCCGCCACCCGAGCCACCGCCACC

(SEQ ID NO 85) TTTG CTTCTCTTGTAAACTTTG

pjOS (SEQ ID NO TTTCTGAAGCCATGGATCCGCCGCCACCCGAGCCA

86) CCGCCACCCTCCTCGCCGAGCGGGATC

pj09 (SEQ ID NO GGATCCATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGAG

87)

pj10 (SEQ ID NO TCTTCATCCTGCGCTCCTGTCTAGAAATACTCTAAT

71) T AATCT ATTTG CTTCTCTTGTAAACTTTG CTTCTGTGCTAATCCTATTTGGTTATCGATTCACTC

CTCGCCGAGC

G ATAAC C AAAT AG G ATTAG C AC AG AAGG G G GTAAT AATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGAG

Expressionsvektor für Methylobacterium extorquens mit (Sonntag et Cumat induzierbarem Promotor 2148 und angepasster al„ 2015, Multiple Cloning Site (MCS); TetR , oriT, pBR322ori Metab Eng,

32, 82-94)

Expressionsvektor für Methylobacterium extorquens zur (Sonntag et Synthese von α-Humulen, ohne Gene kodierend für al., 2015, Proteine des Mevalonatwegs Metab Eng,

32, 82-94)

Expressionsvektor für Methylobacterium extorquens zur (Sonntag et Synthese von a-Humulen al., 2015,

Metab Eng, 32, 82-94)

Expressionsvektor für Methylobacterium extorquens zur

Synthese von Santalen mit FPP Synthase ERG20 und

Santalen Synthase SspiSSY, ohne Gene kodierend für

Proteine des Mevalonatwegs

Expressionsvektor für Methylobacterium extorquens zur

Synthese von Santalen mit FPP Synthase ERG20 und

Santalen Synthase SspiSSY

Expressionsvektor für Methylobacterium extorquens zur

Synthese von Santalen mit FPP Synthase ERG20 und

Santalen Synthase SanSyn

Expressionsvektor für Methylobacterium extorquens zur

Synthese von Santalen mit einem Fusionsprotein aus

der FPP Synthase ERG20 und der Santalen Synthase

SSpiSSY (ERG20fusSSpiSSY), ohne Gene kodierend

für Proteine des Mevalonatwegs

Expressionsvektor für Methylobacterium extorquens zur

Synthese von Santalen mit einem Fusionsprotein aus

der FPP Synthase ERG20 und der Santalen Synthase

SSpiSSY (ERG20fusSSpiSSY)

Expressionsvektor für Methylobacterium extorquens zur

Synthese von Santalen mit einem Fusionsprotein aus

der Santalen Synthase SSpiSSY und der FPP

Synthase ERG20 (SSpiSSYfusERG20) ppjooe Expressionsvektor für Methylobacterium extorquens zur

Synthese von Santaien mit FPP Synthase ERG20 und

Santalen Synthase SspiSSY, wobei die TIR der RBS

von ERG20 maximal hoch eingestellt wurde

Stämme

E. coli DH5a F-, O80dlacZAM15, A(iacZYA-argF)U169, deoR, ATCC

recA1 , endA1, hsdR17(rK-mK+), phoA, supE44, λ-,

M. extorquens Fakultativ methylotrophes, obligatorisch aerobes, gram(Peel and AM1 negatives, Pink pigmentiertes α-Proteobaktehum, CmR Quayle

1961 ,

Biochem J, 81 , 465-9.) DSMZ1338

1.4 Santalen Produktion in wässrig-organischer Zweiphasen Schüttelkolben-Kultivierung

Methylobacterium extorquens AM1 , aufweisend die Santalen Gewinnungsplasmide wurde kultiviert in Methanol Minimalmedium beinhaltend Tetracyclin-5 hydrochlorid (siehe oben). Vorkulturen wurden von Agarplatten in Reagenzgläsern mit 5 ml Medium inokuliert und für 48 h bei 30°C und 180 rpm geschüttelt. Hauptkulturen mit 12 ml Medium in 100 ml

Schikaneschüttelkolben wurden mit einer Vorkultur inokuliert zu einer ODeoo von 0,1. Nach Kultivierung für 16 h bei 30X erreichten die Hauptkulturen die frühe exponentielle

Wachstumsphase (ODeoo 0,3-0,6). Anschließend wurde zur Induktion Cumat hinzugesetzt sowie 3 ml Dodekan als organische Phase zugefügt. Nach 48 h Inkubation wurde ein

Gesamtkulturvolumen von 15 ml dekantiert und für 10 min bei 3220 g zentrifugiert. 1 ml der oberen Dodekanschicht wurde für die Santalen-Analyse verwendet. 1.5 Santalen-Analyse

1 ml Dodekan Probe wurde mit NaS0 4 getrocknet. Als interner Standard wurden 25 μΙ einer Dodekan-LÖsung mit 1 mM Zerumbon zu 225 μΙ Dodekan-Probe zugegeben. Santalen wurde analysiert mit Hilfe einer GC-MS (GC17A mit Q5050 Massenspektrometer, Shimadzu, Kyoto, Japan), ausgestattet mit einer Equity 5 Säule (Supeico, 30 m x 0,25 mm x 0,25 μΜ). Messungen wurden wie folgt durchgeführt: Trägergas: Helium; Spiitinjektion (8:1) bei 250°C; Flussrate: 2.2 ml/min; Interface Temperatur: 250° C; Programm: 80°C halten für 3 min, 16°C/min auf 240°C, halten für 2 min. Da ein Santalenstandard kommerziell nicht erhältlich ist, wurde stattdessen Sandelholzöl zur Analyse von Santalenprodukten in den Proben eingesetzt. Vor der Messung wurde das Sandelholzöl :500 in Dodekan verdünnt. Die verschiedenen in Sandelholzöl enthaltenen Substanzen eluierten zwischen 11 und 12,4 min. 2 E rgebnisse

2.1 Santa!en Produktion unter Verwendung von Plasmiden mit konstitutivem Promoter

(Vergleichsbeispiel)

Für die Produktion von Santalen mit Methylobacterium extorquens AM1 wurden neben dem evalonatoperon aus Myxococcus xanthus die FPP Synthase ERG20 aus Saccharomyces cerevisiae sowie weitere Gene exprimiert. FPP sollte durch eine Santalen Synthase aus Santa/um spicatum (SSpäSSY) oder Clausens lansium (SanSyn) zu Santalen umgesetzt werden. Ebenso wurden Fusionsproteine aus der Santalen Synthase SSpiSSY und der FPP Synthase ERG20 zur Santalenproduktion getestet. Insgesamt wurden sieben Plasmidvarianten (ppjo01, ppjo01_woMVA, ppjo03, ppjo04, ppjo04_woMVA, ppjoOS, ppjo06) zur Santalen Synthese konstruiert.

Nach Transformation von Methylobacterium extorquens MI mit den Santalen

Gewinnungsplasmiden traten Kolonien nach 5 Tagen Inkubation bei 30°C auf. Für Plasmide ohne Mevalonatweg (pQ2418F, ppjo01 wo VA, ppjo04_woMVA) sowie denjenigen, bei denen die TIR der RBS der hmgs auf 189 eingestellt war, waren weit über 3000 Transformanten sichtbar. Im Vergleich dazu traten bei Plasmiden mit einer TIR der RBS der hmgsvon 6345 (ppjoOS, ppjo06) mit circa 100 sichtbaren Kolonien deutlich weniger Transformanten auf. Nach insgesamt 8 Tagen Inkubation bei 30°C traten bei Transformanten mit ppjo05 beziehungsweise ppjo06 weitere, jedoch deutlich kleinere Kolonien auf. Diese Beobachtungen deuteten darauf hin, dass die Santalen Produktionsplasmide mit einer höher eingestellten TIR der RBS der hmgs, vermutlich durch Akkumulation von für Methylobacterium extorquens toxischen

Prenylphosphatintermediaten, das Wachstum des Organismus deutlich beeinträchtigen und es dadurch zur Bildung von Suppressoren kam.

Die nach 5 Tagen sichtbaren Transformanten von AM1 mit ppjo05 beziehungsweise ppjo06, sowie jeweils sechs der kleineren Kolonien, wurdne auf einer frischen Agarplatte ausgestrichen und für 6 Tage bei 30°C inkubiert. Auch bei den zuvor kleinen Transformanten bildeten sich nach Überstreichen große Kolonien, also Suppressoren. Da somit die selektive Kultivierung von Transformanten mit Plasmid ppjoOS oder ppjo06 ohne Suppressorenbildung nicht möglich war, konnten nur Suppressoren auf Produktbildung untersucht werden. Hierzu wurden die neu aufgetretenen Suppressoren zur Gewinnung von ausreichend Zeilmasse auf einer weiteren, frischen Agarplatte ausgestrichen und für 7 Tage bei 30°C inkubiert. Für die übrigen Stämme von M. extorquens, bei denen es nicht zur Suppressorenbildung kam, wurdne ebenfalls jeweils 3 verschiedene Klone auf einer neuen Agarplatte ausgestrichen und für 7 Tage bei 30°C inkubiert.

Die Kultivierung erfolgte unter den oben beschriebenen Bedingungen als wässrig-organische Zweiphasenkulturen, wobei Dodekan als organische Phase diente.

M. extorquens AM1 aufweisend die Plasmide ppjo01_woMVA, ppjo03, ppjo04, ppjo04_wo VA oder ppjoOS war in der Lage, Santalene zu produzieren wie der -Santalen-Peak mit gleicher Retentionszeit und Massenspektrum im Vergleich zu Substanzen im Sandelholzöl in Abbildung 1 zeigte. Exemplarisch ist das Chromatogramm und Massenspektrum einer Probe von M. extorquens AM1 aufweisend das Plasmid ppjo03 dargestellt. Hingegen war für M. extorquens AM1 mit der Leervektorkontrolle (pQ2148F) kein Santalene nachweisbar.

Der Fachmann erkennt, dass die hier in den Ausführungsbeispielen beschriebenen

Bakterienstämme und Fermentationsbedingungen ohne Weiteres angepasst werden können ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. So sind einfache Adaptationen denkbar zur Herstellung von anderen Sesquiterpenen aus Methanol oder Ethanol, beispielsweise potentieller Biokraftstoffe, wie Bisabolen, oder von Aromastoffen, wie Santalen oder von Diterpenen wie Sclareol. Die Erfindung ermöglicht die Bioproduktion von Terpenen aus der nicht mit Lebensmitteln konkurrierenden Kohlenstoff-Quelle Methanoi oder Ethanol.

Sämtliche aus den Ansprüchen, der Beschreibung und der Zeichnung hervorgehenden Merkmale und Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten, räumlicher Anordnungen und Verfahrensschritten, können sowohl für sich als auch in den verschiedensten Kombinationen erfindungswesentlich sein.

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Sequenzprotokoll - freier Text

SEQ ID NO 1 : Hydroxymethylglutaryl-CoA-Synthase, Myxococcus Xanthus

SEQ ID NO 2: Hydroxy- methylglutaryl-CoA-Reduktase, Myxococcus Xanthus

SEQ ID NO 3: Mevalonat-Kinase, Myxococcus Xanthus

SEQ ID NO 4: Phosphomevalonat- Kinase, Myxococcus Xanthus

SEQ ID NO 5: Pyrophosphomevalonat-Decarboxylase, Myxococcus Xanthus

SEQ ID NO 6: Isopentenylpyrophosphat-Isomerase, Myxococcus Xanthus

SEQ ID NO 7: hmgs Gen aus Myxococcus xanthus mit entfernter EcoR\- Restriktionsstelle unter Einfügung einer stillen Mutation (gaattc zu gagttc)

SEQ ID NO 8: hmgr Gen aus Myxococcus xanthus

SEQ ID NO 9: mvaK1 Gen aus Myxococcus xanthus

SEQ ID NO 10: mvaK2 Gen aus Myxococcus xanthus

SEQ ID NO 11 : mvaD Gen aus Myxococcus xanthus

SEQ ID NO 12: fni Gen aus Myxococcus xanthus

SEQ ID NO 13: FPP-Synthase ERG20 aus Saccharomyces cerevisiae, PRT

SEQ ID NO 14- FPP-Synthase ERG20 aus Saccharomyces cerevisiae, DNA

SEQ ID NO 15. Sesquiterpen-Synthase aus Zingiber zerumbet

SEQ ID NO 16: DNA Sequenz der alpha-Humulen-Synthase zss/von Zingiber zerumbet

Codon-

SEQ ID NO 17 Primer

SEQ ID NO 18 Primer

SEQ ID O 19 Primer

SEQ ID NO 20 Primer

SEQ ID NO 21 Primer

SEQ ID NO 22 Primer

SEQ ID NO 23 Primer

SEQ ID NO 24 Primer

SEQ ID NO 25 Primer

SEQ iD NO 26 Primer

SEQ ID O 27 Primer

SEQ ID NO 28 Primer

SEQ ID NO 29 Primer

SEQ ID NO 30 Primer

SEQ ID NO 31 Primer

SEQ ID NO 32 Primer

SEQ ID NO 33 Primer

SEQ ID NO 34 Primer

SEQ ID NO 35 Primer

SEQ ID NO 36 Primer

SEQ ID NO 37 Primer

SEQ ID NO 38 Primer SEQ ID NO 39 optimierte RBS von ERG20 mit einer TIR von 22.000

SEQ ID NO 40 optimierte RBS von ERG20 mit einer TIR von 36.800

SEQ ID NO 41 optimierte RBS von zss/mit einer TIR von 221.625

SEQ ID NO 42: GGPP-Synthase aus S. cerevisiae

SEQ ID NO 43: GGPP-Synthase aus Pantoea agglomerans

SEQ ID NO 44: GGPP-Synthase aus Taxus canadensis

SEQ ID NO 45: Sesquiterpen-Synthase aus Santalum album

SEQ ID NO 46: Sesquiterpen-Synthase Santalum spicatum

SEQ ID NO 47: Diterpen-Synthase aus Abies baisameaSEQ ID NO 48 optimierte

RBS von fni mit einer TIR von 65.000

SEQ ID NO 49 optimierte RBS von hmgs mit einer TIR von 6.345

SEQ ID NO 50 DNA-Sequenz der cis-Abienol Synthase AbCAS aus Abies balsamea codon-optimiert für Methylobacterium extorquens AM1

SEQ ID NO 51 optimierte RBS von AbCAS mit einer TIR von 233.000

SEQ ID NO 52 DNA-Sequenz der GGPP Synthase ERG20F96C aus Saccharomyces cerevisiae

SEQ ID NO 53 optimierte RBS von ERG20F96C mit einer TIR von 10.000 in Plasmid ppjo16

SEQ ID NO 54 DNA-Sequenz der LPP Synthase NtLPPS Gen aus Abies balsamea codon-optimiert für Methylobacterium extorquens A 1

SEQ ID NO 55 DNA-Sequenz der cis-Abienol Synthase NtABS Gen aus Abies balsamea codon-optimiert für Methylobacterium extorquens AM1

SEQ ID NO 56 optimierte RBS von NtLPPS mit einer TIR von 145.000 in Plasmid ppjo16

SEQ ID NO 57 optimierte RBS von NtABS mit einer TIR von 130.000 in Plasmid ppjo 6

SEQ ID NO 58 optimierte RBS von ERG20F96C mit einer TIR von 9.500 in Plasmid ppjo17

SEQ ID NO 59: Promotorbereich von Plasmid ppjo16 einschließlich RBS AbCAS,

beginnend direkt nach CymR*

SEQ ID NO 60: Promotorbereich von Plasmid ppjo 6 aus Klon 16s6 einschließlich RBS

AbCAS, beginnend direkt nach CymR *

SEQ ID NO 61 : DNA-Sequenz der Santalen Synthase SspiSSY aus Santalum spicatum codon-optimiert für Methylobacterium extorquens AM1

SEQ ID NO 62: optimierte RBS von SSpiSSY mit einer TIR von 44.000 in Plasmid ppjo01 und ppjo01_woMVA

SEQ ID NO 63: optimierte RBS von ERG20 mit einer TIR von 20.000 in Plasmid ppjo01 und ppjo01_woMVA

SEQ ID NO 64: DNA-Sequenz der Santalen Synthase SanSyn aus Clausena lansium codon-optimiert für Methylobacterium extorquens AM1

SEQ ID NO 65: optimierte RBS von SanSyn mit einer TIR von 233.000 in Plasmid ppjo03

SEQ ID NO 66: optimierte RBS von ERG20 mit einer TIR von 22.000 in Plasmid ppjo03

SEQ ID NO 67: optimierte RBS von ERG20 mit einer TIR von 53.000 in Plasmid ppjo04 und ppjo04_woMVA SEQ 1D NO 68; optimierte RBS von SSpiSSY mit einer TIR von 402.000 in Plasmiden ppjoOS und ppjo06

SEQ iD NO 69: optimierte RBS von ERG20 mit einer TIR von 1.344.000 in Plasmid ppjo06

SEQ ID NO 70 Primer pj05

SEQ ID NO 71 Primer pj10

SEQ ID NO 72 Primer pj16

SEQ ID NO 73 Primer pj17

SEQ ID NO 74 Primer pj25

SEQ ID NO 75 Primer pj26

SEQ ID NO 76 Primer pj27

SEQ ID NO 77 Primer pj28

SEQ iD NO 78 Primer pj29

SEQ ID NO 79 Primer pj30

SEQ ID NO 80 Primer SspiSSY_RBSopi_fw

SEQ ID O 81 Primer SspiSSY_rev

SEQ ID NO 82 Primer pj01

SEQ ID NO 83 Primer pj06

SEQ ID NO 84 Primer ERG20-fus_fw

SEQ ID NO 85 Primer ERG20-fus„rev

SEQ ID NO 86 Primer pj08

SEQ ID NO 87 Primer pj09

SEQ ID NO 88 Primer pj77

SEQ ID NO 89 Primer pj78

SEQ ID NO 90 optimierte RBS von hmgs mit einer TIR von