B e s c h r e i b u n g

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Verbindungen, die katalysiert durch Enzyme Elektronen aufnehmen oder abgeben können, unter Verwendung von HPLC und elektrochemischen Nachweismethoden.

Gerade im medizinischen Bereich ist es erforderlich, Verbindungen nachzuweisen, die in sehr geringen Konsen¬ trationen im Blut, im Urin, in anderen KÖrperflüssig- keiten oder in Lösungen vorliegen. Oft sind geringste Mengen von Verbindungen schon ein Hinweis auf physiolo¬ gische Vorgänge im Körper, aus denen der Arzt dann auf Krankheiten oder Störungen des Stoffwechsels schließen kann. Es ist deshalb notwendig, Verbindungen bis unter den Picogrammbereich nachweisen zu können. Gerade in den Körperfϊüssigkeiten sind aber sehr viele Verbindun¬ gen, die ähnlich aufgebaut sind, vorhanden. Es ist deshalb erforderlich, nicht nur sehr genaue Nachweis¬ methoden, sondern auch sehr spezifische Nachweismetho¬ den anzuwenden. Als sehr genaue und gute Trennungsme¬ thode hat sich dabei die HPLC bewährt. Mit Hilfe von HPLC lassen sich Substanzen sehr, fein und sehr schnell auftrennen.

Da es weiterhin bekannt ist, daß. mit Hilfe der Enzym¬ analytik der spezifische Nachweis bestimmter Verbin¬ dungen möglich ist, wurde von Potter et al in Journal of .Neurochemistry, Vol. 41, Nr. 1 (1983) , Seiten 188 bis 194 vorgeschlagen, Acetylcholin und Cholin nach¬ zuweisen, indem man eine Lösung, die Acetylcholin und Cholin enthält, zuerst über eine HPLC-Säule schickt, anschließend in dem Eluat, das aus der HPLC-Säule

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komm , den pH neu einstellt, Enzyme hinzugibt und nach der enzymatischen Umsetzung, die einige Minuten dauert, in der den Reaktionscoil verlassenden Lösung gebildetes H-,0-, elektrochemisch nachweist. Dabei liegt die Nachweis- grenze für Cholin und Acetylcholin bei 1 bzw. 2 Picomol.

Es ist nun aber wünschenswert, die Nachweisgrenze für Substanzen wie Cholin und Acetylcholin und andere Ver¬ bindungen noch weiter herabzudrücken, ohne die Spezifi- tät des Nachweises zu beeinflussen. Es war daher Ziel der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, das sehr spe¬ zifisch ist und es ermöglicht, Verbindungen noch in weit geringeren Konzentrationen, als es bisher möglich war, nachzuweisen.

Dieses Ziel wird erreicht durch ein Verfahren zum Nach¬ weis von Verbindungen,- die ^" katalysiert durch Enzyme Elektronen aufnehmen oder abgeben können, unter Verwen¬ dung von HPLC und elektrochemischen Nachweismethoden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Probe, die eine oder mehrere zu bestimmende Verbindungen enthält, über eine HPLC-Säule laufen läßt, dann das Eluat durch eine mit einer TrägerSubs anz, an die immobilisierte Enzyme und gegebenenfalls weitere Enzyme gebunden sind, gepackte Minisäule leitet, wobei der pH des Eluats nicht verändert wird und anschließend die in der die Minisäule verlassende Lösung, die von dem Enzym oxidierte oder reduzierte Verbindung durch elektrochemische Detektion quantitativ bestimmt.

Mit Hilfe dieses erfindungsgemäßen Verfahrens ist es überraschenderweise möglich, Verbindungen, die kataly¬ siert durch Enzyme Elektronen aufnehmen oder abgeben können, bis zu einer Konzentration von 0,1 Picomol

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nachzuweisen. Das bedeutet gegenüber dem bisher be¬ kannten Verfahren eine Verbesserung um den Faktor 10 bis 15. Dazu genügt es, sehr kleine Minisäulen mit einem Bettvolumen von nur 20 bis 150 Mikroliter zu benützen.

Das Verfahren läßt sich für alle Verbindungen anwenden, die durch HPLC aufgetrennt werden können und die kata¬ lysiert durch Enzyme -Elektronen aufnehmen oder abgeben können und die nach der enzymatischen Umsetzung elektro¬ chemisch nachweisbar sind. Bevorzugt werden dabei als Enzyme, die die Redoxreaktion katalysieren, Oxidasen verwende .

Die Auftrennung über HPLC erfolgt in an sich bekannter Weise. Dabei wird die Säulenpackung und das Elutions- mittel je nach den aufzutrennenden Verbindungen ausge¬ wählt. Die entsprechenden Packungen und Elutionsmittel sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.

Das Eluat aus der HPLC-Säule wird dann direkt in eine Minisäule, die eine Größe von etwa 2 bis 8 x 0,05 bis 0,1 cm haben kann, geleitet, die mit einer Trägersub¬ stanz gepackt ist, an die die immobilisierte Enzyme und gegebenenfalls weitere Enzyme gebunden sind. Als Träger¬ substanz besonders geeignet ist dabei Agarose. Es sind jedoch andere, an sich bekannte Trägersubstanzen verwend¬ bar. An die Trägersubstanz ist ein Enzym gebunden, die die für die nachzuweisende Verbindung gewünschte Reaktion spezifisch katalysiert. Es ist auch möglich, weitere Enzyme oder eine Kombination von Enzymen zu binden, die eine Reaktion katalysieren, die zu der Verbindung führt, die Elektronen aufnehmen oder abgeben kann und

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dann durch die immobilisierte Oxidase weiter umgesetzt wird. So können z.B. in der HPLC-Säule verschiedene Derivate einer Verbindung aufgetrennt werden. Die Verbindung und ihre nacheinander eluierten Derivate können dann über eine enzymatisch durch die Oxidase oxidierte oder reduzierte Nachweisverbindung elektro¬ chemisch nachgewiesen werden, wenn die einzelnen Deri¬ vate von einem Enzym vorher in die Verbindung umgewan¬ delt wurden.

In der von den Enzymen umgesetzten Lösung kann sodann die von dem Enzym oxidierte oder reduzierte Verbindung durch elektrochemische Detektion quantitativ bestimmt werden. Dazu sind die an sich bekannten elektrochemi¬ schen Verfahren geeignet. So ist es beispielsweise möglich, gebildetes H_,0„ mit Platinelektroden quanti¬ tativ zu ^' bestimmen. Ebenso läßt sich gebildetes NADH oder NADPH über ele ^' ktrochemische Detektion quantitativ erfassen.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsge¬ mäßen Verfahrens werden Acetylcholin und Cholin neben¬ einander nachgewiesen. Dazu wird die Lösung, die Acetyl¬ cholin und Cholin enthält, über eine HPLC-Säule gege¬ ben. Acetylcholin und Cholin werden in der HPLC-Säule aufgetrennt und nacheinander eluiert. Das Eluat wird durch eine Minisäule geleitet, die mit Agarose gepackt ist. An der Agarose sind Acetylcholinesterase und Cholinoxidase gebunden. Das zuerst eluierte Cholin wird durch die Cholinoxidase zu H„0 ₂ und Betain umge¬ setzt. Das entstehende H^O- wird mit einem elektroche¬ mischen Detektor, der mit Platinelektroden und einer

Ag/AgCl-Referenzelektrode ausgestattet ist, nachgewiesen. Das danach eluierte Acetylcholin wird durch die Acetyl- cholinesterase in Essigsäure und Cholin gespalten. Das Cholin wird durch die Cholinoxidase oxidiert und das dabei gebildete H-.0-, wird wiederum elektrochemisch nachgewiesen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Cholesterin und Cholesterinester nachgewiesen. Dabei werden über HPLC Cholesterin und Cholesterinester aufgetrennt. In einer Minisäule, die mit Agarose gepackt ist, woran Chole- sterinesterase und Cholesterinoxidase gebunden sind, wird das Cholesterin oxidiert.Die außerdem eluierten Cholesterinester werden enzymatisch hydrolysiert und das entstehende Cholesterin wird dann oxidiert. Das bei der Oxidationsreaktion entstehende H-0- wird dann wieder elektrochemisch detektiert.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, z. B. Neurotransmitter, Leukotriene, Steroid- hormone, Cholesterin und Cholesterinester und Substrate von Reduktasen nachzuweisen. Besonders geeignet sind für das ■erfindungsgemäße Verfahren Substanzen, die ein Substrat für eine H-0_-liefernde Oxidase darstellen.

Vorteil'des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, daß es sehr einfach durchgeführt werden kann. Das Eluat aus der HPLC-Säule kann unverändert in die Minisäule und von dort unverändert zu der elektrochemischen Detektion geleitet werden. Eine Änderung des pH's ist überraschen¬ derweise nicht notwendig. Bisher wurde angenommen, daß Elution und Enzymreaktion bei verschiedenen pH-Werten

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stattfinden müßten, da für beide Verfahren in der Regel verschiedene pH-Optima gegeben sind. Überraschenderweise stellte sich jedoch heraus, daß bei Anwendung desselben pH-Bereiches im gesamten Verfahren die Nachv/eisgrenze um den Faktor 10 bis 15 verbessert werden konnte, ohne daß die Spezifität dadurch verschlechtert worden wäre. Es ist also möglich, erfindungsgemäß Substanzen so spezifisch und empfindlich nachzuweisen, wie es bisher nicht möglich war.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verfügung ge¬ stellt, mit dem es möglich ist, sehr einfach, schnell, genau und empfindlich Verbindungen, insbesondere in Körperflüssigkeiten, nachzuweisen. Selbstverständlich eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch für allgemeine analytische Verfahren, wie z. B. den Nach¬ weis bestimmter Verbindungen in Lebensmitteln, Kunst¬ stoffen etc.

Die Erfindung soll noch durch Beispiele erläutert werden.

B e i s p i e l 1

Gewebe aus Meerschweinchengehirn, von Torpedo und isolierte synaptische Vesikel von Torpedo wurden in kalter, 0,4molarer HC10. homogenisiert und dann mit einmolarer KOH auf einen pH von 5,0 eingestellt und mit

10000 g/min zentrifugiert. Die überstände (20 μl) wurden direkt verwendet.

Es wurden Standardlösungen aus Acetylcholinperchlorat und Cholinchlorid wöchentlich frisch hergestellt und bei -20°C eingefroren; bei einem pH von 5,0 aufbewahrt und direkt vor Gebrauch jeweils aufgetaut.

Für das HPLC-Gerät wurde eine Druckeinheit verwendet, wodurch ein konstanter Durchfluß durch einen Stick¬ stoffzylinder gewährleistet war. Die Säule (15x0,2 cm) war gepackt mit kugelförmigem Kieselgel, das SO^H-Grup- pen trug. Die Teilchengröße betrug 5 μm. Es wurde eluiert mit 700 μl/min und einem konstanten Druck von 100 bar. Als Elutionsmittel wurde ein Puffer, der 50 mmol Natriumphosphat und 3 mmol Tetramethylammoniumchlorid in Wasser enthielt und einen pH von 7,6 hatte, verwendet.

Acetylcholesterinesterase (200 Einheiten) aus Electro- phorus electricus und Cholinoxidase (50 U) Arthrobacter clobiformis wurden an 5 ml vorgequollene, mit CNBr aktivierte Agarose gebunden. Ein Teil der Aufschlämmung wurde dreimal mit dem Elutionspuffer gewaschen und dann in eine Glasminisäule (4x0,1 cm, Volumen 125 μl) mit einem keramischen Filter eingebracht, die mit dem Ausfluß der HPLC-Säule verbunden war.

Als elektrochemischer Detektor wurden eine Platinelek¬ trode und eine Ag/AgCl-Referenzelektrode verwendet. Der Detektor wurde bei 500 mV betrieben.

Die erhaltenen Ergebnisse wurden verglichen mit Ergeb¬ nissen, die mit einem Acetylcholinbioassay unter Ver¬ wendung von Blutegelrückenmuskel erhalten wurden.

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Acetylcholin und Cholin wurden zuerst durch HPLC aufge¬ trennt, dann über eine Minisäule, die immobilisierte Acetylcholinesterase und Cholinoxidase gebunden hatte, geleitet. Acetylcholin wurde hier zu Cholin und Essig¬ säure hydrolysiert. Cholin wird dann durch die Oxidase in Betain und H^0 umgewandelt, das dann durch den elektrochemischen Detektor bei 500 mV konstanter Span¬ nung nachgewiesen wird. Die Nachweisgrenze für Cholin und Acetylcholin liegt bei etwa 0,1 Picomol.

B e i s p i e l 2

Es wurden cholesterinhaltige Proben aus menschlichem Blut in üblicher Weise für die Analyse mittels HPLC aufbereitet.

Die Proben wurden dann wie in Beispiel 1 über HPLC aufgetrennt und über eine Minisäule geleitet. Diese Minisäule war eine Glasminisäule (4 x 0,05 cm, 30 Mikroliter Volumen) , die mit CNBr aktivierte Agarose enthielt, an die 5 Einheiten Cholesterinoxidase aus Nocardias erythropolis und 5 Einheiten Cholesterin- esterase aus Schweinepankreas gebunden waren.

Nach Trennung des Cholesterins und der Ester auf der HPLC-Säule erfolgte die Hydrolyse der Ester und die Oxidation des Cholesterins in der Minisäule; das entstehende H- __,,0<-_. wurde dann elektrochemisch nachge- wiesen. Zur Eichung der Messungen wurden ein Cholesterinstandard verwendet.

Zur Durchführung der Analysen wurden jeweils 20 Mikro- liter Blut verwendet. Die Nachweisgrenze war dabei 0,1 pMol Cholesterin in den Proben.