Molekülen

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfah¬ ren zur Trennung und Reinigung von Molekülen aus einer Lösung durch Adsorption der Moleküle an eine in der Vorrichtung angeordneten Matrix.

Zur Probenaufbereitung in chemisch, biochemisch und molekularbiologisch orientierten Laboratorien werden Chromatographiematerialen unterschiedlichster Art seit langem in bewährter Weise verwendet. Häufig fallen da¬ bei die Proben in Mikromaßstab an, insbesondere im bio¬ chemischen und molekularbiologischen, aber auch im ana¬ lytisch-chemischen Laboratorium. Die chromatographi¬ schen Materialien werden auch zur Extraktion von be¬ stimmten Bestandteilen aus den Proben eingesetzt. Die als Festphasenextraktion zu bezeichnende Verfahrenswei¬ se kann man sich auch zur Reinigung und Trennung von Substanzgemischen in Lösung zunutze machen. Bislang wurden neben den Chromatographiesäulen, insbesondere in der Hochdruckflüssigkeitschro atographie, auch Kartu¬ schen, Einwegspritzen oder kleine Plastikchro atogra- phiesäulen, die jeweils mit dem gewünschten Chromato¬ graphiematerial gefüllt sind, verwendet.

Diese Hilfsmittel, die im Niederdruckbereich Verwendung finden, zeichnen sich unvorteilhaft dadurch aus, daß sie nicht mit etablierten Laboratoriumsgerätschaften kompatibel sind. Ein weiterer Nachteil dieser Hilfsmit¬ tel besteht darin, daß sie nur eine Flußrichtung der die zu trennenden und reinigenden Moleküle enthaltenden Lösung zulassen. Man muß also bei der Verfahrensweise gemäß dem Stand der Technik die Probe zunächst in ein Vorratsgefäß, beispielsweise eine Einwegspritze, brin¬ gen, um sie dann durch das Flußmittel, insbesondere Kartuschen oder Extraktionssäulen, zu drücken.

Daher bedient man sich in der Praxis dieser Hilfsmittel überwiegend dann, wenn man die unerwünschten Produkte adsorbieren will. Ansonsten muß man das Vorratsgefäß, beispielsweise die Einwegspritze, entfernen, mit einem die adsorbierte Substanz eluierenden Lösung erneut be- schicken und anschließend durch das Hilfsmittel drucken, um die gewünschten Produkte zu erhalten. Durch das Ab¬ nehmen und Aufsetzen eines Vorratsgefäßes besteht je¬ doch eine Kontaminationsgefahr für den Mitarbeiter, die Umwelt und die Probe selbst. Die Gefahr besteht gerade im medizinisch-technischen Bereich, wenn beispielsweise mit infektiösem Material gearbeitet wird, oder auch in biochemisch-molekularbiologischen Laboratorien, wenn insbesondere mit radioaktiven Substanzen hantiert wird.

In der Praxis besteht ein erheblicher Bedarf an einer Vorrichtung, die es in einfacher Weise ermöglicht, ein Verfahren zur Reinigung und Trennung von Molekülen aus einer Lösung durchzuführen.

Aufgabe der Erfindung ist es also, eine Vorrichtung bereitzustellen, die es ermöglicht,

- Moleküle aus einer Lösung zu extrahieren,

- keine bevorzugte Extraktions- oder Elutionsrichtung zu verlangen, eine Abtrennung und Wiederhinzufügung eines Vorrats¬ gefäßes zu vermeiden,

- die Trennungs- und Reinigungsoperationen in einem geschlossenen System durchzuführen, die Kontaminationsgefahr für Personal, Umwelt und Probe zu vermeiden, und gleichzeitig die Arbeitsweise insgesamt zu erleich¬ tern.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Vor¬ richtung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die

Matrix 2 in einem an beiden Enden 4a, 4b offenen, ke¬ gelstumpfförmigen Hohlkörper 1, an den gegebenenfalls an der weiteren Öffnung 4a ein zylindrischer Hohlkörper anschließt, zwischen zwei für die Lösung durchlässigen

Einrichtungen 3a, 3b angeordnet ist, wobei die Matrix 2 und die Einrichtungen 3a, 3b zusammen 5 bis 50% des

Hohlkörpervolumens ausfüllen und die weitere Öffnung 4a des kegelstumpfförmigen Hohlkörpers 1 an eine Pipette anschließbar ist.

Die Figuren 1 und 2 zeigen schematisch den Aufbau einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vor¬ richtung. Die Matrix 2 wird von zwei Einrichtungen 3a, 3b begrenzt, die gleichzeitig dafür sorgen, daß die Matrix 2 in der gewählten Position fixiert ist. Die Einrichtungen 3a, 3b werden vorzugsweise an der Wandung des Hohlkörpers 1 festgeklemmt. Es kann jedoch neben der Befestigung durch Spannung auch eine Befestigung durch Festkleben der Einrichtungen erreicht werden. Beide Methoden führen zu einer hinreichenden Abdichtung zwischen den Einrichtungen 3a, 3b und der Wand des Hohlkörpers l. Vorzugsweise findet sich zwischen der unteren Einrichtung 3b und der engeren Öffnung 4b ein freier Raum, wobei dieser freie Raum klein sein soll gegenüber dem Gesamtvolumen des Hohlkörpers. Die wei¬ tere Öffnung 4a der beiden Öffnungen 4a und 4b ist so ausgestaltet, daß sie auf eine handelsübliche Pipette passen. Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungs¬ gemäßen Vorrichtung besteht darin, daß der Hohlkörper 1 in Form einer kommerziell im Fachhandel erhältlichen Pipettenspitze (Firma Brand, Gilson, Eppendorf) ausge¬ staltet ist. Die Matrix 2 der erfindungsgemäßen Vor¬ richtung besteht vorzugsweise aus einem porösen Chroma¬ tographiematerial, insbesondere auf der Basis von Sili- cagel, Aluminiumoxid, Titandioxid, Hydroxylapatit, Dex- tran, Agarose, Acrylamid, Polystyrol, Polyvinylalkohol ^'

oder anderen organischen Polymeren, Derivaten oder aus Copolymeren der oben genannten Trägermaterialien. Das die Matrix 2 bildende Material kann auch ein oberfläch¬ lich modifiziertes, poröses Chromatographiematerial auf der Basis von Silicagel, Aluminiumoxid, Titandioxid,

Hydroxylapatit, Dextran, Agarose, Aσryla id, Polysty¬ rol, Polyvinylalkohol oder anderen organischen Polyme¬ ren, Derivaten oder aus Copolymeren der oben genannten Trägermaterialien sein.

Die Wahl des entsprechenden Chromatographiematerials ist abhängig von den jeweiligen zu trennenden und rei¬ nigenden Molekülen und dem Fachmann aufgrund der Regeln der Chromatographie bekannt. So wird beispielsweise ein polares Molekül, wenn es an der Matrix 2 adsorbiert werden soll, nur dann an der Oberfläche der Matrix 2 adsorbiert, wenn entsprechende Wechselwirkungen vorlie¬ gen, die beispielsweise ebenfalls durch polare Gruppen an der Oberfläche der Matrix 2, jedoch mit entgegenge¬ setzter Polarität, vermittelt werden. So können bei¬ spielsweise Ionenaustauschermaterialien als Matrix 2 der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Trennung und Rei¬ nigung von polaren Molekülen eingesetzt werden. Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vor¬ richtung können als Matrix 2 ein Reversed-Phase- und/ oder ein Affinitätschromatographiematerial beinhalten. Die Porengröße der porösen Chromatographiematerialien beträgt vorzugsweise 20 bis 1000 nm, und die Korngröße der Materialien insbesondere 10 bis 2000 μm, vorzugs¬ weise 75 μm bis 125 μm.

Die die Matrix 2 fixierenden Einrichtungen 3a, 3b sind vorzugsweise als poröse Fritten mit Porengrößen von 10 μ bis 1 mm, vorzugsweise 70 μm bis 2000 μ ausge¬ staltet.

Die porösen Fritten können aus Kunststoffen, insbeson¬ dere aus Teflon (PTFE) , Polyethylen, Polypropylen, Po¬ lystyrol, Polyurethan etc. bestehen. Aber auch anorga¬ nische Werkstoffe, wie Glas und/oder gesintertes Metall sind geeignete Materialien zur Herstellung der porösen Fritten.

Die Figuren 3a und 3b zeigen eine weitere Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung, deren einfache Her¬ stellung besonders vorteilhaft ist. In den Hohlkörper 1 wird eine entnehmbare Kartusche 5 eingesetzt, welche die Matrix 2 zwischen den die Matrix fixierenden Ein¬ richtungen 3a und 3b enthält. Die Einrichtung 3b ist dabei über einem netzartigen Träger 6 angeordnet, der vorzugsweise aus demselben Material wie die entnehmbare Kartusche 5 besteht. In besonders vorteilhafter Weise werden der netzartige Träger 6 und die Kartusche 5 in einem Arbeitsgang produziert, beispielsweise im Spritz¬ gußverfahren, wenn Kartuschen aus Kunststoff, insbeson¬ dere Polypropylen, hergestellt werden, über der Ma¬ trix 2 ist die Einrichtung 3a angeordnet, auf der ih¬ rerseits wiederum ein poröser, netzartiger Deckel 7 angeordnet ist. Dadurch wird die Anordnung in der ent¬ nehmbaren Kartusche 5, bestehend aus erster Einrich¬ tung 3b, Matrix 2 und zweiter Einrichtung 3a, zusätz¬ lich fixiert. Die Figur 3b zeigt die Gesamtanordnung, bestehend aus Hohlkörper 1 und entnehmbarer Kartu¬ sche 5. Diese Gesamtanordnung, bestehend aus Kartu¬ sche 5, die Matrix 2 fixierenden Einrichtungen 3a,b und Deckel 7 kann in besonders vorteilhafter Weise mit han¬ delsüblichen Pipettenspitzen kombiniert werden. Im ein¬ fachsten Fall geschieht dies durch Hineindrücken der entnehmbaren Kartusche 5 in den entsprechenden Hohlkör¬ per 1, insbesondere eine Pipettenspitze. Es versteht sich von selbst, daß die Kartusche 5 so dimensioniert ist, daß sie einen leichten Druck auf die Innenwände

der Pipettenspitze ausübt, um bei Aufnahme von Flüssig¬ keit oder einer Probe nicht hochgedrückt zu werden bzw. um die notwendige Abdichtung zur Innenwand des Hohlkör¬ pers 1, vorzugsweise einer Pipettenspitze, und der

Außenwand der entnehmbaren Kartusche 5 zu gewährlei- sten. Die Wandstärke der entnehmbaren Kartusche 5 des netzartigen Trägers 6 und des porösen netzartigen Deckels 7 ist auf die verwendete Pipettenspitze abge¬ stimmt.

Der Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung liegt in der praktischen Handhabung und der Art der Packung der Matrix 2, die einen Fluß der die Moleküle enthaltenden Lösung in Hin- und Rückrichtung zuläßt. Ist der kegel- stumpfför ige Hohlkörper 1 beispielsweise als Pipet¬ tenspitze ausgebildet, so wird die Pipettenspitze in die Probe eingetaucht, die Probe in der Pipettenspitze durch die Matrix 2 hindurch hochgesaugt und anschlies- send herausgedrückt. Dadurch wird eine höhere Effizienz der Adsorption erzielt, da die Probe das Chromatogra¬ phiematerial zweimal passiert. Da man mit einem ge¬ schlossenen System arbeiten kann, wird eine Kontaminie¬ rung der Probe oder eine Gefährdung der Umwelt vermie¬ den. Die erfindungs emäße Vorrichtung erleichtert die Arbeitsweise insgesamt, die bei der Trennung und Reini¬ gung von Molekülen anzuwenden ist. Insbesondere können mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung auch Biopo¬ lymere, insbesondere Nucleinsäuren und Proteine, schnell, einfach und sicher fraktioniert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einer besonderen Ausführungsform durchgeführt mit einem als Pipettenspit- ze ausgestalteten Hohlkörper 1. Die die Moleküle ent¬ haltenden, zu trennenden und reinigenden Moleküle kön¬ nen dann mittels einer Pipette durch die Matrix 2 be¬ fördert werden. Soll die Pipettenspitze als Säulener¬ satz in herkömmlichen Verfahren eingesetzt werden, so

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kann mittels eines Silikonschlauches die Pipettenspitze auch mit einer Einwegspritze verbunden werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet, insbeson¬ dere Biopolymere wie Nukleinsäuren und Proteine zu trennen und zu reinigen, indem als Matrix 2 Ionenaus¬ tauscherchromatographiematerialien, wie sie in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949.3 vorgeschlagen werden, verwendet werden. Es handelt sich dabei um mit Anionenaustauschergruppen oberflächlich modifiziertes Chromatographiematerial auf Silicagelbasis. Befindet sich beispielsweise die Matrix 2 in einer Pipettenspit¬ ze, so saugt man die Nukleinsäure mit der Pipette durch die Matrix 2. Dabei werden unter Verwendung von Puffern niedriger Ionenstärke die langkettigen Nukleinsäuren adsorbiert. Will man die kurzkettigen Nukleinsäuren anschließend verwerten, drückt man die Lösung wieder durch die Matrix 2 hindurch und fängt sie auf. Dann können weitere Verfahrensschritte folgen. Ist man je¬ doch an der Analyse der langkettigen Nukleinsäuren in¬ teressiert, kann man nach einigen Waschschritten die langkettigen Nukleinsäuren durch Elution mit Puffern hoher Salzkonzentration (hohe Ionenstärke) wieder elu- ieren und entsprechend weiterverarbeiten.

Die Figur 4 zeigt ein Elutionsprofil, das bei Verwen¬ dung von Anionenaustauschermaterialien bei der Verwen¬ dung der erfindungsgemäßen Vorrichtung erhalten werden kann. Es zeigt sich, daß bei Verwendung des in der deut¬ schen Patentanmeldung P 36 39 949.3 vorgeschlagenen Materials zur Trennung von Nukleinsäuren ein Elutions¬ profil erhalten wird, durch das mit steigender Ionen¬ stärke Nukleinsäuren mit steigender Kettenlänge eluier- bar werden. So wird doppelsträngige DNS mit Basenpaaren > 500 erst bei einer Ionenstärke von 1,3 M Natriumchlo¬ rid erhalten, während einzelsträngige- DNS des Phagen

M 13 schon bei 1,1 M Natriumchlorid eluiert wird. Die Elutionspeaks sind so scharf, daß sogar "baseline"- Trennungen möglich sind. Bei einer mittleren Ionenstär¬ ke zwischen 0,5 und 1 M Natriumchlorid eluieren Nukle¬ insäuren wie tRNS, 5S RNS und mRNS. Bei niedrigen Ionen- stärken von 0,1 bis 0,5 werden bereits Polysaccharide,

Proteine, Metaboliten, Farbstoffe, einzelne Nukleotide,

Proteine wie BSA (bovine serum albumin) und kleinere

Nukleotide wie beispielsweise ein Nukleotid Decamer, das als "linker" verwendet wird, eluiert.

Eine Verfahrensvariante besteht darin, als Matrix 2 ein Affinitätsadsorbens, wie es beispielsweise in der deut¬ schen Patentanmeldung P 36 27 063 vorgeschlagen wird, zu verwenden. Die Durchführung des Verfahrens erfolgt analog zur oben beschriebenen Verfahrensweise.

Das erfindungsgemäße Verfahren gewährleistet die fol¬ genden Vorteile, insbesondere bei molekularbiologischen Operationen:

- Durchführung von DNS-Präparationen in sogenannten "minipreps",

- Reinigung von RNS, rRNS, viraler RNS und RNS-Tran- skripten,

- Reinigung von Proben, die nach Nicktranslation, End¬ markierung oder 01igonukleotid-induzierter Markie¬ rung (Oligolabeling) erhalten werden,

- Entfernung der DNS-linker in Klonierungsexperimen- ten,

- Reinigung von Nukleinsäuren nach Gelextraktion sowie schnelle Reinigung von Nukleinsäuren nach Abdauung mit Rest-riktionsenzymen, Phosphatasebehandlungen, Polymerasereaktionen usw. anstelle einer zeitaufwen¬ digen Phenolbehandlung.

Die bei Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung erhältliche Reinheit in Routinepräparationen ist zumin¬ dest mit durch Caesiu chlorid-Dichtegradienten-Zentri- fugation erhaltenen Proben vergleichbar. Die isolierten Nukleinsäuren sind befreit von Proteinen, Polysacchari- den und anderen Zell etaboliten und zeigen keinerlei Inhibierung von Enzymen bei enzymatischen Reaktionen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren aus Oligonukleotiden bis hin zu Plasmiden verwendet werden, wobei der Zeit¬ aufwand auf Bruchteile im Vergleich zu anderen Verfah¬ ren eingeschränkt wird.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist geeignet zur Ver¬ wendung in einem Trennungs- und Reinigungsverfahren für Moleküle, vorzugsweise Biopolymere wie Proteine und/ oder Nukleinsäuren, insbesondere von anderen Zellbe¬ standteilen.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in verschiedenen Verfahren wird in den folgenden Beispie¬ len näher erläutert. Dabei wird die erfindungsgemäße Vorrichtung in einer bevorzugten Ausführungsform, der Pipettenspitze, eingesetzt.

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In eine 1 ml Pipettenspitze, passend für Gilson Pipet- an, wird eine 70 μ Polyethylen-Fritte mit 4 mm Durch¬ messer, Dicke 1,6 mm, eingeführt und durch Drücken festgeklemmt. Danach werden ca. 70 mg des Chromatogra¬ phiematerials, vorgeschlagen in der deutschen Patentan¬ meldung P 36 39 949, trocken eingefüllt. Das Chromato¬ graphiematerial wird mit einer wie oben beschriebenen Fritte mit 5,7 mm Durchmesser verschlossen und die Frit- te durch Festdrücken an ihrem Platz fixiert.

Analog verfährt man bei 200 μl fassenden Pipettenspit¬ zen bzw. 5000 μl fassenden Pipettenspitzen.

B e i s p i e l 2

Die allgemeine Handhabung der in Beispiel 1 hergestell¬ ten Pipettenspitze geschieht wie folgt:

Zunächst wird die Pipettenspitze einmal mit 100 μl ei¬ nes geeigneten Adsorptionspuffers äquilibriert. Bei einem zu verarbeitenden Probenvolumen von 100 bis 200 μl reicht es aus, die Probe etwa fünfmal durch das Chromatographiematerial zu drücken. Soll jedoch eine größere Flüssigkeitsmenge verarbeitet werden, wie sie beispielsweise nach Gelelution anfällt, kann die Probe mittels eines Silikonschlauches, der die Pipettenspitze und eine Einwegspritze verbindet, durch die Matrix hin¬ durchgezogen werden. Es ist dann ausreichend, daß die Probe nur zweimal das Chromatographiematerial passiert. Dabei sollte die Fließgeschwindigkeit der Lösung nicht höher als 1 ml pro Minute sein.

Als Äguilibrierungs- und Adsorptionspuffer kann der Puffer A verwendet werden. Puffer A:

400 mM Natriumchlorid 15% Ethanol 50 mM MOPS (3-N-Morphdlinopropansulfonsäure) 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraacetat) pH 7.0

Analog zum oben beschriebenen Adsorptionsvorgang werden die Waschschritte durchgeführt. Als Waschpuffer dienen bei Nukleinsäurepräparationen typischerweise die Puffer B, C und D.

Puffer B : Puffer C:

750 mM Natriumchlorid 1000 mM Natriumchlorid 15% Ethanol 15% Ethanol 50 mM MOPS 50 mM MOPS 1 M EDTA 1 mM EDTA pH 7.0 pH 7.0

Puffer D:

1000 mM Natriumchlorid 50 mM MOPS pH 7.0

Man füllt ein Eppendorf-Gefäß mit 1 ml Waschpuffer und spült dreimal 150 μl durch das Chromatographiematerial, um Verunreinigungen zu entfernen. Dieser Schritt wird wiederholt.

Die Elution der adsorbierten Nukleinsäuren erfolgt wie in beiden vorgangegangenen Schritten entweder mit einer Eppendorf- oder Gilson-Pipette oder mit einer Einweg¬ spritze, wobei darauf zu achten ist, daß die Pipetten¬ spitze mittels eines Silikonschlauches mit der Einweg¬ spritze verbunden ist. Es wird einfach der Elutionspuf- fer E oder F

Puffer E: Puffer F:

1100 mM Natriumchlorid 1500 mM Natriumchlorid 15% Ethanol 15% Ethanol 4 M Urea 50 mM MOPS 50 M MOPS 1 mM EDTA 1 mM EDTA pH 7.50 pH 7.0

durch die Pipettenspitze gesaugt bzw. gedrückt. Dieser Schritt wird einmal wiederholt. Die Eluate werden ver¬ einigt und die Nukleinsäure daraus gefällt.

B e i s p i e l 3

Eine Pipettenspitze, hergestellt nach Beispiel 1, wird mit 50 mM Natriumphosphatpuffer hydratisiert und äqui- libriert, indem man 750 μl Puffer mehrmals durch die

Pipette saugt. Ei.ne Probe, di.e 20 μg Plasmi.d pBR322 DNS in 500 μl 0,5 M Natriumchlorid und 50 mM Natriumphos¬ phat, pH 7, enthält, wird an das Chromatographiemate¬ rial durch fünfmaliges Hochsaugen und Ausdrücken adsor¬ biert. Nicht gebundene Bestandteile und Verunreinigun¬ gen werden durch fünfmaliges Hochsaugen und Ausdrücken von jeweils 1 ml frischem 0,5 M Natriumchlorid und 50 mM Natriumphosphat, pH 7, ausgewaschen. Die Plasmid- DNS wird anschließend mit 1,5 M Natriumchlorid und 50 mM Natriumphosphat, pH 7, eluiert, indem man 1 ml des Elutionspuffers dreimal hochsaugt und ausdrückt.

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Eine Plas id-DNS-Probe wird in einer sogenannten Mini¬ präparation typischerweise durch folgende Schritte ge¬ wonnen:

Die Bakterienzellen werden über Nacht inkubiert und am nächsten Tag durch Zentrifugation geerntet. Das Pellet wird in 85 μl einer eiskalten Lösung von 50 mM Tris- HC1, pH 7.4, mit 2 mg/ml Lysozym (frisch zubereitet) aufgeschlossen und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Danach werden 20 μl einer 0.5 M EDTA-Lösung hinzugefügt und weitere 10 Minuten inkubiert. Nach Zugabe von 4 μl 2%- igem Triton X' 100 inkubiert man auf Eis für eine wei¬ tere Stunde. Die Probe wird in einer Laborzentrifuge 30 Minuten bei maximaler Drehzahl zentrifugiert, und 100 μl des von Zelltrümmern befreiten Zell-Lysates wer¬ den in ein anderes Eppendorf-Gefäß überführt, wonach 1 Volumen 2 M Natriumchlorid, 100 mM MOPS, pH 7, und 5 μl

Isoa ylalkohol zugegeben werden. Eine erfindungsgemäße Pipettenspitze der Firma Gilson, Brand, Eppendorf, her¬ gestellt nach Beispiel 1, wird mit 100 μl Puffer C äqui- libriert. Danach adsorbiert man 100 μl einer E. coli- Plasmid-DNS-Probe an dem Chromatographiematerial, indem man die Probe fünfmal auf- und abpipettiert. Nach der Adsorption wird mit insgesamt 2 bis 5 ml des Puffers C gewaschen, woraufhin die Plasmid-DNS mittels 300 μl des Puffers F eluiert wird. Anschließend fällt man die DNS mit 300 μl Isopropanol, läßt 15 Minuten stehen und zen- trifugiert dann die Probe dann in einer Eppendorf-Labor¬ zentrifuge 30 Minuten lang.

B e i s p i e l 5

Die Isolierung von mRNS, rRNS und viraler RNS von Roh¬ extrakten geschieht wie folgt:

Der RNS-Extrakt wird mit Ethanol gefällt und das erhal¬ tene Pellet in TE-Puffer (10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 7.5) resuspendiert. Man stellt die Adsorptionsbedingungen durch Zugabe von 0.1 Volumenteil (bezogen auf die re¬ suspendierte Lösung) 5 M Natriumchlorid und 0,2 Volu¬ menteile 250 mM MOPS, pH 7.0 ein. Die Pipettenspitze wird mit 1 μl Puffer A äquilibriert. Danach wird die Probe durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren an das Chromatographiematerial adsorbiert. Man spült mit Puf¬ fer A, um Verunreinigungen zu eliminieren. Die Elution erfolgt mit 300 μl des Puffers C. Die RNS wird durch Zugabe von 2,5 Volumenteilen Ethanol gefällt. Nach Ste¬ henlassen bei -20°C, 30 Minuten, wird in einer Eppen¬ dorf-Zentrifuge insgesamt 30 Minuten bei höchster Dreh¬ zahl zentrifugiert. Das Pellet wird vor der Weiterver¬ arbeitung sorgfältig mit Ethanol gewaschen. Die Probe soll einen Nukleinsäuregehalt von höchstens 15 μg ha¬ ben.

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Reinigung von mRNS zur Synthese der entsprechenden cDNS wird wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt.

B e i s p i e l 7

Nicht verbrauchte Triphosphate in Markierungsreaktionen wie Nicktranslationen, Endmarkierungen und Oligonukleo- tid-abhängigen Markierungen (Oligolabeling) von DNS werden wie folgt entfernt:

Die Markierungsreaktion der DNS wird durch Zugabe von 2 μl 0,5 M EDTA pro 20 μl Probenvolumen beendet, und man stellt die Adsorptionsbedingungen durch Zugabe von 1 Volumenteil des Puffers C ein. Die Gesamtsalz-Endkon¬ zentration soll in etwa 500 mM betragen. Die Pipetten¬ spitze gemäß der Erfindung wird mit 100 μl Puffer B äguilibriert. Die Probe wird durch fünfmaliges Hochsau¬ gen und Ausdrücken an das Chromatographiematerial ad¬ sorbiert und insgesamt mit 10 ml des Puffers B gewa¬ schen, um die nicht reagierten Nukleotide abzutrennen. Die Fließgeschwindigkeit des Waschpuffers soll vorzugs¬ weise ca. 5 ml pro Minute betragen. Die markierte DNS wird anschließend mit insgesamt 300 μl des Puffers F eluiert. Die Probe kann direkt weiterverwendet werden, wenn sie mit dem zur Hybridisierung vorgesehenen Puffer mindestens 1:20 verdünnt wird. Anderenfalls wird die Probe ausgefällt und in TE-Puffer gelöst.

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Die Entfernung eines DNS-linkers von einer DNS mit mehr als ca. 400 Basenpaaren in einem Klonierungsexperiment wird wie folgt durchgeführt:

Die zu reinigende Probe wird mit 1 Volumenteil des Puf¬ fers C verdünnt, damit die Endkonzentration an Salz ungefähr 500 mM beträgt. Die erfindungsgemäße Pipetten¬ spitze wird mit 100 μl des Puffers A äquilibriert. Die Probe wird wie in den vorhergehenden Beispielen adsor¬ biert. Die erfindungsgemäße Pipettenspitze wird mit Puffer B gespült, um die Verunreinigungen zu entfernen. Die DNS wird desorbiert und eluiert mit insgesamt 300 μl des Puffers F. Anschließend isoliert man die DNS durch Isopropanolfällung (Zugabe von 1 Volumenteil) und läßt 15 Minuten auf Eis stehen, wonach sich eine Zen- trifugation der Probe in einer Eppendorf-Zentrifuge für die Dauer von 30 Minuten anschließt. Danach wäscht man sorgfältig mit 70%-igem Ethanol.

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Die Schnellreinigung einer DNS-Probe nach enzymatischer Modifizierung (zum Beispiel durch Phosphatase, Restrik- tionsendonuklease, Poly erasen usw. sowie Cofaktoren) erreicht man gemäß folgender Verfahrensweise:

Das zugrunde liegende Reaktionsvolumen beträgt 50 μl und enthält nicht mehr als 100 mM Natriumchlorid. 5 μl 0,5 M EDTA, pH 8.0, werden zum Reaktionsvolumen hinzu¬ gefügt, um die Modifizierungsreaktion abzubrechen. Ein Volumenteil des Puffers C wird zugegeben, um die Adsorp¬ tionsbedingungen einzustellen mit einer Salzkonzentra¬ tion von etwa 500 mM. Die erfindungsgemäße Pipetten¬ spitze wird äquilibriert, die Probe wird adsorbiert und anschließend eluiert wie in Beispiel 8 beschrieben. Auch die weitere Behandlung der Probe geschieht wie in Beispiel 8 beschrieben.

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Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch dazu benutzt werden, um Agarose- und Acrylamid-Verunreinigungen ef¬ fizient abzutrennen. Dies ist insbesondere dann erfor- derlich, wenn Gelelutionen der Probe stattgefunden ha¬ ben. Bei Anwendung der im folgenden beschriebenen Ver¬ fahrensweise wird die DNS gleichzeitig konzentriert, selbst wenn das Startvolumen einige ml beträgt. Die DNS hat eine Größe von > 400 Basenpaaren und kann in einer Menge von 5 ng bis 15 μg vorliegen. Die Probenvorberei¬ tung und die Äquilibrierung der erfindungsgemäßen Pi¬ pettenspitze wird wie in Beispiel 8 beschrieben durch¬ geführt. Dann überführt man die Probe in eine Einweg¬ spritze und drückt sie zweimal durch die erfindungsge¬ mäße Pipettenspitze. Dabei soll die Fließgeschwindig- keit bei etwa 250 μl/ in liegen. Die erfindungsgemäße Pipettenspitze wird anschließend mit 5 ml des Puffers B gewaschen bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 5 ml/min. Die Weiterbehandlung der DNS-Probe geschieht wie in Beispiel 8 beschrieben.