DEL GÉNERO RHODOCOCCUS

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción industrial de lipidos a partir de residuos orgánicos que comprende cultivar cepas del género Rhodococcus , utilizando residuos orgánicos como fuentes de nutrientes. De preferencia, el procedimiento de la invención se lleva a cabo a un pH entre 5 y 11 y a una temperatura entre 20 y 30°C y las cepas del género Rhodococcus se seleccionan entre las pertenecientes a las especies R. fascians, R. erythropolis , R. wratislaviensis, R. opacus y R. jostii. En realizaciones especialmente preferidas, el residuo orgánico se selecciona entre glicerina, suero lácteo, residuos de la elaboración de jugos de fruta y residuos de la elaboración de aceite de oliva.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La demanda energética ha aumentado, de manera exponencial, en los últimos años en todo el mundo. De hecho, hasta la fecha, el 80% de la energía que se consume es de origen fósil (Johansson y Turkenburg, 2004) . Esto lleva a un problema progresivo y trascendental que es el agotamiento de las reservas energéticas. La combustión de material fósil, ampliamente utilizado tanto en la industria como para el transporte y la calefacción, genera altos niveles de emisiones tóxicas (dióxido de carbono, sulfuros, compuestos aromáticos, partículas, etc.) responsables, entre otras cosas, del calentamiento global.

Es por ello que la búsqueda de energías renovables, sustentables y limpias, es una de las principales preocupaciones del mundo moderno. Los biocombustibles (etanol y biodiesel) son las fuentes de energía más prometedoras para la sustitución de los combustibles fósiles.

El biodiesel presenta varios puntos a favor, entre ellos, que es completamente biodegradable y no tóxico. Además, brinda beneficios ambientales, dado que reduce las emisiones durante la combustión y tiene buenas propiedades lubricantes, lo cual aumenta la vida útil de los motores. Asimismo, a diferencia de otras fuentes renovables de energía que requieren el desarrollo de instalaciones sofisticadas, el biodiesel puede ser almacenado y transportado utilizando la infraestructura existente para el diesel de petróleo.

La materia prima para la producción de biodiesel son los triacilglicéridos (TAG) . Éstos son moléculas formadas por tres ácidos grasos de cadena larga, unidos mediante enlaces ásteres al glicerol. Por medio de la reacción de transesterificación, los TAG reaccionan con un alcohol de cadena corta, tal como el metanol o el etanol, para producir metilésteres o etilésteres de ácidos grasos (biodiesel) y glicerol. El glicerol es, por consiguiente, un sub-producto generado durante la producción de biodiesel .

Actualmente, la mayor parte de los biodiesel provienen de aceites obtenidos de plantas oleaginosas y, en menor proporción, de grasas animales y aceites combustibles reciclados. El cultivo de plantas oleaginosas con este fin, está sujeto a una serie de inconvenientes. Por ejemplo, compite con el cultivo destinado a la alimentación humana, produce agotamiento de los suelos debido al monocultivo, es susceptible a los cambios climáticos y es dependiente de las regiones geográficas. Por ello, debido a que no se verían afectados por los factores mencionados más arriba, en la actualidad se están realizando numerosos estudios para la producción de aceites a partir de microorganismos tales como algas, levaduras y bacterias, los cuales podrían ser cultivados en recintos cerrados, bajo condiciones controladas .

La acumulación de TAG como compuesto de reserva en organismos eucariotas, tales como plantas, animales, hongos y levaduras se conoce y estudia desde hace muchos años. Sin embargo, el descubrimiento de éste fenómeno en procariotas es relativamente nuevo. En 1994 se reveló por primera vez la presencia de cuerpos lipidíeos intracitoplasmáticos conteniendo TAG en Streptomyces sp. (Olukoshi y Packter, 1994) .

La capacidad de acumular TAG no es una característica común de todas las bacterias, sino que está restringida a un grupo reducido. Las bacterias del grupo de los actinomyeetes, tales como Nocardia , Streptomyces , Mycobacterium y Rhodococcus , presentan la capacidad de sintetizar TAG en cantidades importantes (Al arez y Steinbüchel 2002) .

Las bacterias del género Rhodococcus tienen la capacidad de degradar y sintetizar TAG a partir de una gran diversidad de fuentes de carbono, entre las que se incluyen los azúcares, los alcoholes, los ácidos orgánicos, los n-alcanos, los alcanos ramificados, los compuestos aromáticos, entre otros (Alvarez y col., 1996,1997, 2000, 2001, 2002; Alvarez y Steinbüchel 2002; Holder y col., 2011) . Rhodococcus opacus PD630 es considerada una bacteria oleaginosa y se ha convertido en un modelo de estudio del proceso de síntesis y acumulación de TAG en procariotas, dado que es capaz de acumular hasta un 87% de ácidos grasos totales por peso seco celular (Alvarez y col. 1996) .

Por todas las características antes mencionadas, las bacterias del género Rhodococcus resultan un objeto de estudio sumamente interesante para la producción de biodiesel .

La mayoría de los reportes de acumulación de TAG en el género Rhodococcus utilizan como fuentes de carbono y energía al gluconato, la glucosa, la xilosa u otros sustratos simples (Alvarez y col., 1996, 2001, 2002; Alvarez y Steinbüchel 2002; Holder y col., 2011).

No obstante, la utilización de dichas fuentes de carbono y energía en un proceso biotecnológico como la generación de lípidos, no sería factible, dado que elevaría de manera importante los costos de producción. Es por ello que la utilización de diferentes residuos como fuentes de nutrientes, para el crecimiento y síntesis de lípidos en diferentes cepas del género Rhodococcus , se plantea como una solución inventiva y que resuelve un problema que, hasta la fecha, no ha podido ser solucionado.

Debido a que tanto la capacidad de degradar diferentes sustratos como la de acumular TAG, varían entre las distintas especies del género Rhodococcus (pudiendo ser inclusive cepa dependiente), con el objeto de producir lípidos a partir de diversos residuos orgánicos, los inventores de la presente estudiaron diferentes cepas del género, seleccionando las cepas que resultan más apropiadas para cada tipo de residuo, aprovechando las diferencias genéticas, bioquímicas y fisiológicas que existen entre ellas.

La producción de lípidos con bacterias oleaginosas a partir de residuos no solo permitiría producir biodiesel u otros derivados oleaginosos a menor costo, sino también solucionar una problemática ambiental que no es menor, tal como lo es la acumulación y la eliminación de los residuos urbanos e industriales, dándole de esta manera un valor agregado al proceso.

En la solicitud de patente WO 2010/147642 Al " Production of triacylglycerides, fatty acids , and their derivatives" se divulga la producción de lípidos, utilizando específicamente Rhodococcus opacus PD630. Aun cuando la descripción es sumamente general, englobando al género Rhodococcus y a todos los organismos oleaginosos procariotas y eucariotas, los resultados refieren únicamente a cultivos utilizando fuentes de carbono simples y comerciales, tales como el gluconato y la glucosa. Asi, el procedimiento allí divulgado resulta ser poco factible desde el punto de vista económico. De hecho, aun cuando se menciona la utilización de residuos, dicho documento no incluye resultados concretos sobre el particular. Es más, dicho documento no plantea la utilización de medios de cultivo preparados a partir de residuos para el crecimiento y la acumulación de TAG. Por el contrario, el procedimiento allí divulgado requiere necesariamente de medios de cultivo preparados con sales minerales y fuentes de carbono comerciales. Además, en dicho documento, no se divulgan cuáles serian las cepas del género Rhodococcus que ofrecerían los mejores rendimientos, tanto en biomasa como en TAG y que, por consiguiente, serían las más adecuadas para ser utilizadas para un procedimiento industrial.

Por otra parte, en la solicitud de patente US 2011/0294173 Al " Process and microorganisms for production of lipids" se divulga la producción de lípidos a partir de diversos residuos y fuentes de carbono, utilizando diferentes cepas del género Streptomyces . No obstante, de ninguna manera plantea la posibilidad de utilizar cepas del género Rhodococcus .

Por otro lado, en la publicación de Gouda M.K. y col., (2008), "Single cell oil production by Gordonia sp . DG using agro-industrial wastes" en J Microbiol Biotecnol 24: 1703- 1711, se divulga la utilización de diferentes residuos como medios de cultivo para la producción de lípidos en Gordonia sp. DG y Rhodococcus opacus PD630. No obstante, no se revelan cuáles serían las especies del género Rhodococcus más apropiadas para cada residuo a utilizar.

En la publicación de Kurosawa K. y col., (2010) . "High- cell-density batch fermentation of Rhodococcus pacus PD630 using a high glucose concentration for triacyglycerol production." Journal of Biotechnology 147: 212-218m se revelan rendimientos de producción de TAG en Rhodococcus opacus PD630, utilizando glucosa como fuente de carbono y energía .

Por otra parte, en la publicación de J.W. Holder y col., (2011) . " Comparative and functional genomics of Rhodococcus opacus PD630 for biofuels development" , PLoS Genet 7(9) : el002219., se presenta una comparación de los genomas de R. opacus PD630 y R. jostii RHA1, analizando aspectos relacionados con el metabolismo de TAG y el metabolismo del nitrógeno, así como la degradación de diversas fuentes de carbono. Si bien dicha publicación menciona la degradación de residuos industriales, todos los resultados que allí se presentan se refieren a la degradación de sustratos comerciales tales como: monosacáridos , oligosacáridos y alcoholes .

Finalmente, en la publicación de Voss I. y col (2001) . "High cell density cultivation of Rhodococcus opacus for lipid production at a pilot-plant scale" . Appl Microciol Biotechnol 55(5) : 547-555 se divulga la producción de TAG a gran escala con Rhodococcus opacus PD630, utilizando azúcar de remolacha y sacarosa como fuentes de carbono y energía. Así, hasta la fecha, no se ha revelado un procedimiento para la producción industrial de lípidos a partir de residuos orgánicos, que comprenda cultivar cepas del género Rhodococcus utilizando residuos orgánicos como fuentes de nutrientes, que posea las características reivindicadas en la presente .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Diferentes regiones productivas de la República Argentina en donde mayoritariamente se generan los diferentes residuos estudiados en la presente.

Figura 2. El Comportamiento general de distintas cepas del género Rhodococcus en la producción de biomasa y lípidos, utilizando diferentes residuos orgánicos como fuentes de carbono y energía. Residuos con los que se lograron altos rendimientos de producción de biomasa y lípidos bacterianos. Residuos de elección para el desarrollo de procesos biotecnológicos de producción de lípidos bacterianos. ---Residuo con el que se obtuvo un alto rendimiento de biomasa pero bajo en lípidos con bacterias del género Rhodococcus. ---Residuo con el que se obtuvieron bajos rendimientos tanto de biomasa como de lípidos en bacterias del género Rhodococcus. ^ Especies que mostraron el mejor desempeño en la producción de lípidos a partir de los residuos seleccionados. En letras rojas se muestran las Cepa/s del género Rhodococcus de elección para profundizar el estudio con cada residuo y para la producción de lípidos bacterianos de acuerdo con la presente invención. Figura 3. Análisis mediante microscopía electrónica de transmisión de la ultraestructura de R. wratislaviensis V, cultivada con residuo de la elaboración de jugo de fruta (Fig.3A), suero lácteo (Fig. 3B), residuo de la elaboración de aceite de oliva (Fig. 3C) , R. fascians F7 cultivada con glicerol como fuente de carbono (Fig. 3D) , así como también R. opacus PD630 cultivada con suero lácteo (Fig. 3E) .

Figura 4: Cromatografía en capa delgada de lípidos extraídos de R. wratislaviensis V cultivada en: MSM0,1 con gluconato al 1% P/V (Gto) , MSM0,1 con glicerol 0,3%V/V (Gly) y en diferentes medios de cultivo preparados a partir de residuos: residuo orgánico domiciliario (ROD) , residuo de la elaboración de jugos de fruta (RF) , suero lácteo (SL) , Vinaza (Vza) , residuo de la elaboración de aceite de oliva (RO) .

Figura 5: Cromatografía en capa delgada de lípidos extraídos de diferentes cepas del género Rhodococcus , cultivadas en medio de cultivo preparado a partir de residuo de oliva (RO) .

Figura 6: Composición relativa de los ácidos grasos de los TAG acumulados a partir de diferentes residuos agroindustriales en R. opacus PD630 (A) y R. wratislaviensis V (B) .

Figura 7: Composición relativa de los ácidos grasos de los TAG acumulados en R. wratislaviensis V y R. opacus PD630 a partir de A) Residuo de la elaboración de jugo de fruta, B) Suero lácteo, C) Residuo de la elaboración de aceite de oliva. D) Composición relativa de los ácidos grasos de los TAG acumulados R. opacus PD630 y R. fascians F7 a partir de glicerol. La relación entre ácidos grasos saturados se encuentra representada como ∑AGS/ ∑AGI .

Figura 8: Composición de ácidos grasos de lipidos de Suero lácteo (A) y Residuo de la elaboración de aceite de oliva (B) .

Figura 9: Esquema general de los diferentes tratamientos físicos y químicos aplicados para reducir y/o eliminar los microorganismos nativos del suero lácteo.

Figura 10: Imágenes de los cultivos de R. wratislaviensis V en suero lácteo sometido a diferentes tratamientos.

Figura 11: Efectos de los diferentes tratamientos sobre biomasa y TAG en R. wratislaviensis V.

Figura 12: Efecto del pH en el crecimiento. Se evaluó el crecimiento de R. wratislaviensis V a diferentes pH en MSM1 con gluconato al 1% p/v como fuente de carbono. El crecimiento fue evaluado mediante densidad óptica (A) y los rendimientos de biomasa generada como PSC (g/L) en fase estacionaria (t= 3 días) (B) .

Figura 13: Efecto del pH sobre la acumulación de lipidos (TAG) . Se evaluó mediante cromatografía en capa delgada la acumulación de TAG en fase estacionaria (t=3 días) en R. wratislaviensis V crecida en medio mineral con déficit de nitrógeno (MSM0,1), utilizando gluconato como fuente de carbono 1) pH=5, 2) pH=7, 3) pH=9 y 4) pH=ll.

Figura 14: Efecto de la agitación sobre los rendimientos de biomasa y TAG. Se evaluaron los rendimientos de biomasa y TAG en R. wratislaviensis V cultivada en suero lácteo bajo diferentes condiciones de agitación. Las barras claras representan la biomasa (PSC g/L) y las barras oscuras la cantidad total de ácidos grasos (% P/P de PSC), como una medida de los lipidos totales. Debajo de las barras se muestran los resultados de TLC, los spots mostrados corresponden a los spots cuyos Rf coinciden con el de TAG.

Figura 15: Efecto de diferentes fuentes de nitrógeno sobre el crecimiento. Se evaluó el crecimiento de R. wratislaviensis V con diferentes fuentes de nitrógeno, en MSM con gluconato al 1% p/v como fuente de carbono. El crecimiento fue evaluado mediante densidad óptica y los rendimientos de biomasa generada como PSC (g/L) en fase estacionaria (t= 3 días) . Se gráfica el crecimiento de R. wratislaviensis V con diferentes fuentes de nitrógeno en una concentración de 1 g/1 (A) y 0,1 g/L (B), respectivamente. En las figuras C y D se representa la biomasa formada en fase estacionaria a partir de diferentes fuentes de nitrógeno, en una concentración de 1 g/1 y 0,1 g/1 respectivamente. En blanco está representado el crecimiento con sulfato de amonio, en gris claro con cloruro de amonio, en gris más oscuro nitrato de potasio, en gris aún más oscuro Nitrito de sodio y en negro la urea.

Figura 16: Efecto de las diferentes fuentes de nitrógeno sobre la acumulación de lipidos. Se evaluó el crecimiento de R .wratislaviensis V con diferentes fuentes de nitrógeno, en una concentración 0,lg/L en MSM con gluconato al 1% p/v como fuente de carbono. Figura 17: Efecto sobre la biomasa y los TAG del agregado de sales minerales y nitrógeno a medio de cultivo preparado a partir de residuo orgánico domiciliario (nombrado como medio ROD) . Se evaluó el crecimiento (A) y la acumulación de TAG (B) en R. wratislaviensis V, cultivada en caldo de cultivo preparado con residuo orgánico domiciliario con y sin el agregado de sales y nitrógeno. Medio ROD: representado como diamantes negros en la curva de crecimiento y 1 en la cromatografía en capa delgada. Medio ROD 50% V/V MSMO (el MSMO aporta únicamente sales minerales) : representado como diamantes en gris oscuro en la curva de crecimiento y 2 en la cromatografía en capa delgada. Medio ROD 50% V/V MSM0,1 (el MSM0,1 aporta sales minerales y 0,lg/L de nitrógeno) : representado como diamantes en gris claro en la curva de crecimiento y 3 en la cromatografía en capa delgada. Medio ROD 50% V/V MSM1 (el MSM1 aporta sales minerales y lg/L de notrógeno) : representado como diamantes en blanco en la curva de crecimiento y 4 en la cromatografía en capa delgada.

Figura 18: Esquema general del proceso de obtención de lípidos en R. fascians F7 en dos etapas. En una primera etapa, se realiza el cultivo en un medio rico en nitrógeno que favorezca el crecimiento. En éste caso, se utilizó un medio de cultivo preparado a partir de residuo orgánico domiciliario (ROD) . En la segunda etapa, la biomasa generada se transfiere a un medio carente de nitrógeno (MSMO), que favorezca la acumulación de TAG, utilizando glicerol como fuente de carbono. Figura 19: Crecimiento en fase sólida: Crecimiento de R. wratislaviensis V sobre filtros de polietersul fona suspendidos sobre medio de cultivo preparado a partir de residuos provenientes de la elaboración de aceite de oliva.

Figura 20: Efecto del tiempo sobre la producción de biomasa y lipidos (TAG) . A) R. fascians F7 cultivada con glicerol. B) R. opacus PD630 cultivada con glicerol. C) R. wratislaviensis V cultivada en medio de cultivo praparado a partir de residuo de la elaboración de jugo de frutas ( F) . D) R. wratislaviensis V cultivada en suero lácteo (SL) . E) R. wratislaviensis V cultivada en medio de cultivo preparado a partir de residuo de la elaboración de aceite de oliva (RO) . En barras claras se gráfica la biomasa (PSC g/L) y en barras oscuras la cantidad total de ácidos grasos (%P/P PSC) . en el caso del cultivo con medio preparado a partir de RO la biomasa se expresa como mg de biomasa generada a partir de 50μ1 de inoculo (D.O=4) .

Figura 21: Efecto del tiempo en la acumulación de lipidos (TAG) . Las imágenes corresponden al análisis semicuantitativo de lipidos neutros totales mediante TLC. Los números debajo de cada calle de siembra corresponden al tiempo de cultivo. A) R. fascians F7 cultivada con glicerol. B) R. wratislaviensis V cultivada en medio de cultivo praparado a partir de residuo de la elaboración de jugo de frutas. C) R. wratislaviensis V cultivada en suero lácteo. D) R. wratislaviensis V cultivada en medio de cultivo preparado a partir de residuo de la elaboración de aceite de oliva. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción industrial de lipidos a partir de residuos orgánicos que comprende cultivar cepas del género Rhodococcus utilizando residuos orgánicos como fuentes de nutrientes, a un pH de entre 5 y 11 y una temperatura entre 20 y 30°C, en donde dichas cepas del género Rhodococcus se seleccionan entre las pertenecientes a las especies R. opacus, R. fascians, R. erythropolis , R. wratislaviensis, y R. jostii y en donde el residuo orgánico se selecciona entre suero lácteo, glicerina, residuos de la elaboración de jugos de fruta y residuos de la elaboración de aceite de oliva y porque cuando dicho residuo es suero lácteo, la cepa se selecciona entre las especies R. opacus y R. wratislaviensis , tales como R. opacus PD630 y R. wratislaviensis V, y porque cuando dicho residuo es glicerina, entonces dicha cepa se selecciona entre las pertenecientes a las especies R. fascians y R. erythropolis, tal como la cepa R. fascians F7 y porque cuando dichos residuos son residuos de la elaboración de jugos de fruta y residuos de la elaboración de aceite de oliva entonces dicha cepa se selecciona entre las especies R. wratislaviensis, R. opacus y R. jostii, tales como R. wratislaviensis V, R. opacus PD630, R. jostii RHA1.

En una forma preferida de la invención, el residuo utilizado es suero láctico. En otra forma preferida de la invención, la cepa es R. opacus PD630. Dicha cepa es bien conocida y está disponible por ejemplo en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares - Leibniz Institute DSMZ- bajo el número de depósito DSMZ 44193. En una forma aún más preferida de la invención, el residuo orgánico utilizado como fuente de nutrientes es suero láctico y la cepa es R. opacus PD630. Utilizando esta forma de realización más preferida del método de la invención, es posible obtener una producción extraordinariamente alta de lipidos, principalmente TAG, la cual excede largamente los valores reportados en la literatura especializada. Es de destacar que dicha producción extraordinaria podría aumentar aún más si antes del cultivo que utiliza residuo de suero láctico para la acumulación de lipidos neutros (SL) se hace crecer la cepa Rhodococcus opacus PD630 en un medio de cultivo rico en nitrógeno (tal como por ejemplo residuo orgánico domiciliario, ROD) , con el objeto de aumentar su biomasa.

Mediante la utilización del procedimiento para la producción industrial de lipidos a partir de residuos orgánicos de la invención, pueden obtenerse lipidos, los cuales son mayoritariamente triglicéridos .

En una realización particular de la invención, el procedimiento para la producción industrial de lipidos a partir de residuos orgánicos comprende el cultivo de las cepas del género Rhodococcus utilizando residuos orgánicos como fuentes de nutrientes y se lleva a cabo a un pH cercano a 7 y una temperatura cercana a 28 °C. Más particularmente aún, el procedimiento además comprende una etapa previa al cultivo con cepas del género Rhodococcus , en la que se elimina la carga microbiana que acompaña al residuo orgánico. De preferencia, dicha etapa en la que se elimina la carga microbiana que acompaña al residuo orgánico consiste en la aplicación de calor. En una realización preferida, la recolección de la biomasa para la posterior extracción de lipidos se realiza en la fase estacionaria del cultivo celular. También de manera preferida, la cepa del género Rhodococcus se selecciona entre las especies R. opacus, R. wratislaviensis y R. jostii y el residuo proviene de la elaboración de aceite de oliva y porque el cultivo se realiza en fase sólida. En otra realización preferida, el procedimiento para la producción industrial de lipidos de la invención comprende que en aquellos residuos que requieran el agregado de nitrógeno, se utilice urea como fuente de nitrógeno .

En otra realización particular, la invención se refiere a un procedimiento para la producción industrial de lipidos a partir de residuos orgánicos que comprende el cultivo en una sola etapa donde se alcanzan simultáneamente elevados rendimientos de biomasa y de lipidos o el cultivo en dos etapas diferentes, caracterizado porque comprende: i) hacer crecer cepas del género Rhodococcus en un medio de cultivo rico en nitrógeno, ii) transferir toda la biomasa bacteriana generada a un medio deficitario en nitrógeno, para favorecer asi la acumulación de lipidos neutros .

Diversos residuos (Tabla 2) producidos en diferentes regiones de Argentina (Figura 1) fueron estudiados como fuentes de carbono y energía para el crecimiento celular y acumulación de lipidos en 12 cepas diferentes del género Rhodococcus (Tablas 3 a 5) . Particularmente, cuando se utilizó glicerol como sustrato se analizaron 6 cepas adicionales pertenecientes a las especies R. fascians y R.

erythropolis , trabajando con un total de 18 cepas (Tabla 1) .

Tabla 1: Cepas del género Rhodococcus utilizadas. Las seis

cepas adicionales pertenecientes a R. fascians y

R. erythropolis que sólo se incluyeron en el estudio de la producción de lipidos a partir de glicerol se muestran en

negrita .

Cepas bacterianas Origen/ Referencia

Rhodococcus opacus PD630 DSMZ 44193, Alvarez et al.1996

Rhodococcus opacus MR22 DSMZ 3346

Rhodococcus wratislaviensis V Muestra ambiental de la Patagonia

Rhodococcus jostii RHA1 Seto et al. 1995

Rhodococcus jostii 602 Muestra ambiental de la Patagonia, Silva et al.2010

Rhodococcus jostii 006 Muestra ambiental de la Patagonia

Rhodococcus jostii 016 Muestra ambiental de la Patagonia

Rhodococcus jostii 346 Muestra ambiental de la Patagonia

Rhodococcus jostii G212 Muestra ambiental de la Patagonia

Rhodococcus erythropolis 43060 DSMZ 43060

Rhodococcus fascians F7 BNM 542

Rhodococcus ruber NCIMB 40126 NCIMB 40126, Haywood et al.1991

Bhodococcus fascians D188-5 Desomer et al. 1990

Bhodococcus fascians S 1.17-b Muestra ambiental de la Patagonia, Bequer Urbano et al. 2014

Bhodococcus fascians 123 Pucci et al. (2000)

Bhodococcus fascians G Muestra ambiental de la Patagonia

Bhodococcus erythropolis 17 Peressutti. 2000

Bhodococcus erythropolis DM1-21 Ruberto et al. 2005 Tabla 2: Residuos orgánicos utilizados en este estudio

La mayoría de los estudios y reportes de acumulación de TAG en el género Rhodococcus utilizan gluconato y glucosa como fuente de carbono. Dado que el gluconato es considerado un sustrato de excelencia para la acumulación de TAG, todas las bacterias fueron cultivadas con este sustrato, con el objetivo de obtener los valores de biomasa (MSM1) y de acumulación TAG en MSM0,1 y así tomar éstos como valor de referencia para hacer un estudio comparativo con los resultados obtenidos con el resto de los residuos. Los resultados de biomasa celular (PSC g/L cultivo) y de acumulación de TAG (% p/p PSC) se muestran en las Tablas 3 y 4 respectivamente.

Tabla 3 : Biomasa obtenida en fase estacionaria a partir de gluconato, glicerol y diferentes residuos utilizados como sustratos. Expresada en Peso seco celular (PSC g/L)

Sustratos utilizados como fuente de

carbono y energia Gto ROD RF RP LR SL Gly Vza RO

Cepa bacteriana PSC (g/L)

Rhodococcus opacus PD630 2,9 3,1 4,2 1,4 ^"4 3, O ^"4 6, 1 3,8 8,5- ⁴ 2,2

Rhodococcus opacus MR22 3,1 3,1 5,6 1,4 ^~4 6,6 ^~4 6, 4 3,3 5,6- ⁴ 2,2

Rhodococcus wratislaviensis V 3,0 3,2 6,1 1,3 ^~4 7,5- ⁴ 6, 3 3,7 7, 0 ^_1 2,6

Rhodococcus jostii RHA1 2,3 2,8 4,3 1,9 ^~4 5,5- ⁴ 2,7 2,5 6, r ⁴ 2,6

Rhodococcus jostii 602 1,3 3,3 6,3 1,6- ³ 7,5- ⁴ 2,6 1,7 7,5- ⁴ 2,2

Rhodococcus jostii 006 1,5 2,2 4,5 2,9 ^~4 8,5- ⁴ 1,8 3, 0 ^_1 2,0

Rhodococcus jostii 016 2,0 2,3 4,0 1,8- ³ 6, O ^"4 1,8 6, 0 ^_1 2,0

Rhodococcus jostii 346 2,9 3,5 3,7 2,9 ^~4 5, O ^"4 2,4 2,5- ⁴ 2,0

Rhodococcus jostii G212 2,5 3,3 4,9 4,5- ⁴ 9,5- ⁴ 3,3 5, O ^"1 2,2

Rhodococcus erythropolis DSM 43060 2,4 2,4 4,8 2,8 ^~4 3, O ^"4 3,7 4,1 3,5- ⁴ 1,2

Rhodococcus fascians F7 2,7 2,1 4,6 2,5- ⁴ 2, O ^"4 2,0 4,3 3, r ⁴ 1,5

Rhodococcus ruber NCIMB 40126 1,9 5,5 2,7 ^~4 1,Q- ⁴ 3,3 1,9 3, 0 ^_1 1,2

Tabla 4 : TAG (%p/p de PSC) acumulados en fase estacionaria a partir de gluconato, glicerol y diferentes residuos

utilizados como sustratos

En la Tabla 5 se muestran resultados de TAG expresados en g/1. Esta forma de expresar los resultados da una idea más clara de la eficiencia del proceso dado que representa los TAG obtenidos por litro de cultivo. Este valor se ve afectado por la capacidad de sintetizar TAG, asi como también de la capacidad de cada bacteria de utilizar y crecer a partir de un determinado residuo (generación de biomasa celular) . Las diferencias en los rendimientos cuando se usa uno u otro residuo como fuente de carbono se observa claramente a partir estas tablas . Tabla 5: TAG (g/1) obtenidos en fase estacionaria a

partir de gluconato, glicerol y diferentes residuos

utilizados como sustratos

Sustratos utilizados como fuente de

carbono y energia Gto ROD RF RP LR SL Gly Vza RO

Cepa bacteriana TAG (g/L)

Rhodococcus opacus PD630 1,9 6,8- ² 1,5 3, O ^"4 3,4 1,2 1,5

Rhodococcus opacus MR22 1,0 9, 6 ^~2 2,1 6,6 ^~4 2,9 < i 1,8

Rhodococcus wratislaviensis V 1,7 8, 9 ^~2 2,3 — 7,5- ⁴ 3,5 1,0 < 7,0 ^~2 2,2

Rhodococcus jostii RHAl 1,3 I,! ^-1 1,8 — 5,5- ⁴ < 5,4 ^~2 ι,τ ¹ < 1,2 ^~2 1,7

Rhodococcus jostii 602 0,7 1,4- ^J 2,1 — 7,5- ⁴ < 5,2 ^~2 8,5- ² < 1,5- ² 0,9

Rhodococcus jostii 006 0,4 7, 0 ^~2 2,2 ^~4 — 8,5- ⁴ < 3,6 ^~2 — < 6,0 ^~3 0,8

Rhodococcus jostii 016 0,7 1,3^ 1,4 — 6, O ^"4 < 3,6 ^~2 — < 1,2 ^" 0,8

Rhodococcus jostii 346 1,0 Ι,ίΓ ¹ 1,3 — 5, O ^"4 < 4,8 ^~2 — < 5,0 ^" 0,9

Rhodococcus jostii G212 1,3 1,2- ⁴ 1,8 — 9,5- ⁴ < 6,6 ^~2 — 5,3 ^"2 1,1

Rhodococcus erythropolis DSM 43060 0,7 6,7- ² < 9, 6 ^~ — 3, O ^"4 < 7,2 ^~2 1,2 < 7, O ^"3 0,2

Rhodococcus fascians F7 0,3 6,5- ² 8,5- ² — 2, O ^"4 < 4,0 ^~2 1,8 < 6,2 ^~3 0,2

Rhodococcus ruber NCIMB 40126 — 3, 8 ^~2 1,5 — 1,0 ^"4 < 6,6 ^~2 1,3- ⁴ < 6,0 ^~2 0,2 En la Figura 2, se muestra un resumen de los resultados obtenidos con los diferentes residuos. En el caso de los residuos de pescado (RP) , líquidos residuales (LR) y vinaza (Vza) , si bien se observó el crecimiento de todas las cepas estudiadas, el mismo fue muy escaso, obteniéndose valores de biomasa bajos. En particular, en el caso de RP y LR, no se logró detectar TAG. Con Vza sólo se observó una acumulación significativa de TAG en R. opacus PD630 (13, 5 %p/p PSC) y R. wratislaviensis V (10,1 %p/p PSC) . El crecimiento pobre podría atribuirse a una baja carga orgánica en el caso de los LR, una baja relación C/N propia de su composición en RP y a la presencia de compuestos tóxicos, tales como fenoles, en el caso de la Vza.

Todas las cepas estudiadas mostraron buen crecimiento a partir de residuo orgánico domiciliario (ROD) , alcanzando valores de biomasa celular entre 2-3,2 g/L en cortos períodos de tiempo (3 días) . Los resultados de biomasa obtenidos fueron similares a los obtenidos con gluconato. La acumulación de TAG en todas las cepas fue entre el 2-5 (%p/p PSC) . Este un rendimiento bajo comparado con los resultados obtenidos con gluconato.

Si bien los rendimientos de TAG muestran que el residuo domiciliario no resultaría apropiado para un proceso biotecnológico de producción de lípidos, resulta interesante el crecimiento y la capacidad para degradar este residuo que mostraron todas y cada una de las cepas del género Rhodococcus estudiadas. Así, este residuo podría utilizarse claramente como medio de cultivo para la generación de biomasa y luego transferir las células bacterianas a un medio deficitario en nitrógeno y rico en carbono, óptimo para la acumulación de TAG, como podría ser un medio mínimo con glicerol como fuente de carbono u otros residuos como suero lácteo o residuos de fruta.

Este residuo también resulta interesante para la generación de biomasa para producir en el futuro otros bioproductos a partir de bacterias del género Rhodococcus, como podrían ser pigmentos, biosurfactantes , ceras, etc, contribuyendo simultáneamente a eliminar un residuo que constituye una problemática ambiental para todas las ciudades del mundo.

De acuerdo con la presente invención, tal como se muestra en la Figura 2, los residuos de fruta (RF) , de suero láctico (SL) , de oliva (RO) y de glicerol (Gly) son los residuos más apropiados para la producción de lípidos, dado que a partir de ellos se obtuvieron resultados elevados de biomasa bacteriana y TAG (tomando como base los resultados con gluconato) de manera simultánea y en un período corto de tiempo (3-7 días) . Como se observa en la Figura 2 las bacterias estudiadas mostraron un comportamiento diferente para cada residuo según la especie bajo la cual se agrupan.

La mayoría de las cepas pertenecientes a las especies R. opacus, R. wratislaviensis y R. jostii mostraron capacidad para crecer y acumular importantes cantidades de TAG a partir de RF (35-42, 2 %p/p) y RO (50-84, 4% p/p) . Mientras que las cepas estudiadas de las especies R. fascians, R. erythropolis y R. ruber crecieron a partir de éstos residuos, pero no acumularon cantidades importantes de TAG. En el caso del residuo de oliva, el cultivo se realizó en fase sólida, inoculando las células sobre un filtro de polietersul fona suspendido sobre el residuo. Este residuo resulta sumamente interesante para un proceso biotecnológico de producción de lipidos. Por un lado, por los rendimientos de TAG extraordinarios. Por el otro, porque se desarrolló un sistema simple y eficiente de cultivo estático en fase sólida, que presenta las siguientes ventajas: un ahorro de la energía de agitación y una forma simple y económica de recolección de la biomasa, dos puntos que resultan críticos en cualquier proceso biotecnológico.

Con suero láctico al igual que con los dos residuos antes mencionados, las bacterias de las especies R. opacus y R. wratislaviensis fueron capaces de crecer y acumular elevadas cantidades de TAG (46, 1-56, 2 % p/p) . Por su parte, las cepas pertenecientes a las especies R. fascians, R. erythropolis y R. ruber, y R. jostii, si bien fueron capaces de crecer a partir del residuo, en todas ellas se observaron valores de TAG inferiores al 2 % v/v. Si bien este resultado era esperable para bacterias de las especies R. fascians, R. erythropolis y R. ruber, dado que según reportes anteriores fueron catalogadas como no oleaginosas (acumulación de TAG inferior al 20%v/v) , resulta llamativa la incapacidad de acumular TAG en las bacterias de la especie R. jostii, dado que existen reportes que demuestran que acumulan importantes cantidades de TAG a partir de diferentes fuentes de carbono. Además, R. jostii RHA1 es un modelo de estudio de la acumulación de TAG en bacterias. Este resultado fue clarificado con el estudio de la utilización de lactosa (principal componente del suero láctico) , en el que se demostró que las bacterias de las especies R. fascians , R. erythropolis y R. ruber, y R. jostii son incapaces de utilizar este disacárido.

Cuando se utilizó glicerol como fuente de carbono se pudieron observar diferentes comportamientos. Al contrario de lo que ocurrió con el resto de los residuos, las cepas pertenecientes a las especies R. erythropolis y R. fascians mostraron un enorme potencial para crecer a partir de glicerol y convertirlo metabólicamente en TAG. En el estudio inicial, se incluyeron solo R. fascians F7 y R. erythropolis DSM 43060, dado que estas especies eran consideradas no oleaginosas. No obstante, a partir de los resultados obtenidos (Tablas 3, 4 y 5), se sumaron siete nuevas cepas pertenecientes a las especies R. fascians y R. erythropolis (Tabla 6) . Todas ellas mostraron rendimientos de biomasa de aproximadamente 4 g/1 y TAG cercanos a un 40 % (p/p) , entre los 5-7 días de cultivo (tabla 6) . Los resultados demuestran que esta seria una característica común a las especies R. fascians y R. erythropolis . Por su parte, las cepas de las especies R. opacus y R. wratislaviensis crecen a partir de glicerol, pero luego de una fase lag de aproximadamente 6 días, llegando a fase estacionaria el día 13-14. Si bien los valores de biomasa son comparables con gluconato y valores de TAG cercanos al 30% (p/p), esto se logra en un período prolongado de cultivo. Las cepas perteneciente a las especies R. ruber y R. jostii mostraron el mismo perfil de crecimiento pero acumularon muy poca cantidad de TAG. Tabla 6: Rendimientos de Biomasa (PSC) y TAG (en % p/p de PSC y g/1) con glicerol 0,3% (v/v) como fuente de carbono en MSM1 y MSMO , 1 respectivamente

Si bien, tal como se mencionó más arriba, puede observarse un comportamiento característico de las bacterias según la especie a la que pertenecen, existen dentro de cada grupo variaciones en los rendimientos, en más o en menos, que son cepa dependientes. Así, en base a los resultados experimentales obtenidos y a un amplio conocimiento de la genética, bioquímica, y fisiología, se proponen tres bacterias del género Rhodococcus (dos de ellas aisladas de la Patagonia semiárida) para el escalado de la producción de lípidos con los siguientes residuos agroindustriales : 1) R. fascians F7 para la glicerina y 2) R. wratislaviensis V y R. opacus PD630 para el suero lácteo, residuos de la elaboración de jugo de fruta y de aceite de oliva (Figura 2) .

Como puede observarse en la tabla 4, si bien el porcentaje de acumulación de TAG a partir de RF y SL en R. wratislaviensis V y R. opacus PD630 y a partir de Gly en el caso de R. fascians F7 resultan inferiores a los obtenidos con gluconato, cuando se comparan los rendimientos de lipidos en g/1 (tabla 5), se observa que con RF, RO y Gly en las cepas antes mencionadas, se igualan los rendimientos obtenidos con gluconato, duplicándolos en el caso del SL. Asi, los rendimientos de lipidos en g/1 resultan más apropiados para evaluar un proceso productivo. A esta conclusión se llega teniendo en cuenta tanto la biomasa generada como el porcentaje de acumulación de TAG, es decir la capacidad de degradación y crecimiento a partir de un determinado residuo, asi como la capacidad de convertirlo metabólicamente en TAG. Este resultado demuestra además la factibilidad de usar residuos como fuentes de carbono y energía para la producción de aceites bacterianos, dado que supera los valores obtenidos cuando se utiliza una fuente de carbono pura, tal como el gluconato.

En el caso del RO, los porcentajes de acumulación de TAG en R. wratislaviensis V (84,4% p/p PSC) y R. opacus PD630 (68,2 % p/p PSC) superan ampliamente los obtenidos con gluconato (Tabla 4) .

Se realizó una observación microscópica de R. opacus PD630 y R. wratislaviensis V luego de su cultivo con RO, pudiendo observarse las células repletas de cuerpos lipidíeos intracelulares , algo que resulta coincidente con los extraordinarios valores de TAG que acumulan con éste residuo.

Con el objetivo de contar con una forma gráfica de mostrar la gran cantidad de lipidos (TAG) acumulados a partir de los diferentes residuos por las bacterias del género Rhodococcus, se realizó el análisis mediante microscopía electrónica de transmisión de la ultraestructura de R. wratislaviensis V cultivada con residuo de la elaboración de jugo de fruta (Figura 3A) , suero lácteo (Figura 3B) , residuo de la elaboración de aceite de oliva (Figura 3C) , asi como también de R. fascians F7 cultivada con glicerol como fuente de carbono (Figura 3D) .

Con el objetivo de explicar las diferencias observadas en la acumulación de lipidos con los diferentes residuos, se decidió realizar la caracterización de aquellos con los cuales se obtuvieron los mayores rendimientos en la producción de lipidos bacterianos. También se caracterizó el residuo orgánico domiciliario, dado que mediante su utilización puede obtenerse buenos rendimientos de biomasa, aunque no asi de TAG, por lo que resulta muy apropiado para la producción de biomasa bacteriana.

Entre las cepas que mostraron la mayor producción de lipidos se encuentra R. wratislaviensis V. Esta acumula 84% TAG (% P/P de PSC) con residuo de oliva (RO) , 56,2% con suero lácteo (SL) , 38,0% con residuo de la elaboración de jugo de fruta de pera y manzana (RF) y solo un 2,8% con residuo orgánico domiciliario (ROD) . Analizando la composición de los residuos se observa una correlación directa entre la relación C/N y la acumulación de TAG. Asi, el RO muestra una relación C/N 5 veces superior al RF y SL, lo cual explicaría porque R. wratislaviensis V acumula valores extremadamente altos de TAG con este residuo.

El gluconato es la fuente de carbono normalmente utilizada en los estudios de acumulación de TAG en bacterias del género Rhodococcus u otros microorganismos oleaginosos. Por lo general, se utiliza al 1% (p/v) en medios deficitarios en nitrógeno (MSM0,1), lo cual determina una relación C/N=100. Esta relación es muy cercana a la que se observa en el SL asi como RF .

En el caso de ROD, la relación C/N resulta inferior, lo cual se atribuye a un alto contenido de nitrógeno, factor que podría estar determinando una baja acumulación de TAG. Así, a mayor relación C/N en el residuo, mayor sería la cantidad de lípidos acumulados en R. wratislaviensis V, R. opacus PD630 y otras bacterias del género Rhodococcus.

Asimismo, en RO, RF y SL se observa la presencia de un mayor contenido de azúcares y lípidos totales que en ROD. Esto resulta ser muy importante dado que son fuentes de carbono y energía necesarios no solo para el crecimiento, sino también para la síntesis de los precursores necesarios para la generación de TAG. Así, aquellos residuos ricos en azúcares y/o lípidos parecen ser con los que se logran los mayores rendimientos de producción de lípidos en bacterias del género Rhodococcus.

Como puede verse en la Tabla 7, todos los medios de cultivo preparados a partir de estos residuos presentan pH ácido, lo cual implica que, para no afectar los rendimientos, deben ser neutralizados antes de su uso (ver efecto del pH) . El glicerol no fue considerado en este estudio dado que es un compuesto puro, que se adiciona como fuente de carbono a un medio mínimo mineral . Tabla 7 : Caracterización de los residuos orgánicos que mostraron mayor eficiencia para la producción de lípidos

SL: Suero lácteo, RF: residuo de la elaboración de jugo de pera y manzana, RO : residuo de la elaboración de aceite de oliva (alperujo), ROD: residuo orgánico domiciliario .

Con el objetivo de determinar si los lipidos obtenidos serian apropiados para ser utilizados como materia prima para procesos futuros de producción de biodiesel, biolubricantes u otros, se analizó la composición de los lipidos obtenidos.

Si bien las bacterias del género Rhodococcus parecen encontrarse especializadas en la síntesis y acumulación de un tipo particular de lípido neutro, los triacilglicéridos (TAG) , se sabe que pueden sintetizar otros tales como polihidroxialcanoatos (PHA) . Además, bajo condiciones especiales, también han mostrado ser capaces de sintetizar ceras (Alvarez et al., 2002) .

Se efectuó el análisis de los lípidos acumulados a partir de diferentes residuos y fuentes de carbono en las 12 cepas del género Rhodococcus estudiadas. En todos los casos se observó que la fracción mayoritaria estuvo constituida por TAG (los mismos se determinaron mediante su Rf comparándose con estándares), aunque también se observaron "spots" pequeños coincidentes con diaciglicéridos (DAG) . No obstante, en ninguna cepa ni en ninguna condición de cultivo se observó la acumulación de ceras.

A modo de ejemplo, se muestran los resultados del análisis de los Triglicéridos (TAG) mediante TLC semicuantitativa acumulados a partir de diferentes residuos en R. wratislaviensis V. Como puede observarse en la Figura 4, en todos los casos se observan spots coincidentes con TAG, aunque en diferentes concentraciones. Este resultado muestra claramente como una misma cepa acumula diferentes cantidades de TAG según el residuo utilizado como fuente de nutrientes.

Con el objeto de demostrar de manera simple que el comportamiento de las diferentes cepas estudiadas ante un mismo residuo no fue el mismo, se muestra el resultado de la TLC semicuantitativa de todas las cepas, cultivadas en un medio de cultivo preparado a partir del residuo de la elaboración de aceite de oliva (RO) .Como se observa en la Figura 5, las cepas pertenecientes a las especies R. opacus, R. wratislaviensis y R. jostii acumularon importantes cantidades de TAG (entre 67 y 84,4 %P/P) a partir de RO, R. erythropolis DSM 43060 y R. ruber NCIMB 40126 acumularon cantidades menores de TAG (13, 6 y 20,7 %P/P respectivamente), y R. fascians F7 por su parte acumuló cantidades muy pequeñas (7,1% P/P) , no detectables mediante TLC. Los triacilglicéridos son esteres de ácidos grasos y glicerol. La composición de los ácidos grasos que forman parte de la estructura de los TAG puede variar, pudiendo diferenciarse no sólo por el largo de sus cadenas, sino también asi por el número y tipo de insaturaciones y/o ramificaciones .

Este tipo de características de los ácidos grasos determina que tengan diferentes propiedades fisicoquímicas tales como, punto de fusión, viscosidad, entre otras. Por ello, resulta fundamental conocer la composición de los ácidos grasos de los lípidos producidos a partir de los diferentes residuos, para poder determinar así su utilidad como materia prima para la síntesis de diferentes productos (biodiesel, biolubricantes , oleoquímicos , sustituyente o complemento de la manteca de cacao, etc.) .

Al analizar la composición de los ácidos grasos que conforman los TAG mediante cromatografía gaseosa, pudo determinarse que, aun cuando la composición de los ácidos grasos varía en diferentes proporciones según el residuo o fuente de carbono utilizada, el perfil en términos generales se mantiene. Los ácidos grasos mayoritarios son los C16:0 (24-41%), seguidos de C18:l (17-32%), con menor contenido de C14:0, C15:0, C17:0 y C17:l. En ningún caso se observaron ácidos grasos de cadena corta o poli-insaturados . A modo de ejemplo se muestra la composición de ácidos grasos de los TAG acumulados en R. wratislaviensis V (Figura 6A) y R. opacus PD630 (Figura 6B) a partir de diferentes residuos, pero los resultados fueron similares para el resto de las bacterias estudiadas . Por lo tanto, el perfil de los ácidos grasos producidos con diferentes bacterias del género Rhodococcus, a partir de diversos residuos, es sumamente beneficioso si se piensa en su utilización para la producción de biodiesel, dado que se buscan para ello ácidos grasos de cadena larga saturados o mono insaturados.

El perfil de ácidos grasos de los TAG obtenidos en R. wratislaviensis y R. opacus a partir de medio de cultivo preparado a partir del residuo de la elaboración de jugos de fruta (Figura 7A) , resulta similar al obtenido con gluconato, donde los ácidos grasos mayoritarios son el C16:0 (aproximadamente 30%) y el C18:l (aproximadamente 20%) seguidos de C18:0, C17:0 y C17:l. Los ácidos grasos saturados representan entre el 63 y el 67% de los ácidos grasos totales .

Cuando se cultivan bacterias de las especies R. wratislaviensis y R. opacus con suero lácteo como medio de cultivo (Figura 7B) , se observó que en la composición de ácidos grasos de los TAG hay un incremento de aproximadamente el 10% en C16:0 respecto al perfil característico obtenido con gluconato y glucosa, en este caso los ácidos grasos saturados representan aproximadamente el 70% de los ácidos grasos totales.

Al cultivar bacterias de las especies R. wratislaviensis , R. opacus y R. jostii con residuos de la elaboración de aceite de oliva, se observó que en la composición de ácidos grasos de los TAG hay un incremento de aproximadamente el 10% en C18:l respecto al perfil característico obtenido con gluconato y glucosa y otros residuos (Figura 7C) . Al igual que en el caso anterior, podría pensarse que la composición del medio de cultivo obtenido a partir de residuo de oliva, rico en C18:l y C18:2 (Fig. 8B) determina un mayor porcentaje de C18:l en los TAG acumulados por las bacterias del género Rhodococcus estudiadas .

Así, los inventores de la presente han encontrado que, dependiendo de la fuente de carbono o residuo utilizado, puedan producirse modificaciones en la composición de los ácidos grasos obtenidos. Ello permitiría realizar combinaciones de residuos y fuentes de carbono para lograr una composición determinada según las necesidades de uso en procesos biotecnológicos diferentes.

En el caso particular de las cepas pertenecientes a la especie R. fascians, al ser cultivadas con glicerol, se obtuvo un perfil de ácidos grasos que componen TAG muy característicos y diferentes a lo observado habitualmente en el resto de las especies. A modo de ejemplo, en la Figura 7D se muestra el perfil de ácidos grasos de los TAG acumulados en R. fascians F7 cultivada con glicerol como fuente de carbono. Como puede observarse, presenta un contenido de C16:0 del 35%, de C18:l del 30%. Lo que resulta sorprendente y muy positivo es el contenido de C18:0 de 27%, duplicando o triplicando los valores de C18:0 observados en las bacterias pertenecientes a R. opacus (Fiq.TO), R. wratislaviensis y R. jostii, cultivadas con glicerol o con cualquier otro residuo. El contenido de ácidos grasos saturados representa el 66% de los ácidos grasos totales. Así el perfil de ácidos grasos de los TAG acumulados en R. fascians F7 cultivada con glicerol se asemeja a la composición de ácidos grasos de la manteca de cacao (23-30% C16:0, 32-37% C18:0, 30-37% C18:l y 2-4% C18:2), en la cual los ácidos grasos saturados representan entre el 60-64% (Verwoert et al. 1989, Papanikolaou 2003) . La manteca de cacao es ampliamente utilizada en la industria alimenticia y existen numerosos trabajos que apuntan a obtener lípidos de composición similar a los presentes en la misma. Así en la presente invención se obtienen lípidos bacterianos de composición similar a la manteca de cacao que podrían servir como alternativa de este producto para las aplicaciones industriales usuales.

Los resultados obtenidos por los inventores de la presente invención, demuestran que pueden obtenerse TAG con ácidos grasos de diferente composición a partir de un mismo residuo, utilizando dos especies diferentes del género Rhodococcus . Podría pensarse en la utilización de genes de R. fascians para realizar modificaciones genéticas que permitan producir TAG con diferente composición de ácidos grasos y diferentes aplicaciones.

En realizaciones particulares de la invención, si se desea realizar un medio de cultivo a partir de un residuo determinado, debería eliminarse la carga microbiana que acompaña a ese residuo. Esto se debe a que, de lo contrario, ésta competiría por los nutrientes con el microorganismo que se desea cultivar (en este caso particular, bacterias del género Rhodococcus) , determinando un descenso en los rendimientos . Por consiguiente, los inventores de la presente han desarrollado diferentes tratamientos químicos y físicos (ver Figura 9) con el objetivo de eliminar la carga microbiana nativa de cada residuo.

A modo de ejemplo, se analizan los resultados obtenidos de dichos tratamientos sobre el suero lácteo. Como puede observarse en la Tabla 8, en el caso de los tratamientos químicos, tal como tratamiento previo del residuo con cloroformo (un tratamiento común aplicado en azúcares que se usan como fuentes de carbono y que no pueden ser autoclavados), y pH alcalinos, si bien se observó crecimiento de las bacterias del género Rhodococcus , no lograron obtenerse cultivos puros, con una persistencia de las bacterias que acompañaban al residuo antes del tratamiento.

Tabla 8 : Resultados de los diferentes tratamientos en la remoción de los microorganismos presentes en el suero lácteo: obtención de cultivos uros de R. wratislaviensis V

En gris se encuentran remarcados los tratamientos que resultaron efectivos . Por otra parte, los tratamientos térmicos mostraron ser efectivos en la eliminación de la carga microbiana nativa del residuo, permitiendo obtener cultivos puros de bacterias del género Rhodococcus. La condición mínima que mostró ser efectiva, fue el tratamiento a 45°C durante 1 hora. A temperaturas o tiempos inferiores, se observó contaminación, lo cual se ve reflejado en la Figura 10.

Para aquellos tratamientos que mostraron ser efectivos en la remoción de la carga microbiana, se analizó el efecto sobre los rendimientos de biomasa y TAG. Como se puede observar en la Figura 11, las diferentes temperaturas afectan los rendimientos. Si se comparan las diferentes temperaturas, a temperaturas iguales o menores a 75°C, se observa que los valores de TAG se mantienen, pero los valores de biomasa resultan mayores. Esto se debería a que a temperaturas superiores o iguales a 90°C, se podría producir la precipitación de las proteínas, con lo cual se pierde parte del contenido de nitrógeno del medio, el cual se sabe, afecta de manera directa en el crecimiento.

Por otra parte, los residuos pueden tener diferentes valores de pH, lo cual dependerá de las características propias del residuo, así como de las diferentes sustancias que pudieran ser agregadas durante el procedimiento en el cual se generan. La neutralización (pH=7) implica el agregado de ácidos y bases, lo cual involucra un costo económico.

Por otro lado, el crecimiento de las bacterias del género Rhodococcus a pH extremos, permitiría realizar medios de cultivos selectivos, inhibiendo asi el crecimiento de otras bacterias que crecerían, por ejemplo, a pH bajos, tales como las bacterias lácticas.

Con el objetivo de evaluar el control del pH en un procedimiento de acuerdo con la invención, se estudió la capacidad de producir TAG a partir de R. wratislaviensis V. El resultado obtenido podría extrapolarse al resto de las cepas estudiadas, considerando que los procesos fisiológicos y bioquímicos básicos involucrados en el crecimiento y acumulación de TAG serían los mismos. Como puede observarse en la Figura 12A, R. wratislaviensis V mostró la capacidad de crecer en rangos de pH entre 5-11. Sin embargo, tal como se muestra en la figura 12B, el máximo rendimiento de biomasa (determinada por gravimetría) se obtiene a pH=7, resulta algo menor a pH=9, mientras que a pH=ll y pH=5 disminuye drásticamente el rendimiento de biomasa. A pesar que R. wratislaviensis V crece en un rango de pH entre 5-11, la capacidad de acumular TAG está restringida a pH entre 5-9. A pH=ll no se observó la presencia de TAG (Figura 13) . Así, del presente experimento se concluye que es muy importante trabajar a un pH cercano al neutro, dado que el pH no sólo afecta de manera directa los rendimientos, sino que puede llegar a inhibir tanto el crecimiento como la acumulación de TAG. Por consiguiente, en realizaciones preferidas de la invención, el pH de los medios de cultivo preparados a partir de residuos debe llevarse a un pH cercano a 7.

Uno de los pasos limitantes en la obtención de bioproductos es el gasto energético que involucran los procesos de agitación y extracción, así como recolección de la biomasa. Por lo tanto, se planteó la posibilidad de realizar el proceso de producción de lipidos con bacterias del género Rhodococcus a partir de residuos sin ningún tipo de agitación. Para ello, se estudio el efecto de la agitación sobre los rendimientos de biomasa y lipidos (TAG) en R. wratislaviensis V. Cuando se pasa de condiciones de agitación (200 rpm) a condiciones estáticas, el rendimiento de biomasa cae 2,1 veces y el de TAG 5,1 veces. Las variaciones en los rendimientos en las diferentes condiciones de agitación estudiadas son mínimas, así como los rendimientos de biomasa fueron de 6,8 y 6,3 g/L y los de TAG 46,9 y 45,5 % de PSC a 200 rpm y 150 rpm, respectivamente (Figura 14) .

Así, en este estudio se determinó que es posible producir lipidos sin aplicar agitación al cultivo. No obstante, la agitación mostró ser un factor clave que afecta de manera directa los rendimientos. Por consiguiente, en realizaciones preferidas de la invención, se aplica agitación durante el procedimiento de obtención de lipidos con bacterias del género Rhodococcus a partir de residuos. No obstante, no se descarta la utilización de cultivos estáticos, aunque esto dependerá de las características del residuo y de la forma de crecimento a partir del mismo (ver cultivo en fase sólida con residuo de oliva) .

Para el crecimiento bacteriano se requiere de carbono, vitaminas, minerales y nitrógeno. Este último resulta elemental para la síntesis de proteínas que cumplen funciones importantes en la célula, tales como, entre otros: dar origen a todas las enzimas que llevan adelante los procesos de síntesis y catabolismo, formar parte de la estructura celular, entre otras funciones. Así, el nitrógeno resulta esencial para el crecimiento celular. De hecho, es uno de los factores fundamentales que limita el crecimiento.

Por ello, algunos residuos en los cuales el contenido de nitrógeno es escaso o inexistente (tal como el glicerol) requerirán del agregado de nitrógeno. Existen diferentes sales de nitrógeno inorgánico que pueden servir como fuente de nitrógeno. Estas van acompañadas de otros elementos inorgánicos que pueden influenciar en el crecimiento celular. Asimismo, el grado de ionización de las diferentes sales determinará la disponibilidad de nitrógeno en el medio. Por otra parte, la célula bacteriana debe contener transportadores específicos que le permitan incorporar NH ₄ ⁺ , N0 ₃ ^~ y N0 ₂ ^~ , así como también las enzimas necesarias para su utilización .

Por lo tanto, se analizó el efecto de diferentes sales inorgánicas, tales como: sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de potasio y nitrito de sodio, sobre el crecimiento y la acumulación de TAG. También se analizó el efecto de la urea como fuente de nitrógeno, ya que se diferencia en las anteriores por el hecho de ser una fuente orgánica (contiene C, N y O en su estructura) , por lo que además de nitrógeno incorporaría también carbono y oxígeno que podrían utilizarse para el crecimiento, sin aportar ningún otro elemento inorgánico que pudiere resultar tóxico para la célula. Además, la urea sería la fuente de nitrógeno más económica que existe en el mercado. Tal como puede observarse en la Figura 15A, cuando se utilizan las fuentes de nitrógeno en una concentración de lg/1 en nitrógeno, existe un crecimiento mayor con cloruro de amonio y sulfato de amonio seguido de urea, con nitrato de potasio el crecimiento resulta menor, mientras que no se observa crecimiento con nitrato de sodio, debido a que probablemente genere toxicidad. Lo mismo se ve reflejado en la figura 15C cuando se analizan los rendimientos de biomasa. Cuando se traba a en una concentración de nitrógeno de 0,1 g/1 los mejores resultados se obtienen con urea y nitrato de potasio (Figuras 15B y 15D) .

Del análisis de la acumulación de lipidos (TAG) surge mediante el análisis semicuantitativo mediante TLC, que la mayor acumulación se produce cuando se utiliza urea como fuente de nitrógeno (Figura 16) . Por ello, en realizaciones preferidas de la invención se utiliza urea como una fuente económica y eficiente de nitrógeno para el proceso de producción de lipidos en los medios de cultivo preparados con residuos carentes en nitrógeno. También puede concluirse que las diferentes fuentes de nitrógeno afectan los rendimientos de biomasa y TAG, y que esto dependerá además de la concentración en la que se utilice.

El medio mínimo mineral descripto por Schlegel y col. (1961) es ampliamente utilizado para el crecimiento y estudio de la acumulación de TAG en diversos microorganismos oleaginosos. Este medio contiene nitrógeno y diversas sales minerales que resultan elementales (en mínimas cantidades), para que las fisiología y bioquímica de los microorganismos pueda desarrollarse normalmente. Los residuos normalmente son mezclas complejas de materia orgánica y minerales cuya composición dependerá de su origen y procesos a los que fue sometido. Tomando en consideración que algunos residuos podrían necesitar del agregado de sales y/o nitrógeno, se decidió estudiar el efecto de los mismos en el crecimiento y la acumulación de TAG de R. wratislaviensis V, crecida con residuo orgánico domiciliario (ROD) .

Como puede observarse en las Figuras 17A y 17B, el agregado de sales parece no tener efecto en el crecimiento y la acumulación de TAG, dado que se logran prácticamente los mismos resultados utilizando un medio de cultivo preparado únicamente a partir de ROD que uno en el que se adiciona un 50%V/V de un medio mínimo mineral carente de nitrógeno (MSM) . Asimismo, se evaluó el efecto del agregado de nitrógeno mediante el agregado de 50% (v/v) de MSM1 (contiene además de sales 1 g/L de nitrógeno) y MSM0,1 (contiene además de sales 0,1 g/L de nitrógeno) . Como se podrá observar, el agregado de nitrógeno tampoco tuvo incidencia en el crecimiento y en la acumulación de TAG.

Esto da idea que el medio de cultivo preparado a partir de ROD contiene todos los elementos orgánicos y minerales necesarios para el crecimiento bacteriano y acumulación de TAG y no necestita del agregado de sales ni nitrógeno. Los ROD contienen materia orgánica rica en carbono y proteínas, el nitrógeno aportadas por estas últimas resultaría suficiente para el crecimiento bacteriano y por ello no requiere del agegado de nitrógeno adicional. Como puede verse en la caracterización de los residuos, el ROD es rico en nitrógeno orgánico total. Ello determina una relación C/N inferior a la lograda con otros residuos y por ello la acumulación de TAG resultaría menor (2-5% de PSC) , aunque ello dependerá de la composición de este residuo que puede resultar variable. Sin embargo, es un residuo muy rico con el que se logra muy buen crecimiento sin necesidad de agregar ningún tipo de sal o nitrógeno, esto lo hace interesante para la generación de biomasa o generación de otros bioproductos que no requieran altas relaciones C/N para su síntesis.

Se podría plantear un bioproceso como una biofábrica, donde cada célula (en éste caso bacteriana) actúa como una unidad productiva. Así, el rendimiento dependerá por un lado de la eficiencia de célula bacteriana de convertir la materia prima en un bioproducto, (en nuestro caso contamos con microorganismos sumamente eficientes especializados en la acumulación de TAG) así como del número de células bacterianas que están sintetizando el bioproducto, lo cual estará representado por el crecimiento que se logre (biomasa bacteriana) . El inconveniente radica en que para favorecer el crecimiento se requiere un medio de cultivo con altas concentraciones de nitrógeno, mientras que para la acumulación de TAG se requiere un medio deficitario en nitrógeno. Esto determina que deba buscarse el equilibrio adecuado en la relación C/N para que el crecimiento y la acumulación de TAG se den simultáneamente. Como ha quedado demostrado de los resultados mostrados más arriba, esto no se logra con cualquier tipo de residuo. Por consiguiente, en una realización particular de la invención, el procedimiento reivindicado consta de, al menos, dos etapas: una primera etapa utilizando un medio de cultivo rico en nitrógeno que favorezca el crecimiento y una segunda etapa en la que se transfiere toda la biomasa bacteriana generada a un medio deficitario en nitrógeno en donde las condiciones son propicias para la acumulación de TAG (ver Figura 18) .

Por lo tanto, en una realización particular de la invención, se propone la utilización de residuo orgánico domiciliario (ROD) para la etapa de crecimiento, dado que este se genera en grandes cantidades y está distribuido universalmente en cualquier país, región o ciudad del mundo. Este residuo, aunque muy rico en nutrientes y nitrógeno, no resulta del todo eficiente para ser utilizado por las bacterias del género Rhodococcus para acumular TAG. Por ello, se propone una segunda etapa, mostrada a modo de ejemplo con glicerol en MSMO como medio de cultivo para favorecer la acumulación de TAG. No obstante, de acuerdo con realizaciones particulares de la invención, podría utilizarse cualquier otro preparado a partir de residuos en el que se acumule TAG (RF, SL, RO, etc.) . Como puede observarse en la Tabla 9, los rendimientos de lípidos obtenidos en R. fascians F7 en un proceso en dos etapas es 1,5 veces mayor que en un proceso en una etapa. Tabla 9: Rendimientos de lípidos en R. fascians F7 en un proceso de una etapa y en un proceso en dos etapas

El medio preparado a partir de residuo orgánico domiciliario es un medio nutritivo de acuerdo con la presente invención, no requiere del agregado de ningún tipo de sal mineral o de nutrientes, por lo que resultaría un medio de cultivo económico. Por ello resulta un medio interesante para generar grandes cantidades de biomasa que luego puede ser transferida a un medio deficitario de nitrógeno para la síntesis y acumulación de TAG. Así mismo este medio de cultivo (ROD) podría ser utilizado para la producción de otros bioproductos tales como pigmentos, ATB u otros en los cuales no se necesiten altas relaciones C/N.

La recolección de la biomasa es uno de los pasos críticos de cualquier proceso productivo, dado que requiere de mucha energía. Además, generalmente en las bacterias cargadas de lípidos resulta más difícil separar las células del sobrenadante, requiriendo la aplicación de procesos más rigurosos. Por ello, para algunos casos particulares donde la recolección de la biomasa puede resultar dificultosa, en una realización particular de la invención, se propone como alternativa al cultivo líquido, el cultivo de las bacterias sobre soportes sólidos, tales como membranas o filtros con un diámetro de poro inferior a 0,22 μπι. Dichos soportes sólidos permiten retener las células bacterianas y están suspendidos sobre medios de cultivo preparados a partir de residuo. Los nutrientes pasan a través de dichos filtros, permitiendo el crecimiento y la acumulación de TAG por parte de las bacterias. Luego de un tiempo que fuera determinado como óptimo, el filtro es retirado por métodos mecánicos, permitiendo la recuperación de la biomasa limpia y sin necesidad de separarla del medio de cultivo. De esa manera, se ahorraría la energía que se invertiría en agitación y recolección de la biomasa por agitación, filtración u otros medios .

A modo de ejemplo, este procedimiento de cultivo fue aplicado con el residuo proveniente de la elaboración de aceite de oliva, que por sus características oleosas dificulta las tareas de recolección de las células bacterianas, ya que las mismas crecen sobre el material oleoso del residuo, formando cúmulos bacterianos, que son sumamente difíciles de separar del residuo por centrifugación o filtración.

Como puede verse en la Figura 19, R. wratislaviensis V crece bien sobre filtros de polietersulfona suspendidos en medio de cultivo preparado a partir de residuo de la elaboración de aceite de oliva (RO) . Los rendimientos obtenidos pueden verse en las Tablas 3, 4 y 5. Los valores de TAG resultan extraordinariamente altos y, hasta la fecha, no se ha reportado en la literatura especializada valores seme antes .

Luego, la biomasa es recuperada fácilmente directamente retirando los filtros mecánicamente del medio de cultivo. Para la remoción de la biomasa de los filtros, se aplicaron dos procedimientos diferentes, en uno de ellos se dejaron secar los filtros, para luego recuperar la biomasa mediante raspado. En otro procedimiento, se utilizó la biomasa húmeda, recuperándola del filtro mediante arrastre con solución fisiológica .

La capacidad de acumular lipidos (TAG) está restingida a un grupo limitado de microorganismos, dentro de los cuales se encuentran algunas especies del género Rhodococcus , y constituye un mecanismo de reserva energética sumamente importante para la célula. Normalmente, pueden detectarse importantes cantidades de TAG desde el comienzo de la fase estacionaria de cultivo y continúan acumulándose durante el transcurso de la misma. Sin embargo, transcurrido un tiempo, estos lipidos de reserva comienzan a ser degrados para obtener energía y sintetizar componentes que resultan elementales para mantener la viabilidad celular. La cinética de acumulación-degradación de los triglicéridos dependerá de varios factores, muchos de ellos determinados por el medio de cultivo, tal como disponibilidad de nutrientes, vitaminas, relación C/N, entre otros.

Algo similar ocurre con el crecimiento celular. Algunos microorganismos muestran una fase de adaptación previa al crecimiento, seguida de una fase de crecimiento exponencial, caracterizada por la duplicación celular (elevada tasa de división) . A un determinado tiempo ingresan en fase estacionaria, la cual es una fase donde se detiene el crecimiento debido a un agotamiento de nutrientes y aparición de componentes tóxicos, para finalmente entrar en una fase de declive o muerte.

El tiempo en que las bacterias entran en fase estacionaria depende tanto de la composición del medio de cultivo como de la cepa bacteriana.

Por ello, para poder establecer un proceso productivo, resulta muy importante conocer la cinética de crecimiento y de acumulación-degradación de TAG en los diferentes medios de cultivo preparados a partir de residuos, con el fin de recolectar la biomasa y efectuar la extracción de lipidos en el tiempo en el cual se logra la máxima productividad.

Asi, en el presente estudio, se estudio la cinética de acumulación de TAG y producción de biomasa en R. wratislaviensis V cultivada con medios de cultivo preparados a partir de RF, SL y RO, asi como en R. fascians F7 y R. opacus PD630, cultivadas en medio mineral con glicerol como fuente de carbono.

Cuando se cultivan diferentes cepas de R. fascians y R. erythropolis con glicerol, estas entran en fase estacionaria en el día 3/4 de cultivo, como puede observarse en la Figura 20A. R. fascians F7 llega a los valores máximos de biomasa entre el día 6-7. Los mismos no varían mucho con respecto a los valores obtenidos en el día 3 al comienzo de la fase estacionaria. Sin embargo, el contenido de TAG obtenido al comienzo de la fase estacionaria (t=3) es inferior al observado hacia el día 6-7. Por ello, para R. fascians F7 y las diferentes cepas pertenecientes a las especies R. fascians y R. erythropolis , en realizaciones preferidas, el cultivo se recolecta entre el día 6-7, ya que pasado este tiempo los rendimientos comienzan a decaer.

Por su parte R. opacus PD630 muestra una fase lag de aproximadamente 5 días antes de iniciar el crecimiento (es una característica común a las cepas de las especies R. opacus, R. wratislaviensis, R. jostii y R. ruber estudiadas), alcanzando una fase estacionaria luego de 14 días de cultivo. Es por ello que la cinética de crecimiento (biomasa) y acumulación de TAG, comenzó a partir del día 5. Como puede verse en la Figura 20B, R. opacus PD630 alcanza los rendimientos más altos de biomasa y TAG entre el día 15-17. Así, en realizaciones preferidas, este sería el tiempo óptimo para efectuar la recolección de la biomasa para la posterior extracción de lípidos, ya que hacia el día 20 se observa un descenso en ambos valores.

En el caso de R. wratislaviensis V se observó un comportamiento similar con RF (Figura 20C) , SL (Figura 20D) y RO (Figura 20E), obteniéndose los máximos rendimientos de biomasa y TAG entre el día 5-7 de crecimiento, para luego comenzar a disminuir.

En términos generales, puede afirmarse que la biomasa se mantiene estable con todos los residuos estudiados desde el comienzo de la fase estacionaria en el día 3 hasta el día 7. Hacia el día 8 ya comienza a verse un descenso en la biomasa. Con respecto a los TAG, estos parecen acumularse en cantidades algo menores al comienzo de la fase estacionaria, haciéndose máximos hacia el día 5, manteniéndose los valores hasta el día 9 (como puede observarse en las gráficas de rendimiento y en las fotos de TLC (Figura 21) .

Los ámbitos de impacto del presente trabajo son los siguientes: (1) Saneamiento ambiental: reduciendo o eliminando los residuos provenientes de actividades agroindustriales mediante su uso en el mencionado proceso biotecnológico (2) acoplar innovaciones en biotecnología con procesos de tecnología agroindus trial convencional, otorgando valor agregado y diversificación de los sistemas productivos, (3) aprovechamiento de los recursos biológicos de la región patagónica como eje del proceso tecnológico desarrollado, que contribuya a la puesta en valor de la diversidad bacteriana de la Patagonia Argentina. En tal sentido, cabe destacar que es frecuente aislar bacterias del género Rhodococcus en la región Patagónica, tanto en suelos prístinos como impactados con hidrocarburos u otros contaminantes. Estas bacterias muestran un gran potencial para la producción no sólo de lípidos (en lo cual se encuentran especializadas), sino también otros bioproductos tales como pigmentos, surfactantes , etc.

EJEMPLOS Ejemplo 1

Estudio de la producción de lípidos en diferentes cepas del género Rhodococcus a partir de diferentes residuos orgánicos.

Análisis de crecimiento , rendimiento de biomasa y lípidos (TAG) de las diversas cepas del género Rhodococcus con diferentes residuos orgánicos

Cepas bacterianas

Las bacterias utilizadas en los siguientes ejemplos se listan en la Tabla 1 (ver más arriba) .

Medios y condiciones de cultivo

Las células fueron precultivadas en nutrient broth médium (0,8% P/V) , durante 24 h a 28°C y a 200 rpm, para luego ser centrifugadas y lavadas con solución fisiológica estéril. Posteriormente, el pellet fue resuspendido en solución fisiológica estéril, llevando la suspensión celular a una densidad óptica D.OA600= 4. Se tomaron 2ml de esta suspensión para inocular 50 mi de los diferentes medios de cultivo. Los cultivos con glicerol o gluconato se realizaron en Mineral Salt Médium (MSM) de acuerdo a lo que se divulga en Schlegel et al. (1961), en una concentración de la fuente de carbono del 0,3% (v/v) y 1% (v/v) respectivamente.

Los residuos utilizados en éste estudio como fuente de carbono y energía se listan en la tabla 2. Asimismo las diferentes regiones productivas de la República Argentina en donde se generan los diferentes residuos estudiados se muestran en la Figura 1. En el caso de los residuos sólidos se prepararon colocando 250 g de residuo en 1.000 mi de agua, se dejó hervir durante 1 hora para, posteriormente, filtrar el extracto en gasa y luego en papel Whatman N°l.

Los diferentes residuos líquidos y sólidos se utilizaron solos o acompañados de MSM en diferentes porcentajes (%, v/v) .

En el caso del residuo de oliva, se aplicaron dos metodologías de cultivo: en fase líquida y en fase sólida. Para ésta última, se utilizaron filtros estériles de polietersul fona (47 mm de diámetro, 0,22 μπι de poro), suspendidos sobre el residuo de oliva preparado tal como se describe más arriba para el resto de los residuos sólidos.

El pH fue ajustado a 7 luego de la esterilización u otros tratamientos aplicados, previo a la inoculación.

Todos los cultivos se realizaron aeróbicamente en agitador rotatorio a 200 rpm y 28°C.

En todos los cultivos se partió de una OD inicial A600 de aproximadamente 0,2, con el objeto de poder comparar los rendimientos entre las diferentes cepas y los diferentes medios de cultivo.

En el caso del cultivo en fase sólida con residuo de oliva, se inocularon 50 μΐ de DO 4 sobre el filtro de polietersul fona en forma de pequeñas gotas.

Tiempo de recolección de biomasa y TAG Con el objetivo de seleccionar las cepas y los residuos más eficientes para el procedimiento de la invención, se determinaron los rendimientos de biomasa y TAG. La determinación se llevó a cabo en fase estacionaria, midiendo el tiempo que tardó el cultivo en entrar en fase estacionaria, el cual es dependiente tanto del medio de cultivo como de la cepa utilizada (ver Figura 2) .

Crecimiento y biomasa celular

La cinética de crecimiento se evaluó mediante la medición en el tiempo de la densidad óptica a λ= 600nm. La biomasa celular fue determinada en fase estacionaria por gravimetría. Para ello se centrifugo el cultivo, se efectuaron 3 lavados sucesivos con solución fisiológica y se secó el pellet hasta peso constante. Los resultados de biomasa se expresaron en g/L.

En el caso del cultivo en fase sólida con residuo de oliva, se determinó la biomasa por gravimetría, luego de secar los filtros conteniendo la biomasa celular hasta peso constante. En éste caso, el resultado de biomasa fue expresado como gramos generados a partir de 50μ1 de un inoculo de DO= 4.

Análisis cualitativo y cuantitativo de Lípidos Totales

El análisis cualitativo y semicuantitativo de los lípidos totales intracelulares fue analizado mediante cromatografía en capa delgada (TLC) .

Para ello, se pesaron 5 mg de un pellet celular seco en el cual los lípidos fueron extraídos con 300 μΐ de metanol/cloroformo (1/2 v/v) , durante 2 h a 4°C. 26 μΐ de fase clorofórmica fueron sujetos a TLC en placas de silica gel 60 F254 (Merck) , usando hexano/dietil éter/ácido acético (80/20/1 por volumen) como fase móvil (Wáltermann et al. 2000) . Tripalmitin fue usado como estándar de TAG (Merck) . Las fracciones lipidicas fueron reveladas con vapores de iodo .

La cuanti ficación de los lipidos totales se llevó a cabo por el método de cobre para ácidos totales, con algunas modificaciones respecto de lo descrito previamente en las publicaciones de Wawrik y Harriman (2010) y Duncombe (1963), de la siguiente manera: se hidrolizaron 5 mg de pellet seco celular con un reactivo alcalino (metanol 25% v/v en NaOH 1N) a 95-100°C durante 3 h. La sal resultante de ácidos grasos unidos al sodio fue tratada con ácido acético concentrado. Luego, el reactivo de cobre, cloroformo para la extracción y el reactivo revelador fueron adicionados sucesivamente. Finalmente las muestras fueron analizadas espectrofotométricamente a λ= 440nm.

La muestra fue comparada respecto de una curva de calibración realizada con ácido oleico, como representante de los ácidos grasos mayoritarios presentes en los TAG de Rhodococcus .

Para la cuantificación de los ácidos grasos como estimación de los TAG y análisis de su perfil, se utilizó cromatografía gaseosa (CG) . Para ello, 5-10 mg de pellet seco celular fue sometido a metanólisis en presencia de ácido sulfúrico (15%, v/v), acorde a Brandl et al. (1988) . Los acilmetilésteres fueron analizados por cromatografía gaseosa (GC) usando un cromatógrafo gaseoso HP 5890 equipado con columna capilar InnoWAX (30 m*0.53 mmx 1 μπι) y un ionizador de llama como detector (FID) . Se inyectaron 0,2 μΐ de fase clorofórmica, usando helio como gas carrier (13 ml/min-1) . El programa de temperatura utilizado para la correcta separación de los metilésteres fue de 90 °C por 5 min, rampa 6 °C/min y 220 °C por 10 min. El ácido tridecanoico fue utilizado como estándar interno .

Microscopía electrónica de transmisión de algunas de las cepas seleccionadas para la producción de lipidos de acuerdo con la presente invención

Si bien podemos decir que existe un comportamiento por especie en lo que respecta a la degradación y acumulación de lipidos a partir de diferentes residuos, se seleccionaron diferentes cepas en base a su comportamiento individual, y al conocimiento de la bioquímica, fisiología y genética de las mismas. Con el objetivo de contar con más evidencias de la acumulación de importantes cantidades de triglicéridos , se realizó microscopía electrónica de transmisión en R. wratislaviensis V cultivada con residuo de la elaboración de jugos de fruta, suero lácteo, residuo de la elaboración de aceite de oliva y R. fascians F7 cultivada en medio MSM con glicerol 0,3% (v/v) como fuente de carbono.

Caracterización de los residuos que mostraron ser más eficientes para el proceso de producción de lipidos con bacterias del género Rhodococcus Se llevó a cabo la caracterización fisicoquímica de los medios de cultivo preparados tal como se describe más arriba a partir de los siguientes residuos: suero lácteo (SL) , residuo de la elaboración de jugo de pera y manzana (RF) , residuo de la elaboración de aceite de oliva (RO) , residuo orgánico domiciliario (ROD) .

La demanda química de oxígeno y el nitrógeno orgánico total se determinó de acuerdo a métodos estándar (A.P.H.A., 2005) .

La concentración de azúcares totales se determinó mediante el método de fenol-sulfúrico (Dubois et al. 1956) .

La cuanti ficación de lípidos totales se llevó a cabo de acuerdo a lo que se describe más arriba.

Para la cuanti ficación de la glucosa se utilizó el kit para glicemia de Wiener lab.

Los sólidos totales fueron determinados por gravimetría. Para ello, se colocaron 20 mi de los medios de cultivo preparados a partir de diferentes residuos en placas de petri y se colocaron en estufa a 60°C hasta peso constante. Cada ensayo fue realizado por duplicado.

El pH fue medido con un pH-metro Adwa AD1040. Ejemplo 2

Optimización del proceso: efecto de diferentes variables sobre la biomasa y los lípidos (TAG)

Con el objeto de optimizar el proceso y mejorar los rendimientos, se evaluaron diferentes variables físico químicas de cultivo. En todos los casos, se evaluaron la biomasa y los TAG, para ver cómo eran afectados en función de las modificaciones aplicadas.

En todos los casos se utilizó un medio mínimo deficiente en nitrógeno para evaluar el efecto de diferentes variables sobre la acumulación de TAG. Se analizó por TLC y, en algunos casos, se cuantificó por el método de cobre para ácidos totales de acuerdo a lo que se describió más arriba. El efecto sobre el crecimiento se evaluó en MSM1 y, en algunos casos, también MSM0,1, mediante la medición de la densidad óptica (DO) y la biomasa producida de acuerdo a lo que se describió más arriba.

Técnicas utilizadas para eliminar o reducir la carga microbiana que acompaña los residuos

Distintas metodologías se aplicaron con el objetivo de reducir o eliminar la carga microbiana que acompaña a los residuos y así obtener cultivos puros de las bacterias del género Rhodococcus estudiadas. Se adicionó cloroformo en una proporción de 5-10 mi cada 100 mi de medio de cultivo, se agito, se dejó decantar 24 h y se tomó en condiciones de esterilidad la fase acuosa para luego inocular. Para estudiar el efecto del pH, se utilizaron pH alcalinos ya que se sabe que los microorganismos presentes en el suero ácido crecen a pH ácidos, se llevó a pH 9 y 11 con hidróxido de sodio. Para el caso de los tratamientos térmicos, 20 mi de medio de cultivos fueron sometidos a diferentes temperaturas durante diferentes intervalos de tiempo. Cuando se utilizaron temperaturas superiores o iguales a 90 °C, dado que se produce la precipitación de las proteínas, fue necesario dejar decantar y tomar el sobrenadante en esterilidad, para luego incorporar el inoculo. El mismo procedimiento se aplicó como paso previo al autoclavado, dado que se determinó que durante el mismo también se produce la precipitación de proteínas.

Efecto del pH sobre la biomasa y los lipidos (TAG)

Se realizó un precultivo de R. wratislaviensis V en nutrient broth médium (0,8% P/V) a 28°C, durante 24 h a 200 rpm. Luego se centrifugaron las células y se lavaron con solución fisiológica estéril. Posteriormente, el pellet fue resuspendido en solución fisiológica estéril llevando la suspensión celular a una densidad óptica D.OA600= 4. Se tomaron 2mi de esta suspensión, se inoculó en diferentes erlermeyers conteniendo 50 mi de medio mínimo (MSM) con diferentes valores de pH (3, 5, 7, 9, 11), que contenían gluconato al 1% (p/v) como fuente de carbono. Las células fueron cultivadas a 28 °C y 200 rpm, la determinación de la biomasa y los TAG se realizó en fase estacionaria (t=3) .

Efecto de la agitación sobre la biomasa y los lipidos (TAG)

Se realizó un precultivo de R. wratislaviensis V en nutrient broth médium (0,8% P/V), durante 24 h a 200 rpm y a 28°C. Luego se centrifugaron las células y se lavaron con solución fisiológica estéril. Posteriormente, el pellet fue resuspendido en solución fisiológica estéril, llevando la suspensión celular a una densidad óptica DO600=4. Luego, 2 mi de esta suspensión fueron inoculados en diferentes erlermeyers conteniendo 50 mi de suero lácteo estéril. Las muestras fueron cultivadas a 28 °C en tres condiciones diferentes: sin agitación, a 150 rpm y 200 rpm respectivamente .

La evaluación de la biomasa y los TAG se realizó en fase estacionaria (t=3) . Los ensayos fueron realizados por duplicado para cada una de las condiciones estudiadas.

Efecto de la fuente de N sobre la biomasa y los lípidos (TAG)

Se realizó un precultivo de R. wratislaviensis V en nutrient broth médium (0,8% P/V) , a 28 °C, durante 24 h y a 200 rpm. Luego, las células se centrifugaron y se lavaron con solución fisiológica estéril. Posteriormente, el pellet fue resuspendido en solución fisiológica estéril, llevando la suspensión celular a una densidad óptica D.0600=4. Se tomaron 2 mi de esta suspensión y se inoculó en diferentes erlermeyers que contenían 50 mi de medio mínimo (MSM) , con diferentes fuentes de nitrógeno, cada una de ellas en dos concentraciones: lg/1 y 0,lg/l de nitrógeno. Las muestras fueron cultivadas a 28°C en agitador orbital a 200 rpm. La determinación de la biomasa y los TAG se realizó en fase estacionaria (t=3) . Para ello, se utilizaron diferentes fuentes de nitrógeno inorgánico: sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de potasio, nitrito de sodio, así como una fuete orgánica: urea.

Necesidad del agregado de sales y nutrientes al ROD: efecto sobre la biomasa y los TAG Se realizó un precultivo de R. wratislaviensis V en nutrient broth médium (0,8% P/V) a 28 °C, durante 24 h y a 200 rpm. Luego, las células se centrifugaron y se lavaron con solución fisiológica estéril. Posteriormente, el pellet fue resuspendido en solución fisiológica estéril, llevando la suspensión celular a una densidad óptica D.OA600=4. Luego, 2 mi de esta suspensión fueron inoculados en diferentes erlermeyers que contienen 50 mi de: 1) medio de cultivo preparado a partir de residuo orgánico domiciliario, denominado como medio ROD, 2) medio ROD con el agregado del 50% de MSM0 (medio mínimo mineral sin contenido de nitrógeno, según Schlegel et al. 1961), 3) medio ROD con el agregado del 50% de MSM0,1 (medio mínimo mineral con una concentración de nitrógeno de 0,lg/L), 4) medio ROD con el agregado del 50% de MSM1 (medio mínimo mineral con una concentración de nitrógeno de lg/L) . Las muestras fueron cultivadas a 28°C en agitador orbital a 200 rpm.

La evaluación de la biomasa y los TAG se llevó a cabo en fase estacionaria (t=3) . Los ensayos fueron realizados por duplicado para cada una de las condiciones estudiadas.

Proceso en dos etapas

Se realizó un precultivo de R fascians F7 en nutrient broth médium (0,8% P/V), a 200 rpm y 28°C, durante 24h. Luego se centrifugaron las células y se lavaron con solución fisiológica estéril. Posteriormente, el pellet fue resuspendido en solución fisiológica estéril, llevando la suspensión celular a una densidad óptica D.OA600=4. 10ml de esta suspensión fueron inoculados en 600ml de medio de cultivo preparado a partir de residuo orgánico domiciliario (ROD) , repartido en 3 erlermeyers de 200ml cada uno y se cultivó a 200 rpm y 28°C durante 48h. Posteriormente, la biomasa fue recolectada en su totalidad, se efectuaron 3 lavados con solución fisiológica estéril y se re suspendió la totalidad de la biomasa en 200ml de medio mineral carente de nitrógeno (MSM0), con glicerol como fuente de carbono (0,3%V/V) . Se cultivó a 200 rpm y 28°C durante 6 días y luego de este periodo, se recolectó el cultivo y se realizó el cálculo de rendimiento de biomasa y TAG, tal como se describió anteriormente.

Cultivo en fase solida

Se realizó un precultivo de R. wratislaviensis V en nutrient broth médium (0,8% P/V) , a 200 rpm y 28°C, durante 24h. Luego se centrifugaron las células y se lavaron con solución fisiológica estéril. Posteriormente, el pellet fue resuspendido en solución fisiológica estéril, llevando la suspensión celular a una densidad óptica DO600=4.

1 mi de ésta suspensión fue inoculado en un filtro de polietersul fona estéril, suspendido sobre 5 mi de cultivo preparado a partir de residuo de la elaboración de aceite de oliva (RO) .

El cultivo se dejó en condiciones estáticas durante 7 días. Luego de este tiempo, se removió el filtro mecánicamente y se dejó secar la biomasa en estufa, a 60°C, hasta peso constante. El valor de biomasa (peso seco celular PSC) se determinó por diferencia con el peso del filtro previo a la inoculación .

Se probaron dos estrategias para remover la biomasa de los filtros. En una de ellas, una vez secada la biomasa hasta peso constante, fue raspada de los filtros y fue recolectada. En la otra estrategia, se recolecto la biomasa húmeda, arrastrándola de los filtros mediante lavados con solución fisiológica .

Tiempo óptimo de recolección de biomasa y lípidos (TAG)

Se realizó un cultivo de R. wratislaviensis V en medios de cultivos preparados a partir de residuo de fruta, suero lácteo y residuo de oliva, realizando la evaluación de la biomasa por gravimetría y de la acumulación de lípidos totales a los 3, 5, 7 y 9 días de cultivo.

Se estudió el tiempo óptimo de generación de biomasa y acumulación de TAG utilizando glicerol como fuente de carbono en R. fascians F7 y R. opacus PD630. Para ello, estas cepas fueron cultivadas en MSM1 y MSM0,1 respectivamente, con glicerol al 0,3% P/V como fuente de carbono. Se determinaron los rendimientos de biomasa y lípidos a los 2, 3, 4, 6,7 y 8 días de cultivo en el caso de R. fascians F7 y a los 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 20 días de cultivo en el caso de R. opacus PD630.

Las condiciones de cultivo utilizadas y la preparación de los medios, así como las técnicas utilizadas para cuantificar la biomasa y los lípidos, se llevó a cabo de la manera que se describe más arriba.

Asi, determinamos que para la producción de lipidos a partir de glicerol las cepas más eficientes pertenecen a las especies R. fascians y R. erythropolis . De estas, se eligió la cepa R. fascians F7 (cepa autóctona), para profundizar el estudio. En el caso del suero lácteo, las especies estudiadas pertenecientes a las especies R. opacus y R. wratislaviensis fueron las únicas que mostraron capacidad para catabolizarlo y convertirlo en lipidos. Por consiguiente, se decidió profundizar el estudio de producción de lipidos a partir de suero lácteo con una cepa aislada de la Patagonia: Rhodococcus wratislaviensis V y Rhodococcus opacus PD630 como modelo de estudio.

Las bacterias estudiadas pertenecientes a las especies R. opacus, R. wratislaviensis y R. jostii fueron las más apropiadas para la producción de lipidos a partir de residuos de fruta provenientes de la elaboración de jugos y residuos provenientes de la elaboración de aceite de oliva.

En el caso de Residuo orgánico domiciliario (ROD) , todas las cepas mostraron buen rendimiento de biomasa pero bajos rendimientos de lipidos con valores entre el 2-8% p/p de PSC.

En la solicitud de patente WO 2010/147642 Al " Production of triacylglycerides, fatty acids , and their derivatives" , arriba mencionada se revelan resultados obtenidos con glicerol y se postula que Rhodococcus opacus PD630, en su forma nativa, es incapaz de utilizar glicerol. Es por ello que realizan modificaciones genéticas, mediante las cuales le incorporan los genes glycerol kinase (glpK) y glycerol-3- phosphate dehydrogenase (glpD) provenientes de Rhodococcus erythropolis a Rhodococcus opacus PD630 y observan crecimiento y acumulación de TAG a los 4 días.

Los inventores de la presente han encontrado que, de manera sorprendente, las especies R, fascians y R. erythropolis son capaces de crecer y producir TAG a partir de glicerol, acumulando entre un 30 y un 40% p/p de TAG a los 6 días en condiciones nativas, es decir, sin necesidad de ningún tipo de modificación genética.

Los resultados obtenidos por los inventores de la presente demuestran que las especies R. fascians y R. erythropolis presentan una mayor eficiencia en la utilización del glicerol y en la acumulación de TAG a partir del mismo, lo cual sin pretender quedar atado a ninguna hipótesis en particular, podría ser atribuido a diferencias genéticas, tales como la presencia de un clúster de genes claves para la utilización del glicerol (los genes glpF, glpK y glpO) , el cual estaría ausente en las especies R. jostii, R. opacus y R. equi .

Por otro lado, los inventores de la presente también han determinado que, de manera sorprendente y contrariamente a lo reportado en la literatura, Rhodococcus opacus PD630 si crece a partir de glicerol y acumula TAG (aproximadamente 29%) sin ningún tipo de modificación genética, pero luego de un período de cultivo sumamente prolongado (13-17 días) . Referencias : Alvarez H. M. , Mayer F. , Fabritius D. , and Steinbüchel, A. (1996) .Formation of intracytoplasmic lipid inclusions by Rhodococcus opacus PD630. Arch Microbiol 165, 377-386. Alvarez H. M. , Kalscheuer R. and Steinbüchel A. (1997).

Accumulation of storage lipids in species of Rhodococcus and Nocardia and effect of inhibitors and polyethyleneglycol . Fett/Lipid 9, 239-246. Alvarez H. M. , Kalscheuer R. , and Steinbüchel A.

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