Verfahren zur fer entativen Herstellung von 2-(4-Hydroxiphenoxi-)propionsäure

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2-(4-Hydroxi- phenoxi-)propioπsäure

2-(4-Hydroxiphenoxi-)propionsäure ist ein wertvolles Zwischenprodukt, insbesondere für die Herstellung von Herbiziden.

Chemische Verfahren zur Herstellung von racemischen, sowie von enantiomeren, reinen Formen von 2-(4-Hydroxiphenoxi-)propionsäure sind bekannt. Diese Verfahren gehen von Hydrochinon aus und besitzen den Nachteil, daß dabei Nebenprodukte entstehen, die mühsam abgetrennt werden müssen. Damit ist eine wirtschaftliche Herstellung nicht möglich.

Es ist bekannt, daß Mikroorganismen aromatische Verbindungen hydroxilieren können. Dabei entstehen in der Regel bishydroxilierte Verbindungen oder Gemische verschiedener Regioisomerer (R.J.W. Byrde, D. Woodcook, Biochem. J. 65, 682 (1957)).

Die regioselektive Oxidation von 2-(Phenoxi-)propionsäure zu 2-(4-Hydroxi- phenoxi-)propionsäure durch Mikroorganismen ist bisher nicht bekannt.

überraschenderweise wurde nun gefunden, daß verschiedene Mikroorganismen die preiswerte 2-(Phenoxi-)propionsäure hoch regioselektiv zu 2-(4-Hydroxiphenoxi-)propionsäure oxidieren.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2-(4-Hydroxiphenoxi-)propionsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man 2-(Phenoxi-)propionsäure oder deren Salze unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Mikroorganismus oxidiert.

Für das Verfahren eignen sich eine Vielzahl von Mikroorganismen, insbe¬ sondere Pilze und Bakterien. Brauchbare Pilze lassen sich beispielsweise aus Erdproben, insbesondere hu ushaltigen Bodenproben, isolieren. Beson¬ ders geeignet für die Umsetzung sind Aspergillus niger-Stämme. Weiter eignen sich auch viele Pilze der Gattungen Beauveria, Paecilomyces, Scleroticum und Coprinus, die beispielsweise aus Stammsammlungen bezogen werden können und deren Eignung für die Hydroxylierung sich in einem ein-

fachen Vorversuch ermitteln läßt. Auch geeignete Bakterien lassen sich unter anderem aus Bodenproben isolieren. Als Bakterien kommen insbesondere Streptomyces-Stämme in Betracht.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden geeignete Stämme auf ein die 2-(Phenoxi-)propionsäure enthaltendes Nährmedium überimpft und darin bei für den jeweiligen Mikroorganismus günstigen Wachstums- bzw. Produktionsbedingungen aerob inkubiert. Die Fermentation erfolgt kontinuierlich oder diskontinuierlich für 1 bis 10 Tage.

Die Zellen des verwendeten Mikroorganismus, die auch in Form von ruhenden, nicht wachsenden Zellen verwendet werden können, läßt man direkt auf das Substrat einwirken. Es können beliebige, bekannte Inkubationsverfahren angewendet werden, besonders bevorzugt sind aber Fermenter in Form von tiefen, belüfteten und gerührten Tanks. Sehr gute Ergebnisse werden durch Inkubation eines flüssigen Nährmediums erhalten.

Geeignet sind Nährmedien, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Spurenelementen und Vitaminen enthalten. Als Stickstoffquellen können anorganische bzw. organische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten, verwendet werden. Beispiele sind Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Bierhefeautolysat, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextract, Hefe, Harnstoff und Kartoffelprotein. Als Kohlenstoffquellen können beispielsweise Zucker wie Glucose, Polyole wie Glycerin oder Fette wie Sojaöl verwendet werden.

Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer, Eisen und anderen Metallen. Als Anion der Salze ist besonders das Phosphation zu nennen. Gegebenenfalls werden dem Nährmedium Wachstumsfaktoren zugesetzt, wie z.B. Biotin, Riboflavin oder andere Vitamine.

Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt von der Art der Fermentation ab und wird im Einzelfall festgelegt.

Im allgemeinen eignen sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Phenoxipropionsäurekonzentrationen von etwa 1 bis 100 g/1, bevorzugt sind Konzentrationen von etwa 5 bis 50 g/1.

Die Züchtungsbedingungen werden so festgelegt,- daß die bestmöglichen Ausbeuten erreicht werden. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen bei 20°C bis 40°C. Besonders vorteilhaft sind Temperaturen zwischen 25°C und

30°C. Vorzugsweise wird der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9 festgehalten. Besonders vorteilhaft sind pH-Werte zwischen 4 und 7. Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von 15 bis 100 Stunden ausreichend. Innerhalb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge des gewünschten Produkts im Medium an. Die Säure wird vorzugsweise in Form eines Salzes, z.B. des Natriumsalzes, zugegeben. Die Säure kann dem Nährmedium am Anfang auf einmal, nach erfolgtem Wachstum oder während der Züchtung in mehreren Portionen oder kontinuierlich zugegeben werden.

Bevorzugt ist der Einsatz der 2-(Phenoxi-)propionsäure, man kann aber auch deren Salze einsetzen. Bevorzugte Salze sind Alkali- und Erdalkalisalze, beispielsweise die Na-, K-, Li-Salze.

Das neue Verfahren eignet sich sowohl zur Oxidation von race ischer 2-(4-Hydroxiphenoxi-)propionsäure als auch von deren Antipoden. Beim erfindungsgemäßen Verfahren bleibt das Assymmetriezentrum unangetastet.

Wenn man beispielsweise R-2-(Phenoxi)-propionsäure einsetzt, erhält man unter Erhalt der Konfiguration die entsprechende R-2-(4-Hydroxiphenoxi-)- propionsäure. Andere Hydroxylierungsprodukte werden bei der Reaktion nicht beobachtet. Das neue Verfahren stellt somit einen einfachen und kostengünstigeren Weg zur selektiven Herstellung von

2-(4-Hydroxiphenoxi-)propionsaure dar.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel 1

Es wurden zur Überprüfung verschiedener Bakterienstämme zwei flüssige Nährmedien verwendet:

Medium A

20 g/1 Glucose

5 g/1 Hefeextrakt 5 g/1 Ammoniumsulfat

0,5 g/1 Magnesiumsulfat-7-hydrat

0,05 g/1 Mangansulfat-1-hydrat

1.5 g/1 Kaliumdihydrogenphosphat

3.6 g/1 Dikaliumhydrogenphosphat 1 g/1 (R)-2-(Phenoxi-)propionsäure

2 mg/1 Eisen-(II)sulfat-l-hydrat

100 μg/1 Zink(II)sulfat-4-hydrat

300 μg/1 Borsäure

200 μg/1 Cobat(II)chlorid-6-hydrat 10 μg/1 Kupfer(II)chlorid-2-hydrat

20 μg/1 Nickel (II)chlorid-6-hydrat

30 μg/1 Natriummolybdat-2-hydrat

Der pH-Wert wurde mit 5 N Natronlauge auf 6,8 eingestellt. Glucose und Phosphate wurden jeweils getrennt bei 121°C für 10 Minuten autoklaviert. Die (R)-2-(Phenoxi-)propionsäure wurde mit wenig 5 N Natronlauge in Wasser gelöst und sterilfiltriert. Das restliche Medium wurde bei 121°C für 10 Minuten autoklaviert.

Medium B

20 g/i Glucose

40 g/ Maisquellwasser

1,5 g/i Kaiiumdihydrogenphosphat

3,6 g/i Dikaliumhydrogenphosphat

1 g/i (R)-2-(Phenoxi-)propionsaure

Der pH-Wert wurde mit 5 N Natronlauge auf 6,8 eingestellt. Glucose und Phosphate wurden jeweils getrennt bei 121°C für 10 Minuten autoklaviert. Die (R)-2-(Phenoxi-)propionsäure wurde mit wenig 5 N Natronlauge in Wasser gelöst und sterilfiltiert. Das restliche Medium wurde bei 121°C für 45 Minuten autoklaviert.

Jeweils 20 ml des sterilen Mediums wurden in sterile 100 ml Erlenmeyer- kolben gefüllt, die mit einem sterilen Watteverschluß versehen waren. Jeweils eine Öse der zu prüfenden Bakterienstämme wurde in einen Kolben eingeimpft. Die Kolben wurden dann bei 28°C und 250 UmM für drei bis sieben Tage schüttelnd inkubiert. Anschließend wurden 1000 μl Fermen¬ tationsbrühe entnommen und mit 100 μl 1 N HCl und 800 μl Essigsäure¬ ethylester versetzt und 15 Sekunden kräftig durchmischt. 700 μl der organischen Phase wurde vorsichtig abgenommen und bei 50°C unter einem sanften Stickstoffstrom im Probegläschen eingedampft. Der Rückstand wurde in 70 μl Essigsäureethylester gelöst und quantitativ in ein Probegläschen für die Gaschromatographie überführt. Hierzu wurden 30 μl N-Methyl-N- trimethylsilyltrifluoracetamid (MSTFA) gegeben. Die Proben wurden dann gaschromatographisch untersucht. Als externer Standard diente eine authentische Probe (R,S)-2-(4-Hydroxiphenoxi-)propionsäure, die chemisch synthetisiert worden war.

Die folgenden Tabelle gibt eine Übersicht der Ergebnisse:

Gattung/Art Sarnmlung/Nummer Umsatz (%) Medium Streptomyces antibioticus DSM 40725 11 A

Streptomyces antibioticus ATCC 11891 10 A

Streptomyces flocculus ATCC 13850 18 A

Streptomyces hygroscopicus ATCC 19040 97 B

Streptomyces hygroscopicus ATCC 21705 98 A Streptomyces kasugaensis ATCC 15715 4 A

Streptomyces kasugaensis ATCC 15714 23 B

Streptomyces mediocidicus ATCC 13279 13 A

Streptomyces niveus ATCC 19793 23 A

Streptomyces panayensis ATCC 31055 2 A Streptomyces roseochromogenes ATCC 21895 4 A

Streptomyces viridifaciens ATCC 11989 24 A

Beispiel 2

Es wurden aus verschiedenen Bodenproben nach der Vorschrift von DREWS (Mikrobiologisches Praktikum, 3. Auflage, Springer Verlag, Seite 47-48, 1976) etwa 400 verschiedene, neue Streptomyceten-Stämme isoliert. Diese wurden nach der Vorschrift von Beispiel 1 geprüft. Die folgenden Tabelle gibt eine Übersicht über die Umsätze der als positiv identifizierten Stämme.

Sta bezeichnung Umsatz (%) Med

1034 8 A 1045 28 A 1053 22 A 5 1057 7 A 1071 11 A 2476 13 A 3279 4 A 3292 33 B

103388 26 B 3520 42 B 3523 80 A 3549 80 B 3558 24 A

153559 32 A 3560 98 A 3561 90 A 3565 4 A 3567 72 B

203574 41 A 3575 24 B 3782 44 A 3925 24 B 4041 14 A

255431 19 A 5432 99 A 5607 24 A 5608 26 A 5613 33 A

305619 51 A 5632 18 A 5635 15 A 5636 5 A 5637 39 A

355638 38 A 5648 25 A 5654 59 A

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Beispiel 3

Es wurde ein flüssiges Nährmedium hergestellt, welches folgende Bestandteile enthielt:

20 g/1 Glucose 5 g/1 Hefeextrakt 5 g/l Ammoniumsulfat 0,5 g/1 Magnesiumsulfat-7-hydrat 0,05 g/1 Mangansulfat-1-hydrat

1.5 g/l Kaliumdihydrogenphosphat

3.6 g/1 Di aliumhydrogenphosphat 3 g/1 Carbopol® 946

(Carboxyvinylpoly er mit extrem hohem Molekulargewicht) 3 g/1 (R)-2-(Phenoxi-)propionsäure

2 mg/l Eisen-(ll)sulfat-l-hydrat

100 μg/1 Zink(II)sulfat-4-hydrat

300 μg/1 Borsäure

200 μg/1 Cobalt(II)chlorid-6-hydrat 10 μg/1 Kupfer(II)chlorid-2-hydrat

20 μg/1 Nickel (II)chlorid-6-hydrat

30 μg/1 Natriummolybdat-2-hydrat

Der pH-Wert wurde mit 5 N Natronlauge auf 6,8 eingestellt. Glucose und Phosphate wurden jeweils getrennt bei 121°C für 10 Minuten autoklaviert. Die (R)-2-(Phenoxi-)propionsäure wurde mit wenig 5 N Natronlauge in Wasser gelöst und steril filtriert. Das restliche Medium wurde bei 121°C für 10 Minuten autoklaviert. Jeweils 20 ml des sterilen Mediums wurden in sterile 100 ml Erleπ eyerkolben gefüllt, die mit einem sterilen Wattever- Schluß versehen waren. Eine Öse Sporen des Pilzstammes Aspergillus niger ATCC 11394 wurde in einen Kolben eingeimpft. Der Kolben wurde dann bei 28°C und 250 UpM für drei Tage schüttelnd inkubiert. Anschließend wurden 1000 μl Fermentationsbrühe entnommen und mit 100 μl 1 N HC1 und 800 μl Essigsäureethylester versetzt und 15 Sekunden kräftig durchmischt. 700 μl der organischen Phase wurde vorsichtig abgenommen und bei 50°C unter einem sanften Stickstoffström im Probegläschen eingedampft. Der Rückstand wurde in 70 μl Essigsäureethylester gelöst und quantitativ in ein Probegläschen für die Gaschromatographie überführt. Hierzu wurden 30 μl N-Methyl-N-tri- ethylsilyltrifluoracetamid (MSTFA) gegeben. Die Probe wurde dann gas- chromatographisch untersucht. Als Referenz diente eine authentische Probe 2-(4-Hydroxiphenoxi-)propionsaure.

Beispiel 4

Es wurde ein flüssiges Nährmedium hergestellt, welches folgende Bestandteile enthielt: 5

40 g/1 Glucose 10 g/1 Hefeextrakt 0,5 g/1 Magnesiumsulfat-7-hydrat 0,05 g/1 Mangansulfat-1-hydrat 10 1,5 g/1 Kaliumdihydrogenphosphat 3,6 g/1 Dikaliumhydrogenphosphat 20 g/1 (R)-2-(Phenoxi-)propionsäure

2 mg/1 Eisen-(II)sulfat-l-hydrat 100 μg/1 Zink(II)sulfat-4-hydrat 15300 μg/1 Borsäure

200 μg/1 Cobalt(ll)chlorid-6-hydrat 10 μg/1 Kupfer(II)chlorid-2-hydrat 20 μg/1 Nickel (II)chlorid-6-hydrat 30 μg/1 Natriummolybdat-2-hydrat 20

Der pH-Wert wurde mit 5 N Natronlauge auf 6,8 eingestellt. Glucose und Phosphate wurden jeweils getrennt bei 121°C für 10 Minuten autoklaviert. Die (R)-2-(Phenoxi-)propionsäure wurde mit wenig 5 N Natronlauge in Wasser gelöst und steril filtriert. Das restliche Medium wurde bei 121°C für 25 10 Minuten autoklaviert. 50 ml des sterilen Mediums wurden in einem sterilen 100 ml Erlen eyerkolben gefüllt, der mit einem sterilen Wattever¬ schluß versehen waren.

Nach Einimpfen von 2,5 ml einer 72 h alten Vorkultur von Beauveria 30 bassiana ATCC 7159 (gezüchtet in gleichem Medium, jedoch in Gegenwart von nur 5 g/l (- ^* n)-2-(Phenoxi-)propionsäure, wurde 4-5 Tage bei 28°C und 200 Upm schüttelnd inkuliert. Die sich anschließende gaschromatographische Analyse ergab, daß die eingesetzte Säure zu 98 % hydroxiliert worden war.

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Es wurden 98 % der eingesetzten (R)-2-(Phenoxi-)propionsäure zu (R)-2-(4- Hydroxiphenoxi-)propionsäure oxidiert. Bei Einsatz des S-Enantiomeren oder des Racemats der 2-(Phenoxi-)propionsäure wurde dasselbe Ergebnis erzielt.

Beispiel 5

Ein neuer Stamm von Aspergillus niger wurde aus einer humushaltigen Erdprobe nach der Methode von DREWS (Mikrobiologisches Praktikum, 3. Auflage, Springer Verlag, Seiten 51-53 (1976)) isoliert. Dieser Stamm (Nr. 1777) wurde nach der Vorschrift im Beispiel 3 geprüft. Nach drei Tagen waren 99,8 % der eingesetzten Säure oxidiert.

Beispiel 6

Es wurden weitere Stämme der Art Aspergillus niger wie im Beispiel 3 beschrieben geprüft und nach drei bzw. sieben Tagen Fermentationsdauer analysiert. Die folgende Tabelle gibt eine Übersicht der Ergebnisse:

Gattung/Art Sarnml Ling/Nummer Umsatz (%) Tage Aspergillus niger ATCC 9142 34 3

ATCC 11394 98 3

Aspergillus niger ATCC 26693 100 3

Aspergillus niger ATCC 1015 83 3

Aspergillus niger ATCC 10577 70 3 Aspergillus niger ATCC 13794 99 3

Aspergillus niger ATCC 11414 79 3

Aspergillus niger ATCC 26550 79 3

Aspergillus niger ATCC 9029 71 3

Aspergillus niger ATCC 9642 41 3 Aspergillus niger ATCC 32656 27 7

Aspergillus niger ATCC 6275 11 3

Aspergillus niger ATCC 16404 97 3

Aspergillus niger ATCC 10575 53 7

Aspergillus niger ATCC 10581 85 3 Aspergillus niger ATCC 10549 27 7

Aspergillus niger ATCC 1027 51 7

Aspergillus niger ATCC 1040 97 7

Aspergillus niger ATCC 10553 14 7

Aspergillus niger ATCC 10864 65 7 Aspergillus niger ATCC 1004 79 7

Aspergillus niger ATCC 16880 99 7

Aspergillus niger ATCC 16888 54 7

Aspergillus niger ATCC 6273 89 7

Gattung/Art Sarnmlung/Nummer Umsatz (%) Ta

Aspergillus niger ATCC 7797 79 7

Aspergillus niger ATCC 7983 90 7

Aspergillus niger ATCC 10574 100 7 Aspergillus niger ATCC 10578 100 7

Beispiel 7

Analog dem Beispiel 3 wurden weitere Pilze geprüft und nach drei bzw. sieben Tagen Fermentationsdauer analysiert.

Gattung/Art Sarnmlung/Nummer Umsatz (%) Tage

Aspergillus carbonarius ATCC 8740 7 7

Aspergillus carbonarius ATCC 6276 5 7 Aspergillus foetidus ATCC 10254 62 7

Aspergillus parasiticus ATCC 26850 7 3

Aspergillus sclerotiorum DSM 63357 5 3

Aspergillus sclerotiorum C I 112328 17 3

Aspergillus sclerotiorum CMI 116935 15 3 Beauvarios bassiana ATCC 7159 99 3

Paecilomyces faπnosus ATCC 26853 63 7

Sclerotturn rolfsi i ATCC 15206 85 7

Sclerotiturn rolfsi i ATCC 15204 19 7

Sclerot m rolfsi i ATCC 15203 89 7 Sclerotturn rolfsili ATCC 15201 81 7

Sclerotturn rolfsli ATCC 15195 85 7

Sclerot m rolfsili ATCC 26326 4 7

Sclerotium delphinii ATCC 15196 I 7

Coprinu: ; cinereu: ATCC 20120 2 7