PROCESSO PARA DEPOSIÇÃO DE BIOMATERIAIS EM SUBSTRATOS REPELENTES A ÁGUA E RESULTANTES BIOMATERIAIS

Domínio técnico da invenção

A presente invenção diz respeito a um processo para a deposição de biomateriais em superfícies planas com elevada repelência a líquidos, substratos tratados e concebidos para esse efeito bem como os produtos ou artigos compreendendo os biomateriais depositados nas superfícies tratadas.

Antecedentes da invenção

O desempenho de materiais para serem utilizados em aplicações biomédicas pode ser aferido em laboratório de acordo com a resposta celular em ambientes controlados. Numa perspectiva de redução de tempo dispendido e custos associados a esta análise é fundamental o desenvolvimento e aperfeiçoamento de técnicas de análise expedita, de modo a rastrear diferentes combinações de materiais, como por exemplo, células, moléculas bioactivas e meios de cultura.

As tecnologias de análise expedita foram inicialmente desenvolvidas e aplicadas na indústria farmacêutica (1). No entanto, são poucos os sistemas de análise expedita disponíveis no mercado para analisar biomateriais. Como pioneiro na criação da primeira "biblioteca" de polímeros, destaca-se Joachim Kohn (2) .

Actualmente, muitas das plataformas para análise expedita são baseadas em superfícies repelentes à adesão celular onde nano/micro-quantidades de polímero podem ser depositadas e estão em contacto com o mesmo meio, após a imersão de toda a plataforma num meio de cultura (3,4). Uma desvantagem deste tipo de plataforma é ser impossível colocar diferentes materiais em contacto com distintos ambientes celulares e meios de cultura, limitando o estudo às combinações de materiais.

Outra possibilidade para se efectuar uma análise combinatorial ou multi-factorial é recorrer ao uso de placas de poços comerciais (5,6) que, apesar de permitirem o estudo dos diversos materiais em diferentes ambientes biológicos, utilizam quantidades relativamente volumosas de biomateriais , que se encontram separadas por paredes rígidas e de elevada altura.

Nas técnicas baseadas em plataformas onde são depositados materiais de reduzida dimensão, existem vários métodos para a sua obtenção, que se podem dividir em técnicas directas e indirectas .

Nos métodos de impressão directa, o uso de uma máscara ou molde não é necessário. Estas podem envolver contacto, estando divididas em impressão por contacto, impressão sem contacto e técnicas baseadas em feixes (7,8). Nas impressões de contacto, uma ponta (geralmente metálica) é usada para aplicar um material ou energia numa superfície.

A impressão sem contacto, também conhecida como impressão "inkjet", é obtida pela ejecção de volumes na ordem dos nanolitros de um microcapilar em posições específicas numa superfície. Esta técnica, geralmente usada para imprimir tinta em papel, foi adaptada para a análise expedita de resposta celular a biomateriais usando uma superfície de vidro revestido com agarose (9). Dois tipos de colagénio foram usados como "tinta", obtendo padrões com 350μπ\ de diâmetro. O uso de gradientes, ou seja, estruturas onde uma propriedade é variada continuamente ao longo do espaço, é outra alternativa para estudos combinatórios de interacções biomateriais-células . Por exemplo, o efeito do módulo de elasticidade de hidrogéis tridimensionais na diferenciação osteogénica foi estudado usando um gradiente continuo de poli (etilenoglicol ) reticulável com radiação ultravioleta (UV) , onde células murinas pré- osteoblásticas se encontravam encapsuladas (10). No entanto, neste tipo de sistemas existe um risco de comunicação entre as células que, além de estarem expostas ao mesmo meio de cultura, poderão comunicar entre si visto não haver uma barreira física a separá-las .

Considerando documentos de patente na área de estudos combinatórios de biomateriais , poderão ser focados três exemplos distintos: (i)a impressão por contacto no qual micro-hidrogéis são depositados numa superfície com repelência à adesão celular, (ii) a fabricação de micro-poços por litografia de materiais planos "soft lithography" , onde biomateriais ou células podem ser depositados, e (iii) o estudo bidimensional de análise da influencia da topografia na resposta celular.

Anderson criou um método para a produção de micro-matrizes de biomateriais poliméricos (11). As superfícies dos substratos apresentam baixa afinidade de adesão celular, permitindo organizar os biomateriais poliméricos como elementos de uma micro-matriz na superfície do substrato. Numa outra abordagem deste método, é feito um encapsulamento celular na micro-matriz de biomateriais poliméricos em que uma dosagem apropriada de células é adicionada em cada elemento da micro-matriz. O substrato é imerso num único meio de cultura. Este facto impede que cada um dos biomateriais depositados na micro-matriz seja totalmente independente do resto da micro-matriz, de modo a que todas as amostras têm de ser testadas sob o efeito do mesmo meio de cultura celular. Uma outra desvantagem deste método relaciona-se com o volume de biomaterial passível de ser depositado. Visto que não existem forças físicas suficientemente fortes para evitar o espalhamento dos biomateriais na plataforma, o controlo estrutural dos biomateriais dependente da sua altura fica restrito tornando, por exemplo, a inserção de porosidade impossível.

Khademhosseini (12) desenvolveu um dispositivo para análise expedita que contém micro-poços com o formato de uma micro- matriz e um molde impresso correspondente para análises combinatórias. A disposição dos dispositivos para depositar os biomateriais para as análises rápidas corresponde à disposição dos micro-poços, de tal forma que cada depósito aborda um único micro-poço quando as duas micro-matrizes entram em contacto. No entanto, trata-se um processamento que envolve vários passos, tornando-o complexo. Além disso, tal como nas placas de poços comerciais, os materiais estão rodeados por paredes e, devido ao seu reduzido tamanho, não é também possível controlar o micro- ambiente em cada região que contém um biomaterial ou uma combinação de biomateriais.

Um outro método (13) propõe uma biblioteca de superfícies com topografias distintas geradas através do uso de algoritmos matemáticos. As bibliotecas e topografias geradas nas superfícies podem ser aplicadas para compreender a relação entre a resposta celular e o relevo dos substratos de modo a encontrar superfícies com desempenhos optimizados ou especiais. Neste método toda a plataforma é imersa apenas num tipo de meio de cultura, não havendo total independência entre as regiões com diferentes topografias, que são unicamente construídas numa lógica bidimensional. Sumário da invenção

De forma a ultrapassar os problemas mencionados, é desejável desenvolver-se um método que permita efectuar a deposição e combinação de diferentes materiais biológicos com diferentes meios e condições de cultura, num único substrato, de acordo com a reivindicação 1.

Noutro aspecto, a presente invenção visa desenvolver substratos úteis para a aplicação do referido método, de acordo com a reivindicação 4.

Outro aspecto da presente invenção diz respeito a produtos ou artigos compreendendo os biomateriais aplicados sobre substratos, de acordo com a reivindicação 12.

Finalmente, num outro aspecto, a presente invenção visa desenvolver a utilização dos produtos os artigos acima mencionados em aplicações de análise de caracterização dos materiais biológicos neles contidos, bem como em aplicações em engenharia de tecidos, de acordo com, respectivamente, as reivindicações 13 e 14.

Descrição geral da invenção

A presente invenção diz respeito a um processo de deposição de biomateriais em substratos com elevada repelência a líquidos padronizados com zonas molháveis que permitem a produção de chips de matrizes de materiais e meios biológicos. Os volumes líquidos são confinados em determinadas regiões devido aos fortes contrastes de tensão superficial existente entre as diferentes regiões definidas no substrato, permitindo assim depositar de forma independente, rigorosa e controlada os biomateriais, materiais biológicos, agentes bioactivos e meios de cultura desejáveis. 1. Substratos

No âmbito da presente invenção, as superfícies utilizadas como substrato para a deposição dos biomateriais devem apresentar ângulos de contacto com a água (WCA) superiores a 110°, mais particularmente 150°. Estes ângulos de contacto permitem que os materiais fiquem restritos à zona molhável da plataforma devido ao contraste de tensão superficial com a zona repelente a água, que exerce uma força contrária à força gravítica que permitiria que a gota se espalhasse na zona circundante à zona molhável.

Os materiais para a preparação de substratos repelentes a líquidos podem ser baseados em polímeros, naturais ou sintéticos, metais, materiais inorgânicos ou combinação entre eles. Depois de processados, os substratos podem sofrer tratamentos subsequentes utilizando processos químicos, físicos, mecânicos ou processos que envolvam a combinação destes.

As superfícies que apresentam ângulos de contacto acima de 150° são designadas por super-hidrofóbicas e devem apresentar topografia exibindo rugosidade à micro- e nano-escalas .

0 substrato repelente a líquidos pode apresentar qualquer geometria, incluindo a de um polígono regular e irregular, circular ou elipsoidal, sendo as mais comuns as formas em quadrados, círculos ou rectângulos. A variabilidade geométrica permite que se realize manipulações no substrato e materiais depositados destruição ou modificação dos mesmos, uma vez que assim podem ser introduzidos em equipamentos com diferentes geometrias e dimensões.

No âmbito da presente invenção, qualquer superfície repelente a líquidos poderá ser utilizada, desde que não interfira com as propriedades químicas da formulação líquida. São preferíveis as superfícies que sejam o mais inerte possível do ponto de visto biológico, de forma a evitar interacções com os materiais. Tal inclui superfícies compostas por poliolefinas tratadas de modo a haver um aumento de micro- e nano-rugosidade, bem como vidros e cerâmicos tratados com moléculas hidrofóbicas ou com revestimentos com elevado teor de carbono, como por exemplo, nanotubos de carbono.

A preparação das superfícies de elevada repelência a líquidos, nomeadamente super-hidrofóbicas, é realizada através de técnicas conhecidas (14-15). Neste sentido, duas abordagens têm sido exploradas: (i) produção de materiais com superfícies com estrutura de textura controlada e (ii) produção de materiais com superfícies de estrutura aleatória.

Nas primeiras, as características rugosas são definidas utilizando técnicas como a litografia ou microfabricação . No caso dos materiais com uma estrutura de superfície aleatória, é possível recorrer-se a uma grande variedade de metodologias, incluindo processos envolvendo modificações físicas e químicas de superfícies de modo a obter superfícies com rugosidade. Exemplos de modificações químicas e físicas para conseguir rugosidade incluem o revestimento de camadas de fluoropolímeros , deposição de nanotubos de carbono, separação de fases, crescimento de cristais, agregação de partículas, deposição de vapor, sublimação e "electrospinning" .

Em particular, metodologias simples baseadas em separação de fases podem ser utilizadas para modificar polímeros sintéticos em substratos com elevada repelência a líquidos. Numa realização preferencial da presente invenção o tratamento das superfícies é efectuado de modo a aumentar a sua micro- e nano-rugosidade. Esta característica permite que, caso seja desejável, não ocorra subtancial indução da citotoxicidade das superfícies. Para aumentar a sua hidrofobicidade, estas podem ser imergidas em soluções fluoradas ou com outras moléculas que induzam uma ma hidrofobicidade .

2. Tratamento e padronização do substrato

No âmbito da presente invenção, os materiais biológicos e/ou combinações de materiais biológicos e meios de cultura são depositados em regiões determinadas e tratadas de superfícies repelentes a água anteriormente descritas, tirando partido das diferenças da energia superficial existentes entre as regiões dessa superfície.

Neste sentido, é necessário realizar o tratamento das superfícies de forma a criar as referidas diferenças de tensão superficial ou seja, é necessário padronizar o substrato. Desta forma, a deposição de diferentes combinações de formulações líquidas, contendo os biomateriais de interesse, é efectuada nas regiões hidrofíliças do substrato repelente. O forte contraste entre a tensão de superficial das regiões molháveis e das regiões repelentes da plataforma impedem qualquer vazamento dos líquidos para fora das regiões molháveis.

Para a modificação da energia superficial de superfícies existem técnicas que permitem a deposição de moléculas hidrofóbicas, incluindo a auto-organização de monocamadas de alcanotiois, silanos orgânicos e ácidos gordos.

Os substratos com elevada repelência a líquidos ou super- hidrofóbicos podem ser padronizados utilizando várias técnicas de tratamento superficial, como já foi descrito anteriormente noutros trabalhos (16-17). Nesta invenção as regiões molháveis são preferencialmente obtidas utilizando radiação UVO ou por plasma. Alternativamente, ainda considerando outras técnicas de modificação superficial, poderão ser usados métodos como tratamento Corona ou deposição física de vapor. Desta forma, regiões são obtidas através da colocação de máscaras poliméricas ou metálicas com regiões geometricamente vazias/abertas. A máscara protege unicamente as regiões da superfície repelente seleccionadas e assim as regiões expostas da parte aberta da máscara são as que sofrem tratamento superficial.

Em alternativa, a obtenção de substratos padronizados, no âmbito da presente invenção, realiza-se através da protecção de regiões do substrato, que se pretende que sejam molháveis, com fita adesiva. De seguida executa-se o procedimento de tratamento de superfície para aumentar a hidrofobicidade, para transformar as regiões não protegidas em superfície repelente.

As regiões protegidas mantêm a molhabilidade do substrato não tratado. No caso da superfície a ser tratada ser transparente a vantagem desta metodologia é a de se obter regiões modificadas transparentes, o que pode ser relevante em técnicas de análise de imagem.

As regiões molháveis podem acomodar volumes de líquidos devido ao contraste de molhabilidade com as regiões envolventes do substrato .

3. Deposição de biomateriais

De acordo com o processo da presente invenção, os biomateriais encontram-se em solução ou em suspensão num meio líquido que é depositado na superfície do substrato tratado e padronizado.

Diferentes combinações de formulações líquidas podem ser depositadas em diferentes regiões hidrofíliças , definidas pelo tratamento e padronização referidos anteriormente, do substrato.

O forte contraste entre a tensão de superficial das regiões molháveis hidrofílicas e das regiões repelentes hidrofóbicas do substrato tratado impedem qualquer vazamento e mistura dos líquidos, contendo as soluções ou suspensões dos biomateriais , para fora das regiões molháveis.

Gotas de formulação líquida são depositadas sobre as regiões hidrofílicas ou super-hidrofíliças do substrato tratado.

As regiões hidrofílicas ou superhidrofíliças , também chamadas de zonas ou regiões molháveis, são zonas de superfície que apresentam ângulos de contacto com água de 0° a 80°, preferencialmente inferiores a 50°.

A deposição das gotas pode ser feita utilizando métodos conhecidos no estado da arte, incluindo dispersão, atomização, deposição electrostática, por pipetagem, tecnologia jacto-tinta ou outro tipo de tecnologias que possam gerar gotas líquidas.

No âmbito da presente invenção, os biomateriais a serem utilizados devem ser dissolvidos ou suspensos em soluções de base aquosas.

Neste sentido, os biomateriais compreendem proteínas, polissacarídeos , ácidos nucleicos e polímeros sintéticos, incluindo poliésteres ou derivados, bem como combinações dos referidos biomateriais.

Exemplos de poliésteres são policaprolactona .

Os biomateriais encontram-se solubilizados ou dispersos em soluções de base aquosa, como por exemplo, na forma de emulsão. Também podem ser usados outros solventes menos convencionais, tais como os líquidos iónicos, que permitem dissolver substâncias tais como celulose, seda ou quitina. Tal como com as soluções aquosas, neste caso poderão também ser depositadas suspensões e soluções saturadas. Exemplos de líquidos iónicos são baseados em 1-alquilimidazole e l-butil-3-metilmidazol e 1-butil- 3-metilimidazólio .

Nesse sentido, encontram-se compreendidas no âmbito da presente invenção soluções de qualquer polímero natural ou sintético, combinado com moléculas de baixo ou alto peso molecular, como genes, ácidos nucleicos, péptidos, fármacos e factores de cresimento, que se encontre solubilizado ou suspendido em soluções de base aquosa, com gamas de pH compreendidos entre 2 e 10, ou em líquidos iónicos.

Exemplos de soluções são soluções de quitosano numa gama de concentrações compreendida entre 0.5% e 4% (massa/volume) em ácido acético dissolvido em água a concentração 1% (volume/volume) poderão ser dispensadas nas zonas molháveis da plataforma através de pipetagem. Podem depois ser obtidas estruturas porosas através de liofilização de toda a estrutura.

A forma e a extensão de dispersão do líquido confinado nas regiões hidrofílicas/ super-hidrofílicas dependem do volume do líquido depositado e da molhabilidade da região. Desta forma, a presente invenção possibilita a deposição de volumes com um volume superior ao do cubo da dimensão característica da região, devido ao forte contraste da tensão de superfície do substrato tratado .

O controlo da altura dos biomateriais depositados permite trabalhar mais uma variável espacial em relação aos substratos do estado da técnica: o substrato tratado, de acordo com a presente invenção, possibilita obter um controlo estrutural dos biomateriais .

Assim, é possível, por exemplo, conceber estruturas porosas que sejam compatíveis com migração e proliferação celulares. Neste caso, cada poro deve ter, no mínimo, 100 μπι de diâmetro, com um número de poros significativo em relação ao volume da própria estrutura .

Além disso, a possibilidade do controlo da altura da estrutura permite o estudo de interfaces entre biomateriais dispostos em camadas, das quais a altura e composição poderão variar. Note-se também que as células na maioria dos tecidos humanos estão em ambientes tridimensionais (matriz extra-celular) onde a razão entre a largura, comprimento e altura em geral é semelhante. Tal não acontece nos substratos do estado da técnica, uma vez que, mesmo quando os materiais depositados são considerados tridimensionais, a sua altura é geralmente muito inferior relativamente às dimensões do material em contacto directo com o substrato (largura e comprimento) .

O volume das gotas pode variar entre 0.5 μΐι e 15 L, dependendo do tamanho das regiões molháveis. Experimentalmente concluiu-se que são estes valores que correspondem aos mínimos e máximos para as dimensões das regiões molháveis consideradas para a presente invenção (200 μπι-3ιηιη) .

Estes valores são reduzidos o suficiente para que a aplicação possa ter vantagens em termos de espaço e quantidade de material usado em relação aos métodos convencionais, como processamento dos materiais em placas de poços comerciais. No entanto, são volumes suficientemente elevados para que se possa controlar estruturalmente as amostras em termos de porosidade ou altura representativa em relação às regiões molháveis.

0 tamanho das regiões molháveis pode ser dimensionado de forma intermédia, entre as dimensões dos materiais obtidos através das técnicas descritas no estado da arte referente ao fabrico de micrõmatrizes, e a dimensão dos poços das placas de cultura celular comerciais geralmente usadas para análise individual de biomateriais .

Desta forma, os substratos da presente invenção podem ser utilizados em aplicações mais vastas que os substratos modificados existentes no estado da arte ou que as placas de cultura comercialmente disponíveis.

As dimensões das regiões molháveis entre 200μπι e 3mm, e de preferência entre 400 m e 1.5mm, poderão simultaneamente permitir obter-se substratos com um elevado número de biomateriais depositados e conseguir-se manipular, analisar e caracterizar individualmente as diferentes regiões. A margem espacial entre cada região molhável deverá ser superior a 500μπι e inferior a 3mm, visto que permite uma eficiente separação dos materiais, evitando a sua junção devido a afinidade electrostática ou alguma inclinação decorrente do manuseamento do substrato.

O contraste de molhabilidades entre as regiões molháveis e as zonas repelentes permite um manuseamento das superfícies ou substratos tratados, incluindo a sua inclinação, sem que haja misturas dos elementos depositados nas regiões molháveis.

Os biomateriais existentes nas porções liquidas aderem à superfície nas regiões molháveis por adsorção, evaporação/ separação do líquido do solvente, reticulação ou através de outro método que induza a insolubilidade. . Produtos ou artigos obtidos

Os produtos ou artigos da presente invenção resultam da deposição dos biomateriais nas zonas molháveis dos subtratos tratados de acordo com a presente invenção. 4.1 Materiais bidimensionais

Numa perspectiva de análise bidimensional, filmes de biomateriais podem ser obtidos pela deposição sucessiva de polielectólitos , pela técnica conhecida por "layer-by-layer" (LbL) ou camada sobre camada, à superfície dos substratos tratados de acordo com a presente invenção.

A tecnologia LbL permite produzir revestimentos nano- estruturados utilizando poli-electrólitos com cargas opostas (negativas e positivas) . Para tal é feita uma deposição sequencial de soluções de poli-electrólitos com cargas opostas intercaladas por lavagem com uma solução de base aquosa, por exemplo uma solução de 0.1M de NaCl em água destilada. No final, são obtidos filmes de biomateriais insolúveis em água, ligados meramente por interacções electrostáticas, sem recurso a outros compostos .

No âmbito da presente encontra-se prevista a deposição de suspensões celulares em filmes e revestimentos produzidos por diferentes combinações de polímeros, especialmente polissacarídeos (incluindo quitosano, ácido hialurónico, heparina, alginato ou sulfato de condroitina) .

Desta forma, e de acordo com a presente invenção, é possível efectuar a deposição de diferentes polieletrólitos em multicamadas com diferentes espessuras sendo possível realizar- se numerosas possibilidades de combinações de materiais, número de multicamadas e variáveis de processamento (por exemplo, força iónica, pH, concentração de polieletrólitos, reticulação posterior do filme obtido) .

No que diz respeito aos materiais depositados bidimensionalmente sobre os substratos tratados, a presente invenção prevê a deposição de biomateriais de diferentes origins, como por exemplo, biomateriais compósitos resultantes de combinações de polímeros com fases inorgânicas ou metálicas (como nanopartícuias ) .

Assim, é possível efectuar a deposição de líquidos contendo os dois elementos nas regiões molháveis da plataforma e procedendo à solidificação do nanocompósito (por exemplo, por evaporação ou sublimação do solvente) e, se necessário, a mais algum tratamento (por exemplo, reticulação ou neutralização) .

Para além de sistemas macromoleculares , a deposição de outros materiais encontram-se previstos no âmbito da presente invenção, como por exemplo materiais de interesse no estudo da resposta celular. Por exemplo, péptidos, enzimas, moléculas poliméricas de baixo peso molecular auto-organizáveis (resultando em hidrogéis de baixo peso molecular) , e combinações entre estruturas de baixo peso molecular poderão ser depositados em forma de solução/precipitado nas regiões hidrofílicas, seguidos da deposição de suspensões celulares.

A deposição de anticorpos nas regiões molháveis (por exemplo, por ligação covalente à plataforma) para investigar a adesão de diferentes tipos celulares poderá também ser realizadas utilizando diferentes combinações de anticorpos e tipos celulares .

4.2 Materiais tridimensionais

Além das interacções em ambiente bidimensional como as descritas anteriormente entre células e proteínas pré-adsorvidas ou filmes bidimensionais, no âmbito do desenvolvimento de biomateriais poderá também ser desejável o estudo de materiais em forma tridimensional, visto que estes mimetizam com mais rigor o ambiente nas quais as células se encontram em condições fisiológicas: a matriz extra-celular . A deposição de biomateriais nas regiões molháveis do substrato, de acordo com a presente invenção, pode ser feita de forma a que após o seu processamento os biomateriais finais adquiriram uma configuração tridimensional, incluindo estruturas porosas ou hidrogéis adequadas para engenharia de tecidos e cultura celular, através de técnicas, como por exemplo, liofilização, lixiviação de partículas ou reticulação.

As construções tridimensionais ficam mecanicamente restritas na região hidrofílica/ superhidrofílica do substrato devido à elevada repelência a líquidos das regiões circundantes. Pretende-se que após este processamento os biomateriais sejam testados para aplicações em engenharia de tecidos, desenvolvimento de implantes biodegradáveis e não biodegradáveis, libertação de agentes bioactivos e revestimentos de materiais para implante.

A aplicação das superfícies tratadas de acordo com a presente invenção, no estudo de adesão de proteínas e correspondente resposta celular, a aplicação relaciona-se com a modificação superficial de biomateriais. Quando um material é implantado, a primeira reacção ocorrente é a adsorção de proteínas à superfície do material, às quais posteriormente as células se ligarão através das integrinas presentes na sua membrana celular, que poderão reconhecer domínios peptídicos das proteínas adsorvidas. Assim, o pré-tratamento de biomateriais bidimensionais ou tridimensionais com proteínas com domínios de adesão celular (como a fibronectina humana (HFN) ) é um meio de aumentar a afinidade de um biomaterial com as células circundantes, potenciando uma mais fácil e eficiente formação de tecido. Pelo contrário, poderá ser desejada em alguns tipos de biomateriais, como enxertos vasculares, a baixa adesão de células relacionadas com a coagulação sanguínea (como plaquetas). Nesse caso, poderão ser efectuados estudos de adsorção de proteínas ou outras moléculas que potenciem a baixa adesão desses tipos celulares.

Estruturas porosas

Estruturas porosas para engenharia de tecidos ou cultura celular são biomateriais onde se induz porosidade. Os poros deverão estar interconectados e ter dimensão suficiente (diâmetro superior a 100 μιτι) , de modo a permitir a migração e proliferação celular dentro da estrutura.

No caso de estruturas porosas, soluções de base aquosa com precursores monoméricos ou poliméricos podem ser depositados em regiões hidrofílicas/superhidrofíliças em volumes que variam entre 0.5 μΐ. e 15 pL. Estas estruturas podem ser obtidas por diversos métodos, entre os quais liofilização e reticulação, usando combinações de polímeros naturais ou sintéticos em solução, incluindo polissacarídeos , poliésteres e proteínas.

0 primeiro contacto das células em ambiente fisiológico com um biomaterial dá-se com a sua superfície. No entanto, nem sempre existe um equilíbrio entre as propriedades estruturais do biomaterial implantável e das suas propriedades de superfície. Assim, de modo a obter o efeito desejado no comportamento celular, realizam-se opcionalmente tratamentos superficiais por adsorção de proteínas, ligação química de grupos químicos favoráveis ou inibidores de adesão celular, tratamentos físicos para indução de topografia desejada, entre outros.

Tratamentos posteriores às estruturas poliméricas porosas podem ser conseguidos através da introdução de outros volumes líquidos em cada uma das estruturas, como, por exemplo, através da adsorção de proteínas em solução. Nestes tratamentos pretende- se, em geral, a inserção de domínios peptídicos de adesão celular ou a modificação química ou topográfica para o aumento da adesão, proliferação ou algum tipo especifico de resposta celular .

Outros métodos para obter porosidade nas estruturas poliméricas, além da liofilização, poderão passar pela introdução de partículas lixiviáveis na formulação inicial. Partículas inorgânicas (por exemplo, de cloreto de sódio ou açúcar) ou poliméricas (por exemplo, de poli (caprolactona) ) com gamas de tamanho de poro poderão ser introduzidas em formulações poliméricas. Durante a imersão do substrato em solventes específicos para as partículas (por exemplo água no caso das partículas de cloreto de sódio ou açúcar) estas são removidas restando apenas a fracção polimérica insolúvel, que apresentará no final uma estrutura tridimensional porosa. O tamanho e quantidade de poros são controlados pela dimensão e quantidade de partículas que serão lixiviadas.

Num outro aspecto da presente invenção, podem ser também depositadas soluções de polissacarídeos ou outros polímeros metacrilatados (por exemplo, quitosano ou dextrano) nos padrões hidrofílicos/ superhidrofílicos, que são depois reticulados e fixados por radiação ultravioleta. Este método de processamento de biomateriais permite uma maior compatibilidade com encapsulamento celular, ausência de produtos tóxicos apresentada, por exemplo, pela maioria dos reticulantes químicos, e ainda maior reproducibilidade e rapidez para obter os biomateriais na sua forma final.

4.2.2 Hidrogéis

Hidrogeis são materiais constituídos por cadeias poliméricas hidrofíliças, que quando reticuladas formam uma rede com elevada capacidade de absorção de água. Biomateriais sob a forma de hidrogel podem ser preparados usando métodos de reticulação química e física. Nesta invenção, a obtenção dos hidrogéis realiza-se preferencialmente após a deposição do precursor monomérico/ polimérico no padrão hidrofilico/ superhidrofilico do substrato, à semelhança do descrito anteriormente para as estruturas porosas. A deposição é seguida da reticulação da solução monomérica/ polimérica. Estas estruturas são úteis no desenvolvimento de biomateriais implantáveis e libertação de agentes activos.

São conhecidos vários métodos de para a obtenção de hidrogéis, entre os quais reticulação obtida por acção de agentes químicos que levam à formação de grupos ligados covalentemente, exposição a radiação ultravioleta de polímeros modificados com grupos metacrilato, gelificação iónica ou reticulação por variação de temperatura .

Como exemplo de hidrogéis são os hidrogéis de alginato usando soluções de ácido alginico em água em gamas de concentração de 1% a 3%, reticuladas iónicamente com diversas concentrações de cloreto de cálcio em concentrações de 1 M a 10 M.

Os hidrogéis depositados podem também conter células encapsuladas, ou seja, células podem estar contidas no precursor polimérico ou monomérico dos hidrogéis antes do seu processamento. Nesse caso é necessário utilizar formas de reticulação que mantenham a viabilidade celular, como é o caso de reticulação de polímeros metacrilatados , como por exemplo no caso de polissacarídeos como quitosano, alginato, ácido hialurónico ou dextrano, por exposição a radiação ultravioleta ou visível. Outra possibilidade compatível com o encapsulamento celular é a gelificação iónica, que pode ser obtida, por exemplo, reticulando alginato com iões cálcio. Também materiais que gelificam perante variações de temperatura, por exemplo à base de gelatina, podem ser usados em aplicações envolvendo encapsulamento celular. As propriedades mecânicas dos hidrogéis e a sua capacidade de adsorção de água podem ser controladas variando o tempo de exposição ao reticulante ou a quantidade/intensidade do mesmo em cada uma das regiões hidrofilicas/super-hidrofilicas .

É possível misturar-se distintos polímeros na mesma região hidrofílica/super-hidrofílica, incluindo polímeros de origem natural e polímeros sintéticos.

Em cada região molhável poderão também ser depositados mais do que um polímero sequencialmente, de modo a que não haja mistura entre polímeros, resultando em camadas de biomateriais na mesma região molhável.

No caso de hidrogéis, as estruturas com mais de um polímero poderão ser obtidas, por exemplo, em forma de redes semi- interpenetradas ou redes interpenetradas.

0 processo da presente invenção tem aplicação na análise dos biomateriais depositados nos substratos tratados e padronizados e, em termos gerais, essa análise pode ser classificada em dois tipos: análise físico-química e análise da resposta biológica. Em ambos os casos, modificações ou adaptações nos equipamentos originalmente preparados para análise de amostras individuais poderão ser necessárias. Preferencialmente, as amostras deverão ser analisadas na plataforma, sem que a sua remoção e destruição sejam necessárias.

4.3. Análise dos biomateriais

Quanto à análise físico-química dos biomateriais, no caso de estruturas porosas tridimensionais, a análise morfológica e quantificação de porosidade pode ser conseguida usando distintos métodos de análise estrutural, incluindo a microscopia electrónica de varrimento e microtomografia computorizada. Para uma análise mecânica dos elementos depositados na plataforma podem-se utilizar métodos como ensaios de compressão estáticos, nanoindentação e microindentação . O comportamento viscoelástico das amostras pode ser analisado por análise mecânica dinâmica, quer em condições a seco, como em situações em que a amostra está imersa num meio liquido adequado.

Também para estruturas porosas e hidrogéis, a composição química e distribuição dos materiais na estrutura são factores determinantes para o comportamento celular. Para uma análise da composição atómica das estruturas, pode usar-se, por exemplo, a dispersão de energia de raios-X.

Para um mapeamento e caracterização química das estruturas sem recurso à destruição da plataforma, uma possibilidade é o uso de espectroscopia da transformada de Fourier de infravermelhos em modo microscópico. Neste equipamento, a plataforma é colocada numa mesa com movimentos possíveis nos eixos xyz, e um feixe de infravermelhos é incidido na amostra. O feixe transmitido é depois analisado e pode aceder-se ao tipo de ligações químicas existentes na porção analisada da estrutura, representadas pela intensidade de picos de transmissão de infravermelhos.

Para a análise do desempenho biológico dos biomateriais , duas possibilidades podem ser consideradas. No caso das estruturas porosas, as células são depositadas em cima do biomaterial processado no seu estado final na plataforma, em cada um dos padrões hidrofílicos/super-hidrofílicos . No caso dos hidrogéis, o mesmo procedimento pode ser realizado, ou as células podem ser directamente encapsuladas no hidrogel durante o seu processamento sobre a plataforma. ^"

Para averiguar a citocompatibilidade dos materiais, tal como a sua capacidade de suportar proliferação e migração celular, linhas celulares podem ser utilizadas, como por exemplo as linhas pré-osteoblástica SaOs-2, fibroblástica L929 ou condral

MTDC5.

Para uma aproximação ao comportamento real dos biomateriais em contacto com células e tecidos, linhas primárias ou estaminais podem ser utilizadas, assim como co-culturas.

O processo da presente invenção possibilita também a utilização mais de um tipo de células em contacto com cada um dos materiais depositados na plataforma, caso os biomateriais sejam constituídos por camadas de materiais distintos.

No contexto desta invenção, a análise do comportamento celular será preferencialmente feita através de técnicas baseadas em tratamento de imagem, de modo a evitar a destruição da plataforma e para que a automatização das aquisição de imagem permita uma análise rápida dos resultados.

Para uma análise preliminar da viabilidade, actividade metabólica e proliferação das células, técnicas como marcação com Calceina AM e " 4 ' , 6-diamidino-2-phenylindole" (DAPI) podem ser usadas em amostras bidimensionais e tridimensionais. Como controlos, quantificação de "3- (4 , 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5- diphenyltetrazolium bzomi.de)" (MTT) ou "3- (4, 5-dimethylthiazol- 2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H

tetrazolium" (MTS) reduzido/Alamar Blue e dsDNA, respectivamente, podem ser efectuados. Enquanto no estudo de viabilidade/actividade metabólica as células devem ser analisadas vivas, no estudo de proliferação, estas podem ser analisadas vivas ou fixadas. A morfologia das células pode ser estudada através de microscopia electrónica de varrimento ou microscopia confocal.

Numa análise de diferenciação, tomando como exemplo a diferenciação osteogénica (não estando, no entanto, a invenção apenas restrita a este tipo de diferenciação) , após 21 dias ou mais de cultura celular, a análise de marcadores osteogénicos poderá ser efectuada através de imunofluorescência . Marcadores como colagénio tipo I, osteocalcina e fosfatase alcalina podem ser estudados.

Estudos de coloração para a procura de marcas fenotipicas de diferenciação, como cálcio (usando vermelho de Alizarina) e fosfatos (corante de Van Kossa) poderão também ser utilizados e os resultados observados por microscopia óptica, sem que seja necessária a remoção das estruturas de biomateriais do substrato da invenção.

Evitando a imersão da totalidade do substrato num poço com meio de cultura, pode também ser possível o estudo de diferentes meios de cultura, nomeadamente meios com diferentes aditivos como fármacos, moléculas tóxicas ou proteínas, em cada estrutura independente da plataforma. É também possível variar com o tempo o ambiente biológico em contacto os biomateriais através da aspiração/reposição de meios de culturas distintos nas estruturas bidimensionais ou tridimensionais. Os estudos posteriores serão os mesmos dos que foram indicados anteriormente .

Breve descrição das figuras

Figura 1. Imagem representativa de SEM para superfícies de poliestireno lisas (A) e rugosas com extrema repelência a líquidos (B) .

A micro- e nano-estrutura das superfícies super-hidrofóbicas foi obtida através da metodologia de separação de fases que consiste em dissolver o polímero com o solvente tetrahidrofurano, misturando posteriormente a solução obtida com um não-solvente (etanol) para forçar a precipitação do polímero. A precipitação do poliestireno leva a formação da superfície rugosa através da formação de núcleos que provocam a diminuição da tensão superficial .

Figura 2. (A) Representação esquemática sequencial usada para produzir substratos com extrema repelência a líquidos, padronizados com regiões molháveis para serem aplicados em testes de interacção entre células e proteínas. (B) Gotas de água com diferentes volumes desde 2 pL até 8 L confinadas nas regiões molháveis produzidas por diferentes tempos de radiação UV/Ozono (UVO) desde 1 até 12 minutos.

As superfícies repelentes a líquidos padronizadas com regiões molháveis foram produzidas usando máscaras com l x l mm ² com espaços abertos (Figura 2A) . A forma e a dispersão dos líquidos confinados nas regiões molháveis dependem do volume do líquido depositado e da molhabilidade . A Figura 2B mostra que para regiões com a mesma molhabilidade utilizando volumes superiores a 6 pL, os líquidos mantêm-se confinados nas zonas molháveis devido à forte diferença de tensão superficial com as zonas repelentes circundantes.

Figura 3. (A) Medição dos ângulos de contacto da evolução da molhabilidade em função do tempo de irradiação UVO para superfícies de poliestireno lisas e rugosas. As imagens mostram gotas de água em cima da superfície rugosa (esquerda) e lisa

(direita) em três níveis diferentes de exposição a radiação UVO.

(B) Espectro XPS Cls da superfície superhidrofóbica (espectro em cima) sem exposição a radiação UVO e da mesma superfície após 12 minutos de exposição a radiação UVO (espectro em baixo) .

A modificação da molhabilidade da superfície foi adquirida através da exposição da superfície a radiações UV/Ozono (UVO) . O espectro da superfície rugosa é dividido em dois picos que correspondem a grupos C-H e C-0 que estão centrados em 285.01 eV e 286.30 eV. Após 12 minutos de radiação UVO, são detectados mais dois grupos hidrofílicos C=0 e 0-C=0 que correspondem aos picos 287.90 eV e 289.26 eV, respectivamente. Os resultados são consistentes com as modificações fotoquimicas dos grupos -CH ₃ das superfícies rugosas em grupos CHO, COOH e OH. A topografia das superfícies rugosas observadas por SEM (Figura 1B) não apresenta mudanças com a irradiação UVO. Contudo, as mudanças observadas nos ângulos de contacto (Figura 3A) são o resultado do aumento da hidrofilicidade do material durante a exposição UVO, devido à introdução dos grupos que contêm oxigénio na superfície.

Figura 4. Adsorção de albumina de soro humano, HSA (A) e fibronectina de plasma humano, HFN (B) após 2 horas de incubação em soluções com diferentes concentrações de proteína. Os diferentes símbolos são definidos em função do tempo da irradiação UVO. Os símbolos abertos correspondem às superfícies rugosas, e os símbolos preenchidos correspondem à superfície de polímero convencional que serve de controlo (superfície sem tratamento) . A adsorção cinética a 37° da HSA (C) e da HFN (D) nas superfícies rugosas após 6 minutos de radiação UVO usando soluções com diferentes concentrações de proteínas.

Os resultados indicam que existe uma grande quantidade de proteína adsorvida nos primeiros 30 minutos, seguindo uma adsorção muito estável até as duas horas de contacto. A adsorção de proteínas no poliestireno convencional apresenta bastantes semelhanças com o poliestireno rugoso para o mesmo ângulo de contacto (após 3 minutos) , mostrando que a topografia das superfícies com a mesma molhabilidade não apresenta influência significativa na adsorção de proteína. Para superfícies com extremas molhabilidades , a quantidade de proteína adsorvida é maior para superfícies que apresentam maior repelência a líquidos, mostrando que nas superfícies completamente molháveis ( super-hidrofíliças ) a adsorção de proteína é escassa.

Figura 5. (A) Imagem obtida por microscopia de fluorescência da superfície com extrema repelência a líquidos padronizada com regiões molháveis, onde 4 L de soluções de (Ai) HSA e (Aii) de HFN com diferentes concentrações (eixo vertical) foram depositadas durante diferentes tempos de adsorção (eixo horizontal) . (Aiii) Diferentes combinações de HSA e HFN foram depositadas nas regiões molháveis das superfícies repelentes a líquidos onde diferentes quantidades relativas (eixo vertical) e diferentes concentrações de proteína (eixo horizontal) foram utilizadas. (Bi) Imagem obtida pelo microscópio de confocal de células SaOs-2 cultivadas durante 4 horas nas regiões molháveis da plataforma com diferentes quantidades de proteínas pré- adsorvidas (equivalente à micro-matriz Aiii) . (Bii) Representação do mapa de intensidade para o número de células em cada região molhável que corresponde à mesma matriz testada com diferentes concentrações de proteína. Escala: 500 μιη.

Foram depositadas diferentes soluções com diferentes quantidades relativas e concentrações de HSA/HFN. A amostra relativa ao substrato tratado contendo deposição de proteína pré-adsorvida foi lavada com solução tampão com pH fisiológico e observada no microscópio de fluorescência. A coluna de controlo foi analisada sem proteína pré-adsorvida onde diferentes números de células foram depositadas . O número de células fixadas em cada ponto é maior para maiores quantidades de HFN pré-adsorvida, ou em superfícies onde a quantidade relativa de HFN no rácio HFN/HSA é maior .

Diferentes biomateriais poliméricos foram igualmente testados utilizando volumes distintos de soluções nas regiões molháveis da superfície repelente (Figura 2B) . Esta plataforma pode ser integrada em testes que envolvem uma grande quantidade de substâncias para serem testadas sob distintas condições biológicas .

Descrição detalhada da invenção

1. Tratamento e padronização das superfícies repelentes a água No âmbito da presente invenção superfícies super-hidrofóbicas são tratadas e padronizadas de forma a se obter na mesma superfície regiões com diferentes tensões de superfície.

A padronização das superfícies com elevada repelência a água com regiões molháveis é realizada pela configuração de uma máscara, sobre o substrato super-hidrofóbico, que apresenta zonas abertas, para a exposição ao tratamento da superfície do substrato seleccionado e definição de zonas com diferentes tensões superficiais através de irradiação UVO ou plasmas.

O tempo de exposição de radiação UVO varia normalmente entre os 0 e 14 minutos.

A modificação superficial pode ser igualmente realizada com plasma de Árgon, a uma potência de 30 e pressão de 0.2 mbar, variando o tempo de exposição de cada secção da superfície entre 0 a 150 segundos

As máscaras aplicadas definem diferentes dimensões e formas geométricas, sendo as referidas dimensões e formas desenhadas através da colocação de fita adesiva ou outra película resistente ao tratamento para o aumento da hidrofobicidade nas zonas a proteger, i.e. nas zonas não sujeitas a tratamento.

As regiões definidas pela máscara têm preferencialmente uma dimensão entre 200 μπι-3πιπι, mais preferencialmente entre 400pm e 1.5mm ou ainda mais preferencialmente entre 0.5-1 mm.

2. Preparação dos biomateriais

São preparadas soluções ou suspensões preferencialmente de base aquosa de biomateriais que podem incluir proteínas, polissacarídeos e polímeros e/ou combinações destes. 3. Deposição dos biomateriais

Gotas de solução ou suspensão de biomateriais com dimensões entre 5 pL e 15 ]i são depositadas nas regiões molháveis, através, por exemplo de micropipetagem ou outra técnica conhecida que permita gerar e depositar gotas liquidas sobre uma superfície.

Para a obtenção de filmes bidimensionais, a deposição dos biomateriais pode ser efectuada por técnica LbL.

Noutra realização preferencial da invenção, os biomateriais depositados no substrato são tratados através de técnicas de liofilização, lixiviação ou reticulação.

Após o tratamento para a obtenção da sua forma final, o material depositado sobre o substrato tratado é em seguida imerso preferencialmente em meio de cultura celular, em atmosfera com baixo CO ₂ , a temperaturas entre 30 e 40°C, mais preferencialmente entre 35 e 38°C e ainda mais preferencialmente a +/- 37°C, numa atmosfera contendo menos de 15% de CO ₂ , preferencialmente menos de 10% de CO ₂ e ainda mais preferencialmente menos de 5% de CO ₂ .

Opcionalmente, o material biológico é fixado através de adição/exposição a um solvente orgânico (como por exemplo formaldeido ou glutaraldeído) e/ou corados com material adequado ao produto biológico em questão, para seguimento e identificação do mesmo.

4. Caracterização dos produtos ou artigos obtidos

De acordo com o processo da presente invenção são obtidos produtos com estrutura bidimensional, resultado do depósito de biomateriais sobre substratos tratados de acordo com a presente invenção, usando por exemplo uma micropipeta.

Numa realização preferencial da invenção os produtos com estrutura biodimensional incluem filmes obtidos por evaporação de solvente ou por LbL.

Noutro aspecto da presente invenção, são obtidos produtos com estrutura tridimensional, porosa ou hidrogéis, através de técnicas de liofilização, lixiviação ou reticulação.

Numa realização preferencial da invenção, os hidrogéis compreendem o biomaterial encapsulado, como por exemplo células encapsuladas.

Noutra realização preferencial da invenção, os hidrogéis compreendem agentes bioactivos encapsulados, como por exemplo fármacos, factores de crescimento, ácidos nucleicos, péptidos ou genes.

Numa outra realização preferencial da invenção, os produtos porosos incluem agentes bioactivos misturados com o precursor do biomaterial antes do seu processamento que lhe confere a porosidade. Os agentes bioactivos poderão também ser imobilizados ou adsorvidos após o processamento do biomaterial como estrutura porosa. Estão incluídos agentes bioactivos como por exemplo factores de crescimento, fármacos, péptidos ou proteínas. Preferencialmente, suspensões com células deverão ser depositadas sobre os produtos porosos após o seu processamento final .

5. Aplicação dos produtos ou artigos

Os substratos tratados de acordo com o processo da presente invenção, têm aplicações em áreas de de desenvolvimento de biomateriais, uma vez que possibilitam a deposição de diferentes combinações de biomateriais e meios líquidos.

Em particular, os substratos tratados da presente invenção são especialmente úteis em aplicações que exijam combinações de biomateriais e meios de cultura.

Desta forma, e devido às diferentes combinações entre biomateriais e distintos meios em que se encontram em solução ou suspensão, quando depositados nos substratos tratados de acordo com a presente invenção, apresentam características que os diferenciam dos produtos ou artigos compreendidos no estado da técnica, que apenas incluem combinações individuais de um biomaterial com um meio de cultura aplicados à superfície do substrato .

Numa aplicação preferencial dos produtos da presente invenção, inclui-se a utilização para análise rápida e expedita de propriedades químicas, físicas ou biológicas dos materiais.

Noutra aplicação preferencial da presente invenção, inclui-se a aplicação em bioengenharia . Em particular, numa aplicação ainda mais preferencial da presente invenção, inclui-se o desenvolvimento de biomateriais implantáveis ou materiais de libertação de agentes activos.

Exemplos

Exemplo 1 - Obtenção de superfícies super-hidrofóbicas

No âmbito da presente invenção superfícies de diferentes polímeros foram tratados, obtendo no final do tratamento um ângulo de contacto superior a 110°, preferencialmente superior a 150°. Dois polímeros foram usados: poliestireno e poliácido láctico . 1.1 Superfícies de poliestireno

As superfícies de elevada repelência a água de poliestireno foram obtidas usando placas de poliestireno cortadas de placas de Petri comerciais, com ângulo de contacto original médio de 98.9°. Estas foram tratadas com uma solução composta por poliestireno dissolvido em tetrahidrofurano (solvente do poliestireno) a uma concentração de 70 mg/mL, à qual foi misturada depois etanol (não-solvente do poliestireno) , numa reacção de separação de fase.

Após o espalhamento da solução na placa inicial de poliestireno, a solução é retirada e toda a placa é imersa em etanol puro. A placa tratada é depois seca sob um fluxo de azoto. As superfícies obtidas apresentavam ângulos de contacto superiores a 150°, nomeadamente com um valor médio de 156.2°.

A análise das superfícies tratadas por microscopia electrónica de varrimento permitiu observar a formação de estruturas hierárquicas às micro- e nano-escalas : esferas com diâmetros compreendidos entre 50 nm e 200 nm aglomerados em estruturas de maior dimensão puderam ser observados.

1.2 Superfícies de ácido poli-láctico

Superfícies de elevada repelência a água foram também obtidas por reacções de inversão de fase usando um polímero biodegradável, como o poli (L-ácido láctico) (PLLA) . Grãos de poliácido láctico foram aquecidos acima da sua temperatura de fusão (173-178 °C) enquanto são comprimidos de modo a obter filmes poliméricos homogéneos.

Para aumentar a sua repelência a água, misturas de PLLA com dioxano a 10% (massa/volume) foram espalhadas nos filmes lisos de PLLA e após alguns segundos as amostras foram imersas em etanol puro de modo a provocar uma separação de fase. Após a total secagem das amostas, a película que reveste a superfície foi removida e obteve-se uma estrutura com micro- e nano- rugosidade, levando as superfícies a apresentar com ângulo de contacto médio de 153.6°.

Exemplo 2 - Tratamento e padronização das superfícies super- hidrofóbicas

2.1 Por irradicação com UVO

Para a padronização das superfícies com elevada repelência a água com regiões molháveis, foi usada uma foto-máscara plástica com quadrados abertos lxl mm ² , separados por 1 mm. O tempo de exposição a radiação UVO foi variado entre 0 e 14 minutos, sendo nessa gama registados valores de ângulo de contacto em todos os minutos, permitindo uma variação do ângulo de contacto das superfícies de aproximadamente 156° (correspondente a 0 minutos de exposição a radiação UVO) a aproximadamente 0° (correspondente a exposição de 14 minutos a radiação UVO) .

Após o tratamento das superfícies com diferentes tempos de exposição a radiação UVO, foi utilizado novamente o método da gota Sessile para comprovar e quantificar o decréscimo no ângulo de contacto das superfícies. Além disso, efectuou-se também espectroscopia fotoelectrónica de raios-X(XPS) com um ângulo de 90° em relação à amostra, com uma energia constante de 100 eV para análise geral e 20 eV para análise de elevada resolução. Esta análise permitiu observar a redução ou aumento de grupos funcionais na amostra de poliestireno que se formam com o tratamento superficial com radiação UVO. 2.2 Por aplicação de plasma de árgon

O gradiente de tensão superficial do substrato seleccionado foi obtido por tratamento com plasma de Árgon, a uma potência de 30 W e pressão de 0.2 mbar.

De modo a obter o gradiente de molhabilidade, uma máscara foi deslizada pelo comprimento da amostra de PLLA com elevada repelêricia a água, variando o tempo de exposição de cada secção da superfície ao tratamento superficial. Assim, o tempo de exposição a plasma foi variado de 0 a 150 segundos, e dentro dessa gama de tempos de exposição uma variação de ângulo de contacto de 153.6° a 0° foi observada.

Exemplo 3 - Preparação das soluções ou suspensões contendo biomateriais

No âmbito da presente invenção, a adsorção de proteínas presentes no plasma humano foi testada nas regiões molháveis de substratos de poliestireno tratado com radiação UVO através de máscaras, em particular de filmes plásticos, com regiões abertas de 1 mm ² durante 6 minutos.

Soluções de albumina do soro humano (HSA) e fibronectina do plasma humano (HFN) foram preparadas em solução tampão com pH fisiológico a concentrações de 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL e 50 mg/mL. A HSA foi adequirida com marcação fluorescente verde de isotiocianato de fluoreceina. A HFN foi marcada em laboratório com o "kit" de marcação de proteínas Alexa Fluor 555.

Exemplo 4 - Deposição de biomateriais em substratos tratados

Diferentes combinações de biomateriais e líquidos de cultura foram individualmente depositadas e limitadas nas regiões molháveis (hidrofílicas ) , como resultado do forte contraste de molhabilidades entre a amostra inicial e as regiões modificadas, como observado na Figura 2B.

As superfícies repelentes foram padronizadas usando radiação UV/Ozono (UVO) (Figura 3) de modo a modificar a molhabilidade da superfície .

A quantidade de proteína adsorvida nas superfícies com diferentes molhabilidades (Figura 4 A-B.) foi avaliada de modo a analisar rapidamente o efeito da concentração de proteína e o tempo de adsorção (Figura 4 C-D) . Outros estudos paralelos de adsorção de HSA e HFN também foram realizados em substratos com diferentes molhabilidades entre a gama de superhidrofóbicos - superhidrofílicas .

Diferentes combinações de HSA e HFN foram adsorvidas nas regiões molháveis da plataforma, como visto na Figura 5A i-ii.

A quantificação da adsorção de proteína nas superfícies controlo (de diâmetro 13 mm) de modo isolado foi realizada através do método de Bradford. Neste caso, apenas estudos isolados de adsorção foram realizados, isto é, na mesma superfície apenas existia HSA ou HFN, e nunca as duas em simultâneo.

Os ensaios realizados nas superfícies controlo com 6 minutos de exposição a radiação UVO foram reproduzidos nas regiões molháveis da plataforma para análise expedita no âmbito desta invenção. Neste caso, estudos competitivos de adsorção de proteína, nos quais HSA e HFN foram colocados em diferentes rácios nas regiões molháveis, foram também realizados. A observação das proteínas coradas com moléculas fluorescentes reflectidas a diferentes comprimentos de onda (correspondentes à cor verde e à cor vermelha, respectivamente) foi efectuada usando um microscópio de fluorescência com análise de luz reflectida .

Posteriormente, aquando da deposição das células nas zona hidrofilicas , a sua quantificação foi possível através também da análise de imagens obtidas por microscopia de fluorescência. Os núcleos celulares foram corados usando DAPI, que reflecte a um comprimento de onda correspondente à cor azul.

Exemplo 5 - Deposição de células fibroblásticas encapsuladas em hidrogeis

Substratos idênticos aos do Exemplo 1 foram padronizados utilizando radiação UVO durante 14 minutos. Uma solução de alginato 1% (massa/volume) foi preparada em meio de cultura com uma suspensão de células fibroblásticas (L929) . Soluções de diferentes concentrações (1%, 1.5% e 2% (massa/volume)) em solução tampão a pH fisiológico de colagénio foram preparadas separadamente. A solução de alginato 1% foi depositada juntamente com uma das soluções de colagénio em cada uma das regiões molháveis em diferentes rácios alginato : colagénio (25:75; 50:50; 100:0) numa lógica gota-a-gota, formando um total de 5 μΐ por região molhável. O alginato em cada região molhável foi reticulado com uma gota de 1 M de cloreto de cálcio, sendo assim formadas hidrogéis (redes semi-interpenetradas ) com células encapsuladas. Meio de cultura foi adicionado a cada região. Após 24 horas e 48 horas de cultura celular, as células foram avaliadas na sua viabilidade usando calceina AM, e na sua proliferação usando DAPI. A recolha de imagens foi realizada num microscópio de fluorescência e a quantificação de células usando um programa informático para análise de imagem. Referências

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Lisboa, 6 de Dezembro de 2011.