L'invention concerne un procédé et un disposi¬ tif d'électrophorese multiple, permettant d'assurer la mi¬ gration contrôlée de macromolecules dans des plaques rec-

10 tangulaires de gel.

On utilise actuellement des techniques de sépa¬ ration de macromolécules , telles que des protéines ou des acides nucléiques, par électrophorese au moyen d'un champ électrique appliqué aux extrémités longitudinales d'une

15 plaque rectangulaire d'un gel approprié, par exemple d'agarose ou de polyacrylamide. Des échantillons de macro¬ molécules, par exemple d'acides nucléiques, à séparer sont . déposés dans des puits formés dans le gel, le long d'un bord de la plaque, puis l'ensemble est immergé dans un li-

20 quide approprié d'électrophorese. Les électrodes placées contre le bord précité de la plaque et le bord opposé de celle-ci sont reliées à des potentiels différents, de sorte qu'un champ électrique s'établit entre les électrodes dans un sens correspondant à la direction souhaitée de migration

25 des macromolecules dans la plaque de gel. Sous l'effet du champ électrique, les macromolécules des échantillons logés dans les puits se déplacent vers le bord opposé de la plaque, à travers le gel; à des vitesses qui sont fonction notamment de leur masse moléculaire, de sorte qu'au bout

30 d'un temps donné, des macromolécules de masses moléculaires différentes ont parcouru dans le gel des distances diffé- ^; rentes.

Dans une technique connue, les macromolécules ainsi séparées sont ensuite transférées, soit par aεpira-

!. _. tion, soit au moyen d'un champ électrique orienté perpendiculairement à la plaque dans le sens voulu, sur une

membrane placée sur une grande face de la plaque de gel, en vue de leur hybridation et de leur détection ultérieures.

Cette technique et les appareils qui ont été réalisés pour sa mise en oeuvre, relèvent essentiellement du laboratoire, c'est-à-dire qu'il s'agit d'appareils de petite taille, fonctionnant à faible cadence, traitant les plaques de gel 1'une après 1'autre, etc...

En outre, les séparations réalisées avec ces appareils ne sont pas parfaitement répétitives et peuvent varier d'une plaque à l'autre ou d'un échantillon à l'autre dans la même plaque, ne serait-ce que parce que le champ électrique développé entre les deux électrodes n'est pas uniforme, en raison de l'hétérogénéité du milieu traversé, de sorte que des macromolécules identiques, de même masse moléculaire, peuvent migrer sur des distances différentes si elles sont placées en des points différents d'une même plaque, ou sur des plaques différentes.

Il en résulte notamment des difficultés d'interprétation des résultats, et une impossibilité d'automatiser les appareils de séparation de macromolécules par électrophorese.

L'invention a notamment pour but d'éviter ces inconvénients de la technique antérieure.

Elle a pour objet un procédé et un dispositif d'électrophorese multiple, permettant de réaliser une sépa¬ ration de macromolécules dans des plaques de gel, de façon fiable, fidèle, répétitive et parfaitement automatisable.

L'invention a encore pour objet un procédé et un dispositif de ce type qui permettent de traiter simulta- nément un grand nombre de plaques de gel.

L'invention a encore pour objet un procédé et un dispositif du type précité, permettant de modifier à vo¬ lonté les conditions de séparation des macromolecules, no¬ tamment par variation contrôlée du champ électrique appli- que aux plaques de gel pour la migration des macromole¬ cules.

L'invention propose, à cet effet, un procédé d'électrophorese multiple pour assurer la migration contrô¬ lée de macromolecules dans des plaques rectangulaires de gel, caractérisé en ce qu'il consiste : - à empiler plusieurs plaques perpendiculaire¬ ment à leur plan en les maintenant espacées pour en former au moins une pile parallélépipédique,

- à disposer entre les plaques et/ou au voisi¬ nage des faces de cette pile une pluralité d'électrodes al- longées, par exemple filiformes, parallèles entre elles et aux plans des plaques, et contenues dans une série de plans perpendiculaires à une direction commune souhaitée de mi¬ gration des macromolécules dans les plaques,

- à immerger l'ensemble des plaques et des électrodes dans un bain de liquide approprié d'électrophorese,

- à porter à un même potentiel les électrodes contenues dans un même plan perpendiculaire à la direction de migration, - et à contrôler dans l'espace et/ou dans le temps, les différences de potentiel entre les différents plans, pour créer dans le bain et à travers les plaques un champ électrique dont la direction est en tous points sen¬ siblement parallèle à la direction souhaitée de migration. Les électrodes contenues dans des plans perpen¬ diculaires à la direction souhaitée de migration des macro¬ molécules définissent des surfaces équipotentielles qui sont sensiblement planes, au moins en première approxima¬ tion, puisqu'elles sont définies par des droites parallèles et coplanaires.

Le champ électrique étant nécessairement normal aux surfaces équipotentielles, qui sont elles-mêmes perpen¬ diculaires à la direction souhaitée de migration, on ob¬ tient ainsi nécessairement, dans les plaques de gel ^' , un champ électrique orienté dans la direction voulue, au moins au niveau de chaque électrode, et cela malgré

l'hétérogénéité du milieu soumis au champ électrique.

Il en résulte un contrôle de l'amplitude et de l'orientation du champ électrique à travers les plaques de gel, qui est tel que l'on obtient, dans des conditions identiques, des séparations de macromolécules et des me¬ sures parfaitement répétitives.

Il en découle la possibilité d'automatiser les processus de séparation de macromolécules, et de les com¬ mander par ordinateur, par exemple au moyen d'un automate décrit dans une autre demande de brevet de la demanderesse, déposée ce même jour.

Selon une autre caractéristique de l'invention, les électrodes sont disposées aux intersections des plans cités avec une autre série de plans perpendiculaires à une seconde direction souhaitée de migration, cette seconde di¬ rection étant perpendiculaire à la première, et le procédé consiste à contrôler successivement les potentiels des électrodes des plans de la première série, puis ceux des électrodes des plans de l'autre série, pour faire migrer les macromolécules dans leεdites plaques successivement dans la première direction citée, puis dans la seconde.

On peut, de cette façon, réaliser non seulement la séparation des macromolécules dans les plaques de gel, mais également leur transfert sur des membranes appropriées placées le long d'une des grandes faces des plaques de gel.

Le procédé selon l'invention prévoit de créer, par une distribution uniforme de potentiel sur les plans d'électrodes régulièrement répartis par rapport à la pile de plaques, un champ électrique uniforme à travers les plaques de la pile.

Le procédé selon l'invention prévoit également de faire varier l'amplitude et/ou le sens du champ élec¬ trique à travers les plaques de la pile, par variation de la distribution des potentiels sur les plans d'électrodes. Les variations dans le temps des différences de potentiel entre les plans d'électrodes peuvent être εyn-

chrones et égales entre elles, pour faire varier dans le temps, l'amplitude du champ électrique sans modifier sa dis¬ tribution dans l'espace, ou bien les différences de poten¬ tiel entre plans d'électrodes peuvent être modifiées loca- lement, pour faire varier localement l'intensité du champ électrique.

Le procédé selon l'invention prévoit encore de modifier, cycliquement ou non, les différences de potentiel entre les plans d'électrodes. On peut, de cette façon, faire migrer les ma¬ cromolécules par à-coups dans une direction souhaitée de migration.

Selon encore une autre caractéristique de l'invention, le procédé consiste également à disposer côte à côte au moins deux piles de plaques, en les juxtaposant dans une direction parallèle ou perpendiculaire à la direc¬ tion précitée de migration.

On peut ainsi traiter par des champs élec¬ triques différents les plaques de gel. des • différentes piles.

L'invention propose encore un dispositif d'électrophorese multiple pour assurer la migration contrô¬ lée de macromolécules dans des plaques de gel, comprenant une cuve destinée à recevoir les plaques de gel, des élec- trodes agencées pour créer un champ électrique dans les plaques de gel, et des moyens d'amenée dans la cuve et d'extraction de la cuve d'un liquide approprié d'électrophorese, caractérisé en ce que ce dispositif com¬ prend : - des moyens de support destinés à recevoir au moins un empilement de plaques de gel en les maintenant es¬ pacées les unes des autres,

- une série d'électrodes parallèles entre elles et aux plaques de la pile, disposées dans des plans perpen- diculaires à une direction souhaitée de migration des ma¬ cromolecules à travers les plaques,

β

- des moyens de liaison électrique entre élec¬ trodes d'un même plan, permettant en particulier de les maintenir à un même potentiel,

- des moyens de liaison entre électrodes de plans différents, permettant en particulier de maintenir une différence de potentiel entre deux plans consécutifs,

- des moyens d'application de potentiel au moins aux électrodes situées dans des plans d'extrémités entre lesquels est disposée la pile de plaques, - et des moyens de commande pour faire varier dans l'espace et/ou dans le temps la distribution des po¬ tentiels des électrodes desdits plans.

De préférence, les électrodes seront réparties régulièrement entre les extrémités des plaques de gel, ainsi qu'entre ces plaques.

Les électrodes sont disposées aux intersections de deux séries de plans, les premiers étant perpendicu¬ laires aux plaques et à la direction souhaitée de migra¬ tion, les seconds étant perpendiculaires aux premiers et parallèles aux plaques.

Selon une autre caractéristique de l'invention, les moyens de liaison entre deux électrodes consécutives d'un même plan sont du type à conduction électrique comman¬ dée, variable entre un état de conduction à résistance sen- siblement nulle et au moins un état de conduction à résis¬ tance de valeur prédéterminée, non nulle.

Ces moyens de liaison peuvent notamment être des composants électroniques, tels que des transistors, des thyristors, etc..., qui sont sélectivement conducteurs ou bloqués.

Ces moyens de liaison peuvent être commandés individuellement ou par groupes, et de préférence par des moyens qui sont communs à toutes les électrodes situées dans un même groupe de plans parallèles. Dans un mode de réalisation de l'invention, les moyens de liaison entre électrodes et les moyens de corn-

mande sont portés par au moins une plaque -de matière di¬ électrique, sur laquelle sont fixées les électrodes par une de leurs extrémités.

Selon une autre caractéristique de l'invention, le support est destiné à recevoir au moins deux piles de plaques disposées côte à côte et juxtaposées dans au moins une direction parallèle à leurs plans, et en ce qu'une sé¬ rie d'électrodes du type précité, comprenant les moyens précités de commande et de liaison entre électrodes, est associée à chaque pile de plaques, pour créer dans les plaques des différentes piles des champs électriques qui sont à volonté identiques ou différents, liés ou indépen¬ dants les uns des autres.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les électrodes précitées sont intégrées à un panier mobile formant le support des plaques de gel.

En pratique, il suffit de réunir entre elles ces électrodes par des plaques, perforées ou non, ou des grilles de matériau diélectrique pour disposer d'un panier support, entre les électrodes duquel on peut disposer les plaques de gel, et que l'on va immerger dans la cuve et ex¬ traire de la cuve par la face horizontale supérieure de celle-ci.

L'invention prévoit également que les extrémi- tés, par exemple inférieures, des électrodes précitées com¬ portent des moyens de liaison ou de raccordement à des électrodes portées par la paroi correspondante, par exemple de fond, de ladite cuve.

Il suffit donc, dans ce cas, de déposer le pa- nier sur le fond de la cuve pour que les électrodes verti¬ cales du panier puissent être reliées aux moyens d'application de potentiel et aux circuits de commande du dispositif, par l'intermédiaire des électrodes du fond de la cuve. Avantageusement, ces moyens de liaison ou de raccordement forment également des moyens de positionnement

6 du panier dans la cuve.

De préférence, les électrodes du fond de la cuve sont sensiblement ponctuelles, et forment un réseau à maille carrée ou rectangulaire, à côtés respectivement pa- rallèles et perpendiculaires à la direction souhaitée de migration des macromolécules.

Elles sont reliées entre elles par des moyens de liaison commandés, permettant sélectivement de maintenir à un même potentiel les électrodes situées dans un même plan perpendiculaire à la direction souhaitée de migration des macromolécules, et d'établir une différence de po¬ tentiel entre deux successifs de ces plans.

L'invention prévoit également, dans ce cas, que les parois verticales de la cuve comportent des électrodes ^" linéaires verticales, raccordées également à des moyens commandés de liaison permettant sélectivement d'établir entre elles des différences de potentiel, ou bien de les mettre à un même potentiel.

Afin d'augmenter la capacité de traitement du dispositif selon l'invention, le panier peut contenir, à un même niveau, au moins deux séries de plaques de gel, dispo¬ sées tête-bêche, c'est-à-dire dans lesquelles les plaques d'une série sont sensiblement dans le prolongement des plaques de l'autre série, mais orientées longitudinalement dans un sens opposé, par rapport à la position initiale des macromolécules.

On peut ainsi traiter plusieurs doubles séries de plaques de gel, sans augmenter pour autant la différence de potentiel totale dans la cuve au-delà de celle requise pour une plaque.

L'invention prévoit également que les élec¬ trodes verticales du panier sont entourées par des manchons ou tubes cylindriques de matière diélectrique, perforés ou poreux vis à vis du liquide d'électrophorese. Ces tubes, ouverts à leurs extrémités, forment des pièges pour les bulles de gaz produites par électro-

S lyse au contact des électrodes, et guident les bulles vers la surface libre du liquide, sans qu'elles puissent venir au contact des plaques de gel.

Dans la description qui suit, faite à titre d'exemple, on se réfère aux dessins annexés, dans lesquels:

- la figure 1 représente schématiquement un ap¬ pareil connu de séparation de macromolécules par électro¬ phorese ;

- la figure 2 est une vue schématique de bout d'une série d'électrodes propres à être utilisées dans un dispositif selon l'invention ; la figure 3 représente la même série d'électrodes, mais commandée de façon différente ;

- la figure 4 représente schématiquement une série semblable d'électrodes et ses moyens de commande ;

- la figure 5 représente schématiquement, en vue de dessus, la disposition de quatre séries d'électrodes selon l'invention, pour quatre piles de plaques de gel ;

-. les figures 6 et 7 sont deux vues schémà- tiques en perspective d'un réseau d'électrodes selon deux réalisations différentes de l'invention ;

-la figure 8 est une vue schématique en éléva¬ tion d'un panier de support de plaques de gel ;

-la figure 9 est une vue de côté de ce panier ; -la figure 10 est une vue schématique en perspective d'un panier de support de plaques ;

-la figure 11 est une vue schématique en perspective, avec arrachement partiel, d'une cuve d'électrophorese; -la figure 12 est une vue partielle, à plus grande échelle, d'un moyen de positionnement de panier dans la cuve ;

-la figure 13 est une vue schématique du cir¬ cuit, de liaison des électrodes du fond de la cuve ; -la figure 14 est une vue schématique en perspective, avec arrachement partiel d'une autre forme de

réalisation d'une cuve d'électrophorese ;

-la figure 15 est une vue schématique par¬ tielle, en coupe transversale, de tubes poreux montés au¬ tour des électrodes verticales d'un panier, En figure 1, on a représenté très schématique- ment le principe de la séparation des macromolécules dans une plaque de gel par électrophorese.

Des échantillons contenant des macromolécules, par exemple des acides nucléiques, sont déposés dans des puits 10 formés dans une plaque rectangulaire 12 d'un gel d'agarose ou de polyacrylamide, le long d'un des petits cô¬ tés de cette plaque. La plaque de gel 12 contenant les échantillons est disposée dans une cuve 14 d'électrophorese entre deux électrodes 16 (respectivement une anode et une cathode), dans la position représentée en figure 1. La cuve 14 est ensuite remplie d'un liquide approprié d ^! électrophorese, puis les électrodes 16 sont reliées aux bornes d'une -source d'énergie électrique, de façon à ce qu'il s'établisse entre les électrodes une différence pré- déterminée de potentiel créant un champ électrique allant d'une électrode à l'autre dans la direction voulue de mi¬ gration des macromolécules contenues dans les puits 10, à travers la plaque de gel 12.

Les vitesses de migration des macromolécules à travers la plaque 12, en direction du bord opposé de cette plaque, sont fonction de leur masse moléculaire. En consé¬ quence, au bout d'un temps donné, les macromolecules auront parcouru dans la plaque 12 des-distances qui sont fonction de leur masse moléculaire. On a représenté, à titre d'exemple, des distances Dl, D2, D3 parcourues par des ma¬ cromolécules depuis un puits 10.

Cette séparation des macromolecules en fonction de leur masse moléculaire permet, après transfert sur une membrane et marquage par hybridation ou autre procédé, d'identifier et de reconnaître les macromolecules marquées au moyen de sondes appropriées.

Les applications d'une telle technique sont multiples et intéressent de plus en plus l'industrie. Ce¬ pendant, les appareils connus d'électrophorese ne peuvent être utilisés qu'en laboratoire et ne sont pas susceptibles d'automatisation.

Il en est ainsi notamment parce que le milieu dans lequel s'établit le champ électrique, entre les élec¬ trodes 16, est particulièrement hétérogène : il comprend la plaque 12, la membrane de transfert qui se trouve le long d'une grande face de la plaque 12, le liquide d'électrophorese qui baigne la plaque 12 et les électrodes 16, le support de la plaque 12 et de la membrane, etc.. Le champ électrique entre les électrodes 16 n'est donc pas uniforme et n'est pas non plus orienté en tous points pa- rallèlement à la direction souhaitée de migration des ma¬ cromolécules dans la plaque 12. Par réaction électrochi¬ mique, il se produit également des bulles dans le liquide d'électrophorese au contact des électrodes, en raison de la différence de potentiel relativement importante entre les électrodes 16 et de leur faible surface, et ces bulles qui se détachent des électrodes sont susceptibles de gêner ou d'influencer les migrations des macromolécules.

Comme indiqué, le procédé et le dispositif se¬ lon l'invention permettent d'éviter ces inconvénients de la technique actuelle et en outre d'automatiser la séparation et le transfert des macromolecules par électrophorese.

Le procédé et le dispositif selon l'invention permettent également de traiter simultanément un grand nombre de plaques de gel, comprenant des échantillons de macromolécules à séparer.

On fera donc maintenant référence aux figures 2 et 3, qui illustrent schématiquement certaines caractéris¬ tiques essentielles de l'invention, applicables notamment à la migration des macromolécules à travers les plaques de gel, et au transfert des macromolécules sur les membranes associées aux plaques de gel.

Le dispositif selon l'invention comprend essen¬ tiellement, dans une cuve d'électrophorese de dimensions appropriées, une série d'électrodes 20 de forme allongée, constituées par exemple par des fils de matériau électro- conducteur approprié. Les électrodes 20 sont parallèles entre elles et s'étendent perpendiculairement au plan du dessin dans les figures 2 et 3. Elles sont disposées aux intersections de deux séries de plans perpendiculaires, dont les uns sont perpendiculaires à la direction souhaitée de migration des macromolécules, et dont les autres sont perpendiculaires aux premiers et à la direction de trans¬ fert des macromolécules sur les membranes.

Les électrodes 20 situées dans un même plan perpendiculaire à la direction souhaitée de migration, sont reliées entre elles de façon à se trouver au même poten¬ tiel, tandis que les électrodes situées dans des plans dif¬ férents de ce type doivent être à des potentiels diffé¬ rents, pour l'établissement d'un champ électrique parallèle à la direction souhaitée de migration. Par ailleurs, les électrodes sont réunies entre elles, de la façon voulue, uniquement à leurs extrémités de façon à permettre la dis¬ position, dans le réseau d'électrodes, d'une pile de plaques de gel 12 dont une grande face est pourvue d'une membrane de transfert 22 et qui sont portées par des sup- ports 24 d'un panier 26, représenté en traits fantèmes uniquement en figure 2. Les plaques de gel 12 forment ainsi un empilement vertical, en étant maintenues espacées les unes des autres et sont disposées de façon équidistante ou non, à volonté, entre des plans parallèles d'électrodes 20 en traversant chacune une série de plans perpendiculaires délimités par des électrodes 20. _.

Une électrode d'un plan vertical d'extrémité, par exemple l'électrode située au coin supérieur gauche du dessin de la figure 2, et l'électrode diagonalement oppo- εée, sont reliées à deux bornes d'une source de tension électrique continue, les électrodes situées dans un même

plan vertical sont reliées entre elles pour être au même potentiel, et la série d'électrodes située dans un même plan vertical est reliée à la série d'électrodes située dans un autre plan vertical adjacent ou consécutif par une résistance électrique 28 ^* d'un pont diviseur de tension éta¬ blissant entre elles de proche en proche une différence de potentiel prédéterminée.

Lorsqu'on souhaite obtenir un champ électrique uniforme à travers toutes les plaques 12, les résistances 28 ont toutes la même valeur et les plans verticaux d'électrodes sont équidistants.

Les plans verticaux parallèles délimités par les électrodes 20 sont des surfaces équipotentielles, au moins au niveau des électrodes 20 qu'ils contiennent. Le champ électrique Ei ou gradient de potentiel développé entre les électrodes est normal aux surfaces équipoten¬ tielles et est donc, de par la disposition géométrique des électrodes et des plaques de gel 12, parallèle en un très grand nombre de points à la direction souhaitée de migra- tions des macromolécules, en ayant une amplitude sensible¬ ment constante.

Il en résulte que les résultats de séparation des macromolécules par migration à travers les plaques de gel 12 sont, au moins en première approximation, fidèles et répétitifs. Un étalonnage ou calibrage préalable du dis¬ positif permettra, si nécessaire, de déterminer avec préci¬ sion les éventuelles singularités du champ électrique qui seront de toute façon faibles,- et d'en tenir compte pour une appréciation des résultats de séparation. Corollairement, le procédé et le dispositif se¬ lon l'invention permettent de traiter simultanément un très grand nombre de plaques de gel 12.

La même disposition d'électrodes 20 est utili¬ sée en figure 3 pour le transfert des macromolécules sur les membranes 22 associées aux plaques 12. Seules chan¬ gent, par rapport à la figure 2, les liaisons entre élec-

trodes, puisque l'on veut obtenir un champ électrique per¬ pendiculaire aux plans des plaques 12.

Pour cela, les électrodes 20 contenues dans un même plan horizontal, parallèle aux plaques 12, sont re- liées pour être au même potentiel, tandis que la série d'électrodes contenue dans un même plan horizontal est re¬ liée à la série d'électrodes contenue dans un autre plan horizontal adjacent ou consécutif par une résistance 30 de valeur déterminée. Les plans horizontaux contenant les électrodes 20 définissent ainsi des surfaces équipoten¬ tielles, auxquelles est perpendiculaire le champ électrique E2 produit quand le plan horizontal supérieur d'électrodes 20 et le plan horizontal inférieur d'électrodes sont reliés à deux bornes opposées de la source de tension continue. Lorsque toutes les résistances électriques 30 ont la même valeur, le champ électrique de transfert E2 a la même amplitude pour toutes les plaques 12, quelle que soit leur disposition dans la pile.

Il est bien* évident cependant qu'il suffit de modifier les valeurs des résistances 28 et 30 pour obtenir des distributions particulières de champ électrique à tra¬ vers les plaques 12, dans la direction de migration et dans la direction de transfert des macromolecules. En contrôlant les valeurs des potentiels appliquées aux électrodes des plans d'extrémité, et la variation dans le temps de ces po¬ tentiels, on peut faire varier, localement ou dans l'ensemble du dispositif, l'amplitude du champ électrique, non seulement de façon permanente, mais également de façon cyclique. On peut ainsi, notamment, inverser la direction du champ électrique pendant une durée prédéterminée, puis l'inverser à nouveau pour le réorienter dans la direction souhaitée de migration ou de transfert.

On peut également réaliser un balayage, par commutation, d'une distribution donnée de potentiels appli- qués à des plans successifs d'électrodes, cette distribu¬ tion pouvant notamment comporter une inversion de champ

électrique, que l'on fera se déplacer de proche en proche dans le réseau d'électrodes

On peut encore balayer les plans successifs d'électrodes ou certains d'entre eux par une différence de potentiel déterminée, par exemple pour la migration des ma¬ cromolécules dans les plaques de gel. Cela permet de faire agir le champ électrique de façon répétitive sur des frac¬ tions déterminées de la longueur des plaques de gel, ou sur toute leur longueur si on le souhaite, en créant ce champ au moyen d'une différence de potentiel plusieurs fois infé¬ rieure à la différence de potentiel qu'il faudrait appli¬ quer, pour obtenir un champ électrique de même intensité, aux électrodes situées aux extrémités opposées des plaques de gel. Il en résulte des avantages importants, au niveau de la consommation d'énergie, du choix des composants de commutation des potentiels, de 1'échauffe ent du liquide, de la formation des bulles dans ce liquide, etc..

La figure 4 représente schématiquement, en vue de bout, la disposition d'électrodes et leurs moyens de liaison qui permettent d'obtenir notamment les agencements des figures 2 et 3 pour la migration et le transfert, res¬ pectivement, des macromolécules.

En figure 4, chaque électrode 20 est disposée selon l'intersection d'un plan horizontal et d'un plan ver- tical (tous deux perpendiculaires au plan du dessin) et est reliée aux électrodes voisines par un composant électro¬ nique 32 à conduction commandée, telle qu'un transistor ou un thyristor, qui peut être sélectivement conducteur et bloqué, c'est-à-dire dont la résistance électrique est soit sensiblement nulle, soit sensiblement infinie.

Dans le mode de réalisation représenté, les composants 32 reliant les électrodes 20 situées dans des plans horizontaux différents sont tous reliés, par leur en¬ trée de commande, à une même ligne 34 aboutissant à un cir- cuit de commande 36. De même, tous les composants 32 re¬ liant entre elles des électrodes 20 situées dans des plans

verticaux consécutifs, sont tous reliés, par leur entrée de commande, à une même ligne 38 aboutissant au circuit de commande 36. Ce circuit commande également les potentiels des électrodes 20 situées au coin supérieur gauche et au coin supérieur ^• droit des dessins de la figure 4, par des lignes conductrices 40 et 42 respectivement.

Les électrodes contenues dans un même plan ver¬ tical sont reliées aux électrodes contenues dans le plan vertical adjacent par une résistance 28, et les électrodes contenues dans un plan horizontal sont reliées aux élec¬ trodes du plan horizontal adjacent par une résistance 30, ces résistances pouvant être de même valeur ou avoir des valeurs différentes, selon les cas de figure. On peut en particulier utiliser des résistances variables.

Lorsque tous les composants 32 reliant entre elles des électrodes situées dans des plans horizontaux su- cessifs sont commandés pour avoir une résistance sensible¬ ment nulle, et que tous les composants 32 reliant entre elles des électrodes situées dans des plans verticaux suc¬ cessifs sont commandés pour avoir une résistance sensible¬ ment infinie, on obtient l'agencement de la figure 2.

Inversement, lorsque les composants 32 reliant entre eux des plans horizontaux successifs sont commandés pour avoir une résistance sensiblement infinie, et que les composants 32 reliant entre eux des plans verticaux succes¬ sifs sont commandés pour avoir une résistance sensiblement nulle, on obtient l'agencement de la figure 3.

Lorsque les résistances 28 et 30 sont rempla¬ cées par des sources de potentiel variable, dont la valeur est commandée par un circuit de commande approprié tel qu'un amplificateur opérationnel, on obtient des champs électriques qui sont localement différents d'une zone d'une plaque à une autre.

Au moyen du circuit de commande 36, on peut également faire varier de la façon souhaitée les potentiels appliqués par les lignes 40 et 42 aux électrodes des coins

supérieur gauche et inférieur droit du réseau de la figure

4. On peut, de cette façon, inverser temporairement le champ électrique, à intervalles réguliers ou non, par exemple pour obtenir un champ électrique puisé. On peut également balayer les plaques par une séquence de champs électriques qui sont localement différents, voire opposés.

Lorsque des séries de plaques de gel doivent être soumises à des champs électriques différents, c'est-à- dire dont les distributions dans l'espace et/ou les varia- tions dans le temps sont différentes, on peut utiliser l'agencement représenté en figure 5 qui permet le traite¬ ment simultané d'un certain nombre de piles 46 de plaques de gel. Chaque pile 46 est associée à un système 48 d'électrodes du même type que celui de la figure 4, compre- nant un circuit 36 de commande des variations du champ électrique à travers la pile de plaques. Chaque circuit de commande 36 est relié lui-même à un système central de com¬ mande 50 qui est par exemple piloté par un ordinateur. Dans ce cas, les variations de potentiel dans les systèmes d'électrodes 48 associés aux différentes piles de plaques 46 peuvent être à volonté identiques ou différentes, liées les unes aux autres ou indépendantes les unes des autres.

Le procédé et le dispositif selon l'invention permettent donc de réaliser des séparations de macromolé- cules de masses moléculaires différentes dans des condi¬ tions uniformes, ou encore d'étudier le comportement de macromolécules de même nature et de même masse moléculaire dans des champs électriques différents et dans des plaques de gel de nature différente. Un avantage de l'agencement d'électrodes selon l'invention est que des plaques de gel peuvent occuper tous les emplacements prévus entre les plans d'électrodes, ou seulement certains d'entre eux, sans qu'il en résulte une modification de la distribution des champs électriques. En pratique (figure 6), les électrodes 20 se¬ ront toutes fixées, par une extrémité, sur une même plaque

52 de matériau diélectrique incluant les composants 28,

30, 32 et les liaisons nécessaires. Comme les électrodes seront avantageusement des fils de matériau conducteur, elles seront fixées à leur autre extrémité sur une seconde plaque de matériau diélectrique qui pourra comporter, ou non, certains des composants de liaison nécessaires.

La source de potentiel et les circuits de com¬ mande 36, 50 seront de préférence à l'extérieur du bain de liquide d'électrophorese. Comme on l'a représenté schématiquement en fi¬ gure 2, les différentes plaques de gel sont montées sur des supports faisant partie d'un panier 26, déplaçable par translation à l'intérieur et à l'extérieur du réseau d'électrodes. En variante (figure 7), les électrodes peuvent être limitées à des bandes conductrices 54 parallèles for¬ mées sur des parois 56 de la cuve, par exemple par métalli- sation.

Les cuves d'électrophonèse selon l'invention sont, de façon connue, équipées d'un système de circulation et de refroidissement du liquide d'électrolyse.

On se réfère maintenant aux figures 8 et 9 où l'on a représenté schématiquement un panier de support de plaques de gel selon l'invention. Ce panier 60 comprend essentiellement des plaques horizontales 62 verticalement superposées et sépa¬ rées les unes des autres d'une distance égale à la hauteur d'une plaque de gel disposée verticalement, certaines plaques 62 étant en retrait des parois de la cuve et/ou perforées pour permettre le passage des bulles de gaz, ou même constituées par des grilles.

Les plaques 62, en matériau diélectrique, sont reliées entre elles par des électrodes verticales recti- lignes 64 qui peuvent être des tiges rigides de matériau électroconducteur, ou encore de simples fils électroconduc¬ teurs tendus entre les plaques 62, dans ce cas reliées par

des montants rigides, non électriquement conducteurs, pos¬ sédant la résistance mécanique voulue et disposés par exemple aux coins et au centre des plaques 62.

Les électrodes 64 sont disposées en un réseau à maille transversale rectangulaire ou carrée et ont essen-

*. tiellement pour fonction d'être des lignes d'accrochage de surfaces équipotentielles.

Les plaques de gel 66 sont disposées verticale¬ ment sur les plaques 62, entre les électrodes 64, de telle sorte que la direction souhaitée de migration des macromo¬ lécules dans les plaques de gel soit horizontale.

Comme on le voit sur les figures 8 et 9, on peut disposer aux différents niveaux du panier 60 un assez grand nombre de plaques de gel 66, qui sont côte à côte et qui, à chaque niveau, forment par exemple deux séries de plaques, les plaques d'une série étant situées dans le pro¬ longement des plaques correspondantes de l'autre série.

Comme on le souhaite, les plaques d'une série peuvent être orientées dans le même sens que les plaques de l'autre série, ou bien en sens contraire. Dans le premier cas, la différence de potentiel entre les extrémités du pa¬ nier sera de l'ordre de deux fois la différence de poten¬ tiel à appliquer aux extrémités d'une plaque de gel. Dans le second cas, la différence de potentiel entre les extré- mités du panier sera sensiblement égale à la différence de potentiel entre les extrémités d'une plaque de gel : on ap¬ pliquera par exemple une tension VI aux électrodes 64ι des extrémités du panier, et une tension V2 aux électrodes 642 du plan médian transversal du panier, avec la différence VI - V2 égale à la différence de potentiel à appliquer entre les extrémités d'une plaque de gel.

La figure 10 est une vue en perspective d'une variante de réalisation du panier, qui ne comprend qu'un seul niveau de chargement des plaques de gel, délimité entre deux plaques 62 de matériau diélectrique, dont seule la plaque supérieure est perforée pour permettre le passage

Z0 des bulles de gaz formées par électrolyse dans le liquide d' électrophorese.

La figure 11 représente schématiquement une cuve destinée à recevoir le panier de la figure 10. Cette cuve 70 est de forme parallélépipédique et comprend un fond 72 horizontal et quatre parois verti¬ cales 74, avec éventuellement une paroi horizontale supé¬ rieure mobile, non représentée sur le dessin.

Le fond 72 de la cuve comprend une série d'électrodes sensiblement ponctuelles 76 formant un réseau à maille carrée ou rectangulaire, identique à celui des électrodes 64 du panier, de telle sorte que, lorsque le pa¬ nier sera placé dans la cuve, les électrodes ponctuelles 76 du fond 62 de la cuve se trouvent exactement dans le pro- longement des électrodes verticales 64 du panier.

Comme représenté en figure 12, les extrémités inférieures des électrodes 64 peuvent comprendre des moyens de contact avec les électrodes ponctuelles 76 et de posi¬ tionnement du panier dans la cuve. Dans l'exemple représenté, chaque électrode fi¬ liforme 64 du panier est raccordée, à son extrémité infé¬ rieure, à un plot conducteur 78 ayant une surface infé¬ rieure semi-sphérique en saillie sur la face inférieure de la plaque de fond 62 du panier, et qui est reçue dans un évide ent tronconique 80 d'un plot conducteur formant une électrode ponctuelle 76 du fond de la cuve.

Les électrodes ponctuelles 76 sont reliées entre elles, à l'extérieur de la cuve, par le circuit re¬ présenté en figure 13 et déjà décrit en référence à la fi- gure 4, qui comprend des moyens de liaison commandés entre électrodes 76 voisines. Les différentes rangées d'électrodes 76 sont reliées entre elles par des éléments de liaison 82 qui sont conducteurs avec une résistance électrique sensiblement nulle, ou bloqués avec une résiε- tance électrique sensiblement infinie. De même, les diffé¬ rentes colonnes d'électrodes ponctuelles 76 sont reliées

entre elles par des éléments de liaison 84, du même type que les éléments 82. En outre, des résistances 86, ou des éléments conducteurs équivalents, sont prévues entre les différentes rangées d'électrodes 76, et des résistances 88, ou des éléments conducteurs équivalents, sont prévues entre les différentes colonnes d'électrodes ponctuelles 76.

Les éléments de liaison 82 et 84 sont commandés de la façon suivante : quand les éléments de liaison 82 ont une résistance électrique sensiblement nulle, les éléments 84 ont une résistance électrique sensiblement infinie, de telle sorte que les colonnes d'électrodes ponctuelles 76 définissent des lignes équipotentielles, et que deux co¬ lonnes successives d'électrodes ont entre elles une diffé¬ rence de potentiel déterminée par la valeur de la réεiε- tance 88 correspondante, les électrodes de l'angle supé¬ rieur gauche et de l'angle inférieur droit du circuit étant reliées à des sources de potentiel appropriées. Alternati¬ vement, lorsque les éléments de liaison 82 ont une résis¬ tance électrique senεiblement infinie, et les éléments 84 ont une résistance senεiblement nulle, les rangées d'électrodes ponctuelles définisεent deε lignes équi- potentielleε et deux rangées εuccessives ont entre elles une différence de potentiel déterminée par la valeur de la résistance 86 correspondante. Les parois verticales 74 de la cuve 70 peuvent comprendre (figure 11) des électrodes linéaires verticales 90, formées par exemple par des lignes métallisées de leur surface interne, qui sont raccordées entre elles et aux rangées ou aux colonnes, respectivement, d'électrodes ponc- tuelles 76 du fond de la cuve par des éléments 82, 84.

On comprend le fonctionnement de la cuve 70 re¬ présentée en figure 11. Le panier chargé du nombre voulu de plaques de gel est placé danε la cuve et y eεt positionné automatiquement, grâce aux moyens de la figure 12, qui aεεurent en même temps la liaiεon électrique entre leε électrodeε ponctuelleε 76 et leε électrodes 64 du panier.

Par commande des éléments de liaison 82 et 84, on assure tout d ^r abord la migration des macromolécules dans les plaques de gel, parallèlement à la longueur de ces plaqueε, puis, en inversant les rôles des éléments de liaison 82 et 84, la migration des macromolécules à travers l'épaisseur des plaques de gel et leur transfert sur les membranes associées. Les rangées, puis respectivement les colonnes d'électrodes ponctuelleε 76, ainsi que leε électrodeε li- néaireε 90 deε faceε verticales de la cuve, définissent des surfaces équipotentielles planes permettant, comme déjà ex¬ pliqué, des meεureε fiables et rigoureuseε.

En figure 11, la flèche en trait plein indique la direction danε laquelle les plaques de gel εont orien¬ tées, et les flècheε en pointilléε indiquent leε directions du champ électrique, pour la migration et le transfert res¬ pectivement des macromolécules.

Le déplacement du panier dans la cuve 70 s'effectue par translation verticale, à travers la face su¬ périeure ouverte de la cuve 70, par exemple au moyen d'un bras robot qui permet d'amener le panier dans une εtation de chargement-déchargement où l'on peut préparer un panier, pendant qu'un autre panier est en cours de traitement dans la cuve 70.

Dans une variante de réalisation plus simple représentée en figure 13, le fond 92 de la cuve comprend des électrodes ponctuelles 94, disposées selon un réseau carré à maille carrée et formant des rangées dans leε- quelleε elles sont raccordées entre elles par des conduc¬ teurs noyés dans le fond de la cuve. Ces rangées correεpon- dent respectivement aux rangées d'électrodeε 64 d'un pa¬ nier et sont raccordées à leurs extrémités à des électrodeε verticales 96 formées sur deux faceε verticales oppoεéeε 98 de la cuve. Ceε électrodes 94 et 96 définissent, avec leε électrodeε rectiligneε 64 d'un panier, des plans équipoten- tiels qui sont perpendiculaires à la direction souhaitée de migration deε macromolécules.

On procède donc de la façon εuivante : le pa¬ nier est placé dans la cuve de telle sorte que les plaques de gel qu'il contient s'étendent perpendiculairement aux plans équipotentiels définis par leε électrodes linéaires 94 et 96. L'électrophorese permet alors d'assurer la migra¬ tion des macromolécules dans les plaques de gel, parallè¬ lement à la longueur deε plaqueε. On peut ensuite sortir le panier de la cuve, le faire tourner de 90 ⁼ autour d'un axe vertical, puis de le replacer dans la cuve, de telle sorte que les plaques de gel seront parallèles aux plans équipo¬ tentiels définis par leε électrodes linéaires 94 et 96. L'électrophorese provoquera alors la migration deε macromo¬ lécules dans l'épaisεeur deε plaqueε de gel, et leur trans¬ fert εur les membranes associéeε.. Les deux flèches en pointillé indiquent les orientations longitudinales des plaques de gel, danε leε deux poεitionε reεpectives de migration et de tranεfert des macromolecules,. et leε flèches en traits pleins correspon¬ dent à l'orientation du champ électrique entre les plans d'électrodes.

En variante, on peut prévoir deux cuves telles que celles de la figure 13, montées au voisinage immédiat l'une de l'autre, et réaliser dans l'une la migration des macromolécules εur la longueur des plaques de gel, et danε l'autre, le transfert des macromolécules sur les membranes aεεociéeε.

Leε deux autreε faces verticaleε 100 de la cuve de la figure 13 sont dépourvues d'électrodes.

On peut utiliser, pour fixer les potentiels des différents plans d'électrodes, des amplificateurs opéra¬ tionnels, commandés par un système de traitement de l'information. Il est alors très simple d'obtenir entre les plans d'électrodes des champs électriques variables dans le temps et dans l'espace, selon des lois cycliques ou non, d'utiliser deε champs électriques de type impulsionnel, etc...

Par exemple, comme représenté sur la partie droite de la figure 12, des amplificateurs opérationnels 102 sont reliés chacun, à leur sortie, à une rangée d'électrodes 76. Une de leurs entrées est reliée à une sor¬ tie d'un circuit de commande 104, tandis que leur autre en¬ trée est à la masse.

Lorsque les électrodes 76 forment un réseau carré, un commutateur multiple 106 permet d'appliquer les tensions de sortie des amplificateurs 102 soit aux rangées, soit aux colonnes d'électrodes 76.

En figure 14, on a représenté schématiquement des tubes ou manchons cylindriques 108 entourant leε élec¬ trodes verticales 64 d'un panier. Ces tubes 108, ouverts à leurs extrémités, sont en matière diélectrique et sont soit perforés soit poreux, pour permettre le passage du liquide d'électrophorese à travers leur paroi en direction des électrodes 64. Ces tubes forment ainsi des pièges à bulles, dans lesquelε leε bulleε de gaz produites par électrolyse sont guidées vers la surface libre du liquide, sans venir au contact deε plaques de gel. Ils servent auεεi de protec¬ tion deε électrodeε 64, et empêchent leε plaques de gel 66 de venir au contact des électrodes.De plus, on peut alors utiliser des électrodes fromées en un métal conducteur moins coûteux que le platine. Si d'éventuels dépôts sont formés par électrolyse au contact des ces électrodes, les tubes 108 évitent que ces dépôts puisεent paεεer dans le bain de liquide dans lequel εe trouvent leε plaques de gel.

Dans ce qui précède, on a décrit des formes de réaliεation de l'invention applicableε au cas où, les plaques de gel étant verticales, leε deux directions de mi¬ gration et de transfert des macromolécules sont horizon¬ tales. Bien entendu, l'invention couvre auεεi le caε où, les plaqueε de gel étant verticaleε, la direction de migra¬ tion deε macromolécules dans leε plaqueε est verticale, et leur direction de transfert εur leε membraneε associées est horizontale. Il suffit pour cela d'utiliser des paniers

danε leεquels les électrodes 64 sont horizontaleε