AplaGen GmbH

Arnold-Sommerfeld-Ring 2, 52499 Baesweiler

Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken

Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken bekannt. So ist es beispielsweise bei einer Standardmethode zur Zyklisierung von Peptiden durch Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken bekannt, K ₃ [Fe(CN)e] als Oxidationsmittel einzusetzen. Dieses Reagenz gewährleistet saubere Zyklisierungspro- dukte bei hohen Ausbeuten; Nebenreaktionen werden vermieden. Darüber hinaus sind noch Zyklisierungen durch den Einfluss von Sauerstoff oder Jod bekannt. Diese Methoden haben jedoch den Nachteil, dass sie entweder zu langsam sind oder eine Vielzahl unerwünschter Nebenprodukte zur Folge haben. Eine andere bekannte Methode zur Zyklisierung von Peptiden ist der Einsatz von immobilisierten Ellmann's-Reagenz (5,5;- Dithiobis(2-Nitrobenzoesäure)) als Oxidationsmittel. Diese Methode ermöglicht die vollständige Oxidation bspw. eines linearen Peptids; Unreinheiten durch das Reagenz werden vermieden. Dieser Ansatz wurde erst kürzlich zu Cross-Linked-Ethoxylate-Acrylate- Resin (CLEAR)-Trägern erweitert. Diese sind sowohl mit organischen als auch mit wässrigen Lösungsmittelmischungen kompatibel.

Eine weitere im Stand der Technik bekannte Methode zur Ausbildung von Disulfidbrücken bspw. zur Zyklisierung von Peptiden ist der Einsatz von DMSO als Oxidationsmittel. Dieses Verfahren führt ebenfalls zu einer vollständigen Oxidation des linearen Peptids. Diese Methode hat jedoch den Nachteil, dass die Reaktion sehr langsam ver- läuft und dass der überschuss an DMSO vor der weiteren Prozessierung entfernt werden muss, was sich bei diesem organischen Lösungsmittel schwierig gestaltet.

Aus obigen Ausführungen ergibt sich, dass mehrere Methoden zur Ausbildung von Disulfidbrücken, was insbesondere bei der Zyklisierung von Peptiden durch Ausbildung

von intramolekularen Disulfidbrücken von Bedeutung ist, bekannt sind. Jede dieser Methoden hat jedoch entweder hinsichtlich der Ausbeute, der Reaktionsgeschwindigkeit oder der Reinheit Nachteile.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein alternatives Verfahren zur Erzeugung von Disulfidbrücken bereitzustellen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken, welches sich dadurch auszeichnet, dass die Reaktion in einem flüssigen Gemisch durchgeführt wird, das wenigstens eine heterozyklische Verbindung enthält, die mindestens ein Stickstoffatom im Ring aufweist.

Entsprechend betrifft Anspruch 1 ein Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Reaktion in einem flüssigen Medium durchgeführt wird, das wenigstens eine Verbindung enthält, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, wobei diese Verbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist:

(a) eine Verbindung, die in ihrer Struktur einen gesättigten oder ungesättigten sechsgliedrigen Heterozyklus mit wenigstens einem Stickstoffatom aufweist, wobei dieser Heterozyklus am zum Stickstoffatom benachbarten

Kohlenstoffatom wenigstens eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) aufweist, wobei im Falle des Vorhandenseins einer Hydroxygruppe der Heterozyklus ungesättigt ist;

(b) eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel

in welcher der Substituent A - für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 bis 3 Heteroatomen, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro,

Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto steht.

Es hat sich überraschender Weise gezeigt, dass die oben definierten Verbindungen die Ausbildung von Disulfidbrücken fördern und somit in der Reaktion als eine Art Katalysator wirken können. Es ist daher vorteilhaft, diese Verbindungen dem Reaktionsgemisch hinzuzufügen, um die Ausbildung von Disulfidbrücken bei unterschiedlichen SH-Gruppen tragenden Substanzen, wie insbesondere Peptiden und Proteinen, zu fördern.

Gemäß einer Ausführungsform weist die Verbindung gemäß Alternative (a) folgende Grundstruktur auf:

wobei der Heterozyklus je nach Wahl der Substituenten R1 bis R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann;

- V, W, X, Y und Z entweder Kohlenstoffatome oder Stickstoffatome darstellen, wobei der Heterozyklus insgesamt nicht mehr als drei, vorzugsweise zwei, Stickstoffatome aufweist;

- R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) darstellt;

- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH ₂ ) _n COOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH ₂ oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 zusammen mit R3 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R2 und/oder R3 fehlen;

- R4 und R5, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH ₂ oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R4 zusammen mit R5 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, R5 zusammen mit R6 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt oder R4 und/oder R5 fehlen;

- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht, oder R6 zusammen mit R5 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R6 fehlt.

Fehlen können die genannten Substituenten R2 bis R6 dann, wenn an der verknüpfenden Position im Ring ein Stickstoffatom sitzt, das eine Doppelbindung aufweist (siehe bspw. die Verbindungen 2,6-Dihydroxy-Pyridin-Hydrochlorid; Uracil-6- Carbonsäure, 4,6-Dihydroxypyrimidin).

Ein zentrales Merkmal der erfindungsgemäßen Substanzen gemäß der Alternative (a) ist das Vorhandensein des 6-gliedrigen, stickstoffhaltigen Heterozyklus sowie der Hydroxy- oder erfindungsgemäßen Oxogruppe (=0) am benachbarten Kohlenstoffatom. „Oxogruppe" im Sinne der Erfindung bedeutet, dass der jeweilige Substituent mit dem Ringatom zusammen eine Oxogruppe bildet und entsprechend ein Sauerstoffatom über eine Doppelbindung an den Ring gebunden ist:

So haben umfangreiche Versuche gezeigt, dass Verbindungen ohne eine solche funktionelle Gruppe (Hydroxygruppe, Oxogruppe =0) regelmäßig nicht die Fähigkeit aufwiesen, die Ausbildung der Disulfidbrücken zu fördern (so bspw. Aminopyrazin, 2,4- Diaminopyrimidin, Melamin, Pyrazincarbonsäure und Pyrazinamid).

Wie sich aus der Definition der Substituenten ergibt, gibt es Verbindungen, die nur ein Stickstoffatom im Heterozyklus aufweisen und die vorteilhaften Wirkungen hinsichtlich der Förderung der Ausbildung der Disulfidbindungen aufzuweisen. Ein Beispiel für eine

Verbindung mit nur einem Stickstoffatom im Heterozyklus und einer

erfindungsgemäßen Oxogruppe (=0) am benachbarten Kohlenstoffatom ist die Verbindung N-Methyl-2-Pyridon:

Ein weiteres Beispiel für eine Verbindung mit nur einem Stickstoffatom im Heterozyklus und mit einer Hydroxylgruppe am benachbarten Kohlenstoffatom ist die Verbindung 2,6- Dihydroxy-Pyridin-Hydrochlorid:

Wie im Anspruch festgelegt, ist der Heterozyklus im Falle des Vorhandenseins von Hydroxylgruppen ungesättigt. Versuche haben gezeigt, dass in diesem Fall das Vorhandensein wenigstens einer Doppelbindung für die katalytische Wirkung augenscheinlich bedeutsam ist. Ohne darauf festgelegt sein zu wollen, wird spekuliert, dass dies darauf zurückzuführen sein könnte, dass Verbindungen dieser Struktur tautomerisieren können. Tautomere sind Strukturisomere, die sich lediglich in der Stellung einer Gruppe (bspw. Wasserstoff) und in der Stellung einer Doppelbindung unterscheiden. Im Falle der Hydroxy- und der Oxogruppe (=0) spricht man auch von Keto-Enol-Tautomerie. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die aromatisch vorliegenden Verbindungen, wie das 2,6-Dihydroxy-pyridin Hydrochlorid tautomerisieren können. Dies trifft insbesondere auf die Enolformen zu, die vorzugsweise in Richtung der Ketoform tautomerisieren können. Tautomere (Isomere) Formen der dargestellten Substanzen sind daher erfindungsgemäß mit umfasst.

Vorzugsweise weist der sechsgliedrige Heterozyklus zwei Stickstoffatome auf, die unterschiedlich positioniert sein können. Beispiele für aktive Verbindungen dieser Struktur sind Uracil-6-carbonsäure, 2,4-Dihydroxy-6-methylpyrimidin, 2,4-Dimethyl-6- hydroxypyrimidin, 2-lsopropyl-6-methyl-4-pyrimidinol, 4,6-Dihydroxy-2-methylpyrimidin, 4,6-Dihydroxypyrimidin, 1 ,2-Dihydro-3,6-pyridazindion:

Ein Beispiel für Verbindungen, bei denen R5 und R6 zusammen eine Ringstruktur bilden, ist 7-Hydroxy-5-methyl[1 ,2,4]triazolo[1 ,5-a]pyrimidin:

Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist die Verbindung folgende Substruktur auf:

wobei der Heterozyklus je nach Wahl der der Substituenten R2, R3, R4 und R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann; wobei

- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH ₂ ) _n COOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH ₂ oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 zusammen mit R3 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R2 und/oder R3 fehlen;

- R4 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R4 fehlt;

- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R6 fehlt.

Aktive Beispiele dieser Ausführungsform sind bspw. Barbitursäure, Alloxan-Monohydrat und Violursäure

Weitere Beispiele dieser Ausführungsform sind Uracilderivate der folgenden allgemeinen Formel:

wobei R4 und R6 unabhängig voneinander für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest stehen, vorzugsweise für Wasserstoff oder einen verzweigten oder unverzweigten C1 bis C10 Alkylrest, besonders bevorzugt für einen C1 bis C4 Alkylrest oder Wasserstoff stehen.

Beispiele mit guter Aktivität sind Uracil und 1-Methyl-Uracil:

Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Verbindung, die die Ausbildung von Disulfidbindungen fördert, um Purinderivate, deren Grundgerüst der folgenden allgemeinen Formel entspricht

wobei der Fünfring ungesättigt ist und entsprechend Doppelbindungen aufweist und wobei

R4 und R6, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest; vorzugsweise Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Ci- bis Cio-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substitu- ierten C ₆ - oder Cio-Arylrest; besonders bevorzugt Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten d- bis C ₆ -Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C ₆ -Arylrest; insbesondere für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Ci bis C ₃ -Alkylrest stehen;

- R7, R8 und R9, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH ₂ ) _n COOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl oder eine funktionelle Gruppe stehen; vorzugsweise Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten d- bis Ci _O -Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C ₆ - oder Cio-Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -{CH ₂ ) _n -COOX mit n = 1 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder C _r bis C ₈ -Alkyl; besonders bevorzugt Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten d- bis C ₆ -Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C ₆ -Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH ₂ ) _n -COOX mit n = 1 bis 6 und X gleich Wasserstoff oder C _r bis C ₆ -Alkyl; insbesondere Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Ci bis C ₃ -Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH ₂ ) _n -COOX mit n = 1 bis 4 und X gleich Wasser- Stoff oder C ₁ - bis C ₃ -Alkyl stehen.

Wie dargelegt, kann die cyclische Verbindung demnach auf einem Puringrundgerüst basieren. Das Puringrundgerüst kann als kondensiertes Ringsystem, zusammengesetzt aus den beiden Heterocyclen Pyrimidin und Imidazol, aufgefasst werden. Sein systematischer lUPAC-Name ist 7H-lmidazol[4,5-d]pyrimidin.

Das 7H-Purin steht mit seinem Isomer, dem 9H-PuHn, in einem tautomeren Gleichgewicht, wobei im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Verbindungen als umfasst gelten, welche auf beiden tautomeren Formen basieren:

7H Purin 9H Purin

Je nach Wahl der Substituenten am Pyrimidin-Ring kann dieser auch weniger Doppelbindungen aufweisen.

In einer ganz besonders bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung ist mindestens ein Rest R4, R6, R7 und R9 eine Alkylgruppe und mindestens einer, vorzugsweise zwei der Reste R4, R6, R7 und R9 stellen Wasserstoff oder eine d- bis C ₃ -Alkylgruppe, vorzugsweise Methyl, dar.

Besondere Beispiele dieser heterozyklischen Verbindungen auf der Basis von Purin sind 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin, Koffein, Isokoffein, Xanthin, Theophyllin-7-Essigsäure, Theophyllin-8-Buttersäure und 3-lsobutyl-1-Methylxanthin:

Wie diese ausgewählten Beispiele zeigen, sind tautomere Verbindungen, denen anstelle des oben dargestellten 7H-Puringrundgerüsts das 9H-Puringrundgerüst zugrunde liegt, ebenfalls umfasst.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform bilden R2 und R3 zusammen einen gegebenenfalls substituierten Sechsring, der optional wenigstens ein Heteroatom aufweist. Bei dieser Ausführungsform handelt es sich vorzugsweise um Verbindungen, bei denen ein Aromat an den Grundheterozyklus ankondensiert wurde. Dies bevorzugt an einer Brücke aus zwei C-Atomen. Beispiele, in denen ein 5-Ring ankondensiert wurde (bspw. Imidazol), wurden bereits vorstehend erläutert (Verbindungen auf Basis des Puringrundgerüsts). Weitere Beispiele für ankondensierte Ringstrukturen sind Pyrazin und Chinoxalin.

Ein Beispiel für eine Verbindung mit einem Benzolring als ankondensierten 6-Ring ist 1 ,2,3-Benzotriazin-4(3H)-on:

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform weist die Verbindung folgende Grundstruktur auf:

wobei die Ringe je nach Wahl der Substituenten ungesättigt sein und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen tragen können und

R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) darstellt;

R4 und R6, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest stehen oder fehlen; vorzugsweise für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten verzweigten oder unverzweigten C _r bis C ₁₀ -Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C ₆ - oder C ₁₀ -

Arylrest stehen; besonders bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C ₁ - bis C ₆ -Alkylrest oder einen gegebenen-

falls substituierten C ₆ -Arylrest; insbesondere Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten C ₁ bis C ₃ -Alkylrest stehen;

R5 für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) steht oder R5 fehlt;

R10 und R13, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest stehen oder R10 und/oder R13 fehlen; vorzugsweise für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten verzweigten oder unverzweigten Cr bis Ci _O -Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C ₆ - oder Cio-Arylrest stehen; besonders bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C ₁ - bis C ₆ -Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C ₆ -Arylrest; insbesondere für Wasserstoff oder einen mit wenigstens einer Hydroxylgruppe substituierten C ₁ bis C ₆ - Alkylrest stehen;

R11 und R12, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), eine Carboxygruppe, -CONH ₂ oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R11 und R12 bilden zusammen einen fünf oder sechsgliedrigen Ring aus, der optional weitere Heteroatome sowie Substituenten tragen kann.

Ausgesuchte Beispiele für unter diese Formel fallende Verbindungen sind bspw. (-)- Riboflavin, Lumazin und Alloxazin

Es hat sich als vorteilhaft für die Wirkung erwiesen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß der Alternative (a) keine exozyklischen Aminogruppen tragen.

Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäß einzusetzenden Verbindungen daher keine exozyklischen Aminogruppen auf.

Die oben genannten Substituenten R2, R3, R4 und R5 können ferner unabhängig voneinander Wasserstoff, ein gegebenenfalls substituierter verzweigter oder unverzweigter C ₁ - bis C ₁₀ -Alkylrest oder ein gegebenenfalls substituierter C ₆ - oder Ci ₀ -

Arylrest; vorzugsweise Wasserstoff, ein gegebenenfalls substituierter verzweigter oder unverzweigter C ₁ - bis C ₆ -Alkylrest oder ein gegebenenfalls substituierter C ₆ -Arylrest; insbesondere Wasserstoff oder ein gegebenenfalls substituierter C ₁ bis C ₃ -Alkylrest, insbesondere Methylrest, sein.

R6 ist vorzugsweise Wasserstoff oder ein Alkylrest, C ₁ bis C ₈ , vorzugsweise C ₁ bis C ₄ , besonders bevorzugt Wasserstoff oder eine Methylgruppe.

Elektronenziehende Gruppen oder Atome, welche vorliegend auch als Substituenten an dem Heterocyclus verwendet werden können (siehe oben), sind bspw. elektronenziehende Gruppen oder Atome, welche als Substituenten die Elektronendichte an einem entsprechenden aromatischen heterozyklischen Ring erniedrigen (auch als deaktivierende Gruppen bezeichnet). Elektronenziehende Gruppen besitzen einen (-)-M- und/oder einen (-)-l-Effekt. Der Resonanz-Effekt (M- Effekt, mesomerer Effekt) wirkt im Allgemeinen nur, wenn die Gruppe direkt an dem ungesättigten heterozyklischen System gebunden ist. Er wirkt über π-Elektronen, im Gegensatz zum Feld-Effekt (I-Effekt, induktiver Effekt), welcher über den Raum, über Solvenz-Moleküle oder vorzugsweise über σ-Bindungen eines Systems wirkt.

Ein elektronenziehender Effekt kann entweder induktiv (d.h. durch den so genannten (- )-l-Effekt) und/oder mesomer (d.h. durch den so genannten (-)-M-Effekt) erfolgen. Die Einteilung von aromatischen Substituenten in Substituenten mit (+)-l- und (-)-l-Effekt sowie mit (+)-M-Effekt und (-)-M-Effekt ist dem Fachmann an sich bekannt. Für weitergehende Ausführungen wird auf Beyer/Walter, „Lehrbuch der Organischen Chemie", 1998, 23. überarbeitete und aktualisierte Auflage, Seiten 515 bis 518, verwiesen, dessen diesbezügliche Offenbarung in die vorliegende Erfindung eingeschlossen wird.

Einige, nicht-beschränkende Beispiele für Gruppen mit (-)-M-Effekt sind -SO ₂ -, -SO ₂ O-, -00-, -COO-, -CONH-, -CONR-, -SOR-, -CN, -NO ₂ , -CHO, -CO-, -COSH, -COS ^" , -SO ₃ H und die erfindungsgemäße Oxogruppe (=0). Wie hieraus deutlich wird, können sich die Begriffe „elektronenziehende Gruppe" und „funktionelle Gruppe" überschneiden. Entsprechende Gruppen sind Beispiele für einsetzbare Substituenten.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist die Verbindung gemäß Alternative (b) einen Substituenten A auf, der

für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituiertes C ₁ - bis Ci _O -Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C ₆ - oder Cio-Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4

Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto; bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C ₁ - bis C ₆ -Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C ₆ -Arylrest oder gesättigtes Heterocyclyl mit 5 oder 6 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto; - insbesondere Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Ci bis C ₃ -

Alkylrest oder gesättigtes Heterocyclyl mit 5 oder 6 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert ist; steht.

Besondere Beispiele dieser Pyrimidinderivate sind die folgenden Verbindungen:

Aminexil

Minoxidil

Um die Anbindung der Substanz an den Trägerstoff zu ermöglichen, sind funktionelle Gruppen an der erfindungsgemäß zu verwendenden heterozyklischen Verbindung hilfreich. Daher können auch weitere, zuvor nicht explizit erwähnte Derivate der heterozyklischen Verbindungen erfindungsgemäß verwendet werden.

Die zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindungen können sowohl in reiner Form als auch als Mischungen verschiedener möglicher isomerer Formen, insbesondere von Stereoisomeren, wie E- und Z-, threo- und erythro-, sowie optischen Isomeren, wie R- und S-Isomeren oder Atropisomeren und von Tautomeren vorliegen. Die Erfindung umfasst sowohl die reinen Isomeren als auch deren Gemische.

Je nach Art der oben definierten Substituenten weisen die heterozyklischen Verbindungen saure oder basische Eigenschaften auf und können Salze, gegebenenfalls auch innere Salze bilden. Tragen die Verbindungen der Formel (I) Hydroxy, Carboxy oder andere, saure Eigenschaften induzierende Gruppen, so können diese Verbindungen mit Basen zu Salzen umgesetzt werden. Geeignete Basen sind beispielsweise Hydroxide, Carbonate, Hydrogencarbonate der Alkali- und Erdalkalimetalle, insbesondere die von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium, weiterhin Ammoniak, primäre, sekundäre und tertiäre Amine mit (C _r C ₄ -)-Alkylresten sowie Mono-, Di- und Trialkanolamine von (Ci-C ₄ )-Alkanolen. Tragen die Verbindungen der Formel (I) Amino, Alkylamino oder andere, basische Eigenschaften induzierende Gruppen, so können diese Verbindungen mit Säuren zu Salzen umgesetzt werden. Geeignete Säuren sind beispielsweise Mineralsäuren, wie Salz-, Schwefel- und Phosphorsäure, organische Säuren, wie Essigsäure oder Oxalsäure, und saure Salze, wie NaHSO ₄ und KHSO ₄ . Die so erhältlichen Salze sind ebenfalls einsetzbar.

Weitere bevorzugte Gruppen der oben genannten Verbindungen werden nachfolgend diskutiert.

Beispiele für heterozyklische Verbindungen, die erfindungsgemäß zur Förderung der Ausbildung der Disulfidbrücken eingesetzt werden können, können ferner wie folgt beschrieben werden:

Die Reste R ₁ ', R ₂ ' sowie R ₃ ' sind entweder gleich oder verschieden; wenigstens einer der Reste stellt jedoch eine Alkylgruppe dar. Es versteht sich, dass Tautomere, bei de-

nen u.a. die Doppelbindung wandert, ebenfalls durch die obige Formel erfasst werden. Entsprechende Strukturisomere werden daher ebenfalls von dieser Formel umfasst. Diese Verbindungen eignen sich wie dargelegt insbesondere zur Förderung der Ausbildung von Disulfidbrücken in aminosäurehaltigen Substanzen, insbesondere in Peptiden und Proteinen.

Wenigstens einer, vorzugsweise zwei der Reste R ₁ ', R ₂ ' sowie R ₃ ', die entweder gleich oder verschieden sind, stellt vorzugsweise entweder Wasserstoff oder eine Ci bis C ₅ Alkylgruppe dar. Insbesondere kurzkettige Alkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, insbesondere die Methyl-Gruppe, haben sich als vorteilhaft erwiesen. Ferner kann wenigstens einer der Reste eine funktionelle Gruppe beinhalten. Ferner ist es auch möglich, dass an den verbleibenden Positionen am heterozyklischen 5-Ring Reste R ₄ ' (am Stickstoff) und R ₅ ' (am zwischen den Stickstoffatomen liegenden Kohlenstoff) vorliegen (insbesondere bei den tautomeren Formen). Diese sind beliebig gestaltbare, vor- zugsweise organische Reste. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich um funktionelle Gruppen, die die Anbindung der Substanz an bspw. einen Trägerstoff ermöglichen. Diese Variante wird nachfolgend noch im Detail beschrieben.

Besonders geeignete Substanzen zum Einsatz mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind wie bereits dargelegt neben Koffein auch koffeinähnliche Substanzen wie bspw. Theobromin und Theophyllin.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass sich insbesondere Peptide und Proteine, insbesondere Peptide mit einer Aminosäurelänge zwischen 5 und 100, vorzugs- weise 10 und 50, besonders bevorzugt zwischen 15 bis 40 Aminosäuren in Wasser selbst bei höheren Peptid konzentration bei Raumtemperatur nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken zyklisieren lassen. Das Verfahren ist daher besonders zur Ausbildung intramolekularer Disulfidbrücken und daher insbesondere zur Zyklisierung von Peptiden geeignet. Ferner lassen sich Polypeptide und Proteine mit dem entsprechenden Verfahren zyklisieren. Ferner lassen sich auch Disulfidbrücken bei anders strukturierten SH-Gruppen tragenden Substanzen ausbilden. Die Ausbildung der Disulfidbrücken, bspw. bei einer Zyklisierung, erfolgt aufgrund der Zugabe der erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindung wie bspw. Koffein bzw. einer koffeinähnlichen Substanz (siehe obige Formeln) bei einigen Peptiden beinahe quantitativ. Dies ist jedoch nicht zwingend. überraschender weise ist es nicht erforderlich (jedoch möglich), ein Oxidationsmittel zur Beschleunigung der Reaktion zuzugeben, da der Luftsauerstoff in Anwesenheit der oben charakterisierten Substanz zur Ausbildung von Disulfidbrücken ausreichend ist.

Versuchsergebnisse haben ferner gezeigt, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Reaktionsgeschwindigkeit im Laufe der Reaktion zunehmen kann. Die positive

Beeinflussung durch die erfindungsgemäße Zugabe der oben charakterisierten Substanz ist insofern überraschend, da es sich zumeist - im Gegensatz zu den im Stand der Technik eingesetzten Substanzen DMSO oder lod - nicht um Oxidationsmittel handelt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der Luftsauerstoff zur Oxidation ausreichend, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit aufgrund der Zugabe der erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindung in vorteilhafter Weise zunimmt. Die Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit könnte auch einen autokatalytischen Mechanismus ggf. durch das zyklisierte Produkt nahe legen.

Vorteilhafterweise hat sich gezeigt, dass trotz der Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit und selbst bei Einsatz von hohen Peptidkonzentrationen, oft keine oder nur wenig Oligomerisierungsprodukte auftreten. Die im Falle einer Zyklisierung eines Peptids unerwünschte Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken wurde daher nicht beobachtet. Die einzusetzende Peptidkonzentration hängt jedoch von dem jeweils ein- gesetzten Peptid ab und sollte daher für jedes Peptid optimiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhafter Weise bei Raumtemperatur durchgeführt werden.

Der augenscheinlich autokatalytische Verlauf der Reaktion tritt sowohl in ungepufferten als auch in gepufferten Lösungen (bspw. Phosphatpuffer, pH 6 - 9) auf. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit deutlich erhöht werden kann, wenn der pH-Wert abgesenkt wird. Es ist daher vorteilhaft, den pH-Wert bei < = 7 einzustellen, vorzugsweise in einem pH Bereich von ca. 4 bzw. 5 bis 6,5, besonders bevorzugt ist ein pH Wert um die 6 (5.5 bis 6.5).

Die Menge an Substanz, die dem Reaktionsgemisch zugegeben wird, um die Ausbildung der insbesondere intramolekularen Disulfidbrücken zu fördern, variiert je nach Verbindung und dem Stoff, bei dem Disulfidbrücken ausgebildet werden sollen. In der Regel reichen kleine katalytische Mengen. Die einzusetzende Menge liegt vorzugsweise bei wenigstens ca. 0,0001 mg/ml, besonders bevorzugt in einem Bereich von ca. 0,0001 , 0,001 oder 0,01 bis 20mg/ml, 0,001 oder 0,01 bis 15mg/ml, 0,001 oder 0,01 bis 10mg/ml, 0,001 oder 0,01 bis 5mg/ml, vorzugsweise 0,001 oder 0,01 bis 1 mg/ml und besonders bevorzugt in einem Bereich von 0,03 bis 0,5 mg/ml. Die Mengen variieren je nach gewählter Substanz (bspw. Koffein oder koffeinähnlicher Substanz) und zu behandelndem Peptid bzw. Protein und sollten daher jeweils individuell optimiert werden. Ein besonders geeigneter Konzentrationsbereich für Peptide mit einer Länge von ca. 15 bis 25 Aminosäuren (insbesondere im Falle von EPO-mimetischen Peptiden) liegt bei 0,05 bis 0,3mg/ml, besonders bevorzugt bei 0,075 bis 0,15 mg/ml. Die Mengen variieren jedoch wiederum je nach Peptid und können auch deutlich höher liegen; die Mengen sollten daher vorzugsweise für das jeweilige Peptid optimiert werden.

Die Reaktionsgeschwindigkeit kann weiter beschleunigt werden, wenn dem Reaktionsgemisch ein zusätzliches Oxidationsmittel zugegeben wird. Beispielsweise sei GIu- tathion in oxidierter Form (GSSG) genannt.

überraschender Weise hat sich gezeigt, dass die Zyklisierung effektiv auch bei hohen Peptidkonzentrationen durchgeführt werden kann, ohne dass unerwünschte Oligomeri- sierungen auftreten. Hohe Peptidkonzentrationen sind daher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bei vielen Peptiden eher unproblematisch. Vielmehr hat sich bei einigen Peptiden später gezeigt, dass gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zykli- sierungsreaktion bei hohen Peptidkonzentrationen sogar besser abläuft. Je nach Peptid liegen geeignete Peptidkonzentrationen bei ca. 0,05 bzw.0,1 oder 0,5 bis 5 mg/ml, bevorzugt sind Konzentrationen in einem Bereich von 0,7 bis 1 ,5 mg/ml. Die genaue Konzentration hängt selbstverständlich von dem jeweiligen Peptid, seiner Länge sowie seiner Aminosäurezusammensetzung ab und variiert entsprechend. Die vorliegenden Angaben sind daher nicht beschränkend anzusehen. Für EPO-mimetische Peptide hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, eine Konzentration von ca. 0,7 bis 1 mg/ml einzusetzen. Sie lassen sich besonders effektiv durch die Zugabe von Koffein zyklisie- ren.

üblicher Weise wird eine Disulfidbrücke in einem Peptid oder Protein zwischen zwei Cysteinen ausgebildet. Jedoch kann erfindungsgemäß die Disulfidbrücke auch zwischen anderen natürlichen und nicht natürlichen Aminosäuren ausgebildet werden, sofern diese entsprechende Gruppen aufweisen, die zur Ausbildung einer Disulfidbrücke (-S-S-) geeignet sind. Thiolysin, Homocystein und andere Cysteinderivate sind neben Cystein als Beispiele für geeignete Aminosäuren zu nennen. Der Begriff Disulfidbrücke ist jedoch nicht mit dem Begriff Cysteinbrücke gleichzusetzen, sondern umfasst die Ausbildung entsprechender -S-S- Bindungen zwischen irgendwelchen natürlichen oder nicht-natürlichen SH-haltigen Aminosäuren oder anderen SH-Gruppen haltige Verbindungen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich daher auch Disulfidbrücken bei anderen SH-Gruppen haltigen Verbindungen, insbesondere Polymeren, ausbilden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können selbstverständlich auch mehrere Disulfidbrücken ausgebildet werden.

Besonders vorteilhaft kann das vorliegende Verfahren zur Zyklisierung von EPO-mime- tischen Peptiden (siehe bspw. WO 96/40479) eingesetzt werden. Neuartige EPO mimetische Peptide sind in der PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959) beschrieben, deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Peptide hiermit vollumfänglich zum Gegenstand dieser Anmeldung gemacht wird. Wie in der PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959) ausführlich beschrieben ist, weisen diese neuartigen EPO mimetischen Peptide kein Prolin in der Position 10 des EPO mimetischen Konsensusmotivs auf (hinsichtlich der

Nummerierung wird auf Johnson et al, 1997 verwiesen). Vielmehr ist das Prolin gegen eine nicht konservative Aminosäure, insbesondere eine basische Aminosäure wie insbesondere Lysin, ausgetauscht.

Die in der PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959) beschriebenen Peptide weisen vorzugsweise folgenden Konsensus auf:

X6X7X8X9X10X11 Xi 2X13X14X15

wobei jede Aminosäure eine natürliche oder nicht natürliche Aminosäure darstellt und

X ₆ ist C, A, E, α-Amino-γ-Brombuttersäure oder Homocystein (Hoc);

X ₇ ist R, H, L, W or Y or S;

X ₈ ist M, F, I, Homoserinmethylether (Hsm) or Norisoleucin;

X ₉ ist G oder ein konservativer Austausch von G; X ₁₀ ist ein nicht-konservativer Austausch von Prolin; oder X ₉ und X ₁₀ sind durch eine einzige Aminosäure substituiert;

X ₁₁ kann eine beliebige Aminosäure sein;

X ₁₂ ist T oder A;

X ₁₃ ist W, 1-nal, 2-nal, A oder F; X ₁₄ ist D, E, I, L oder V;

X ₁₅ ist C, A, K, α-Amino-γ-Brombuttersäure oder Homocystein (Hoc) wobei entweder X ₆ oder X ₁₅ C oder Hoc sind.

EPO mimetische Peptide zeigen eine besonders gute Aktivität in zyklisierter Form. übli- cherweise werden daher zwei Peptidmonomere (die Monomere entsprechen Bindungs- domänen) mit einem EPO mimetischen Konsensus jeweils zyklisiert und zu einem Dimer verbunden, da die Bindung an den EPO-Rezeptor in dieser Form am effektivsten ist. Die EPO mimetischen Monomere weisen durchschnittlich 10 bis 25 Aminosäuren auf. Vorzugsweise werden sie, wie in der PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959) beschrieben, als kontinuierliche Dimere (bivalente Peptide) synthetisiert, um separate Dimerisierungsschritte zu vermeiden.

Im Stand der Technik sind verschiedene Methoden zur Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken zur Zyklisierung von EPO-mimetischen oder auch TPO-mimeti- sehen Peptiden bekannt. Kern der bekannten Lehren ist die Oxidation der Cystein- Reste (oder entsprechender anderer SH-Gruppen haltigen Aminosäuren) im EPO-mimetischen Konsensus. Als typisches Oxidationsmittel wurde bislang DMSO eingesetzt, was jedoch die eingangs geschilderten Nachteile aufweist.

Die Zyklisierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hat gegenüber den im Stand der Technik bekannten Verfahren einige entscheidende Vorteile. So werden bessere Ausbeuten sowie eine größere Reinheit des Produkts als mit dem im Stand der Technik bekannten Verfahren erzielt. Ein weiterer entscheidender Vorteil der erfindungsgemä- ßen Methode ist die einfache Trennbarkeit des erfindungsgemäßen Zyklisierungsrea- genz vom Reaktionsprodukt durch eine einfache HPLC. Gemäß einer weiteren Variante lässt sich die heterozyklische Verbindung (bspw. Koffein) durch Flüssig-Flüssig-Extrak- tion abtrennen. So lässt sich z.B. Koffein durch wiederholte Extraktion mit Dichlor- methan von einer wässrigen Peptidlösung abtrennen. Bei der Zyklisierung längerer Peptide ist auch die Anwendung von Grössenausschlusschromatographie (size exclu- sion chromatography, SEC) möglich. Die Aufreinigung ist daher erheblich vereinfacht.

Je nach SH-Gruppen haltiger Substanz bzw. Peptid und eingesetzten Reaktionsbedingungen kann die Reaktionszeit auf unter acht Stunden gesenkt werden (bspw. durch Absenkung des pH-Werts; Wahl eines zusätzlichen Oxidationsmittels). üblicherweise liegt die Reaktionszeit < = vierundzwanzig Stunden, vorzugsweise unter zwanzig Stunden, besonders bevorzugt unter fünfzehn Stunden und ganz besonders bevorzugt zwischen fünf und zehn Stunden.

Neben den erwähnten EPO mimetischen Peptiden wurden jedoch auch andere Peptide erfolgreich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zyklisiert. So unter anderem an dem von Oxytocin abgeleitetem Peptid, welches im Gegensatz zu Oxytocin eine Carbonsäure am C-Term anstelle eines Amides besitzt:

H-CYIQNCPLG-OH das ebenfalls durch Ausbildung einer intramolekularen Cysteinbrücke zyklisiert vorliegt.

Wie erwähnt, wird die intramolekulare Disulfidbrücke vorzugsweise zwischen zwei Aminosäuren ausgebildet. Diese können natürlich oder nichtnatürlich sein, einzige Voraus- setzung ist die Fähigkeit zur Ausbildung einer Disulfidbrücke durch Reaktion der SH- Gruppe. Cystein ist wohl die bekannteste Disulfidbrücken ausbildende Aminosäure, die auch in der Natur überwiegend zur Ausbildung von Disulfidbrücken eingesetzt wird. Disulfidbrücken treten in der Natur insbesondere bei der Ausbildung intra- und intermolekularer Disulfidbrücken auf. So bewirken sie bspw. den Zusammenhalt zwischen den einzelnen Polypeptidketten von Proteinen (bspw. Insulin) in Form von intermolekularen Disulfidbrücken und bewirken innerhalb eines Proteins durch Ausbildung intramolekularer Disulfidbrücken regelmäßig eine Stabilisierung der Konformation.

Das Keratin der Wolle und des Haares enthält bspw. über 10% Cystein, weswegen dort auch viele Disulfidbrücken vorliegen. Werden diese Disulfidbrücken aufgebrochen

(bspw. durch Laugen, Licht, Erwärmung etc.), nimmt die Reißfestigkeit der Fasern stark ab. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher auch dazu eingesetzt werden, um Disulfidbrücken in Fasern (Natur- und Synthetikfasem) auszubilden. Gleiches gilt für die Behandlung von Haaren, bei denen Disulfidbrücken ebenfalls eine große Bedeutung für die Strukturfestigkeit haben. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich daher auch zur Ausbildung von Disulfidbrücken in Haaren einsetzen, wodurch auch ein kosmetischer Anwendungsbereich eröffnet wird (bspw. Shampoos, Reagenzien zur Ausbildung von Dauerwellen etc.). So lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise als Mittel zur Schließung der Disulfidbrücken im Rahmen einer Dauerwellenbehandlung einsetzen. Hierzu ist es besonders vorteilhaft, wenn zusätzlich zu der oben näher charakterisierten Substanz zur Förderung der Disulfidbrückenbildung ein Oxidationsmittel zugegeben wird. Es hat sich gezeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit dadurch deutlich beschleunigt werden kann und die Disulfidbrücken entsprechend schneller geschlossen werden. Dies hat zur Folge, dass bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei Haaren, die Einwirkzeit und somit auch die Dauer der Behandlung für den Kunden in vorteilhafter Weise verkürzt wird. Ein besonders geeignetes Oxidationsmittel ist oxidiertes Glutathion (GSSG). Die dadurch erzielte Verbesserung der Schließung der Disulfidbrücken in quantitativer als auch zeitlicher Hinsicht, ist anschaulich in den experimentellen Beispielen beschrieben.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindungen in kosmetischen Zubereitungen. Mit diesen kosmetischen Zubereitungen können entsprechend die Ausbildung von Disulfidbrücken beispielsweise bei Haaren gefördert werden.

Die kosmetischen Zubereitungen können neben der zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindung geeignete Lösungsmittel sowie in derartigen Formulierungen übliche Zusätze enthalten. Zu nennen sind beispielsweise Emulgatoren und Coemulgatoren, Tenside, ölkörper, Konservierungsmittel, Parfümöle, kosmetische Pflege und Wirkstoffe wie AHA-Säuren, Fruchtsäuren, Ceramide, Phytantriol, Collagen, Vitamine und Pro-Vitamine, beispielsweise Vitamin A, E und C, Retinol, Bisabolol, Panthenol, natürliche und synthetische Lichtschutzmittel, Naturstoffe, Trübungsmittel, Mikropigmente wie Titanoxid oder Zinkoxid, überfettungsmittel, Perlglanzwachse, Konsistenzgeber, Verdicker, Solubilisatoren, Komplexbildner, Fette, Wachse, Silikonverbindungen, Hydrotrope, Farbstoffe, Stabilisatoren, pH-Wert-Regulatoren, Reflektoren, Proteine und Proteinhydrolysate, Eiweißhydrolisate, Salze, Gelbildner, Konsistenzgeber, Silikone, Feuchthaltemittel, Rückfetter und weitere übliche Additive. Des Weiteren können zur Einstellung der jeweils gewünschten Eigenschaften Polymere enthalten sein.

Zum Schutz der Haare vor Beeinträchtigung durch UV-Strahlung können in den kosmetischen Zubereitungen auch UV-Lichtschutzmittel enthalten sein.

Haarkosmetische Zubereitungen umfassen insbesondere Stylingmittel und/oder Konditioniermittel in haarkosmetischen Zubereitungen wie Haarkuren, Haarschäume,

Haargele, Haarsprays, Haarlotionen, Haarspülungen, Haarshampoos, Haaremulsionen,

Egalisierungsmittel für Dauerwellen, Haarfärbe- und Bleichmittel, Festigerlotions oder ähnliche Produkte. Je nach Anwendungsgebiet können die haarkosmetischen

Zubereitungen als (Erosol-) Spray, (Erosol-) Schaum, Gel, Gelspray, Creme, Lotion, Milch oder Wachs appliziert werden.

Bevorzugt handelt es sich bei dem Mittel um ein Produkt für das Haar, das unter den Haarwaschmitteln und Produkten für das Haar ausgewählt ist, die ausgespült oder nicht ausgespült werden und vor oder nach einer Haarwäsche, Färbung, Entfärbung, Dauerwelle oder Entkräuselung aufgetragen werden.

Erfindungsgemäß wird daher auch ein Verfahren zur Behandlung von Haaren zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Haare mit dem kosmetischen Mittel, enthaltend wenigstens eine der zuvor näher erläuterten heterozyklischen Verbindung in Kontakt gebracht werden und ggf. mit Wasser gespült wird. Die heterozyklische Verbindung ist vorzugsweise ausgewählt aus den oben eingehend erläuterten Verbindungen und Verbindungsklassen.

Ferner kann das Verfahren wie dargelegt auch zur Ausbildung von Disulfidbrücken von synthetischen Substanzen eingesetzt werden, die lediglich entsprechende SH-Gruppen tragende funktionelle Gruppe aufweisen, aber bspw. nicht aus Aminosäuren aufgebaut sind (jedoch bspw. aus einem organischen Polymer).

Gemäß einer vorteilhaften Weiterentwicklung wird die Abtrennung der die Ausbildung von Disulfidbrücken fördernden Substanz erheblich erleichtert. Gemäß dieser Idee wird ein Trägerstoff mit der Disulfidbrücken fördernden Substanz beladen. Der Trägerstoff kann bspw. ein (hydrophiles) Harz sein. Die Bindung der Substanz an den Trägerstoff hat zur Folge, dass die Abtrennung der geträgerten Substanz bspw. durch einfaches

Abfiltrieren möglich ist. Daher kann es vorteilhaft sein, in dem obigen Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken Koffein bzw. Koffeinähnliche Substanzen (siehe obige

Formeln) einzusetzen, die an einen Trägerstoff gebunden sind, um die Abtrennung zu erleichtern.

Um die Anbindung der Substanz an den Trägerstoff zu ermöglichen, sind funktionelle Gruppen an der Substanz hilfreich. Daher können auch Derivate der die Disulfidbrücken ausbildenden Substanz eingesetzt werden.

Beispiele für geeignete Koffein-Derivate sind:

Theophyllin-8-Buttersäure

und

Theophyllin-7-Essigsäure

Beide Derivate fördern die Ausbildung von Disulfidbrücken und damit auch die Zyklisie- rung von Peptiden in Lösung. Bindet man diese Substanzen über ihre funktionelle Gruppe kovalent an einen geeigneten Trägerstoff, so erhält man ein immobilisiertes Reagenz, das in der Lage ist, das Schließen von Disulfidbrücken zu beschleunigen. Nach der Reaktion kann das Reagenz durch einfaches Abfiltrieren von der Reaktionslösung entfernt werden. Wie anhand dieser Verbindungen deutlich wird, ist es erfindungsgemäß auch möglich, an die verbleibenden Positionen am heterozyklischen Ring auch unabhängig von den Resten R ₁ ' bis R ₃ ' Reste, wie hier im Falle von 8-(3-Carbo- xypropyl)-1 ,3-dimethylxanthin bspw. eine funktionelle Gruppe als R ₅ ' zur Kopplung an die Trägersubstanz, anzuhängen.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindungen zur Ausbildung von Disulfidbrücken, insbesondere von intra- oder intermolekularen Disulfidbrücken in Peptiden und Proteinen.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Substanzen sind besonders geeignet zur Zykli- sierung von Peptiden, insbesondere EPO mimetischen Peptiden, durch Ausbildung von

intramolekularen Disulfidbrücken. Besonders bevorzugte Beispiele sind N-Methyl-2- Pyridon, 2,6-Dihydroxy-pyridin-Hydrochlorid, Uracil-6-carbonsäure, 2,4-Dihydroxy-6- methylpyrimidin, 2,4-Dimethyl-6-hydroxypyrimidin, 2-lsopropyl-6-methyl-4-pyrimidinol, 4,6-Dihydroxy-2-methylpyrimidin, 4,6-Dihydroxypyrimidin, 1 ,2-Dihydro-3,6- pyridazindion, 7-Hydroxy-5-methyl[1 ,2,4]triazolo[1 ,5-a]pyrimidin, Barbitursäure, Alloxan- Monohydrat und Violursäure, Uracil, 1-Methyl-Uracil, 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin, Koffein, Isokoffein, Xanthin, Theophyllin-7-Essigsäure, Theophyllin-8- Buttersäure, 3-lsobutyl-1-Methylxanthin, 1 ,2,3-Benzotriazin-4(3H)-on, (-)-Riboflavin, Lumazin, Alloxazin, Minoxidil (= 6-(1-Piperidinyl)-2,4-pyrimidindiamin-3-oxid) und Aminexil (= 2,4-Diaminopyrimidin-3-oxid).

Diese Substanzen lassen sich erfindungsgemäß besonders gut zur Ausbildung von Disulfidbrücken einsetzten. Besonders bevorzugt sind:

N-Methyl-2-pyridon, Barbitursäure, Alloxan-Monohydrat, Violursäure, 4,6-Dihydroxy- pyrimidin, Uracil-6-carbonsäure, Minoxidil, 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin, 3- lsobutyl-1-methylxanthin, Koffein, Isokoffein, Lumazin, Alloxazin.

Solche Disulfidbrücken werden zwischen SH-haltigen Gruppen ausgebildet. Insbesondere natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren, die freie SH-Gruppen aufweisen, sind geeignete Disulfidbrückenbildner.

Aufgrund ihrer Fähigkeit, die Ausbildung von Disulfidbrücken zu fördern, können die Substanzen der obigen Formel bspw. zur Behandlung von SH-Gruppen haltigen Sub- stanzen und Materialien eingesetzt werden, um die Ausbildung von Disulfidbrücken zu fördern. So lassen sich die Substanzen bspw. zur Behandlung von Haaren oder Fasern (Natur- und Synthetikfasem) einsetzten. Dies trifft insbesondere auf cysteinhaltige Fasern zu. Die erfindungsgemäß einzusetzenden heterozyklischen Verbindungen können bspw. auch in flüssigen Formulierungen (bspw. in Form von Spülungen oder Shampoos oder anderen Mitteln zur Behandlung von Haaren wie bspw. Dauerwellenreagenzien) zum Einsatz kommen. Entsprechende Zusammensetzungen werden daher ebenfalls von der Erfindung umfasst.

Augrund der katalytischen Wirkung der erfindungsgemäß charakterisierten heterozyklischen Verbindungen auf die Ausbildung von Disulfidbrücken können diese bspw. auch zur Katalyse bei der Ausbildung von inter- oder intramolekularen Disulfidbrücken zur Herstellung dynamischer kombinatorischer Bibliotheken eingesetzt werden. Sie können daher zur Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen synthetischen oder natürlichen oder modifizierten natürlichen Molekülen dienen. Sie können daher bei der Herstellung dynamischer kombinatorischer Bibliotheken für die Wirkstoffsuche Anwendung finden. Bei dynamischen kombinatorischen Bibliotheken werden die

einzelnen Einheiten oftmals über Disulfidbrücken zu Makromolekülen vernetzt (siehe Fig. 15). Einzelheiten zu den Bibliotheken sind bspw. in "Dynamic combinatorial libraries of macrocyclic disulfides in water. S. Otto, R. L. E. Furlan and J. K. M. Sanders, J. Amer. Chem. Soc, 2000, 122, 12063-12064"; „Selection and amplification of hosts from dynamic combinatorial libraries of macrocyclic disulfides. S. Otto, R. L. E. Furlan and J. K. M. Sanders, Science, 2002, 297, 590-593"; "Drug discovery by dynamic combinatorial libraries. Ramström, Lehn. Nat Rev Drug Discov. 2002" und WO01/64605 beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren soll nachfolgend anhand einiger Beispiele verdeut- licht werden. Als Beispiele für die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zyklisierbaren Peptide wurden EPO mimetische Peptide und Oxytocin gewählt.

Fig. 1

Gezeigt ist der Reaktionsverlauf der Zyklisierung eines EPO-mimetischen Peptids der folgenden Sequenz

GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am (BB57)

(0,7 mg/ml) zu dem entsprechenden zyklisierten Produkt in Anwesenheit von Koffein (0,3 mg/ml) mit Luft in Wasser bei Raumtemperatur. Wie die Kurve deutlich zeigt, nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit im Laufe der Reaktion zu, was einen autokatalytischen Mechanismus der Reaktion nahe legt. Die Abkürzung Am steht allgemein für eine Amidierung.

Fig. 2 Gezeigt ist die Zyklisierung desselben Peptids wie in Fig. 1 (0,7 mg/ml) zu seiner zyklisierten Form in Abwesenheit von Koffein. Wie deutlich erkennbar ist, ist die Reaktionsgeschwindigkeit erheblich herabgesetzt.

Im Falle von EPO-mimetischen Peptiden hat sich eine optimale Konzentration von Koffein in einem Bereich von 0,075 bis 0,15 mg/ml ergeben. Der Umsatz ist bereits nach zehn Stunden quantitativ.

Fig. 3

Dargestellt ist die Abhängigkeit der Geschwindigkeit der Umsetzung des in Fig. 1 ge- zeigten EPO-mimetischen Peptids von der Koffeinkonzentration. Wie dargestellt, sind sehr gute Ergebnisse in einem Konzentrationsbereich von 0,03 mg/ml bis 0,3 mg/ml erzielbar. Die optimalen Werte liegen in einem Bereich von 0,06 mg/ml bzw. 0.075 und 0,15 mg/ml.

Fig. 4

Dargestellt ist die Abhängigkeit der Zyklisierungsgeschwindigkeit vom pH-Wert. Wie deutlich erkennbar ist, ist der autokatalytische Verlauf der Reaktion nicht auf eine änderung des pH-Werts zurückzuführen, da dieser Effekt auch in den dargestellten gepufferten Lösungen (Phosphatpuffer, pH 6 bis 9) auftritt. Jedoch hat sich gezeigt, dass die Ausbeute an zyklisierten Peptid bei höheren pH-Werten sinkt. Ferner hat sich überraschender gezeigt, dass die Reaktion schneller verläuft, je niedriger der pH-Wert der Lösung ist. Daher ist ein niedrigerer pH-Wert von unter 7 und vorzugsweise < = 6,5 bevorzugt.

Fig. 5

Dargestellt ist der Einfluss des milden Oxidationsmittels Glutathion (oxidierte Form) auf die Reaktionsgeschwindigkeit. Hier fand die Umsetzung des in Fig. 1 dargestellten Peptids (0,7 mg/ml H ₂ O) in Anwesenheit von 0,1 mg/ml (0,5 äquivalente) Glutathion, oxidierte Form (GSSG) und Koffein (0,3 mg/ml) statt. Innerhalb von fünf bis sechs Stun- den war die Reaktion bereits vollendet. Die Umsetzung des Peptids nur mit GSSG (in Abwesenheit von Koffein) erfolgt nur langsam. Ferner hat sich gezeigt, dass unerwünschte Nebenprodukte entstehen (s. Abb. 6).

Fig. 6 Dargestellt sind Chromatogramme, die jeweils nach einer Stunde Reaktion aufgezeichnet wurden und die die Umsetzung des eingesetzten EPO-mimetischen Peptids mit 0,5 äquivalenten GSSG belegen.

Fig. 7 Dargestellt ist eine tabellarische übersicht, die das erfindungsgemäße Verfahren mit den im Stand der Technik bekannten Methoden vergleicht. Die getesteten Peptide wiesen folgende Sequenz auf:

EMP1 : Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-Am APG1 : Ac-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am APG2: Ac-GGTYSCHFGKLT-NaI-VCKKQRG-Am

Die in wϊro-Experimente zeigten eine vergleichbare Aktivität der Peptide, die nach den verschiedenen Methoden zyklisiert wurden. Die erfindungsgemäße Methode zeichnet sich jedoch durch bessere Ausbeuten sowie Reinheiten im Verhältnis zu den anderen getesteten Zyklisierungsmethoden aus, wie Fig. 7 anschaulich belegt. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass das eingesetzte Zyklisie- rungsreagenz auf einfache Weise durch HPLC abgetrennt werden kann.

Weitere Beispiele von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zyklisierten EPO-mi- metischen Peptiden sind nachfolgend aufgeführt:

Ac-C(tBu)-GGTYSCHFGKLT-Nal1 -VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-NaH -VCKKQRG-Am (APG3) AC-C(MOb)-GGTYSCHFGKLT-NaII-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-NaII-VCKKQR G-Am (APG4)

Ac-C(tBu)-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am (APG5) (Sama)-GGTYSCHFGKLT-Nai -VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-NaI -VCKKQRG-Am (APG6)

Fig. 8 Gezeigt ist die Zyklisierung von dimeren EPO mimetischen Peptiden. Die Zyklisierung von di- oder multimeren Peptiden erfolgt vorzugsweise in mehreren Schritten. Fig. 8 zeigt das Syntheseschema anhand eines bivalenten (dimeren) EPO-mimetischen Peptids, das in 2 Schritten durch Ausbildung von zwei intramolekularen Disulfidbrücken zyklisiert wird. Nach diesem Verfahren wird die erste Disulfidbrücke nach dem erfin- dungsgemäßen Verfahren ausgebildet. Die zweite intramolekulare Disulfidbrücke wurde unter Einsatz einer optimierten lod-Oxidation durchgeführt. Zur Kupplung der Peptide an einen polymeren Carrier wurden ferner teilweise weitere Cystein-Reste ins Molekül eingebracht. Dieses Cystein wurde durch geeignete Schutzgruppen tBu or Mob) geschützt.

Die erste erfindungsgemäße Zyklisierung unter Einsatz von Koffein wird vorzugsweise bei pH 6 durchgeführt, während die zweite Zyklisierung gemäß dem gezeigten Beispiel in 80% Essigsäure erfolgte. Die Ausbeute der Synthese lag typischer Weise zwischen 60 und 90%.

Fig. 9

Einige der EPO mimetischen Peptide lassen sich nur sehr schwer zyklisieren. Ein Beispiel dafür ist das folgende Peptid:

Ac -GGTYSCHFG-Har-LT- 1 -NaI- VCK- Aad-Q-Aad-G-NH ₂

Har=Homoarginin

Aad = 2-Aminoadipinsäure, "Homoglutaminsäure" NaI: Naphtylalanin

Bei dieser Sequenz hat sich gezeigt, dass die Erhöhung der Konzentration an Zyklisie- rungsreagenz von Vorteil ist. So war die Zyklisierung mit 10mg/ml Koffein innerhalb von 24h erfolgreich. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 gezeigt. Die Ausbeute lag nach ca. 21 h in Lösung bereits bei > 90%.

Fig. 10 bis 12

Neben EPO mimetischen Peptiden wurde auch ein von Oxytocin abgeleitetes, reduziertes Peptid mit Koffein bzw. der Koffeinähnlichen Substanz (siehe obige Formel) zyklisiert.

Bei der Reaktionsdurchführung wurde Oxytocin, reduziert (OyxR), Rohprodukt, in Wasser (bzw. H ₂ O/ACN/TFA) gelöst und mit verschiedenen Konzentrationen von Koffein (und evtl. GSSG) an der Luft stehen gelassen. Der Reaktionsansatz wurde per HPLC in regelmäßigen Abständen vermessen, um die Gehalte an OxyR und dem Produkt Oxytocin (Oxy) zu bestimmen.

Die in Fig. 10 bis 12 gezeigten Tabellen und die dazugehörige Graphik geben eine zusammenfassende übersicht über die Ergebnisse.

Erkennbar ist, dass die Produktausbeute mit der Peptidkonzentration korreliert. Geringere Peptidmengen führen bei Oxytocin zu besseren Ergebnissen.

Die Reaktionszeit bis zum vollständigen Umsatz von OxyR korreliert mit der Konzentra- tion an Koffein in der Reaktionslösung. Bis zu einer Konzentration von 0.5mg/ml Koffein gilt je mehr Koffein, desto schneller läuft die Oxidation ab. Die Peptidkonzentration hat nur einen untergeordneten Einfluss auf die Dauer der Reaktion.

GSSG scheint keinen Einfluss auf Geschwindigkeit oder Ausbeute zu haben.

OxyR, HPLC gereinigt, cyclisiert schon spontan „recht" schnell. Die Reaktionsgeschwindigkeit lässt sich mit Koffein jedoch nochmals deutlich verkürzen. Geringe Mengen ACN/TFA haben geringen Einfluss auf die Ausbeute, die Reaktionszeit wird etwas verlängert.

Fig. 13 und 14

Gezeigt sind die Ergebnisse der Zyklisierung des Peptids BB57 mit der Substanz Minoxidil:

Dazu wurden 0,7mg BB57 und 0,3mg Minoxidil (6-(1-Piperidinyl)-2,4-pyrimidindiamin 3- oxid, Minox) in 1ml destilliertem Wasser gelöst und an der Luft stehen gelassen. Der

Umsatz von BB57 zu oxidiertem BB57C wurde mit HPLC (UV-Detektion bei 216nm) beobachtet. Die Ergebnisse sind in Fig. 13 gezeigt.

Wie Fig. 13 zeigt, ist die Oxidation in Anwesenheit von Minoxidil nach ca. 29h abge- schlössen (bei einer Vergleichsmessung mit Koffein sind es ca. 24h). Minoxidil hat als weiterer Vertreter der erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindungen daher ebenfalls eine positive Wirkung auf die Ausbildung von Disulfidbrücken. Die Ausbeute in Lösung der Minoxidil-katalysierten Reaktion liegt über 95%. Daß es sich bei der Reaktion um eine katalytisch ablaufende Reaktion handelt, zeigt sich dadurch, daß die Konzentration von Minoxidil bei der Reaktion praktisch nicht abnimmt (Abnahme < 2% bei 4.4 eq Minoxidil bezogen auf BB57, siehe Fig. 14).

Fig. 15

Gezeigt sind mögliche Verknüpfungsstrategien über Disulfidbrücken zur Erzeugung vemetzter Makromoleküle. Derartige Bausteine finden oft in dynamischen kombinatorischen Bibliotheken Anwendung.

Fig. 16

Ferner wurden Versuche durchgeführt, um zu demonstrieren, dass Haare, welche zuvor im Sinne einer Dauerwellenbehandlung reduziert wurden, sich mit einer Kombination der erfindungsgemäßen Substanz (hier Koffein) und einem zusätzlichen

Oxidationsmittel (hier oxidiertes Glutathion-GSSG) in Anwesenheit von Luft beschleunigt oxidativ schließen. Damit lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren in vorteilhafter Weise auch im kosmetischen Bereich und insbesondere im Friseurbereich zur Behandlung von Haaren anwenden.

Der Versuch wurde wie folgt durchgeführt:

Je 5-6 mg Haare werden mit 400μl einer 10%gen Lösung einer Ammoniumthioglykolat- haltigen „Well-Lotion" (Produkt „Poly Lock - starke Dauerwelle", Schwarzkopf & Henkel,

Germany) 0,5h bei Raumtemperatur behandelt. Die Lösung wird entfernt und das Haar anschließend 6mal mit je 400μl H ₂ O gewaschen. Je eine dieser so behandelten

Haarproben wird a) in H ₂ O, bzw. einer wässrigen Lösung von b) 10mg/ml Koffein, c)

5mg/ml GSSG in H ₂ O und d) 10mg/ml Koffein und 5mg/ml GSSG bei Raumtemperatur über 3 Tage behandelt.

Zur Bestimmung der freien, noch verbliebenen Thiolgruppen werden die Haare nach Abtrennung der Reaktionslösung mit Ellmansreagenz (5,5'-Dithiobis(2- nitrobenzoesäure), DTNB) umgesetzt. Als zusätzliche Referenzproben dienen unbehandeltes Haar sowie reduziertes Haar, welches ansonsten keiner weiteren Behandlung unterworfen wurde. Die Haarproben werden dazu mit je 200μl eines

10OmM Phosphatpuffers, pH 8.0 und 1mM EDTA, und 300 μl einer 1 mM DTNB-Lösung in demselben EDTA-haltigen Puffer gegeben. Die Lösung wird nach einigen Minuten in einem UV-Vis-Spektrometer vermessen.

Die UV-Vis-Spektren der Proben zeigen, dass die Reduktion der Haare durch die Behandlung mit der Ammoniumthiolglykolathaltigen „Well-Lotion" erfolgreich war (siehe Abb. 29, Kurven e und f, die einmal unbehandelte und einmal reduzierte Haare zeigen). Dies kann man daran erkennen, dass die Bande bei 412nm - ein Maß für die Zahl freier Thiolgruppen - am größten ist. Eine Behandlung in Anwesenheit von Luft mit a) H ₂ O, b), mit einer koffeinhaltigen Lösung, c) der GSSG-haltigen Lösung führt jeweils nur zu einer teilweisen Oxidation der Thiolgruppen. Jedoch lässt sich bereits hier erkennen, dass das Koffein einen positiven Einfluss auf die Schließung der Disulfidbrücken hat. Die Kombination d) aus Koffein und dem Oxidationsmittel GSSG führte jedoch zu einer nahezu quantitativen Oxidation der Thiolgruppen bei Haaren. Dieser Versuch belegt daher, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Schließung von Disulfidbrücken auch erfolgreich an Haaren eingesetzt werden kann.

Fig. 17 bis 39

Gezeigt sind die Ergebnisse der Zyklisierung des Referenzpeptids BB57 mit verschiedenen Substanzen, die erfindungsgemäß die Ausbildung von Disulfidbrücken fördern können.

Die Versuche wurden wie zuvor dargelegt durchgeführt (siehe oben). Die getestete Substanz sowie die getesteten Mengen sind jeweils angegeben.