Campo da Invenção

A presente invenção se refere a um processo de fermentação extrativa. Mais especificamente, a presente invenção se refere a um processo de fermentação extrativa que emprega um único solvente capaz de remover produtos e inibidores simultaneamente, e/ou resfriar o meio. Além disso, a presente invenção se refere ao uso do processo, por exemplo, para obtenção de etanol.

Antecedentes da Invenção

É fato conhecido que a obtenção de produtos de fermentação, como ácidos orgânicos, solventes e álcoois, a partir de carboidratos depende muito dos custos de matéria- prima e custos de capital e energia, tornando outros fatores de importância secundária. Desenvolvimento de tecnologia de produção de combustíveis, alcoóis, solventes ou ácidos orgânicos de segunda geração tem como princípio a conversão de biomassa, geralmente ligno-celulósica, amilácea e similares, ou carboidratos diretamente extraíveis, transformando-as em produtos de interesse económico de maior valor agregado.

Na fermentação alcoólica convencional e principalmente na fermentação alcoólica de segunda geração, a produtividade da mesma é limitada por efeitos de inibição, seja pelo produto da fermentação ou por inibidores introduzidos na extração dos carboidratos da matéria-prima ou inibidores provenientes da hidrólise de biomassa ligno- celulósica. O mesmo problema surge também na fermentação para a produção de outros produtos como, por exemplo, acetona, butanol, e produtos do tipo ácido orgânico como ácido acético, ácido propiônico, ácido láctico, ácido succinico, ácido butanóico, entre outros ou qualquer combinação destes. Tecnologias desenvolvidas e atualmente usadas na indústria pretendem diminuir este efeito de inibição por detoxificação do meio antes da fermentação e/ou remoção do produto após a fermentação.

Para evitar a introdução de inibidores durante o processo de extração de carboidratos da matéria-prima, por exemplo cana de açúcar ou beterraba, a temperatura empregada nesta etapa deve ser mantido baixa, em detrimento de maiores rendimentos de extração destes carboidratos que podiam ser obtidos para temperaturas maiores.

Para fermentações de biomassa hidrolisado, pesquisas têm sido realizadas para desenvolver meios de remoção de componentes inibidores do caldo hidrolitico antes da introdução do mesmo no estágio de fermentação.

Um método convencionalmente aplicado é o tratamento alcalino do caldo, por exemplo, a caleação: aumento de pH a 9-10 com hidróxido de cálcio. Além da neutralização do caldo e sedimentação de sais com ácido sulfúrico na forma de gipsita, compostos como furfural e HMF são quimicamente alterados, diminuindo a toxicidade destes inibidores, o qual foi descrito por Martinez e colaboradores, no trabalho intitulado "Detoxification of dilute acid hydrolysates of lignocellulose with lime" publicado na Biotechnology Progress 17; 287-293 em 2001. Porém, o método tem a desvantagem de reduzir a qualidade e a quantidade de açúcar .

Para tratamentos baseados em adsorção de inibidores, como a adsorção por carvão ativo ou troca iônica, uma excelente adsorção dos compostos pode dificultar a regeneração do carvão ou resina, de forma que sua utilização se torna inviável, o qual foi comprovado por Sainio e colaboradores no trabalho intitulado "Adsorptive removal of fermentation inhibitors from concentrated hydrolyzates of lignocellulosic biomass" publicado na Bioresource Technology 102; 6048-6057 em 2011.

A aplicação de todos estes métodos possue efeitos positivos na fermentação, mas a instalação e uso de um estágio separado de tratamento do mosto antes da fermentação encarece o processo, exceto para tratamentos in-situ, como a detoxificação microbiológica in-situ ou extração liquido-líquido utilizando um solvente biocompatível .

O mais simples tratamento microbiológico in-situ emprega a própria levedura de fermento, eventualmente em elevada concentração, para diminuir a toxicidade do meio, ou pela imobilização, reciclo de células ou alimentação controlada na fermentação batelada-alimentada, conforme descreveu Talebnia e Taherzadeh, no trabalho intitulado "In situ detoxification and continuous cultivation of dilute- acid hydrolyzate to ethanol by encapsulated S. cerevisiae" publicado no Journal of Biotechnology 125, 377-384, em 2006.

Porém, a desvantagem destes métodos é a limitada taxa de detoxificação pela levedura, prejudicando o crescimento e produtividade e aumentando o tempo do processo fermentativo, além do acúmulo de inibidores que não podem ser convertidos como vários ânions de ácidos orgânicos conforme comprovou Almeida e colaboradores no trabalho intitulado: "Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae" publicado no Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 82 (2007) 340-349 em 2007.

O regime de fermentação extrativa contínua a vácuo foi estudado por Átala em sua tese de doutorado intitulada "Montagem, instrumentação controle e desenvolvimento experimental de um processo fermentativo extrativo de produção de etanol", FEA/UNICAMP em 2004 para remover o etanol do meio durante a fermentação com um evaporador a vácuo do tipo flash. O sistema, diminui a concentração de etanol no meio até em torno de 5 °GL, ou seja, abaixo do nível de inibição. Em consequência, a fermentação, alimentada com fluxo com alto teor de açúcar (até em torno de 500g/L) , mostrou menor inibição pelo etanol produzido, alta viabilidade e produtividade volumétrica. Além disso, a concentração de etanol no fluxo de vapor proveniente do evaporador pode reduzir custos na recuperação do produto conforme descreveu Junqueira e colaboradores no trabalho intitulado "Simulation and optimization of the continuous vacuum extractive fermentation for bioethanol production and evaluation of the influence on distillation process" publicado no Computer Aided Chemical Engineering 26; 827- 832 em 2009. A alta concentração de substrato resulta em menor quantidade de água utilizado no processo integral de produção de etanol, implicando menor gasto energético, e flegmassa e vinhaça mais concentrados. O último resulta em menor custo de secagem e transporte de vinhaça para os campos de cana para fertilização dos mesmos. Também foi previsto um resfriamento eficiente da dorna, pelo próprio sistema a vácuo.

Neste sistema, ainda não foi estudado o uso de caldo hidrolitico como substrato, a economia do uso de membrana para reciclo de células e o evaporador flash na escala industrial em combinação com a taxa elevada do reciclo pelo sistema. O evaporador a vácuo pode provavelmente diminuir as concentrações de inibidores voláteis como furfural e ácido acético, enquanto outros inibidores como baunilha e 4-hidroxibenzaldeído podem acumular caso a massa celular não seja bastante elevada para conversão efetiva dos mesmos. Também, o estresse elevado do fermento, gerado pela alta taxa de reciclo de levedura pode influenciar negativamente a viabilidade da mesma em sistema de escala industrial, embora este efeito não tenha sido observado na escala de bancada. No entanto, é possível que a baixa concentração de etanol seja de importância maior para manter alta viabilidade. Neste contexto, é importante lembrar que o fator de estresse devido à presença do produto e de inibidores no caldo hidrolitico pode se somar ao estresse que ocorre na membrana celular através do sistema de reciclo de células. Por exemplo, os inibidores fenólicos justamente perturbam a integridade da membrana celular e outros inibidores provocam desvio de ATP para reparos intracelulares, em detrimento de manutenção da integridade da membrana celular.

A fermentação extrativa liquido-liquido envolve a utilização de um solvente biocompativel durante a fermentação alcoólica para remover o produto da fermentação pelo solvente e, sobretudo, diferente de tecnologias semelhantes propostos anteriormente por outros autores, os inibidores no meio provenientes do processo de extração de carboidratos da matéria-prima e/ou de caldo hidrolitico, além de extração de calor deste meio de fermentação.

Há alguns exemplos no estado da técnica onde o solvente empregado não é biocompativel, necessitando a separação da levedura do meio ou vinho antes da extração ou utilização de uma membrana para evitar contato direto entre o fermento e o solvente, como por exemplo, decanol (Minier . , Goma G., 1998, Eckert e Schugerl, 1987, Kapucu e colaboradores, 1999) , isso-octano, octano, gasolina, querosene e diesel (Rahman e colaboradores, 2007) , fluidos supercriticos, como gases comprimidos CO2, etano e propano (Bothun e colaboradores, 2003) para remoção de etanol, ou éter etílico ou acetato de etila (Cruz e colaboradores, 1999) . Nestes casos é impossível também a aplicação do solvente como agente de refrigeração in-situ.

Por outro lado, existem ainda exemplos de utilização de um solvente biocompativel. Kollerup e Daugulis, no trabalho intitulado "Ethanol production by extractive fermentation - solvent identification and prototype development" publicado no The Canadian Journal of Chemical Engineering, 64, 598 - 606 em 1986, fizeram uma avaliação teórica de 1361 possíveis solventes para extração de etanol através de propriedades como coeficientes de partição, biocompatibilidade, disponibilidade e custo. Para a biocompatibilidade foi observado que solventes com uma cadeia de carbono com número de átomos de carbonos menor do que 12 têm efeitos tóxicos ou inibidores no crescimento da levedura (Minier e Goma, 1982) . Exemplos destes e outros solventes descritos no estado da técnica são uso de óleo oléico (Daugulis e colaboradores, 1987, Roffler e colaboradores, 1987, Weilnhammer e Blass, 1994), dodecanol (Gyamerah e Glover, 1996, Minier e Coma, 1981) e ácido oléico para remoção de etanol (Jassal e colaboradores, 1994) ou para produção simultânea de biodiesel (Oliveira e colaboradores, 1998, Csányi e colaboradores, 2004) , ácido ricinoleico ou outros ácidos graxos (Waibel e colaboradores, 2010, Boudreau e Hill, 2006) .

O uso de biodiesel, ésteres metílicos de ácidos graxos de óleos vegetais, para remoção de etanol, butanol ou acetona também foram avaliados e descritos no estado da técnica (Waibel colaboradores, 2010, Grobben colaboradores, 1993, Ishizaki colaboradores, 1999) , mas não para remoção de inibidores provenientes do processo de extração dos carboidratos da matéria-prima, inibidores provenientes do caldo hidrolitico e muito menos a utilização do solvente para agente refrigerante do meio de fermentação. Utilizando álcool oléico em um processo de sacarificação e fermentação extrativa com celulase, Moritz e Duff (1996) chegaram perto de realizar a extração simultânea de produto e inibidores do caldo hidrolitico, mas sua literatura não mostra esta compreensão .

Outros estudos mostram resultados positivos utilizando polímeros para extração de etanol (Seiler e colaboradores, 2003, Offeman e colaboradores, 2008) e, para extração de compostos fenólicos do caldo hidrolitico, polímeros cuja separação do meio é induzida por um aumento da temperatura

(Hasmann e colaboradores, 2008) . A utilização de variações de polietilenoglicol foi revisado por Banik e colaboradores

(2003) . A remoção de etanol por adsorventes, em combinação de levedura imobilizada foi estudada por Cartón e colaboradores (1998) .

Somente para a remoção in-situ de etanol (sem remoção de demais inibidores ou refrigeração do meio) , com solvente biocompatível, o processo foi testado na escala de bancada e modelado, mostrando retornos de custos de investimento para usinas existentes e novos usinas (Daugulis e colaboradores, 1991, 1994) . O processo propiciou a utilização de elevadas concentrações de açúcar, menor inibição de etanol durante a fermentação e menor requisito de energia.

A patente norte-americana US 4,865,973, depositada em 13 de agosto de 1986 em nome de UNIV KINGSTON e intitulada: "Process for extractive fermentation" descreve um processo para a produção de etanol por fermentação acoplado a uma unidade de extração do produto formado, citando o ácido ricinoléico e outros ácidos graxos como opções de solvente. É descrito também que a extração é in situ e listadas como vantagens: diminuição dos custos devido ao tamanho do fermentador, redução dos custos de recuperação do produto devido a maiores concentrações finais e redução do pré- tratamento e custo de tratamento de resíduos, devido ao menor fluxo aquoso. Além disso, o agente extratante pode ser recirculado. A fermentação descrita no referido documento ocorre de 20 a 80 °C.

Empregar um solvente com características iguais ou semelhantes ao biodiesel pode ter um efeito semelhante para a remoção de inibidores desde que todas as demais condições do processo também sejam iguais. Porém, a extração dos inibidores não é apenas um efeito colateral, mas uma tecnologia de pré-tratamento em si, reconhecendo o fato que a remoção deve ser tal que a concentração final dos inibidores no meio de fermentação deve ser igual ou menor à concentração máxima que ainda permite um desempenho satisfatório do micro-organismo . Sabendo que os inibidores mostram efeitos de inibição sinérgicos, agravado por certas faixas de pH e temperatura, o nível da remoção desejável de inibidores se torna um complexo cálculo, envolvendo coeficientes de partição de cada inibidor e a dependência destes coeficientes ao temperatura, pH, concentração de etanol e sais no sistema bifásico. Por isto, o nível de remoção colateral de inibidores empregando o solvente no primeiro lugar apenas para remoção do produto como sugerido pelos outros autores do estado da técnica, dificilmente é satisfatório no uso de caldo hidrolítico como matéria- prima, ainda mais porque a concentração natural dos inibidores dependa muito de modo de preparo desta matéria- prima, seja por hidrólise ácida ou hidrólise enzimática. O último também vale para inibidores em mostos obtidos por extração de carboidratos da matéria-prima, como cana-de- açúcar ou beterraba, cujas concentrações dependem principalmente da temperatura empregada neste processo de extração .

Nestes casos, será necessário empregar uma etapa de pré-tratamento do mosto em um estágio anterior da fermentação, enquanto que a tecnologia proposta pela presente invenção pretende, justamente, entre outros, tornar tal etapa obsoleta.

Contudo, a remoção simultânea e satisfatória de inibidores empregando um solvente para remoção in situ de produto da fermentação, não é óbvia e não foi descrito e muito menos sugerido no estado da técnica. A remoção dos inibidores pode acontecer, mas a remoção suficiente para um bom desempenho do processo fermentativo depende, entre outros, da taxa de vazão do solvente, temperatura, pH, concentração de compostos polares, como também o produto da fermentação, concentrações de outros componentes como sais, que podem promover ou limitar a remoção dos inibidores além de contribuir à inibição total, mesmo que a remoção do produto seja satisfatória para os processos de extração liquido-liquido do produto como sugerido no estado da técnica .

Observa-se que a utilização do solvente como agente de refrigeração do meio, não é descrito por outros autores. O resfriamento convencional, por reciclo externo do meio da fermentação através de trocadores de calor ou serpentinas de resfriamento na dorna, é desvantajoso por formação de incrustações a partir do próprio meio, entre ouros. Estas incrustações dificultam o transporte de calor, aumentam o risco de contaminação, promovem formação de biofilmes e complicam a troca de calor pela baixa condução térmica e a limitação dos gradientes de temperatura disponíveis. Outras desvantagens de tais equipamentos de refrigeração são choque térmico para a levedura; estresse físico para levedura causado pelo fluxo alto do meio na tubulação e a ainda a necessidade de equipamento de resfriamento externo.

Para que um agente possa funcionar como agente de refrigeração, a entalpia específica do solvente no momento de introdução do mesmo no meio da fermentação, a taxa de vazão do solvente, e a integral da capacidade de calor do solvente sobre a faixa de temperatura entre a temperatura do solvente e a temperatura final do meio, são fatores determinantes na capacidade de resfriamento pelo solvente. De fato, o solvente só funciona como agente de refrigeração quando o mesmo é introduzido com temperatura abaixa da temperatura do meio de fermentação.

O que é revelado na presente invenção é a refrigeração completa do meio pelo solvente, tornando obsoleto um sistema secundário de refrigeração convencional. Para este objetivo, a temperatura e taxa de vazão do solvente precisam ser calculados com precisão, prevendo a geração de calor por atividade metabólica e agitação do meio. Afinal, a temperatura do meio não pode ser muito baixa, nem muito alta, para garantir um bom desempenho da fermentação. Esta requisição torna o usufruto do solvente como agente de refrigeração, permitindo resfriamento por contato direto, dispensando superfícies de troca térmica. Sendo assim, o uso do solvente para fins de refrigeração do meio não foi previsto, descrito ou muito menos sugerido em nenhum documento do estado da técnica.

O pedido de patente internacional WO 2009/042950, depositado em 26 de setembro de 2008, em nome de LS9 INC e outros e intitulado: "Reductíon of the toxic effect of impurities from raw materiais by extractive fermentation" descreve a produção de etanol e butanol por fermentação seguida da extração in si tu e o agente também é reciclado. Contudo, no referido documento o solvente utilizado não é definido .

O pedido de patente internacional WO 2010/100642, depositado em 02 de março de 2010 em nome de EYAL RES CONSULTANTS LTD e EYAL AHARON e intitulado: "Fermentation processes" descreve um método de produção de pelo menos um produto de fermentação e um derivado do mesmo, compreendendo entre as etapas, a de fornecer uma solução aquosa fermentável compreendendo um composto fermentável . No referido documento ocorre remoção de inibidores com octanol, e sugestões de tratamento com carvão ativo, adsorção, tratamento com calor, base, trocador de íons e separação utilizando membrana. Uma desvantagem do referido documento está na remoção de inibidores fora da dorna, a qual necessita o impedimento da geração de inibidores no processo de extração de carboidratos da matéria-prima usando temperaturas baixas, e/ou uma etapa de pré- tratamento do mosto a base de ligno-celulose, que requer maior investimento em equipamento e menor eficiência do processo em geral.

O artigo de Grobben N. e colaboradores, intitulado "Production of acetone, butanol and ethanol (ABE) from potato wastes : fermentation with integrated membrane extraction" publicado no Applied Microbal Biotechnology 39, 494-498, em 1993 descreve a produção de butanol, acetona e etanol (ABE) a partir de resíduos de batata através de fermentação com extração de membrana integrada. O referido artigo menciona somente a aplicação de biodiesel como solvente extratante. Além disso, o referido artigo não menciona e nem sugere o uso in-situ do solvente.

O artigo de Boudreau T. M., e colaboradores, intitulado "Improved ethanol-water separation using fatty acids", publicado na Process Biochemistry 41, 980-983 em 2006, descreve uma separação aperfeiçoada de etanol-agua usando ácidos graxos. O artigo descreve a extração de somente o produto e sem a utilização do solvente como agente de refrigeração.

Neste caso, será necessário empregar uma etapa de pré- tratamento do caldo em um estágio anterior da fermentação para fermentação de mosto a base de caldo hidrolítico, enquanto que a tecnologia proposta pela presente invenção pretende, entre outros, justamente tornar tal etapa obsoleta .

Como pode ser observado, nenhum documento do estado da técnica descreve ou muito menos sugere abordagens de combinar o pré-tratamento do mosto com a remoção de produto inibidor do meio de fermentação por extração liquido- liquido. Portanto, esta lacuna é a matéria principal da presente invenção. Além disso, não há exemplos no estado da técnica de refrigeração do meio de fermentação pelo solvente, muito menos em combinação com extração simultânea de produto e/ou inibidores. A extração líquido-líquido pode tornar a fermentação um processo mais eficiente, causando menos estresse à levedura e resultando em menor custo energético .

Sumário da Invenção

Para solucionar os problemas acima mencionados, a presente invenção, baseada em fermentação extrativa, propiciará vantagens significativas em relação aos processos fermentativos convencionais, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/beneficio mais favorável.

A presente invenção se refere a um processo fermentativo extrativo para mostos provenientes de processos hidroliticos de matéria-prima ligno-celulósica, amilácea, carboidratos diretamente extraíveis, melaços fortemente esgotados com alto conteúdo de inibidores como, entre outros, biotina, ou mostos similares, ricos em carboidratos e com objetivos de fermentação. Especificamente, a presente invenção se refere ao uso de um solvente biocompativel, tais como biodiesel de óleo de soja, de milho, de mamona, de palmeira-de-óleo-africana (dendezeiro) , de macaúba, entre outros, como agente extrator para a extração in-situ e simultânea de produto e/ou componentes inibidores da fermentação, especificamente o produto da fermentação e compostos inibidores presentes no mosto, e/ou como agente refrigerante do meio da fermentação, sendo o último em combinação ou não com as finalidades de extração de produto e/ou inibidores.

A produtividade da fermentação em termos de produtos como etanol, butanol, propanodiol, 2-3 butanodiol, acetona, enzima, aminoácidos, como o ácido glutâmico, lisina e glutamato monossódico, ácidos orgânicos como ácido acético, ácido propiônico, ácido láctico, ácido succinico, ácido butanóico, matéria-prima para bioplásticos e outros produtos, é limitada pela concentração do próprio produto, ou seja, existe um efeito de inibição pelo produto. Além disto, fermentação de biomassa de ligno-celulose ou outro tipo de biomassa, é limitada pela inibição química do processo devido a inibidores presentes nesta matéria-prima. Estes inibidores, sendo os principais furfural, HMF, compostos fenólicos e ácidos carboxílicos, inibem a fermentação em termos de crescimento microbiano e taxa de produção. Mesmo efeito ocorre causado por inibidores presentes em outros tipos de mosto como mostos preparados com açúcares diretamente extraíveis da matéria-prima, como cana-de-açúcar ou beterraba, quando a temperatura do processo de extração dos carboidratos desta matéria-prima é mais elevada, muitas vezes resultando em maiores rendimentos de extração.

O mosto final pode também conter componentes orgânicos como, por exemplo, a biotina, que inibem fermentações mais específicas como a biosíntese de aminoácidos, como o ácido glutâmico, lisina e glutamato monossódico.

A presente invenção possibilita a remoção de todos estes compostos do meio de fermentação, acelerando o processo. Assim, a tecnologia proposta pela presente invenção efetivamente viabilizará a produção de biocombustiveis a partir de biomassa, ou seja, combustíveis de segunda geração, assim como outros produtos a partir de biomassa hidrolisada, possibilita o uso de maiores temperaturas nos processos de extração de carboidratos de matérias primas como cana-de-açúcar e beterraba, resultando em maiores rendimentos deste processo, e possibilitará e promoverá o uso de mostos em qeral que contêm compostos com efeitos inibidores extraíveis pelo solvente.

Na presente invenção, a etapa de pré-tratamento do mosto e a da remoção do produto são integradas. Desta forma, a remoção in-situ de produto e demais inibidores do meio de fermentação com solvente biocompatível, sem ou com utilização do solvente como agente refrigerante, de fato elimina a necessidade de uma unidade extra de tratamento do meio e pode aumentar o retorno sobre o investimento total do processo de produção, tanto por aumento da produtividade e do rendimento, quanto por diminuição de custos energéticos e de água utilizada no processo integral.

O próprio solvente pode também ser utilizado para o resfriamento do processo fermentativo. A fermentação é um processo exotérmico, ou seja, calor está sendo gerado durante a conversão do substrato. Este calor pode ser efetivamente retirado do meio de fermentação utilizando o próprio solvente em sistema continuo, sendo que o solvente pode ser introduzido na dorna com baixa energia interna após resfriamento prévio e eventual estocagem do mesmo. Desta forma, a temperatura da fermentação pode ser mantida em torno da ótima, devido a grande superfície de troca de calor, resultado da propriedade de liquidez do solvente e rapidez de se misturar com o meio, resultando em menores gradientes de temperatura na dorna e, consequentemente, elevando a eficiência em geral, tanto em termos de custos energéticos, como em termos de custos de equipamento de refrigeração e manutenção.

Breve Descrição das Figuras

A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e a seguinte descrição:

A Figura 1 mostra o processo da presente invenção de forma simplificada, onde (A) é a entrada de mosto

(substrato) ; (B) é uma opcional entrada do micro-organismo reciclado; (C) é a entrada de solvente; (D) é a saída de solvente e produto; (E) é a saída de vinho com fermento;

(F) é a saída de mistura de produto e água; (G) é a saída de vinho clarificado; (H) é a saída do produto purificado e (I) é a saída de resíduos e sub-produtos .

A Figura 2 mostra o diagrama de blocos de um processo com a tecnologia proposta pela presente invenção.

A Figura 3 mostra a biocompatibilidade do biodiesel (4A) e óleo de mamona (4B) e produção de dióxido de carbono durante a fermentação sem fase orgânica (linha pontilhada) , com biodiesel (círculo preto) e com óleo de mamona (triângulo branco) .

A Figura 4 mostra um desenho esquemático explicando como o solvente tem a capacidade de absorção de certa quantidade de água, ocorre concentração de açúcar durante a extração, levando a fermentação a um rendimento maior

A Figura 5 mostra um gráfico de barras com a absorção de água e etanol em oléo de mamona e biodiesel para várias concentrações de etanol na fase aquosa.

As Figuras 6, 7 e 8 mostram os resultados para a fermentação A, B e C, onde (A) é a fermentação sem inibidores, sem solvente; (B) é a fermentação com inibidores, sem solvente; e (C) é a fermentação com inibidores, com solvente.

As Figuras 9 e 10 mostram os perfis de concentração de furfural, furfuril-álcool, baunilha e álcool baunílico durante a fermentação sem solvente e com solvente, respectivamente . A Figura 11 mostra um gráfico de comparação de viscosidade entre óleo de mamona e biodiesel para várias temperaturas .

A Figura 12 mostra um fluxograma de uma planta de fermentação extrativa conforme a presente invenção.

A Figura 13 mostra um fluxograma de uma planta de fermentação extrativa com uma dorna, conforme uma primeira modalidade da presente invenção.

A Figura 14 mostra um fluxograma de uma planta de fermentação extrativa com três dornas, apenas a primeira dorna mantendo uma camada orgânica conforme uma segunda modalidade da presente invenção.

A Figura 15 mostra um fluxograma de uma planta de fermentação extrativa para fermentação em regime de batelada ou batelada alimentada, com uma dorna conforme uma terceira modalidade da presente invenção.

A Figura 16 mostra um fluxograma de uma planta de fermentação extrativa para fermentação continua com resfriamento e remoção de inibidores em todas as dornas, conforme uma quarta modalidade da presente invenção.

A Figura 17 mostra uma modalidade da presente invenção de um processo esquemático com fluidos e unidades de processamento de um sistema de fermentação extrativa. Os estágios do processo na linha pontilhada foram modelados. Descrição Detalhada da Invenção

Embora a presente invenção possa ser suscetivel a diferentes modalidades, é mostrada nos desenhos e na seguinte discussão detalhada, uma modalidade preferida com o entendimento de que a presente modalidade deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui.

A presente invenção se refere a um processo de fermentação extrativa. Mais especificamente, a presente invenção se refere a um processo de fermentação extrativa que emprega um único solvente capaz de remover produtos e inibidores simultaneamente, além de resfriar o meio. Além disso, a presente invenção se refere ao uso do processo.

A presente invenção revela um processo de fermentação extrativa com alta produtividade, que será capaz de tornar máxima e rápida a conversão de carboidratos fermentescíveis obtidos por extração ou hidrólise química em produtos.

0 que ocorre é que alguns compostos contidos nos hidrolisados puros, sendo os principais furfural, HMF, compostos fenólicos e ácidos carboxílicos, inibem a fermentação em termos de crescimento e taxa de produção.

A tecnologia proposta pela presente invenção possibilita a remoção in-situ destes componentes por meio de um agente extrator biocompativel . Este procedimento de eliminação do efeito inibidor destes componentes resultará em um incremento da produtividade do micro-organismo, viabilidade, eficiência da fermentação, e elevado estabilidade do processo, assim como favorecendo uma fermentação rápida e com alta taxa de conversão do substrato. No caso dos produtos extracelulares, além dos inibidores presentes no mosto o próprio produto da fermentação, que inibe o processo a partir de certa concentração, também será removido pelo solvente. Para produtos intracelulares, como por exemplo, lipídeos, polihidroxialcanoatos e várias enzimas, a presente invenção aplica-se a remoção dos inibidores provenientes do mosto e/ou ao resfriamento do meio de fermentação.

Matérias-primas e insumos

A matéria-prima preferencial vislumbrada para a aplicação da tecnologia envolve hidrolisados de material sólido ligno-celulósicos, amiláceos, como bagaço de cana- de-açúcar, hidrolisado de amido de milho ou mandioca. Podem também envolver o uso de carboidratos diretamente extraíveis, como carboidratos convencionalmente usadas na fermentação: melaço, caldo de cana, extrato de beterraba e melaços fortemente esgotados com alto conteúdo de inibidores, como biotina, além de mostos similares, ricos em carboidratos e com objetivos de fermentação ou ainda qualquer combinação ou derivado dos mesmos, daqui em diante denominado como 'mosto' . Sendo carboidratos a denominação geral de substratos para fermentação como sacarose, glicose, frutose, xilose, arabinose, entre outros.

Para certas fermentações, a escolha da matéria-prima do mosto ou a concentração dos carboidratos no mosto é limitada pela presença de inibidores naturais como a biotina.

Uma das principais vantagens da tecnologia proposta pela presente invenção é justamente a remoção de inibidores presentes no mosto, provenientes do caldo de extrato da matéria-prima, do licor hidrolisado, ou de outra fonte, como ácidos carboxilicos, como ácido acético, derivados de furano, como furfural e hidroxi-metil furfural, e compostos fenólicos, como a baunilha, álcool coniferilico, catechol, entre outros. Compostos naturais no mosto que exibem propriedades inibidoras, como biotina, também podem ser removidos pela tecnologia proposta.

A presente invenção é baseada no uso de um agente extrator biocompatível, aqui em diante denominado como 'solvente' , durante a fermentação. O solvente utilizado como fase orgânica, especificamente parte da especificidade da presente invenção envolve um biodiesel selecionado do grupo que compreende óleos vegetais tais como óleo de soja, óleo de milho, óleo de mamona, biodiesel de dendezeiro e biodiesel de macaúba . Outros líquidos biocompativeis também podem ser utilizados, como álcoois com cadeia longa (álcool oléico, fitol, isofitol, álcool estearílico, álcool cetíloco, octildodecanol) , ácidos graxos (ácido ricinoléico, ácido oléico, ácido linoléico, ácido linolênico, ácido láurico, ácido palmítico, ácido palmitoléico, ácido esteárico) , etanoatos (dodecil acetato, butil dodecanoato) , ou outros substâncias de cadeia longa como dibutilsebacate, di (2-etilhexil) sebacato, dibutiladipato, di (2-etilhexil) adipato, di(2- etilhexil) ftalato, di (3, 5, 5-trimetilhexil ) phthalato, glicerol tridecanoato, 2-dodecanone e dodecanal . Preferencialmente é empregado um éster metílico ou éster etílico de um ácido graxo, como o ácido ricinoléico.

0 ácido ricinoléico (ácido cis-12-hidroxioctadeca-9- enoico) é uma molécula de cadeia longa, tendo um grupo hidroxila na posição C-12. Este grupo hidroxila aumenta a polaridade da molécula, favorecendo coeficientes de partição de inibidores e produtos de fermentação com características polares. A dupla ligação em posição C-9 favorece menor viscosidade. A fonte do ácido graxo pode ser um produto agrícola como óleo de mamona que possui uma porcentagem de 85 a 90% de ésteres de ácido ricinoléico.

O solvente tem um ponto de ebulição maior do que o produto e os inibidores voláteis, e seu tamanho é tal que limita a difusão e integração com a parede celular do micro-organismo, o que prejudicaria a viabilidade e o crescimento do mesmo.

Mais especificamente, o solvente tem as seguintes propriedades essenciais e favoráveis:

• Coeficientes de partição favoráveis aos componentes a ser extraídos (inibidores e/ou produto) ;

• Seletividade alta para os componentes de interesse (produto e inibidores) em comparação com outros componentes (substrato e minerais) ;

• Imiscível em água e com solubilidade desprezível na fase aquosa;

• Capacidade de absorção de certa quantidade de água, elevada pela fração de etanol no solvente, que efetivamente concentra o substrato na fase aquosa diminuindo a perda do mesmo e assim aumentando o rendimento do produto;

· Baixa toxicidade (fato positivo para o elemento humano - operadores da empresa, para o ambiente e para o organismo empregado na fermentação (bio-compatibilidade) ;

• Possibilidade de recuperação do produto do solvente e sua regeneração;

• Não formação de emulsões (estáveis) durante a fermentação e o processamento ^Λ down-stream' em condições de baixa turbulência do meio;

· Separação rápida de fases orgânica e aquosa;

• Alta estabilidade química, independente de utilização de altas temperaturas na recuperação ou outros componentes como ácidos presentes no processo;

• Baixo ponto de fusão e viscosidade na faixa de temperatura utilizada, e ponto de ebulição acima da faixa da temperatura utilizada;

• Baixo custo e possibilidade de produção do mesmo no local ;

Possibilidade de ser utilizado como combustível, biodiesel, após vários ciclos de uso como solvente do processo .

O solvente pode ser injetado a baixas temperaturas, de forma a atuar no resfriamento do meio fermentado, para manter a temperatura desejada. O produto de fermentação é extraído pelo solvente, que é retirado do biorreator, sendo em seguida retificado com retirada de produto e contaminantes inibidores, e reciclado continuamente, livre de produtos e inibidores . O diagrama apresentado na Figura 1 ilustra o processo de forma simplificada.

O processo da presente invenção propicia a utilização de elevadas concentrações de carboidratos, menor inibição pelos inibidores provenientes do mosto e pelo produto inibidor (etanol, butanol, acetona, propanodiol, 2-3 butanodiol, ácidos orgânicos, solventes, enzimas, aminoácidos, como o ácido glutâmico, lisina e glutamato monossódico, terpenos, matéria-prima para bioplásticos, entre outros) durante a fermentação e menor requisito de energia .

Produtos

A presente invenção revela um processo de fermentação extrativa com alta produtividade, que será capaz de tornar máxima e rápida a conversão de carboidratos fermentescíveis obtidos por extração ou hidrólise química em produtos como: butanol, acetona, propanodiol, 2-3 butanodiol, xilitol, ácidos orgânicos como ácido acético, ácido propiônico, ácido láctico, ácido succínico, ácido butanóico, ácido cítrico, enzimas, aminoácidos como o ácido glutâmico, lisina e glutamato monossódico, terpenos, matéria-prima para bioplásticos, lipídeos, polihidroxialcanoatos, o próprio fermento, ou outros produtos orgânicos ou qualquer combinação destes, aqui em diante denominado como ^produto' . O foco da presente invenção é etanol, mas as características dos sistemas bifásicos envolvendo a distribuição de um componente com polaridades menores do que a polaridade de etanol, que é o caso para, por exemplo, butanol, acetona e a maioria dos aminoácidos e outros produtos mencionados acima, inevitavelmente mostrarão um bom desempenho em termos de extração, melhor até do que o próprio etanol. Isto porque, comparando com o etanol, os coeficientes de partição de componentes com menor polaridade são maiores, e como a seletividade para estes componentes são maiores, então a extração para a fase orgânica será favorecida.

Nota se que vários produtos mencionados podem ser produzidos como produtos intracelulares, produtos extracelulares , ou uma combinação disso, dependendo do(s) micro-organismo (s) empregado (s) e a sua capacidade de transporte do produto pela parede celular.

Para produção de biomassa ou produtos intracelulares como, por exemplo, em muitos casos lipídeos, polihidroxialcanoatos, várias enzimas e aminoácidos, a presente invenção aplica-se apenas à remoção de inibidores provenientes do mosto e/ou ao resfriamento do meio de fermentação .

O que ocorre é que alguns compostos contidos nos hidrolisados puros, sendo os principais furfural, HMF, compostos fenólicos e ácidos carboxilicos, inibem a fermentação em termos de crescimento e taxa de produção. Efeitos similares de inibição ocorrem para mostos preparados por extração de carboidratos da matéria-prima, por exemplo, da cana-de-açúcar ou beterraba, processo em que altas temperaturas promovem altos rendimentos de extração, porém provocam a geração de tais inibidores.

Equipamentos

A fermentação extrativa pode ser executada de forma continua, batelada ou batelada alimentada e com preferência de forma continua. A dorna de fermentação, necessária para a execução do processo fermentativo, deve ter uma entrada para o solvente, com preferência na parte inferior da mesma, possivelmente integrada no agitador ou nos defletores, contando com uma pressão bastante alta para superar o peso da coluna das fases aquosa e orgânica do conteúdo da dorna.

O volume da dorna deve ser maior do que a soma da fase aquosa e a fase orgânica empregada, sendo que a razão do volume destas fases pode ser ajustada para qualquer razão entre 1:0.01 á 1:20.

Demais equipamentos necessários para a produção e recuperação do produto e a reciclagem do solvente podem ser: misturador de meio, coluna de absorção, decantador, cascata de destiladores, destilador, retificador, centrífuga, válvula ou equipamento para sangramento de uma fração de células do fermento, equipamento para reativação celular de eventual fermento reciclado, trocadores de calor, e outros

A Figura 2 representa o diagrama de blocos de um processo com a tecnologia proposta pela presente invenção. Processo biológico

O processo biológico para conversão de substrato para produto envolve uma fermentação empregando um microorganismo como, mas não limitado a, levedura, como Saccharomyces cerevisia ou bactéria, como Zymomonas mobilis, geneticamente modificado ou não, entre outros ou em quaisquer combinações destes, aqui em diante denominado como ^λ fermento' . O fermento consome fontes de carbono como sacarose, glicose, frutose e/ou xilose, arabinose ou quaisquer combinação destes, e converte-os em produtos tais como etanol, butanol, acetona, propanodiol, 2-3 butanodiol, xilitol, ácidos orgânicos como ácido acético, ácido propiônico, ácido láctico, ácido succínico, ácido butanóico, ácido cítrico, enzimas, aminoácidos como o ácido glutâmico, lisina e glutamato monossódico, terpenos, matéria-prima para bioplásticos, lipídeos, polihidroxialcanoatos, o próprio fermento ou outros produtos orgânicos ou qualquer combinação destes. O processo pode ser executado em condições anaeróbicas ou empregando aeração, dependendo das necessidades microbiológicas do fermento empregado para produção do produto desejado. Eventuais inibidores presentes no meio de fermentação são removidos do meio pelo solvente, completamente ou parcialmente. Produtos extracelulares, muitas vezes um fator inibidor a partir de certas concentrações como no caso de etanol para Saccharomyces cerevisiae, também são parcialmente removidos do meio pelo solvente. Desta maneira, o desempenho do micro-organismo em termos de taxa de crescimento, viabilidade, produtividade volumétrica e especifica e rendimento pode ser otimizado, assim como o uso de energia do processo total de produção incluindo a recuperação e purificação do produto e o reciclo do solvente.

A fermentação é um processo exotérmico, ou seja, calor está sendo gerado durante a conversão do substrato. Este calor pode ser efetivamente retirado do meio de fermentação utilizando o próprio fluxo de solvente em sistema continuo, sendo que o solvente pode ser introduzido na dorna com baixa energia interna após resfriamento prévio e eventual estocagem do mesmo. Desta forma, a temperatura da fermentação pode ser mantida em torno da ótíma, com menores gradientes de temperatura na dorna e com mais eficiência em geral, tanto em termos de custos energéticos quanto em termos de custos de equipamento e manutenção.

O processo de fermentação extrativa de acordo com a presente invenção compreende as seguintes etapas:

a) Entrada de um mosto rico em carboidratos no biorreator;

b) Entrada de um inoculo no biorreator;

c) Injeção do solvente no biorreator;

d) Remoção do solvente do biorreator;

e) Recuperação do solvente;

f) Purificação da fase vapor;

g) Remoção da fase aquosa do biorreator;

h) Recuperação do micro-organismo .

Na presente invenção, a etapa de detoxificação do mosto, previstas em casos como descritos acima, e de remoção do produto do meio de fermentação, são integrados. Desta forma, a remoção in-situ de produto e demais inibidores do meio de fermentação com solvente biocompativel de fato facilita a concentração do produto, elimina uma unidade extra de tratamento do mosto e diminui o custo total de produção de etanol, tanto em termos de aumento de produtividade quanto em termos de minimizar custos energéticos e de água utilizada no processo integral .

A etapa (a) é de alimentação do biorreator com mosto proveniente de processos hidroliticos de matéria-prima ligno-celulósica, amilácea, carboidratos diretamente extraiveis, melaços fortemente esgotados com alto conteúdo de inibidores, como biotina, entre outros ou mostos similares ricos em carboidratos, onde o conteúdo do fermentador é composto por uma fase aquosa e outra orgânica.

A etapa (b) é de entrada de um inoculo no biorreator, por reciclagem, onde uma pequena fração do micro-organismo é adicionada, ou por reativação, empregando tratamento aeróbico, tratamento ácido e/ou alimentação de nutrientes. Esta etapa pode ou não ser opcional, e esta escolha depende do tipo de produto, sendo indicada na produção de produtos extracelulares e não aplicada para a produção de produtos intracelulares, onde a parede celular do fermento será perfurada ou destruída para obtenção de produtos como lipídios, enzimas, polihidroxialcanoatos, entre outros.

A etapa (c) é de injeção do solvente no biorreator, que ocorre pelo fundo do biorreator ou através de furos nos propulsores e/ou defletores. 0 solvente é injetado no fermentados a baixas temperaturas, variando entre -10 e 25 °C . O solvente pode conter oxigénio estéril para auxiliar nos mecanismos de manutenção do micro-organismo . A densidade do solvente é relativamente baixa, o que faz com que este flua naturalmente para a parte superior do biorreator, onde se forma uma camada orgânica, sendo que outra fração permanece parcialmente dispersa na fase aquosa. Por outro lado, a agitação do meio pode resultar em maior mistura do solvente no meio de fermentação, aumentando a superfície de troca de calor e o tempo em que esta superfície está exposta ao meio. O solvente funciona, portanto, como um extrator ΐη-situ do produto, inibidores e/ou calor do meio de fermentação.

Na etapa (d) , o solvente é removido do biorreator, com agitação limitada do meio, preferencialmente da parte superior, onde o mesmo é consequentemente mais rico em produto, por decantação ou centrifugação, após ou durante a fermentação .

Na etapa seguinte (e) o solvente é enviado para uma unidade de recuperação do mesmo. Como o solvente tem uma volatilidade menor que a água e o produto, os últimos podem então ser recuperados pelo aquecimento e evaporação a vácuo e pode ser reintroduzido no biorreator.

Inibidores voláteis podem ser removidos também nesta etapa. Para produtos sensíveis a altas temperaturas, como no caso de várias enzimas, ou produtos de baixa volatilidade, como no caso de aminoácidos, esta etapa pode ser modificada para prevenir o prejuízo à estrutura molecular do mesmo ou possibilitar a sua purificação. Neste caso podem ser aplicados outros métodos de separação como a utilização de um segundo solvente com maior volatilidade, ultrafiltração, aplicação de campos eletromagnéticos, diminuição da solibilidade do produto, por exemplo, por aplicação de baixa temperatura ou modificação da polaridade do solvente, entre outros.

A fase vapor, composta por produto da fermentação e água, é enviada para setores de purificação, como colunas de separação ou destilação e retificação (etapa (f) ) .

A camada aquosa é bombeada do biorreator como vinho (etapa (g) ) e, opcionalmente, o micro-organismo pode ser recuperado por centrifugação, ultrafiltração, separação por membrana ou qualquer método de separação e concentração de células, na etapa (h) .

Como mencionado anteriormente, para produtos intracelulares, a etapa (h) pode ser utilizada para a concentração das células. Já para produtos extracelulares, como por exemplo no caso de etanol produzido por levedura, a maior parte do inoculo pode ser re-utilizada, enquanto que a fase leve é enviada para o setor de tratamento final como vinho clarificado, podendo ser as colunas de destilação ou separação e retificação. O setor de tratamento final gera o produto e resíduos ou subprodutos, como vinhaça, flegmassa e óleo-fúsel, por exemplo.

Podem-se citar os seguintes benefícios da tecnologia proposta pela presente invenção:

• Reduzir o custo energético do processo integral de fermentação e recuperação do produto;

• Controle da inibição causada pelo produto da fermentação e/ou pelos produtos secundários originados do mosto, resultando em maior eficiência de fermentação e maior produtividade volumétrica e estabilidade de processo;

• Maior viabilidade dos micro-organismos, elevada estabilidade microbiana geral e menores riscos de aplicação de micro-organismos geneticamente modificados;

• Uso de maiores concentrações de açúcar, implicando menor necessidade de água, energia e menos resíduos no final do processo (por exemplo, para a vinhaça do processo de produção de etanol que é atualmente de 11 a 13 L/L EtOH, pode passar a 3-5 L/L EtOH) ;

• Aplicação em processo contínuo ou batelada alimentada. Durante fermentação contínua, uma vantagem adicional é a redução da perda de substrato: a taxa de escoamento de solvente pode ser utilizada como um fator extra de controle para eliminar comportamento oscilatório no bioprocesso;

• Resfriamento implícito do meio de fermentação pelo solvente, introduzindo-o na dorna com baixa energia interna, eliminando a necessidade de dispendiosa instrumentação externa de refrigeração, que introduz um fator de stress desnecessário ao micro-organismo;

• Utilização do solvente pode também resultar em menores concenrações de impurezas na vinhaça, promovendo a opção de reciclo da vinhaça no processo, resultando em menores quantidades de água utilizado no processo e menos energia necessária para tratamento da vinhaça;

• O solvente agirá como tampão de inibidores, assegurando por muito tempo certa quantidade limitada de inibidores também na fase aquosa, que pode atuar como antibiótica natural, porque organismos contaminantes como vírus e bactérias são expostos a efeitos inibidores similares aos efeitos para o micro-organismo produtor (ex. levedura);

• Assegurar por muito tempo certa quantidade limitada de inibidores na fase aquosa pode aumentar o rendimento da fermentação porque para certas concentrações de furfural o rendimento de etanol sobre glicose pode ser mais elevado devido à balança na via metabólica de NADA(P) e inibição expressão reprimida ou induzida de enzimas chaves.

• Utilização de um solvente renovável com base biológica, como o biodiesel sugerido nesta invenção, pode diminuir o custo do extrator, por ser produzido em ampla escala e opção de produção no local pela própria usina e, após de várias reciclagens no processo fermentativo, pode ser re-utilizado como combustível.

Como exemplo, a presente invenção pode ser aplicada na fermentação alcoólica convencional e, mais preferencialmente, na fermentação alcoólica de segunda geração. Porém, a tecnologia proposta pela presente invenção pode ser aplicada também na fermentação para a produção de outros produtos com propriedades adequadas para extração pelo solvente, sendo, por exemplo, acetona, butanol, propanodiol, 2-3 butanodiol, ácido acético, ácido lático, ácido propiônico, ácido butanóico, ácido succínico, enzimas, aminoácidos, como o ácido glutâmico, lisina e glutamato monossódico, terpenos, matéria-prima para bioplásticos, entre outros ou qualquer combinação destes. O processo da presente invenção também possibilita a recuperação de sub-produtos provenientes do caldo hidrolisado como furfural e compostos fenólicos, que tem valor económico. Na produção de hidrogénio especificamente, a composição de cerca 35-50% de etanol-água no fluxo de solvente proveniente do fermentador é ideal na reformação a vapor de etanol por catálise, eliminando uma etapa de destilação neste processo.

Como pode ser observado, o diferencial do processo da presente invenção está no uso do biodiesel, como agente extrator biocompativel para a extração ίη-situ e simultânea de produto e componentes inibidores da fermentação, especificamente o produto da fermentação e compostos inibidores presentes no mosto, sendo provenientes do hidrolisado da biomassa, do processo de extração de carboidratos da matéria-prima, ou diretamente provenientes da matéria-prima. Outro diferencial é o uso do solvente como agente refrigerante no processo fermentativo, em combinação ou não com o uso como agente de extração de componentes inibidores.

Outros agentes extratores, tóxicos ou biocompativeis, foram explorados no estado da técnica, in-situ, ou fora da dorna, mas não o biodiesel proposto pela presente invenção, muito menos para o combinatório dos objetivos de extração de componentes inibidores e/ou refrigeração.

O diferencial de uso do preferido solvente, biodiesel, no processo da presente invenção é grande, sendo que ele é renovável e sua produção sustentável. Além de ser um agente extrator adequado em termos de biocompatibilidade, propriedades extrativas e propriedades físicas, tal como baixa viscosidade.

O preferido solvente tem vantagens implícitas como produção no local a partir de óleo vegetal e re-utilização como combustível após várias reciclagens, como proposto no processo da presente invenção.

EXEMPLO I

Comparação de óleo vegetal e biodiesel com base em óleo vegetal como solvente orgânico para extração de inibidores de fermentação in-situ em bagaço hidrolisado.

O óleo de mamona e seu etilester, de agora em diante indicado como "biodiesel", são comparados em termos de biocompatibilidade, coeficientes de partição para vários inibidores, substratos e etanol, viscosidade e absorção de água. A absorção de água pode ser significante por concentrar o substrato na fase aquosa, por um lado, mas diluir o produto de fermentação na fase orgânica, por outro lado. As fermentações de licor hidrolítico sintético também são realizadas para verificar o esperado aumento do desempenho de etanol solvente-mediado .

Biocompatibilidade

A biocompatibilidade dos solventes (óleo de mamona e biodiesel com base neste óleo) foi determinada utilizando quatro frascos Erlenmeyer (125mL) , equipados com pescoço de cisne para saída de dióxido de carbono. O pescoço de cisne continha aproximadamente 2 mL de ácido sulfúrico para secagem do gás de exaustão. O meio de fermentação foi composto de 10 g/L peptona, 10 g/L extrato de levedura, 2,5 g/L K ₂ HP0 ₄ e 60 g/L glicose e foi autoclavado a 121 °C por 15 min. O meio do inoculo foi similar e utilizou-se uma cepa industrial de Saccharomyces cerevisiae (Santa Adélia) , previamente repicada em placas de petri com agar-agar da mesma composição. Após 12 horas de incubação, 50 mL do inoculo foi adicionado a cada frasco. A dois frascos também se adicionaram 10 mL de um dos solventes. O peso de cada frasco foi monitorado durante a fermentação, utilizando uma balança analítica (Scientech SA210) , indicando a perda de dióxido de carbono. A variação dos pesos dos frascos com e sem solvente orgânico foram comparados para verificar a biocompatibilidade dos solventes. A Figura 3 mostra o perfil de peso para a fermentação com e sem solvente. Pode- se ver que não há, praticamente, diferença entre os dois processos, provando a biocompatibilidade de ambos os solventes.

No fim da fermentação, todos os frascos com solventes extrativos tiveram uma perda de 3% dióxido de carbono a menos por litro do que os frascos sem solvente, mas como houve retardo consistente no perfil de perda de peso dos frascos com solvente orgânico, isso pode ser indicador de que houve acúmulo de dióxido de carbono na camada orgânica, ao invés da falta de biocompatibilidade .

Absorção de água e etanol

O solvente tem a capacidade de absorção de certa quantidade de água, que se eleva na medida em que se eleva a fração de etanol no solvente, o que efetivamente concentra o substrato na fase aquosa como ilustrado na figura 4. Visto que o micro-organismo empregado na fermentação converte o substrato até que este atinja uma determinada concentração no final da fermentação ou na saída de uma fermentação contínua, a perda total do substrato, em termos da quantia absoluta, diminui, ou seja, o rendimento da fermentação aumenta.

A absorção de água no solvente foi determinada para várias concentrações de etanol na fase aquosa (0 a 200 g/L) . Para ambos os solventes, biodiesel e óleo de mamona, foi construído um sistema bifásico a partir de 5 gramas de água Milli-Q, 5 gramas de solvente orgânico e uma quantia de etanol.

O sistema foi mantido em banho-maria a 34 °C sem agitação por 48 horas para que se estabelecesse um completo equilíbrio. Depois deste período amostras da fase orgânica foram transferidas para um balão de evaporador rotativo, com um peso conhecido, e mantido sob baixa pressão (0.5 bar) a 35°C em evaporador rotativo (Marconi MA120) . Determinou-se o peso do balão com balança analítica em intervalos de 5 minutos até o peso estabilizar, significando a completa remoção do etanol e água previamente presentes na fase orgânica. Uma amostra da fase aquosa foi retirada, filtrada com um exemplar de filtron 0.22 (Millipore) , e a concentração de etanol foi analisada com HPLC, equipado com um auto-sampler (Varian 9095) , um detector de UV (Varian 9095) , um detector de índice refrativo (Varian RI-4) , uma bomba binária (Varian 9010) e usando uma coluna de separação Aminex HPX-87H (Bio-Rad, 7.8*300 mm), com um Biorad micro-guard Cation-H125-0129 pre-coluna, a 25° C, e 5 mM H2SO4 como a fase móvel a 0.7ml/min. As concentrações de etanol e água na fase orgânica foram calculadas a partir do balanço de massa do sistema bifásico, utilizando a conhecida massa total de água e etanol presentes no sistema e a concentração de etanol na fase aquosa.

Como resultado, foi observado que o biodiesel absorveu quantidades significantes de água e em média duas vezes mais água do que etanol. Não há relação constante de água absorvida e etanol absorvido, como sugerido por Malinowski et al. (1993) para álcool oleico. Na Figura 5 pode-se observar que com o aumento das concentrações de etanol na fase aquosa, ambos os solventes orgânicos absorveram mais etanol e água e a razão entre água e etanol absorvida diminui. O biodiesel absorveu 2.4 a 6.8 vezes mais água do que o óleo de mamona, enquanto a absorção de etanol foi aproximadamente a mesma para ambos os solventes orgânicos.

Embora uma relação clara da razão água-etanol na fase orgânica com a concentração de etanol na fase aquosa não pudesse ser concluída pelos dados experimentais, um aumento na proporção de absorção etanol/água pode ser vista como aumento de concentração de etanol, especialmente para biodiesel .

Isto significa que com uma concentração mais alta de etanol na fase aquosa, o etanol é relativamente mais absorvido. Isso é muito mais significativo no caso de biodiesel, onde ambas frações de água e etanol absorvidas são maior com aumento da concentração de etanol. Enquanto que a diferença em absorção de água é considerável entre biodiesel e óleo de mamona, a diferença em absorção de etanol reside mais dentro dos padrões de desvio dos experimentos .

Frise-se que, com outro produto, por exemplo butanol, outras quantidades podem ser esperadas.

No todo, o biodiesel apresenta uma vantagem sobre o óleo de mamona quanto à maior absorção de água e pode assim como efeito concentrar substratos na fase aquosa durante a fermentação, o que leva a uma redução na perda de substratos em fermentações continuas ou aumento na produção e rendimento para fermentação em regime batelada e batelada alimentada .

Coeficientes de partição

Os coeficientes de partição (ver equação abaixo) foram determinados para subprodutos de hidrólise: furfural, 5- hidroximetil-furfural, baunilha, seringaldeido, aldeído coniferílico e ácido acético. Também foram determinados os coeficientes de partição para a glicose, sacarose, frutose, xilose e para glicerol e etanol.

W

YYl — —

P (coeficiente de partição)

org onde: m _p é o coeficiente de partição (-) ,

w _org : a fração mássica do componente na fase orgânica (-) , w _aq : a fração mássica do componente na fase aquosa.

Todos os coeficientes foram determinados para seis diferentes concentrações de etanol na fase aquosa na faixa de 0 a 200 g/L. Para cada um destes componentes e para cada concentração de etanol, foi estabelecido o sistema bifásico em um tubo Eppendorf contendo 1 grama de uma solução de lg/L do componente, exceto para etanol, em água Milli-Q como a fase aquosa e 1 grama de biodiesel como a fase orgânica. O sistema bifásico foi mantido fechado e não agitado por 48 horas em um banho-maria a 34 °C antes de centrifugar por 5 minutos a 2000 RPM. Uma amostra de cerca de 500 mg da fase orgânica foi adicionada a 700 mg água Milli-Q, formando um segundo sistema bifásico de extração reversa do componente. Este sistema bifásico reverso também foi mantido sem agitação por 48 horas a 34 °C. As fases aquosas dos sistemas bifásicos originais e bifásicos reversos foram analisadas em um equipamento HPLC . As medições de HPLC para glicose, xilose, glicerol e etanol foram feitas usando uma coluna de intercâmbio de ion (Bio- Rad, Aminex HPX-87H 7.8* 300mm) , a 25°C e 5 mMH ₂ S0 como fase móvel a 0.7ml/min; a deteção foi feita por um detector de índice de refração (Varian RI-4) . Ácido acético e ácido láctico foram separadas com a mesma coluna, mas quantificadas com um detector UV (Varian 9095) a 210nm. Furfural, furfural 5-hydroxymetilo, baunilha, syringaldeído e coniferylaldeído, foram retidos usando uma coluna C-18 (pBondapak, 10 μιη, 3.9*300nm) e quantificados com detecção UV (Varian 9095) em extensão de ondas que eram mais apropriadas para cada composto individualmente. Uma solução de acetonitrila em água foi usada como eluente (lml/min) . Os eluentes foram preparados com água Milli-Q, filtrada com 0.45 filtro μπι (Millipore) .

A partir do balanço de massa sobre o sistema bifásico original e reverso, foram determinados os coeficientes de partição para cada componente e para cada concentração de etanol na fase aquosa. Todas as medidas foram executadas em duplicatas ou triplicatas e os resultados resumidos na tabela 1.

Os coeficientes de partição dependem muito da quantidade de etanol presente no sistema bifásico. Coeficientes de partição para HMF e furfural aumentam com o aumento da concentração de etanol. Por entanto, para baunilha, seringaldeido e aldeído coniferilico os coeficientes de partição tendem a diminuir com maior concentração de etanol no sistema.

Pode ser visto também que para estes componentes existem coeficientes de partição máximas para concentrações de etanol dentro da faixa escolhida de 0 a 200 g/L e, mais especifico, para concentrações abaixo de 80 g/L. Coincidentemente, este valor é em torno da concentração de etanol que é visto como a concentração a partir da qual a inibição por etanol é significativa, em temperaturas padrões de fermentação de acordo com o trabalho de Rivera e colaboradores, de 2006 e incorporado aqui por referência em sua totalidade. Durante a fermentação etanólica, os maiores coeficientes de partição de biodiesel podem então ser explorados sem prejuízo de inibição por etanol.

Para os substratos sacarose, glicose, frutose e xilose, os coeficientes de partição são relativamente pequenos, até desprezíveis, com valores de 0,04 para glicose e frutose até 1,2· IO ^"3 para xilose. A seletividade para açúcares é baixa e os coeficientes de partição para os substratos estudados são desprezíveis e ainda diminuem para maiores quantidades de etanol no sistema.

Coeficientes de partição de glicerol, ácido acético e ácido láctico são relativamente baixos e não maiores do que 0,3. Para a extração destes componentes, biodiesel não tem um desempenho ideal. Contudo, a concentração ótima de etanol na fase aquosa para exploração máxima de coeficientes de partição de glicerol, ácido acético e ácido láctico encontra-se abaixo de 80 g/L.

O mesmo experimento foi feito, sendo que foi substituído o biodiesel por óleo de mamona. Do balanço de massa sobre os sistemas bifásicos, sendo o sistema original e o sistema secundário como acima descrito para biodiesel, os coeficientes de partição foram determinados para cada componente e para cada concentração de etanol na fase aquosa . Os coeficientes de partição medidos são representados na Tabela 1. Até as concentrações de etanol de 100g/L na fase aquosa, o biodiesel supera o desempenho do óleo de mamona como agente extrator para todos os componentes inibidores de fermentação medidos, sendo HMF, furfural, baunilha, siringaldeido e coniferil aldeído ácido acético e ácido lático. Aparentemente, todos esses compostos têm mais afinidade com biodiesel do que o óleo de mamona. Entretanto, essa afinidade depende fortemente da quantia de etanol presente no sistema de duas fases. Os coeficientes de partição para HMF e furfural aumentam com a crescente concentração de etanol, pelo menos até 100g/L de etanol na fase aquosa.

Este também é o caso para coeficientes de partição de baunilha, siringaldeido e coniferilaldeído no caso do óleo de mamona como solvente orgânico, mas no caso do biodiesel, cada coeficiente de partição, tende a diminuir mais rápido com a quantia crescente de etanol no sistema. Também pode ser visto que os valores máximos dos coeficientes de partição desses compostos são atingidos para concentrações de etanol dentro da faixa de concentração de etanol escolhida de 0 a 200g/L, mas que as concentrações de etanol para atingir estes valores máximos, não são os mesmos para biodiesel e óleo de mamona. Para o biodiesel como solvente orgânico, as coeficientes de partição máximas podem ser encontradas para concentrações de etanol mais baixas de do que para o óleo de mamona. Coincidentemente, para o biodiesel, essas máximas são encontradas no etanol abaixo de 80 g/L, concentração na qual o etanol se torna um inibidor para a fermentação, na maioria das temperaturas padrão de fermentação (Rivera et al., 2006). Durante a fermentação de etanol, as propriedades extrativas de biodiesel podem assim serem exploradas ao máximo enquanto a inibição pelo etanol ainda pode ser mantido baixa.

Para os substratos sacarose, glicose, frutose e xilose, nenhuma diferença significante pode ser vista entre as coeficientes de partição para biodiesel e óleo de mamona, mas em todos os casos os coeficientes de partição são relativamente pequenos, com valores medidos variando entre 0.04 para glicose e abaixo de 1.2Ί0 ^"3 para xilose. Além disso, coeficientes de partição para os substratos estudados diminuem frente a uma quantidade aumentada de etanol no sistema, para ambos, biodiesel e óleo de mamona.

Assim, como desejado, a seletividade para o açúcar é desprezível em ambos os casos, biodiesel e óleo de mamona como solvente orgânico. O uso de qualquer desses solventes durante a fermentação consequentemente não conduzirá a nenhuma diminuição significante em concentrações de açúcar na fase aquosa.

No geral, a ótima concentração de etanol na fase aquosa para máxima exploração dos coeficientes de partição para glicerol, o ácido acético e ácido lático podem ser encontrados abaixo de 80 g/L.

Tabela 1: Coeficiente de partição de vários compostos para biodiese (BD) e Óleo de Mamona (CO) na presença de concentrações diferentes de etanol . na fase aquosa

CO < 0,01 0,37 1, 1 0,5 2,5 0,025 0,040 0,040 0,0026 0,044 0,006 0,0019

37 BD 0,26 2,1 3,7 1 ,8 28 0,018 0,033 0,034 0,0018 0,068 0,127 0,096 0,12 CO < 0,01 0,45 1,0 0,4 2,6 0,0092 0,027 0,027 0,0032 0,023 0,048 0,0024 0,09

74 BD 0,17 2,3 2,8 1,4 29 0,0073 0,022 0,022 0,0012 0,084 0,258 0,070 0,12 CO 0,012 0,85 1,5 0,6 3,8 0,011 0,024 0,024 0,0038 0,021 0,068 0,0042 0,11

110 BD 0,40 2,4 1,8 0,97 22 0,0046 0,020 0,023 0,0014 0,041 0,304 0,065 0,12 CO < 0,01 1,5 5,4 1,98 16 0,0061 0,019 0,019 0,0034 0,018 0,076 0,0084 0, 12

149 BD 0,49 2,5 1,5 0,86 18 0,0093 0,020 0,021 0,0014 0,054 0,337 0,071 0,15 CO 0,15 1,4 4,5 1,84 13 0,0075 0,022 0,019 0,0022 0,018 0,104 0,013 0,14

183 BD 0,61 2,5 1,4 0,81 15 0,0022 0,014 0,014 0,0016 0,038 0,346 0,068 0.15 CO 0,19 1,4 4,1 1,72 9,7 0,0058 0,017 0,018 0,0018 0,016 0,102 0,013 0,17

Fermentações

Foram executadas fermentações para ilustrar a viabilidade técnica da presente invenção. Como inibidores foram escolhidos furfural, ácido acético e baunilha, representando os grupos principais de inibidores: furanos, ácidos carboxílicos e compostos fenólicos.

Estes inibidores, foram introduzidos no pré-inoculo, no inoculo e nas fermentações finais na razão furfural : ácido acético :baunilha de 1:2.2:0.6 g/L, que é uma razão representativa para caldo hidrolitico. Além destes inibidores, os meios foram preparados com 10 g/L de peptona, 10 g/L extrato de levedura, 2.5 g/L de K ₂ HPO ₄ e 110 g/L de glicose, esterilizados em autoclave a 121°C por 15 minutos. A incubação do inoculo foi feita em Erlenmeyer, utilizando um agitador (Tecnallab TE420) a 34°C e 150rpm e monitorando a densidade ótica a cada 12 horas, usando um espectrofotômetro (Beckman Coulter DU 640) a 600nm.

A biomassa das fermentações finais foi determinada pela massa seca de cada amostra, tendo cada uma sido lavada duas vezes com água milliQ. Estas fermentações finais, executadas empregando uma cepa de Saccharomyces cerevisiae industrial (Usina Santa Adélia) em faixas de temperatura entre 30 e 37 °C e pH entre 4.0 e 4.5, foram distintas de seguinte forma:

A. Fermentação sem inibidores, sem solvente

B. Fermentação com inibidores, sem solvente

C. Fermentação com inibidores, com solvente

Os volumes das fermentações A e B foram de 1L de meio. Para a fermentação C, um total de 400mL do solvente foi adicionado a 800mL de meio. Antes da fermentação, o solvente foi lavado 4 vezes em bateladas de cada 500mL cada com 2500mL de água destilada a 25°C, utilizando borbulhamento de ar comprimido com fluxo de 0.2 L-min ^-1 durante 2 horas. Com este método, bolhas de ar levam uma micro-camada de água limpa para a fase orgânica, na parte de superior do sistema bifásico. Na superfície desta fase a bolha quebra, espalhando a água na superfície da camada de biodiesel e submerge em seguida, levando impurezas até a fase aquosa inferior. Entre cada ciclo de lavagem, o solvente foi deixado por duas horas antes da drenagem da camada aquosa. Amostras desta fase aquosa foram analisadas com HPLC para garantir a remoção completa de traços de glicerol, etanol e outras impurezas. Depois de repetir o processo da lavagem, o solvente foi transvazado, secado e clarificado em evaporador rotativo (Marconi MA 120) a 55 °C e 0.5 bar .

Massa seca do fermento e concentrações de substrato, inibidores e produto (etanol) foram determinados através de amostras obtidas durante as fermentações. As Figuras 6, 7 e 8 mostram os resultados para a fermentação A, B e C.

As Figuras 9 e 10 mostram os perfis de concentração de furfural, furfuril-álcool, baunilha e álcool baunílico durante a fermentação sem solvente (Figura 9) e com solvente (Figura 10) . O resultado destas fermentações mostra a viabilidade do invento processo, que pode ser resumido de seguinte forma: comparando-se a fermentação sem inibidores (A) , que demorou 24 horas, com a fermentação com inibidores e sem solvente (B) , que demorou 90 horas para ser concluída, verifica-se que houve um aumento de quase 4 vezes no tempo de fermentação.

Assim, a introdução de solvente no fermentador com inibidores, reduziu o tempo total de fermentação, que voltou a ser de 24 horas, ou seja, quatro vezes menor, aproximadamente. Corrigindo o volume aquoso para 20% menos, estas quantias correspondem a uma redução de tempo de fermentação de 67%.

Além da desintoxicação do meio pelo solvente, ocorre a desintoxicação natural por via metabólica do fermento. Quanto ao furfural e a baunilha, o mecanismo de desintoxicação microbiológica funciona com a redução de furfural a álcool furfurílico e baunilha à álcool baunílico. A princípio, o furfural é reduzido com uma taxa que decresce quando a concentração de furfural torna-se menor. A redução de baunilha, ao contrário, é mais vagarosa ou negligente inicialmente, e depois a completa conversão de furfural, suas taxas aumentam até toda a baunilha tenha sido reduzida.

A fermentação com inibidores, mas sem solvente (Figura 9) permanece em fase lag até furfural e baunilha serem convertidos a níveis menos tóxicos, no o caso a partir de 60 horas. A partir deste momento, a fermentação continua de maneira convencional durante as mesmas 24 horas, como visto para fermentação sem inibidores (A) .

Na presença do solvente (Figura 10) , a fermentação alcoólica começa logo após de introdução de levedura ao meio, Neste caso, os inibidores são distribuídos entre a fase aquosa e a fase orgânica. A concentração dos inibidores na fase aquosa é consequentemente menor do que na fermentação B, e a levedura que está somente susceptível aos inibidores nesta fase aquosa, tem uma necessidade menor de desintoxicar o meio para manter um desempenho fermentativo viável.

Na presença do biodiesel, o mesmo padrão de redução pode ser visto como foi o caso para a fermentação sem solvente, com exceção de duas observações principais. Primeiramente, há uma fase de retardo de 5 horas antes do furfural começar a ser reduzido significantemente, enquanto que a redução dos inibidores na fermentação B começa diretamente depois da introdução do inoculo no meio. Embora que o inoculo cresceu sob condições inibidoras iguais para ambas as fermentações, a levedura tinha que induzir novamente sua capacidade metabólica para reduzir o furfural, mas foi acionada a fazer isso mais tarde em fermentação C e em uma menor extensão. As concentrações mais baixas de furfural, baunilha e ácido acético na fase aquosa podem ter reduzido a necessidade de uma reação imediata à presença desses compostos tóxicos. Em segundo lugar, a taxa máxima de redução especifica de furfural, calculada a partir da somma da redução na fase aquosa e na fase orgânica, é maior no sistema bifásico (0.27 g-g ^"1 -]! ^-1 ) do que na fermentação sem solvente (0.05 g-g^-h ^'1 ) . Para baunilha, uma diferença semelhante é vista: 0.20 g*g ^~1 'h ^~1 redução especifica versus 0.03 g-g^-h ^-1 ;. Aparentemente, o mais baixo nivel de inibição sinérgica na presença de uma fase orgânica permite uma redução de furfural e baunilha mais efetiva. Assim, enquanto na presença de uma fase orgânica a concentração de furfural à qual a levedura é exposta (0.9 g-l ^-1 na fase aquosa) é mais baixa do que na fermentação sem a fase orgânica (2 g'l ^~x ) a taxa de redução especifica é de cinco para seis vezes mais alta.

Portanto, para fermentação de licor hidrolisado, manter a concentração dos inibidores limitada é importante tanto para a taxa de crescimento da levedura quanto para a redução mais rápida dos inibidores e, assim, para a produtividade do processo fermentativo em geral.

A alta taxa de redução de furfural resultou na redução total do furfural em 13 horas, bem antes do fim da fermentação. Isto tem implicações para o rendimento de etanol comparado com glicerol, que é maior enquanto furfural está presente no meio em baixas concentrações. Por outro lado, a taxa de crescimento especifica e taxa de produção especifica de etanol sofrem na presença de inibidores .

As concentrações de ácido acético não são mostradas, mas aumentaram levemente durante as fermentações. A tabela 2 resume diversos parâmetros de fermentações para cada lote de fermentação.

Tabela 2: Concentrações iniciais de inibidores e parâmetros de fermentação na seguinte ordem: máximo crescimento especifico, redução de furfural e baunilha e taxas de etanol , etanol, glicerol e produção de biomassa .

furfural vanillin acetic acid biodiesel

g i- ¹ g r ¹ g r ¹ % g g h- ¹ g g - ¹ g g h- ¹ g g - ¹ g-i^h- ¹ g g- ¹ g g- ¹ g-9 ^"1

0 0 0 0 0,47 - - 1,7 3,4 0.46 0.040 0.043

2 1,2 4,4 0 0,09 0,05 0,03 1,2 3,0 0.41 0.014 0.018

2 1,2 4,4 33,3 0,13 0,27 0,20 1,3 4,1 0.45 >0.026 0.045

Em contraste, foi mostrado no estado da técnica que a redução das taxas de furfural aumentou com concentrações mais altas de furfural até 4 g'1 ^"1 do furfural. Para concentrações ainda maiores, as taxas de redução diminuíram conforme apresentado no trabalho de Palmqvist et al . , em 1999 e incorporado aqui em sua totalidade por referência.

Provavelmente, o efeito da toxicidade sinérgica da baunilha e ácido acético em combinação com o furfural diminui a concentração de furfural, para a qual a taxa de redução do mesmo é máximo. Uma implicação importante desta observação é que para fermentações executadas em regime batelada alimentada, com mosto contendo inibidores como furfural, independente da aplicação de uma fase orgânica, as taxas de conversão de furfural e baunilha podem ser mais favoráveis do que para a fermentação em regime batalada, sendo que a alimentação regulada no regime de batelada alimentada permite manter as concentrações dos inibidoras constantes, mas baixas. Entretanto para a viabilidade de uma fermentação continua, a inibição do crescimento pode ser o real fator limitador ao invés da taxa máxima conversão dos inibidores, mesmo sendo que a taxa de conversão será menor do que para fermentações em regime batelada ou batelada alimentada como se nota também por Horvath et al., 2001, incorporado aqui em sua totalidade por referência.

Ainda por cima, antes de chegar às condições de ^washout' da biomassa na fermentações em regime continuo, os baixos níveis de conversão do substrato causarão a perda do mesmo e baixos níveis da taxa de produção de etanol. Assim especialmente para fermentações contínuas, o sistema proposto de duas fases é uma opção prometedora para a produtividade e rendimento aumentado com menor dependência de taxas de redução dos inibidores pelo próprio fermento.

Portanto, o processo de fermentação da presente invenção pode ser otimizado para a obtenção de máximo rendimento, otimizando-se a vazão de substrato alimentado e vazão da fase orgânica pelo sistema, e no caso de fermentação em batelada ou batelada alimentada, mantendo-se em nível ótimizado a concentração de inibidores presentes no meio, até o final da fermentação.

Viscosidade

Para ambos os solventes, biodiesel e óleo de mamona, foram feitas medidas de viscosidade usando um reômetro Physica MCR301 (Anton Paar GMbh, Graz, Áustria), equipado com placa paralela de aço (75mm de diâmetro, abertura de 0.5mm) . As medidas para montagem da curva de fluxo foram realizadas em triplicatas com a taxa de cisalhamento variando de 0 a 300s ^-1 . Um programa de passos sobe-desce- sobe (up-down-up) foi realizado a fim de avaliar a tixotropia do produto avaliado.

O comportamento do fluxo do biodiesel e do óleo de mamona foi modelado a fim de obter parâmetros reológicos (tensão de cisalhamento (σ ₀ ) , índice de consistência (K) e índice de comportamento do fluido (n) ) , de acordo com o modelo Herschel-Bulkley e incorporado aqui por referência em sua totalidade, das quais foi determinada a viscosidade.

O efeito de temperatura sobre a viscosidade do biodiesel e óleo de mamona foi estudado dentro da faixa de 5 a 40 °C, usando um intervalo de temperatura de 5°C entre cada medida. Os resultados desse efeito da temperatura na viscosidade foram avaliados de acordo com a equação de Arrhenius, e incorporado aqui por referência em sua totalidade . σ ^-σ ο ⁺ ^ (modelo Herschel-Bulkley)

ÍEA 1

ln( ) = ln(77 ₀ ) +

^ J ¹ (equação de Arrhenius)

Onde η: viscosidade (Pa's) , E _a : energia de ativação para fluido viscoso (Jmol^K ^-1 ) , T: temperatura (K) .

Para ambos, biodiesel e óleo de mamona, a tensão de cisalhamento demonstrou uma forte relação linear com a taxa de cisalhamento com intercessão a zero nos dois eixos e uma regressão média de 0.9999 para todas as temperaturas. Consequentemente não há tensão de cisalhamento (σ _ο ) e a índice de comportamento de fluxo (n) é igual a 1, conduzindo a um comportamento Newtoniano com um índice de consistência (K) igual à viscosidade (η) na mesma temperatura .

A Figura 11 mostra o efeito da temperatura sobre a viscosidade do biodiesel e óleo de mamona. Grafiçando o logaritmo natural da viscosidade contra o inverso da temperatura em Kelvin observa-se uma relação claramente linear para ambos os solventes, com regressões de 0.999. Para os dois, biodiesel e óleo de mamona, o aumento de temperaturas resultou em viscosidades decrescentes. Entretanto, o biodiesel, consistentemente teve uma viscosidade mais baixa que o óleo de mamona, para todas as temperaturas, o que era esperado já que o biodiesel foi originalmente desenvolvido para ser combustível substituto de petróleo com baixa viscosidade. Para o biodiesel e óleo mamona, l"|o é encontrado 3.126"10 ^~8 e 5.751 ^'11 respectivamente; η _ο de biodiesel é portanto mais alto que o de óleo de mamona, mas ambos são relativamente pequenos. E _a foi encontrado 33556 para biodiesel e 57431 para óleo de mamona, o que significa que a energia de ativação necessária para iniciar o fluxo é consideravelmente mais baixa para biodiesel, e pode ser entendida, que a temperatura necessária para baixa viscosidade é muito mais alta para o óleo de mamona. Escolha do agente extrator preferido

Ambos, biodiesel e óleo de mamona, demonstram ótima biocompatibilidade com levedura industrial. Porém, conforme demonstrado nos itens acima, o biodiesel em base de óleo de mamona, solvente sugerido na presente invenção, tem diversas características que o tornam uma escolha interessante como agente de extração para fermentação extrativa in-situ de inibidores como provenientes da biomassa ligno-celulósica hidrolisada ou outros mostos e matérias-primas definidos acima com fins de fermentação. É relativamente barato e um bioproduto renovável que pode ser produzido localmente. É biodegradável e um produto que, depois de diversos ciclos de utilização como agente extrator e/ou agente refrigerante, pode ainda ser vendido ou usado com biocombustível para a própria frota da usina ou subsidiários.

Mais específico, o biodiesel tem a menor densidade em comparação com o óleo de mamona, favorecendo sua separação do caldo de fermentação.

Outra vantagem do biodiesel é que absorve mais água e etanol do que o óleo de mamona, o que, de fato, concentra substrato na fase aquosa. Para uma fermentação em regime batelada ou batelada alimentada, isso significa que o açúcar é mais concentrado no final da fermentação, promovendo a produtividade máxima neste estágio da fermentação, e aumenta o rendimento de fermentação em regime continuo.

Os coeficientes de partição para os principais inibidores de fermentação são mais altos para biodiesel, resultando na remoção desses inibidores do caldo de fermentação em favor do processo de fermentação como um todo .

Para uma fermentação em regime batelada ou batelada alimentada, a produção de etanol começa mais cedo e as taxas de produção serão mais altas do que sem um solvente extrativo. Para uma otimização do uso das capacidades extrativas do biodiesel, a concentração de etanol na fase aquosa deveria ser ligeiramente mais abaixa que 50-80 g/l, coincidentemente a concentração em que o etanol se torna inibidor.

A comparação de uma fermentação convencional sem inibidores, uma fermentação com inibidores e uma fermentação com inibidores e biodiesel, confirmam o efeito positivo do uso de biodiesel para uma série de fermentação com furfural, baunilha e ácido acético em termos de tempo de fermentação total, taxas de crescimento e taxas de produção de etanol .

Operações Unitárias envolvidas e Fluxograma de modalidades do Processo da Presente Invenção

A Figura 12 mostra um exemplo de um possível fluxograma de uma planta de produção de etanol por fermentação extrativa, baseada na tecnologia proposta pela presente invenção. Segundo o diagrama, o meio é preparado no misturador. Após o preparo e um procedimento de tratamento térmico, o meio é resfriado por um trocador de calor e introduzido no fermentador, onde o substrato será convertido em produto (seja etanol, butanol, acetona, enzima, aminoácido, entre outros) por um micro-organismo (seja Saccharomyces cerevisia, Zymomonas mobilis, entre outros, geneticamente modificado ou não) . A mistura de vinho e solvente orgânico na saída do fermentador é enviada para um decantador, aonde o solvente será separado por diferença de densidade, eventual aplicação de calor, outro método de separação ou qualquer combinação destes .

Em seguida, como em processo de produção convencional, o vinho é clarificado em unidades de centrifugação e, via outro trocador de calor, introduzido no sistema de destilação. No caso de produto extracelular, o microorganismo pode ser reciclado e introduzido numa unidade onde se pode ocorrer eventual sangria de células, seguido por uma unidade para reativação das células por tratamento ácido, aeróbico, com nutrientes ou demais métodos com fins de reativação.

Um produto volátil como o etanol, butanol ou acetona, parcialmente presente no gás de saida do fermentador, é recuperado pela coluna de absorção do produto. O solvente orgânico, que foi separado no decantador, absorve calor via trocadores de calor, antes de entrar num sistema, por exemplo, uma cascata de destiladores, com o fim de recuperação do solvente, o produto e água, de preferência usando apenas vapor de baixa pressão. Antes de ser reintroduzido no fermentador, o solvente é resfriado a uma temperatura abaixa da temperatura de fermentação pelo trocador de calor e um sistema de resfriamento sob baixa pressão. Produto e água recuperados do solvente são introduzidos diretamente no sistema de purificação, como, por exemplo, um retificador.

Outras configurações possíveis são mostradas nas Figuras 13 e 14.

A Figura 13 mostra a remoção de inibidores e produto com refrigeração simultânea, com recuperação do produto, solvente, água e inibidores em sistema com apenas um biorreator.

A Figura 14 mostra o uso de mais biorreatores em série, neste caso três dornas de fermentação. Nesta configuração, a primeira dorna é responsável pela fermentação da maior parte do substrato alimentado, enquanto a segunda e terceira dorna são responsáveis pela fermentação do restante do substrato. Apenas na primeira dorna é necessário a remoção de inibidores e produto pelo solvente o suficiente para obter concentrações bastante baixas de pelo menos a maioria dos inibidores na saída da primeira dorna, assim garantindo uma mínima inibição sinérgica e a fermentação efetiva tanto nesta dorna como nas dornas conectadas em serie.

A Figura 15 mostra um fluxograma de uma planta de fermentação extrativa para fermentação em batelada ^■ ou batelada alimentada com uma dorna conforme uma terceira modalidade da presente invenção. Durante a fermentação, o solvente está sendo reciclado pelo sistema, aumentando a produtividade da fermentação por meio de extração contínua dos inibidores, do produto e por estar mantendo o meio de fermentação na temperatura ótima. Após a fermentação, a fase aquosa retirada da dorna é centrifugada e o resto do produto presente nesta fase é recuperado e purificado pela etapa de destilação e retificação.

A Figura 16 mostra um fluxograma de uma planta de fermentação extrativa para fermentação contínua com resfriamento e remoção de inibidores em várias dornas, conforme uma quarta modalidade da presente invenção, onde o solvente é enviado por todas as dornas em sentido contracorrente ao meio fermentado. Assim, as concentrações de todos os inibidores e o produto são minimizadas na última dorna, garantindo uma produtividade e um rendimento máximo no processo integral.

Modalidade Preferencial da Presente Invenção

MODELAGEM DE FERMENTAÇÃO DE ETANOL EXTRATIVO EM COMBINAÇÃO COM RECUPERAÇÃO DE PRODUTO IN-SITU, MÉDIA DESINTOXICAÇÃO E RESFRIAMENTO.

Um processo de fermentação continuo foi modelado com uma série de três fermentadores , representando uma armação industrial realística.

A Figura 17 mostra uma visão esquemática do processo. Em um primeiro estágio, o mosto, composto de suco clarificado e caldo hidrolisado, é misturado, concentrado por evaporação, resfriado e alimentado ao primeiro fermentador como fluxo (B) . A água evaporada (A) pode ser usado para limpeza do solvente depois da remoção do etanol na unidade de recuperação de etanol, mas isso não é considerado no modelo. O primeiro fermentador é o maior em volume, contém uma fase orgânica e é responsável pela conversão de cerca 40-70 % do substrato. A fase aquosa contém todo o substrato e levedura. A fase orgânica é parcialmente dispersada na fase aquosa, mas tende a migrar para o topo do fermentador devido a sua baixa densidade. A fração do etanol produzido, inibidores e uma pequena quantia de água do processo são extraídos para a fase orgânica, assim melhorando o desempenho e produtividade da fermentação e concentrando o substrato. Otimizadas concentrações de etanol no volume aquoso também permitem a máxima partição da maioria dos inibidores hidrolisados para a fase orgânica.

Outros fluxos que entram no fermentador são o eventual micro-organismo concentrado e reativado da unidade de reativação das células (Q) e solvente reciclado ^■ e refrigerado (I) que não contém inibidores e etanol. A temperatura do solvente na entrada da dorna é ajustada para permitir refrigeração do meio da fermentação, enquanto permanecer em torno de três graus acima do ponto da solidificação ou turvação deste solvente. Na simulação, uma variedade de temperaturas de fermentação alvo é avaliada por sua influência no desempenho da fermentação.

A mistura de vinho e solvente é retirada da parte de cima do biorreator onde a concentração de solvente é mais alta devido à diferença de densidade entre o solvente e a fermentação média. Este fluido (D) é conduzido a uma unidade decantadora da qual o solvente, rico em etanol e água, é atraído do topo (E) enquanto o vinho decantado ou fase aquosa (J) é recuperado no fundo do decantador. Por ter um ponto de ebulição mais alto que ambos, etanol e água, o solvente enriquecido com etanol (E) é aquecido e o etanol e água são separados do solvente por evaporação, um estágio que não é incluído no modelo. A fração de água e etanol recuperada do solvente (F) é conduzida diretamente a um retificador, unidade da qual o etanol pode ser recuperado com alto grau de pureza (R) . O fluido de vinho decantado (J) é alimentado a um segundo e terceiro fermentador, os quais são colocados em séries através do fluxo (K) .

Os dois fermentadores contêm apenas uma fase aquosa de um terço do tamanho da fase aquosa do primeiro fermentador e servem para conversão do substrato restante. Porque a maior parte do etanol produzido no primeiro fermentador foi removida, a inibição por acumulação adicional de etanol produzido nestes últimos dois fermentadores é limitada. A remoção adicional de inibidores hidrolisados também não é necessária porque a concentração desses inibidores já deveria ser pelo menos baixa o suficiente para viabilizar a fermentação no primeiro fermentador e quantias baixas de furfural têm demonstrado ter um efeito positivo para o rendimento de etanol. O resfriamento do segundo e do terceiro fermentador é feito convencionalmente, presumindo temperaturas de fermentação iguais às temperaturas alvo do primeiro fermentador e considerando que a geração de calor nestas dornas é limitado devido a pequena quantidade de substrato a ser convertido nestes volumes. Após da saida do fluido do terceiro fermentador (L) , a levedura neste fluido é separada por centrifugação e conduzido para unidades dé sangramento e tratamento da mesma por fluxo (N) , enquanto o vinho clarificado (M) é bombeado para destilação e unidades retificadoras, purificando o etanol (R) de fluidos de produtos secundários, vinhaça e óleos de fusão (S) , um estágio do processo que por si mesmo não incluido no modelo. Uma porção menor da levedura é sangrada (O) e a fração restante (P) é tratada por arejamento, ácido, aeração e nutrientes em uma unidade de tratamento para leveduras antes de re-introduzir no fermentador através de fluxo (Q) .

A escolha do solvente, um etil-éster de ácido ricinoléico ou biodiesel de óleo de mamona, foi elaborado conforme o trabalho descrito nos itens acima e baseado nas propriedades desejadas: coeficientes de partição favoráveis para produto e inibidores, alta seletividade para estes compostos comparada ao substrato, alta biocompatibilidade, baixa solubilidade na fase aquosa, alta capacidade de absorção de água para concentrar o substrato do fermentador, características termodinâmicas favoráveis para remoção do produto do solvente e regeneração do solvente como alto ponto de ebulição, sem formação de emulsões estáveis, rápida separação da fase aquosa, alta estabilidade química em altas temperaturas, baixa viscosidade, baixo custo, possivelmente fabricada localmente e reutilização para outros propósitos, entre outros .

A cinética do processo microbiológico de fermentação com aplicação na presente invenção foi modelado usando funções cinéticas de temperaturas e concentrações de substrato, etanol, biomassa e inibidores hidrolisados, os quais foram elaborados no trabalho de Zautsen et al . , 2011 (submetido em Nov. 2011 para publicação sob título 'Kinetics of ethanol fermentation and inhibition by hydrolyzed lignocellulosic biomass' ) , e incorporados aqui em sua totalidade por referência. Para a maioria das etapas do processo, apenas balanços de massa simplificados foram modelados. A recuperação de etanol e reciclagem de solvente, destilagem e retificação não foram modelados. A energia calorífica introduzida nas dornas dos biorreatores por atividade metabólica relacionada à produção de etanol e a energia dissipada pelos agitadores nestas dornas foram incluídas no modelo. A energia introduzida por movimento de mistura foi apenas considerada para os fermentadores e o calor introduzido por dissolução exotérmica de produção de etanol não foi considerado.

Dimensões e suposições

O primeiro fermentador foi dimensionado com um volume de fase aquosa de 600m ³ , enquanto o segundo e terceiro fermentadores ambos continham 200m ³ de caldo. A fase orgânica no primeiro fermentador teve um volume de 20% da fase aquosa. A taxa de diluição da fase aquosa do primeiro fermentador foi fixada para 0.125h ^-1 , pelo ajusto da taxa de alimentação, reconhecendo as diferentes densidades de todos os fluidos com suas composições e temperaturas. Os custos das matérias-primas caldo de cana clarificado . e licor hidrolitico foram relacionados como 3:1.

Os componentes considerados no modelo foram substrato, biomassa, etanol, furfural, baunilha, ácido acético, água, biodiesel como solvente e dióxido de carbono. Sacarose, glicose, frutose e xilose foram consideradas como substratos iguais, sem diferenciação para conversão cinética que dependeria das características e capacidades específicas da linhagem da levedura aplicada no processo real. Caldo de cana clarificado e liquor hidrolitico são supostos a não evaporar durante a preparação do "mosto", embora em um esquema mais realístico, as concentrações de alguns inibidores mais voláteis como ácido acético e furfural podem muito bem serem reduzidos neste estágio.

Compostos presentes em melaço e xarope que inibem a fermentação tais como sulfeto, ácidos orgânicos, altas concentrações de sal, cálcio e magnésio e sólidos insolúveis não são considerados. Todavia as taxas de conversão biológica de inibidores diferem para cada composto furânico ou fenólico, dependendo principalmente do grupo funcional distinto. A inibição por furfural e HMF é considerada cumulativa, e é representada no modelo por furfural como sua soma total de furanos, como é a baunilha, um aldeído fenólico, escolhido como representante para a soma de todos os fenóis. O ácido acético representa todos os ácidos orgânicos. As densidades dos líquidos são calculadas como a soma média das densidades de todos os componentes e onde for possível com dependência de temperatura. O Etanol foi recuperado a 100% do fluxo solvente de saída e o solvente de fluxo de saída foi reintroduzido seco no primeiro fermentador e livre de compostos inibidores previamente extraídos. A temperatura limite mais baixa para solvente entrando no fermentador foi determinada como três graus acima de seu ponto de solidificação, que é aproximadamente -5°C. A cinética do transporte de compostos da fase aquosa à orgânica não foi considerada e condições de mistura em todos os equipamentos envolvidos foram considerados ideais. O número de Reynolds Re foi fixado a IO ⁶ como foi o número da potência N _p em 5.5 para a turbina do misturador com regulagém. Para cálculo de potência e turbulência, três misturadores foram supostos por fermentador, cada um com um diâmetro igualando-se a 30% de diâmetro da dorna, e a razão entra a altura e o diâmetro da dorna foi dois para todos os fermentadores . Nestas condições, a velocidade de ponta do agitador foi entre 3.3 e 6.4 m-s ^-1 , dependendo da viscosidade e densidade do caldo e da fase orgânica. Os valores das coeficientes de partição dos componentes sobre a fase orgânica e aquosa no fermentador e no fluxo de saida do biorreator foram iguais aos coeficientes de partição como medidos em 3 °C em equilíbrio para concentrações diferentes de etanol na fase aquosa.

A viabilidade celular foi modelada somente dependente da temperatura, com taxas de morte celular relativas ao desvio da temperatura do mosto da temperatura máxima, estabelecida em 39°C, e somente a fração viável da levedura contribuiu para o crescimento celular e a produção de etanol enquanto a fração restante acrescentou à perda do rendimento do produto. A taxa de produção de dióxido de carbono foi presumida como equivalente a 95.7% da produção do etanol por peso, e a captura de etanol na exaustão de CO ₂ não foi considerado, nem de água, por nenhum dos três biorreatores . A geração de água devido a processos químicos metabólicos não foi considerada. A densidade da levedura foi presumida a 1200 Kg m ^-3 . Para cada 1000 litros de etanol produzido, uma fração de 20kg de creme de levedura foi sangrada e o restante foi reativada e retornada ao fermentador. Nenhum calor foi introduzido pelo processo de centrifugação ou em qualquer outro estágio do processo, exceto na fermentação como detalhado acima. A transferência de calor do meio da fermentação para o solvente foi presumida como rápida em todos os casos, de maneira que as temperaturas da fase orgânica e o caldo da fermentação foram iguais logo após da introdução do solvente na dorna. Método de cálculo

O processo de fermentação foi modelado usando Python como linguagem de computação. Um método de cálculo numérico foi escolhido para o qual milhões de combinações de valores de parâmetros de entrada foram avaliadas em paralelo. O cálculo continuava até os variáveis de estado foram constantes para todas as combinações de valores de parâmetros de entrada.

Resultados

Os resultados do cálculo mostraram as faixas para as melhores condições de fermentação, otimizando a produtividade volumétrica e minimizando os custos de matéria-prima . Como ponto de referência para avaliar o desempenho da fermentação extrativa, foi feito primeiro uma simulação para a fermentação convencional, ou seja, sem solvente como agente extrator.

Fermentação convencional

Fermentações sem solvente também foram simuladas usando dimensões e suposições iguais para permitir a comparação com fermentação com a proposta tecnologia de extração aplicada. Neste caso, três parâmetros de entrada foram variados: a proporção de licor hidrolítico no mosto, a concentração final de substrato no mosto de alimentação e a temperatura da fermentação.

Os resultados mostraram que a otimização da taxa de produção volumétrica, e a minimização dos custos de matéria-prima, ambos dependem da razão entre caldo clarificado e licor hidrolítico e da concentração de substrato. Porque o resfriamento foi fornecido convencionalmente para esta fermentação, a quantia de inibidores no mosto final foi o único fator limitador para a fermentação. Para baixas f ações de licor hidrolítico, a taxa de crescimento foi suficientemente alta para prevenir perda total da levedura por diluição do meio. Para mosto contendo apenas suco, as taxas de produção volumétricas foram maximizadas usando uma concentração de substrato de em torno de 24%. Concentrações mais altas de substratos reduziram a taxa do crescimento e consequentemente as taxas de produção de etanol (volumétrico) . Embora na concentração ideal de 24% de substrato, o rendimento total (dados não demonstrados) foi meramente 53% do máximo teórico devido a uma produção mais alta de biomassa em detrimento de etanol.

O custo de substrato por volume de etanol produzido foi menor apenas para os substratos de mais baixas concentrações de açúcares usados nas simulações, mas não alcançando menos que 20% dos valores calculados menores para ambos, fermentação convencional e fermentação extrativa. As concentrações mais altas de substratos causaram conversão incompleta de açúcares, e, portanto, diminuiu o rendimento geral, que está diretamente relacionado à produção por custo de substrato.

Para fermentações convencionais, as proporções de caldo hidrolitico não podiam ser maiores do que 2% e temperaturas de fermentação ideais para taxas de produção volumétrica ideal foram aproximadamente 32° C, enquanto que para um menor custo de substrato, as temperaturas ideais foram mais altas perto de 37°C. Fermentação extrativa

Para fermentações com solvente, a taxa do fluxo do solvente foi usada como um quarto parâmetro independente e expresso como taxa de diluição de solvente sobre o volume aquoso.

Resultados mostraram a dependência da taxa de produção volumétrica e os custos de substrato por volume de etanol produzido, como a da proporção do caldo hidrolitico e da taxa de diluição do solvente. A quantidade de inibidores no mosto final foi um fator limitador para o desempenho da fermentação para qualquer taxa de diluição de solvente dada, causando depleção de levedura para altas concentrações destes inibidores, mas não tão grave como no caso da fermentação convencional.

Outro fator limitador foi o resfriamento oferecido pelo solvente. Para baixas taxas de diluição de solvente, ambas as taxas de produções volumétricas, e a produção por custo de substrato entraram em colapso devido ao resfriamento insuficiente. Acima de uma taxa de diluição de 0.25h ^_1 , o solvente forneceu resfriamento suficiente para todas as composições do mosto. Com taxas de diluição do solvente maiores, as taxas de produção volumétrica aumentaram devido à remoção de etanol e inibidores provenientes do caldo hidrolitico. E ainda mais, as taxas aumentadas de diluição do solvente permitiram que frações mais altas de hidrolisado fossem fermentadas e diminuíram o custo mínimo de substrato, embora mesmo a taxa de diluição de l ^~h não foi suficiente para viabilizar a fermentação de um hidrolisado puro. Entretanto, as consequências económicas de altas taxas de diluição de solvente, em termos de custos de operação e energia, não foram calculadas e são propensas a aumentar o total de custos da produção, limitando assim a viabilidade do uso de taxas muito altas de diluição do solvente.

Para a produção por custo de substrato, com o suco sendo três vezes mais caro que o hidrolisado, uma composição otimizada de mosto foi encontrada, diferente para cada taxa de diluição de solvente.

Para uma composição de mosto com a proporção de caldo hidrolítico fixo a 30%, concentrações de substrato acima de 20% requeriam consideráveis taxas de diluição de solventes para obter altas taxas de produção volumétrica. Para taxas de produção volumétrica, diferentes concentrações otimizadas de substrato foram encontradas para diferentes taxas de diluição de solventes. Por outro lado, custos mínimos de substrato foram apenas obtidos para concentrações mínimas de substratos e diminuíram levemente com a taxa de diluição de solvente acima do ápice da provisão do resfriamento.

Para esta mesma proporção de caldo hidrolitico fixo a 30%, mostos com concentrações de substrato mais elevadas geraram taxas de fermentação mais altas e elevaram a produção de calor por atividade metabólica. Consequentemente, taxas de diluição de solventes mais altas foram necessárias para fornecer resfriamento suficiente para concentrações mais altas de substratos.

Para a taxa de produção volumétrica, uma concentração otimizada de substrato foi encontrada a um porcentagem mais baixa do que para a fermentação convencional e difere de uma concentração otimizada de substrato para máximo rendimento ou minimo custo de substrato, que foram ótimos ambos a mais baixa concentração de substrato de 15%.

Como também foi notado para fermentações sem remoção de inibidores e em regime continuo, no trabalho de Horvath et al . 2001 e incorporado aqui em sua totalidade por referência, perca total de fermento devido a taxa de diluição do meio já ocorre a relativamente baixos níveis de concentrações de inibidores.

O efeito tóxico sinérgico da baunilha, ácido acético e furfural diminuiu a concentração de furfural para a qual a taxa de redução de furfural foi ao máximo. A inibição do crescimento foi um fator limitador para taxas máximas de conversão de inibidores específicos por redução metabólica.

Contudo foi provado, por meio de modelagem e simulação, que a fermentação extrativa em regime contínua, permitiu uma extração simultânea in-situ de inibidores presentes no hidrolisado e etanol como produto de fermentação, bem como resfriamento efetivo do processo de fermentação pelo mesmo agente extrativo.

Para a fermentação extrativa modelada, o furfural migrou para a fase orgânica como ocorreu com a baunilha e ácido acético, cada um com diferentes coeficientes de partição dependendo das concentrações de etanol no sistema, melhorando as taxas de conversão de inibidor, aumento de taxas e taxas de produção de etanol, especialmente a taxas de solvente aumentadas.

Assim, o modelo combinou remoção de diversas inibidores por extração e conversão biológica, ambas afetada por temperaturas e composição do caldo de fermentação. Diferentes valores para a proporção de caldo hidrolítico no mosto, concentração de substrato, temperaturas alvo de fermentação e taxas de diluição de solvente foram avaliadas, enquanto incluindo a geração de calor mecânico e metabólico, efeito de inibição pelo produto etanol, coeficientes de partição dos diferentes compostos e efeitos de temperatura na conversão cinética inibidora. Deste modo, efeitos combinatórios no desempenho de diversas chaves de indicadores de fermentação foram revelados .

A taxa de diluição do solvente precisava apenas ser alto o suficiente para assegurar o crescimento de levedura tão rápido quanto a taxa de diluição da fase aquosa, sobre os três fermentadores, e providenciando refrigeração suficiente do meio de fermentação. Antes de chegar a condições de washout' do fermento, devido a altas concentrações de inibidor ou de substrato, baixas taxas de conversão de açúcar causaram perda de substrato e baixas taxas de produção de etanol .

As taxas otimizadas de diluição de solvente reduziram de melhor forma a inibição para ambos, inibidores provenientes de caldo hidrolitico e o produto etanol, melhorando as taxas de fermentação.

No contexto de diferentes regimes de fermentações, as concentrações de inibidor podem ser mantidas baixas em relação à concentração de biomassa para fermentação em regime batelada do licor hidrolitico, por controle da taxa de alimentação do mosto para fermentação em regimes batelada-alimentada ou continua, e taxa de diliução da fase orgânica no caso da fermentação continua como apresentada nesta simulação. Porém, para fermentações em regime batelada ou continuo sem a aplicação de uma fase orgânica, isto não é possível. Consequentemente, taxas de conversão de furfural e baunilha foram mais altas na fermentação extrativa apresentada do que na fermentação contínua convencional, permitindo a fermentação de frações de caldo hidrolítico no mosto mais altas, gerando taxas de produção volumétricas mais altas e diminuindo os custos totoal de substrato .

Deve-se ainda notar que as concentrações de inibidores provenientes do caldo hidrolítico foram pressupostos a não diminuir durante a preparação do mosto, que representa um cenário piorado considerando a alta volatilidade de inibidores como ácido acético. Dependendo da fonte de licor hidrolítico e do método e severidade da hidrolise da matéria-prima, pode-se esperar que as concentrações finais de inibidores no alimento do mosto são mais baixas que os valores presumidos neste trabalho, levando a resultados até mesmo mais favoráveis. Ao todo, pode ser concluído que para fermentação contínua, o sistema de fermentação extrativa duas-fases líquido-a-líquido é uma integração eficiente e uma promissora integração de redução ín-situ da concentração de inibidores, recuperação do produto e resfriamento da fermentação.

Resumo Os ésteres orgânicos, mais conhecidos como biodieseis, à base de ácidos graxos como, por exemplo, ácido ricinoléico ou ácido oléico, são os solventes mais adequados para ser empregados no processo de fermentação extrativa conforme revelado pela presente invenção, uma vez que possuem características fundamentais, tais como:

Biocompatibilidade - o solvente tem uma alta biocompatibilidade, de importância vital para o desempenho do bioprocesso. O tamanho da molécula sendo maior do que 12 carbonos impede a miscibilidade da molécula com a parede celular do fermento e, assim, garante a biocompatibilidade, desde que não há grupos especiais na molécula que podem tornar o mesmo em componente tóxico;

> Viscosidade, ponto de ebulição e densidade - A estrutura, contendo pelo mínimo uma ligação dupla por ser um éster metílico, etílico ou propílico, faz com que a superfície de interação molecular do solvente seja limitada na terceira dimensão, resultando em uma viscosidade limitada e densidade baixa em comparação à fase aquosa, ambas são propriedades favoráveis. Por outro lado, o tamanho da molécula, a superfície da mesma e a quantidade de pontes de hidrogénio que podem ser formados entre as moléculas, garantem um ponto de ebulição alto e bastante diferenciado do produto da fermentação e dos demais componentes voláteis, permitindo a recuperação do produto e do próprio solvente de forma economicamente viável;

Polaridade - A polaridade da molécula, principalmente determinada pelo tamanho da cadeia principal da molécula e pelos grupos e ligações polares, promove a extração de substâncias polares e apoiares (inibidores e produtos como etanol, butanol, acetona entre outros.), mas justamente não as substâncias que são tão polares como os açúcares (substrato) . Por razões ambientais, o solvente não pode dissolver na fase aquosa. Por outro lado, água pode ser absorvida na fase orgânica e assim concentrar o substrato. Muitos possíveis grupos polares, como OH, NH3, ésteres, entre outros e combinações dos mesmos podem formar uma polaridade ideal .

Coeficientes de partição - capacidades de absorção e coeficientes de partição altas para o produto e inibidores provenientes do mosto e seletividade baixa para substrato.

> Viabilidade económica - a alta disponibilidade no mercado local e baixo preço da sua matéria-prima, no caso de biodieseis um óleo vegetal como óleo de mamona, são fatores muito importantes para que tal molécula possa ser economicamente viável ou não, além da opção de re ^¬ utilização do solvente por outros fins, como, por exemplo, biocombustível;

^ Toxicidade - a baixa toxicidade é importante tanto para operários no local da utilização do solvente, no caso a usina, como para a eventual introdução no meio- ambiente, no caso que frações mínimas do solvente misturam com um fluxo de saido do processo que será exposto ao meio- ambiente, por exemplo, a vinhaça ou célula sangrada.

Emulsão - não formar emulsões (estáveis) durante a fermentação e/ou processos downstream;

Estabilidade química do solvente - o solvente não pode degradar o produto ou causar sua degradação, ou ainda reagir com o produto para formar outro, independente da utilização de altas temperaturas nos processos de recuperação ou da presença de componentes reativos, como os ácidos, no meio fermentativo;

Em sistema bifásico vale para ambos solventes, óleo de mamona e biodiesel em base deste óleo, para maiores concentrações de etanol na fase aquosa, os coeficientes de partição dos principais inibidores são mais elevados e a razão entre absorção de etanol e água também é maior, especialmente para biodiesel. Biodiesel absorve relativamente mais água, resultando em maior capacidade de concentração de substrato no meio da fermentação. As fermentações em fermentadores de 1L em regime batelado, mostraram o efeito positivo do uso de biodiesel como solvente na fermentação extrativo liquido-liquido, na presença de inibidores furfural, baunilha e ácido acético no mosto. As taxas de redução de furfural e baunilha em produtos sem efeito inibidor foram mais elevadas na presença do solvente, diminuindo a fase lag e aumentando a taxa de crescimento e a produtividade especifica e volumétrica, enquanto mesmas concentrações destes inibidores frequentemente inibibem a fermentação convencional, diminuindo a viabilidade e até levando a morte completa do inoculo antes do mesmo sair da fase lag.

Uma série de experimentos permitiu a construção de um modelo cinético da redução de furfural e baunilha, na presença de ácido acético e para várias temperaturas e concentrações destes inibidores. O modelo descreve, entre outros, as taxas de conversão de furfural e baunilha, a taxa de crescimento e taxa de produção de etanol em função da temperatura, substrato e concentração de inibidores e produto, ajustado por estimação de parâmetros e validado para várias possíveis combinações chaves das variáveis independentes envolvidas.

A modelagem e simulação de um sistema integrado de fermentação extrativa liquido-liquido com recuperação de solvente e resfriamento do meio de fermentação pelo próprio solvente da presente invenção, permitiram a otimização da taxa de diluição de solvente, a concentração de substrato, a temperatura alvo da fermentação e a fração de caldo hidrolitico. Utilizando um modelo de custos relativos das matérias primas, obtém uma relação importante entre os custos da mistura do mosto e a produtividade do processo, baseado no rendimento total do mesmo e admitindo o limite para a utilização de caldo hidrolitico. Sobretudo, mostrou- se a vantagem da utilização do biodiesel como agente extratante de inibidores proveniente de caldo hidrolitico, etanol e agente de resfriamento para o processo fermentativo, permitindo a fermentação de maiores frações de caldo hidrolitico e elevando a produtividade e rendimento do processo integrado.

Assim, embora tenham sido mostrados apenas algumas modalidades e modelos da presente invenção, será entendido que várias omissões, substituições e alterações no processo de fermentação extrativa para mostos provenientes de processos hidroliticos de matéria-prima ligno-celulósica, amilácea, carboidratos diretamente extraiveis, melaços fortemente esgotados com alto conteúdo de inibidores naturais como, entre outros, biotina, ou mostos similares, ricos em carboidratos e com objetivos de fermentação, da presente invenção, que emprega um solvente capaz de remover produtos e inibidores simultaneamente, alem de resfriar o meio, podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espirito e escopo da presente invenção.

É expressamente previsto que todas as combinações ou omissões dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma, para alcançar resultados semelhantes, estão dentro do escopo da invenção. Substituições de elementos de uma modalidade descrita por outra ou omissões dos mesmos são também totalmente pretendidas e contempladas.

Também é preciso entender que os desenhos não estão necessariamente em escala, mas que eles são apenas de natureza conceituai. A intenção é, portanto, ser limitada, tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas.