Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur integrierten onkologischen Eingangsuntersuchung und Krebstherapie durch Impfung oder Vakzination mit aus Tumorzellen stammendem Material sowie autologes Tumor¬ antigen in lösbarer und in nicht lösbarer Fraktion für immunbiologische Untersuchungen, für Hauttest- und für Impf-/Vakzinationszwecke.

In der Krebstherapie ist neben dem operativen Vorgehen - je nach Tumorform - die zusätzliche Bestrahlung, bzw. die Anwendung von zytostatischen Substanzen, die soge¬ nannte Chemotherapie, sowie ggf. die Hormontherapie etabliert. Obwohl die Erkenntnisse über die immunbiolo¬ gische Auseinandersetzung des Tumorträgers (Patient) mit seinem Tumor (Krebszellen) von Tag zu Tag zunehmend sind, steht man bei der Erschließung der Tumorimmunolo- gie als therapeutische Reserve erst am Anfang. Diese Aufgabe stellt eine wissenschaftliche Herausforderung dar.

Die bisherigen Bemühungen, die Tumorimmunologie einer praktischen Anwendung zuzuführen, lassen sich grund¬ sätzlich in zwei verschiedene methodische Richtungen einordnen.

Eine Grupppe bemüht sich, die Art und Weise der immun¬ biologischen Auseinandersetzung des Wirtes mit dem Tu¬ morgeschehen mit verschiedenen Untersuchungstechniken

passiv zu analysieren, um feststellen zu können, welche prognostische Bedeutung diesen Reaktionen zuzuordnen ist. Hierbei handelt es sich meistens um ex-vivo-in- vitro-üntersuchungstechniken. Dieses Vorgehen hat viele positive Ergebnisse erbracht, die nachstehend am Bei¬ spiel von Brust- und Eierstockkrebs näher erläutert werden.

Eine weitere nicht zu vernachlässigende Zahl von For¬ schern hat sofort eine medikamentöse Therapie verord¬ net, in der Erwartung, hiermit den Krankheitsverlauf positiv zu beeinflussen. So ist aus klinischer Sicht der alleinige Einsatz von BCG-Vakzination bei ver¬ schiedenen Krebsformen ein allgemeinbekannter histo¬ rischer Versuch. Partiell mehr positive Resultate haben Autoren erzielt, die z.B. bei Dickdarmkrebspatienten mit einer homologen etablierten Dickdarmkrebszellinie vakziniert, bzw. geimpft haben. Ähnliche Erfahrungen wurden bei Prostatakrebspatienten gemacht. Noch bessere klinische Resultate wurden erzielt, wenn man die homo¬ logen Impfzellen vorher z.B. mit Neuraminidase behan¬ delt hatte. Die homologen Tumorzellen wurden vor der Impfung in geeigneter Weise, z.B. durch subletale Be¬ strahlung vermehrungsunfähig gemacht. Bei dieser Art der Behandlung, * die als unkontrolliert zu bezeichnen ist, waren jedoch eklatante Fehlschläge zu verzeichnen. Statt Effektivität oder zumindest einer Unwirksamkeit wurde wiederholt ein beschleunigtes Tumorwachstum, ein sogenanntes Enhancement, induziert. Diese Vorgehenswei¬ se konnte sich nicht etablieren.

Einen weiteren Fortschritt brachte die immuntherapeu- tisσhe Technik, wobei vitalisolierte, autologe Tumor¬ zellen mit geeigneten Maßnahmen teilungsunfähig gemacht wurden, z.B. durch in-vitro Mitomycin-C-Behandlung, und diese Tumorzellen alleine oder kombiniert mit BCG oder

nach Neuraminidase-Behandlung zur Vakzination, vor¬ zugsweise intralymphatisch appliziert, eingesetzt wur¬ den.

Zur Vermeidung eines negativen Effektes, einer Be¬ schleunigung des Tumorwachstums (Enhancement) , wurde zur optimalen Dosisfindung die Schachbrett-Titration eingeführt. Hierbei werden Tumorantigendosen, vorzugs¬ weise in der Haut des Rückens des Patienten, in stei¬ genden Dosen, erfahrungsgemäß in der Größenordnung von 10 bis 10 , max. 10 Tumorzellen pro Impfstelle appli¬ ziert. Als Zeichen einer Abwehrreaktion tritt im posi¬ tiven Falle eine Rötung um die Applikationsstelle der optimalen Antigendosis/Antigendosen auf (positive Haut¬ reaktion vom verzögerten-Tuberkulin-Typ) . Im weiteren Vorgehen richtet man sich dann nach dieser Hautreak¬ tion. Insbesondere ein Negativwerden der Reaktion zeigt die Notwendigkeit einer erneuten Vakzination an.

In den letzten Jahren kam die Erkenntnis, daß im Rahmen einer tumorassoziierten Immunreaktion ein ganzes Spek¬ trum von Antigenen, wie z.B. Differenzierungsantigene, organspezifische, onkofetale und vor allem individual- spezifische Antigene reagieren und das Vorhandensein, d.h. die Expression dieses Antigenspektrums von Patient zu Patient und sogar von Tochtergeschwulst zu Tochter¬ geschwulst in erheblichem Umfange variiert. Dies ist die Begründung dafür, weshalb man mit autologen Tumor- antigenpräparationen bessere Resultate erzielen kann, so passiv im Rahmen der Krebstherapie begleitenden Diagnostik, wie beim aktiven therapeutischen Vorgehen, d.h. bei Vakzination.

Auch wenn viele der bisher durchgeführten immunthera¬ peutischen, immunmodulierenden klinischen Studien po¬ sitive Resultate aufweisen konnten, waren diese Studien

fast ausnahmslos mit dem Fehler behaftet, daß bei einer Tumorform, z.B. beim Brustkrebs, einfach angenommen wurde, daß bei jeder Mammakarzinompatientin eine ein¬ heitliche tumorassoziierte Abwehrreaktion gegeben sei, die einheitlich beeinflußt werden könnte. Es wurde über¬ sehen, bzw. schlicht ignoriert, daß für positive immun¬ therapeutische Ansätze die Voraussetzung erfüllt sein muß, daß nur mit einem geeigneten Präparat, an einem dafür geeigneten Objekt zu einem dafür geeigneten Zeit¬ raum therapiert werden darf. Ansonsten ist ein Fehl¬ schlag vorprogrammiert.

Zwar hat die tumorassoziierte Immunreaktion kein Privi¬ leg. Ganz vereinfacht kann gesagt werden, daß der erste Schritt bei der Auseinandersetzung des Tumorträgers mit den Krebszellen ebenfalls auf der Ebene der Makrophagen und der Natural-Killer-Zellen und dann im Zusammenwir¬ ken mit den funktioneil verschiedenen Subpopulationen der T-Zellen stattfindet. Erst danach tritt eine B-Zell- Immunantwort auf, mit dem Erscheinen und der Naσhweis- barkeit von tumorassoziierten Antikörpern, in der Regel mit den Immunglobulin-Typen Ig-M, Ig-A und Ig-G.

Die tumorassoziierten Antikörper können wiederum die zelluläre Zytotoxizität gegenüber den Tumorzellen ver¬ stärken. Jedem Experten ist es bekannt, daß die höchste Effizienz einer antikörpergesteuerten, komplementab¬ hängigen, zellulären Zytotoxizität zuzuordnen ist, wo Antikörper des Typs Ig-M und/oder Ig-G nachweisbar sind.

Erst die Klärung der Qualität und der Stärke einer tu¬ morassoziierten zellulären und humoralen Immunität gibt endgültig darüber Aufschluß, welches zusätzliche prog¬ nostische Kriterium die tumorassoziierte Immunreaktion darstellt und welches zusätzliche therapeutische Po¬ tential diese beinhaltet.

So wird in der Krebstherapie unverweigerlich die For¬ derung nach routinemäßig durchführbaren immunbiolo¬ gischen Eingang- und Kontrolluntersuchungen gestellt. Eine blinde, unkontrollierte spezifische Immuntherapie oder eine einfache unspezifisσhe Reiztherapie mit im¬ munmodulierenden Substanzen ist strikt abzulehnen und wird aus mehreren Gründen als gefährlich bezeichnet. Jede biologische Therapie ist eine zweischneidige Waf¬ fe, die sowohl gewünschte als auch ungewünschte Effekte bei dem gleichen Patienten bewirken kann.

Den Idealzustand stellt die Situation dar, daß für je¬ den Krebspatienten eigene, autologe Tumorzellen iso¬ liert werden und diese entweder in Gewebekultur gehal¬ ten oder vital im flüssigen Stickstoff eingefroren wer¬ den, um bei Bedarf auftauen zu können. Diese vitalen, patienteneigenen Tumorzellen stellen dann laufend die geeigneten Zielzellen für immunbiologische Kontrollun¬ tersuchungen dar und können gleichzeitig zur Immunisie¬ rung/Vakzination des Patienten benutzt werden. Führt man die geeignetesten Untersuchungen, wie z.B. Cr-Re- leasing-Test, Koloniebildung-He mtest, usw. vor und nach im unrestaurativen-, immunmodulierenden Maßnahmen oder nach Vakzination durch, so kann exakt die Wirkung und der Sinn oder Unsinn der therapeutischen Maßnahmen beurteilt werden.

Dieses Vorgehen kann in der Routine aus verschiedenen, vor allem aus histopathologischen und technischen Grün¬ den, nur in Ausnahmefällen, meist für Forschungsfälle sichergestellt werden und bleibt auf die Dauer mangels entsprechender Ressourcen nicht bezahlbar. So bedarf es der Entwicklung und Etablierung äquivalenter Techniken, die rationell durchführbar sind.

Es wurde gefunden, daß die oben aufgeführten Probleme gelöst werden durch ein Verfahren zur integrierten on¬ kologischen Eingangsuntersuchung und Krebstherapie durch Impfung oder Vakzination mit aus Tumorzellen stammendem Material, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß Bestandteile aus Fraktionen, die aus dem bei der an sich bekannten Hormonrezeptoranalyse anfallenden Untersuchungsmaterial erhältlich sind, immunologisch, biochemisch und/oder molekularbiologisch analysiert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsge¬ mäßen Verfahrens werden die Fraktionen aus dem bei der Hormonrezeptoranalyse anfallenden Tumorzellcytosol und/oder -sediment erhalten. Die Fraktionen beinhalten als Bestandteile Proteine und/oder DNA und/oder RNA, welche analysiert werden. In einer besonders bevorzug¬ ten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens stammen die Tumorzellen aus Mammakarzinomen, Ovarial- tumoren und/oder Gebärmutterkörperschleimhauttumoren. Dabei ist das aus dem Tumorzellcytosol und/oder -sedi¬ ment erhältliche Protein vorzugsweise tumorrelevantes Antigen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht durch Verwendung der aus dem Tumorzellcytosol und/oder -sediment erhältlichen DNA die Identifizierung von Tumoren mittels Hybridisierung von tumorindizierender DNA eine sichere Diagnose bestimmter Tumoren.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele des Brust- und/oder des Eierstockkrebses näher erläutert:

1. Beim Mammakarzinom wird weltweit neben der obliga¬ torischen histopathologischen Untersuchung des Pri¬ märtumors und des Operationspräparates (Brust mit dem dazugehörigen auxiliaren Fett- und Drüsenpaket)

auch die routinemäßige Durchführung der Hormonrezep¬ toranalytik, sowohl aus dem Primärtumor, als auch aus den eventuell befallenen Lymphknotenmetastasen gefordert und durchgeführt. Hierfür etablierte sich ein logistisches System zwischen der operierenden Klinik, dem pathologischen Institut und dem Hormon¬ rezeptorlabor.

Bei dieser, zwischenzeitlich zur Routine gewordenen Zusatzuntersuchung, wird das Tumormaterial gekühlt zum Pathologen transportiert. Dort werden die für die Hormonrezeptoranalytik benötigten, bzw. zur Ver¬ fügung stehenden Tumormengen tiefgefroren und vor¬ zugsweise unter -21°C zwischengelagert. Der Weiter¬ transport zum Hormonrezeptorlabor erfolgt dann in der Regel unter Trockeneis. Zumindest die Bestimmung und Austitrierung der Estrogen- und Progesteronre- zeptorkonzentration erfolgt überall obligatorisch. Das Vorhandensein von Hormonrezeptoren ist die Vor¬ aussetzung für die hormoneile Empfindlichkeit der Tumorzellen. Eine hormonelle Therapie ist nur im positiven Fall sinnvoll. Für die Hormonrezeptorana¬ lytik wird das Tumormaterial in Europa aufgrund ei¬ nes internationalen Konsens (EORTC-Methode) einheit¬ lich vorbereitet und aufgearbeitet. Das Tumorgewebe wird feingeschnitten und mit Hilfe von flüssigem Stickstoff auf ca. -170°C abgekühlt und wird in die¬ sem Zustand mit einem Hammer und in einem speziellen Apparat, in dem sogenannten Dismembrator, pulveri¬ siert. Der Dismembrator besteht aus einer Stahlkugel in einer Teflonkapsel, die vorher ebenfalls auf ca. -170 ^β C abgekühlt wird. Das pulverisierte Tumorgewebe wird anschließend, stets im gekühlten Zustand zwi¬ schen 0 und 4°C mit einem Puffergemisch extrahiert. Nichtlösbare Tumorbestandteile werden in einer prä- parativen Ultrazentrifuge 45-60 Minuten lang bei

105.000 g abgetrennt. Das so gewonnene Tumorsediment wird bis heute weltweit unbenutzt weggeschmissen, zumindest wird dieses Tumorsediment nicht für tumor- immunbiologische Untersuchungen in-vitro oder am Patienten eingesetzt. Der Ultrazentrifugenüberstand bildet das Tumorcytosol. Die Gesamteiweißkonzentra- tion des Tumorcytosols beträgt in der Regel 1,0 bis 10,0 mg/ml. Im Rahmen der Hormonrezeptoranalytik wird zusätzlich die Humanalbuminkonzentration be¬ stimmt und der Gesamteiweißwert des Cytosols wird um die Humanalbuminkonzentration gekürzt. Der so ermit¬ telte Eiweißwert bildet den korrigierten Proteinwert des Tumorcytosols und wird zur Berechnung der Hormon¬ rezeptorkonzentration in Femtomol/mg Tumorprotein herangezogen. Die Albuminkonzentration im Cytosol gibt Aufschluß über die Blutbeimengungen, da Human¬ albumin nur in der Leber gebildet wird.

2. Die erfinderische parallele Verwendung der Cytosoi- reste aus der Hormonrezeptoranalytik und der Einsatz des nicht benutzten Tumorsedimentes hat eine sehr wichtige innovative immunbiologische Relevanz. Hier¬ bei, bei dem kombinierten getrennten Einsatz von autologem Antigen aus dem Tumorcytosol und aus dem Tumorsediment handelt es sich immunbiologisch um vollwertige, native Antigene, die zusammen das ge¬ samte antigene Spektrum der Tumorzellen beinhalten. Im Cytosol befinden sich die cytoplasmatischen Anti¬ gene, die im Zellinneren gebildet und zunächst dort zu finden sind. Bei der schonenden, auschließlich mechanischen Präparationstechnik, die stets im ge¬ kühlten Zustand stattfindet, gehen nur minimale An¬ teile der Kernantigene und die zellmembranständigen Antigene in lösbare Form über. Reagiert das so auf¬ gearbeitete Cytosol in einem Testsystem positiv, so

ist mit hoher Wahrscheinlichkeit anzunehmen, daß diese Antigene Neoantigene sind, wie z.B. Genproduk¬ te von Krebsviren.

Bei Krebsviren, wie z.B. bei verschiedenen Subtypen der Papillomviren, die 80% des Gebärmutterhalskreb¬ ses mitverursachen, wird das Virusgenom komplett oder zum Teil in das Genom der Tumorzelle inte¬ griert. Komplette Krebsviren werden in den selten¬ sten Fällen gebildet. In der Regel werden nur Teil¬ abschnitte des Virusgenoms translatiert, d.h. nur einzelne virale Genprodukte werden in den Tumorzel¬ len exprimiert, die dann als Antigene für die Abwehr des Tumorträgers fungieren.

Der Anmelder dieser Erfindung ist Inhaber des er¬ teilten europäischen Patentes für die Cytosol-CEA- Bestimmung. Durch die standardisierte Cytosol-CEA- Bestimmung können Mammakarzinome bereits alleine, oder in Kombination mit anderen Untersuchungstechni¬ ken, einfach in zwei Biotypen Biotyp-A und Biotyp-B differenziert werden. Biotyp-A wird mit hoher Wahr¬ scheinlichkeit durch ein Retrovirus mitverursacht, da Biotyp-A regelmäßig kreuzreagiert mit gp-55, mit dem Hüllprotein des Maus-Mammatumorivrus, bzw. mit dem Hüllprotein verwandter Retroviren und diese Form des Brustkrebses weist gehäuft Reservetranskriptase Aktivität in Tumorextrakten auf.

Mit Hilfe der indirekten Laserimmunofluoreszenz bei vitalisolierten Mammakarzinomzeilen Biotyp-A kann belegt werden, daß diese cytoplas atischen Neoanti¬ gene in die Zellmembran hineinprozessiert, bzw. durch die Zellmembran durchgeschleust werden können.

Das Antigen aus dem aufgearbeiteten Tumorsediment hat eine immunbiologische Äquivalenz zu der Zell¬ membran der Tumorzellen. Das Tumorsediment besteht zwar zum größten Teil aus Gewebsfasern, Zellkern¬ trümmern, nichtlösbaren Anteilen der Zellorganellen, wie z.B. Mitochondrien, beinhalten jedoch auch die feinsten Partikel der zerrissenen TumorZellmembran. Dieses Zellmembrankompartiment läßt sich in einem weiteren Schritt auf sehr elegante Weise weiter an¬ reichern, wie es noch dargestellt wird.

Reagiert eine Antigenpräparation aus dem Tumorsedi¬ ment nicht in einem immunbiologischen Testsystem, so ist mit hoher Wahrscheinlichkeit davon auszugehen, daß in der Tumorzellmembran keine Antigenität vor¬ handen ist und immunmodulierende, immuntherapeu¬ tische Maßnahmen nicht sinnvoll sind, bzw. nur auf der niedrigsten Ebene der Abwehr, auf der Ebene der Makrophagen- und Natural-Killer-Zellen-Stimulatoren therapeutische Maßnahmen sinnvoll sind. Es ist näm¬ lich ein schulmedizinisches Dogma, daß jede Tumor¬ zelle, wie überaltete somatische Zellen, von den Natural-Killer-Zellen als solche erkannt und ange¬ griffen werden würden.

3. Tumorantigen, aus dem Tumorcytosol und Tumorsediment präpariert, kann in verschiedenen Testsystemen ein¬ gesetzt werden, qualitativ abhängig davon, auf wel¬ cher Ebene der Immunantwort eine Reaktion bejaht oder .verneint werden kann. Medikamentös-therapeu¬ tische Maßnahmen werden sinnvollerweise dann gezielt in Abhängigkeit von der Qualität und Stärke der Im¬ munabwehrreaktion durchgeführt.

In der relevanten Weltliteratur hat beim Brustkrebs aus klinisch-prognostischer Sicht der Leukozyten-

Makrophagen-Inhibitationstest (LMI/MIF) an Bedeutung erlangt. Dem Leukozytenadhärenzinhibitionstest (LAI) kann diese Bedeutung nicht zugeordnet werden. Der LAI ist mehr aus der Sicht der immunologischen Brust¬ krebsfrühdiagnostik/Risikogruppenbildung von Inter¬ esse. So liegt es auf der Hand, daß innovative und erfinderische Anwendung von Antigenpräparationen aus dem Tumorcytosol und Tumorsediment zuerst, beispiel¬ haft, auf dieses Testsystem, auf den LMI-Test adap¬ tiert werden sollte.

4. Es wurden diverse Bemühungen unternommen, Antigen¬ präparationen im LMI-Test einzusetzen. Der Test wird in der Regel mit Tumorgefrierschnitten durchgeführt. Hierzu werden 1 cm ² 20 Mikron dicke Tumorschnitte auf einem Deckglas in der Kulturkammer den isolier¬ ten Abwehrzellen zur Antigenerkennung angeboten. Um hiervon abzukommen, wurden meistens lösbare Tumor¬ antigene präpariert, wie z.B. 3M KCL. Extrakte, und auch erfolgreich im Testsystem eigesetzt. Zwar gab es Autoren, die sogar formalinfixierte ganze Tumor¬ zellen im LMI-Test als Antigen eingesetzt haben, aber es ist bis heute kein Verfahren beschrieben, das aus dem gleichen Tumorstück parallel, in immun¬ biologisch relevanter Form, sowohl lösbares als auch nichtlösbares Tumorantigen, mit dem voll erfaßten Antigensprektrum in rationeller Form präparierte und zur Erfassung der tumorassoziierten Immunreaktion einsetzte.

5. So besteht ein Hauptmerkmal des neuen Verfahrens darin, daß für die Antigenpräparation Reste des Tu- morstückes mitverwendet werden, das die Hormonrezep¬ toranalytik, z.B. beim Brust- und Eierstockkrebs, durchläuft. Durch die modernen Untersuchungstechni¬ ken, wie Estrogen- und Progesteronrezeptor-Enzym- immunoassay der Fa. Abbott, werden immer weniger

Mengen von Tumorcytosolprotein, max. 1 - 3 mg, benö¬ tigt. So stehen die Cytosolreste weitgehendst und das Tumorsediment quantitativ für die Antigenpräpa- ration zur Verfügung. Dieses Vorgehen hat eine er¬ hebliche ökonomische Bedeutung. Bei kleinen Tumoren, die zu diagnostizieren und zu therapieren zu wün¬ schen sind, aus der Sicht der besseren Prognose, steht darüberhinausgehend wegen Mangel an der Tumor¬ masse überhaupt keine andere Alternative offen, als die Weiterverwendung der Cytosolreste und des Tumor¬ sediments, wenn man die zwingend notwendigen immun¬ biologischen Untersuchungen sicherstellen will.

Auch bei größeren Tumoren, wo getrenntes Tumorstück aufgearbeitet werden könnte, ist es aus ökonomischen Gründen sinnvoller, die Cytosol- und Tumorsediment- reste zum Antigen weiterzupräpariere . Bereits die getrennte Aufhebung, Einsendung (Verpackung, Trocken¬ eis, Versandpapiere und Transportkosten) eines zwei¬ ten Tumorstückes in ein zweites Labor macht Zusatz- kosten in Höhe von mindestens 40 bis 70 DM aus, von den Kosten einer zweiten Präparation (Pulverisieren, Extrahieren, Ultrazentrifugieren, usw. ) gar nicht zu sprechen.

6. Ein zweites Hauptmerkmal des neuen erfinderischen Verfahrens besteht wiederum darin, daß zunächst ohne jegliche chemische Behandlung des Cytosols und des Tumorsedi ents gearbeitet wird. Damit bleibt das Tumorantigen in seiner biologisch relevanten Form erhalten. Hier wird z.B. nur auf die Wichtigkeit der tumorzellmembrangebundenen Antigene hingewiesen. Bei diesen Antigenen haben nur diejenigen Molekülab- schnitte/Epitope, eine immunbiologische Relevanz, die aus der Zellmembran herausragen und so bei den

lebenden Tumorzellen dem Abwehrmechanismus des Tu¬ morträgers zugänglich sind. In diesem Sinne wird bei dem erfinderischen neuen Verfahren zunächst nur mit Hilfe von mechanischen Maßnahmen gearbeitet, d.h. die primären lösbaren und nichtlösbaren Antigenprä- parationen hergestellt. Diese Maßnahmen bestehen aus Differential- und/oder Gradientenzentrifugation, bzw. aus Differentialfiltration.

Das Cytosol wird vorzugsweise gegen eine geeignete Pufferlösung, z.B. 0,15M PBS (Phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung mit oder ohne Mg und Ca -Ionen in physiologischer Konzentration) dialy- siert, um die verwendeten Chemikalien der Cytosol- präparation für die Hormonrezeptoranalytik, wie z.B. SH-aktive Gruppen zu eliminieren. Erfolgt die Cyto- solpräparation ohne unphysiologische chemische Zu¬ sätze, so entfällt der Arbeitsschritt des Dialysie- rens.

Vorzugsweise wird das 100- bis SOOfache Volumen zum Dialysieren verwendet. Das so präparierte Cytosol wird vorzugsweise durch einen Membranfilter mit ei¬ ner Maschenweite von 0,2 Mikron gefiltert. Dies ent¬ spricht einer Sterilfiltration. Diese Cytosol-Anti- genpräparation ist bereits geeignet, außer ex-vivo- in-vitro-Untersuchungen, auch im Hauttest, einge¬ setzt zu werden. Im LMI-Test wird diese Cytosol-An- tigenpräparation vorzugsweise in den Konzentrationen 100-, 20-, 4-, 0,8-Mikrogramm korrigierter Tumorpro¬ tein per ml Medium eingesetzt. Als Hauttest und für Vakzinations-/Impfzwecke wird man dieses Cytosolanti- gen selbstverständlich vorzugsweise weiter präparie¬ ren. Flüssige, lösbare Antigene, insbesondere dann, wenn diese ein schwaches Antigen darstellen, sind gelöst nicht sehr geeignet für Hauttests oder zur

Immunisierung. Hierzu wird man das Cytσsolantigen vorzugsweise in einem weiteren Schritt bzw. Schrit¬ ten noch aufarbeiten und konditionieren. Dies bein¬ haltet vorzugsweise die weitere Anreicherung der antigenrelevanten Fraktionen, bzw. die Insolubisie- rung der Antigenfraktionen, wie z.B. die physiko- chemische Absorption an Aluminiumhydroxid-Gel in pharmazeutischer Qualität. Hierzu sind nach dem Stand der Technik die verschiedensten Anreicherungs- möglichkeiten und Potentierungsmöglichkeiten offen.

Sehr praktikabel hat sich beim Mammakarzinom die schonende Hitze-Mikropräzipitation erwiesen. Hierzu wird ein Volumen Tumorcytosol mit zwei Volumen 0.2M Azetatpuffer pH 5.0 versetzt und bei 70"C 15 Minuten inkubiert. Auf diese Weise entstehen feinste Pro- teinmikropräzipitate als feinste Partikel, die nach Abtrennen und Waschen in PBS sehr gut zu resuspen¬ dieren sind, mit weitgehendst erhaltengebliebenem Antigenspektrum. Wurde vorher das Cytosol oder die Cytosolfraktion sterilfiltriert, läßt sich die Pro¬ teinpartikelsuspension bei aseptischem Weiterverar¬ beiten als Antigen für Hauttests oder für Vakzina¬ tion einsetzen. Bei der Vakzination wird man das Mischen mit weiteren immunologisch aktiven Sub¬ stanzen, wie z.B. BCG oder Propionbakterien bevor¬ zugen. Im hitzestabilen überstand verbleibt nur ein kleiner Teil der Antigenität des Cytosols.

Die nicht chemische, nur mechanische Weiteraufarbei¬ tung des Tumorsediments besteht im ersten weiteren Schritt in der Differentialzentrifugation. Das Tu¬ morsediment .wird bei der Cytosolpräparation, nach der Zertrümmerung im Dismembrator, durch Ultrazen- trifugieren über 100.000 g mit eine ^' r Laufzeit bis zu einer Stunde abgetrennt. Unter diesen Konditionen

werden praktisch alle nichtlösbaren, partikularen Tumorbestandteile im Sediment abgetrennt. 1 g Tumor nach Feuchtgewicht ergibt im Durchschnitt 20-25 mg Tumorcytosolprotein in 3-5 ml Pufferextrakt und 200-250 mg Tumorsediment mit einem Feuchtigkeits-/ Cytosolrestanteil von ca. 10 bis max. 20%.

Dieses Tumorsediment wird vorzugsweise zunächst im 5-fachen Volumen PBS resuspendiert. Die Resuspension wird durch rasches Aufziehen und Wiederausspritzen durch eine Kanüle mit entsprechender Weite bewerk¬ stelligt. Durch stufenweises Verwenden einer immer feiner werdenden Injektionskanüle wird die Resus¬ pension schrittweise verfeinert. Hierbei wird das Resuspensionsvolumen unter ständigem Kühlen zwischen 0 bis 4°C auf das 25-fache der Sedimentmenge erhöht. Danach werden die Grobpartikel, wie z.B. Bruchstücke von Kollagenfasern usw. , vorzugsweise bei nur 1000-1500 G über 10 Minuten, möglichst in einer Kühl¬ zentrifuge bis max. 4 ^β C, abgetrennt und ggf. mit einem weiteren PBS-Puffervolumen erneut ausgewa¬ schen. Das Sediment wird als Fraktion 0 bezeichnet.

Der überstand, bzw. die vereinigten überstände, Fraktion I, ist eine opaleszente, weißliche Suspen¬ sion von Feinpartikeln und wird vorzugsweise vor dem weiteren Bearbeiten gegen 50- bis lOOfache Volumen PBS dialysiert. Fraktion-I kann ebenfalls aufgrund des Gesamteiweißwertes kalibriert werden. In der Regel ist es jedoch ausreichend sich nach der Ver- dünnungsstufe des ursprünglichen Tumorsedimentes zu richten und so wird nach der Dialyse mit PBS eine Endverdünnung von 50-fach, bezogen auf die ur¬ sprüngliche Ultrazentrifugen-Sedimentmenge, einge¬ stellt.

Die weiteren Schritte der nur-mechanischen Reinigung besteht aus Differentialfiltration. Hierzu wird die Tumorsedimentsuspension jeweils durch einen Membran¬ filter mit der Maschenweite 20-10-4-0,8-0,2 Mikron gefiltert. Die Abstufungen können frei gewählt wer¬ den. Das jeweilige Filtrat bildet die nächste Frak¬ tion, z.B. durch den 20-Mikron-Membranfilter Frak¬ tion U/20, usw. Durch das Rückspülen des jeweiligen Membranfilters gewinnt man den jeweiligen Membran¬ filterrückstand, bezeichnet z.B. Fraktion II/20-Rück- stand usw.

Von besonderer Bedeutung ist das 0,2-Mikron-Membran- filtrat, da es die feinste Dispersion aufweist und keimfreifiltriert ist. Im LMI-Test und im Hauttest hat man mit diesem Tumorsedimentfiltrat die besten Ergebnisse erzielt. Dieses 0,2-Mikron-Sedimentfil- trat macht etwa nur 1 bis 4% der Gesamttumorsedi¬ mentmenge aus und ergibt aus 1 g Tumorgewebe nach Feuchtgewicht ca. 2,5 bis 10,0 mg Partikelsuspenison in ausverdünntem Zustand. Dieses Sedimentfiltrat eignet sich ohne weitere Bearbeitung nicht nur für immunbiologische ex-vivo-in-vitro-Untersuchungen, sondern auch als Antigen für Hauttest und für Vakzi¬ nation/Impfung. Vorzugsweise wird jedoch dieses An- tigenpräparat für diese Anwendung weiter konditio- niert, wie Abtrennen und Resuspendieren in höherer Partikelkonzentration, bzw. Absorbieren an Alumini¬ umhydroxid-Gel, Mischen mit BCG oder mit einem Pro- pionbakterien-Suspensionspräparat als zusätzlicher Immunmodulator. Selbstverständlich wird man nach dem Prinzip der früher beschriebenen Schachbrett-Titra¬ tion vorzugsweise vorgehen.

Das 0,2-Mikron-Sedimentfiltrat, Verdünnungsstufe 50fach, wird im LMI-Test optimal in Konzentrationen

von 100-, 20-, 4,0- und 0,8-Mikroliter per Kultur¬ medium eingesetzt. In der Routine kommt man mit zwei, bis max. drei Antigenkonzentrationen aus, wo¬ bei die 20- und 4-Mikroliter-Sedimentfiltrate per ml Kulturmedium von der größten Relevanz sind. Diese sind die günstigsten Erfahrungswerte.

Berechnungen ergeben, daß in der Antigenpräparation aus dem Tumorsediment, nach diesem Verfahren, nicht verschleppte cytoplasmatische, lösbare Antigenreste reagieren, sondern tatsächlich nicht-lösbare, kor¬ puskulare Antigene, wie z.B. tumorzellmembranstän- dige Antigenstrukturen.

7. Verwendet man das 0,2-Mikron-Membranfiltrat des Tu¬ morsedimentes als Antigen, so geht gegenüber der Tumorsediment-Fraktion I in erheblichem Umfange, ca. 80-90% der Gesamtantigenmenge verloren. Im LMI-Test hat sich jedoch das 0,2-Mikron-Membranfiltrat als optimale Antigenpräparation erwiesen, da größere Partikel, wie z.B. das 10-Mikron-Membranfiltrat, bereits in erheblichem Umfange die scharfe Randbil¬ dung der Migrationshöfe stört und dieser Umstand macht die Auswertung in der Syke-Moore-Kammer prak¬ tisch unmöglich.

Ist die Ausbeute an Antigen, wie z.B. für Vakzina¬ tionszwecke über einen längeren Zeitraum, nicht aus¬ reichend, so kann bereits das Tumorsediment-Fraktion I für diesen Zweck voll eingesetzt werden, wenn man die Verarbeitung von Anfang an aseptisch durchführt. In diesem Falle sind Sterilitätskontrollen obligat.

8. Das dritte Hauptmerkmal dieser erfinderisch neuen und innovativen Präparationstechnik besteht darin,

daß die zerlegte Antigenität des Tumorcytosols (lös¬ barer Anteil) und des Tumorsedimentes (nicht-lösba¬ rer Anteil) dem Gesamtantigenspektrum einer Tumor¬ zellsuspension entspricht, als wenn man optimaler¬ weise mit isolierten Tumorzellen arbeiten würde. Hierzu ist notwendig, daß vorzugsweise in den immun¬ biologischen Testsystemen, die angewendet werden, sowohl präpariertes Cytosolantigen, wie präpariertes Sedimentantigen miteingesetzt wird.

9. Im weiteren eröffnet die erfinderische Verwendung des Tumorsedimentes, in der beschriebenen Weise, den Weg membranständige tumorassoziierte Antigene ein¬ fach und eleganterweise, ebenfalls in biologisch intaktem Zustand zu isolieren. Der Erfinder konnte in einer früheren Arbeit zeigen, daß beim Mammakar- zinom bereits zum Zeitpunkt der Primärtherapie in 21/28(=75%) der Fälle, an der TumorZellmembran be¬ reits tumorassoziierte Antikörper des Types IG-A, IG-M und/oder IG-G vorhanden sind. Dem Vorhandensein von tumorassoziierten Antikörpern vom Typ-IG-G an der Tumorzellmembran konnte die beste klinische Pro¬ gnose zugeordnet werden. Es steht eine hochsignifi¬ kante Korrelation zum positiven Reaktionsausfall des LMI-Testes mit Inhibition, der ebenfalls eine besse¬ re klinische Prognose zugeordnet werden kann. So besteht ein hohes Interesse daran, auch die tumor¬ assoziierten, membranständigen Antigenstrukturen aus der Tumorsedimentantigenpräparation weiter anzurei¬ chern und die Qualität und die Menge der vorhandenen tumorassoziierten Antikörper zu bestimmen. Dies läßt sich rationell, eleganterweise durch eine einfache, Immunabsorptionstechnik bewerkstelligen. Man nimmt hierzu geeignete, immobilisierte Antikörper, die gegen Humanimmunglobuline gerichtet sind. Die rele¬ vanten membranständigen Tumorantigene sind mit den

tumorassoziierten Antikörpern ja weitgehendst abge¬ deckt. So reichert man aus dem Tumorsediment durch die Immunabsorptionschromatographie eben diejenige Feinstpartikeln an, die immunbiologisch die relevan¬ ten Strukturen für die humorale Immunantwort an sich tragen. So konnte man mit immobilisierten Anti-Hu- man-H-L-Ketten-Antikörpem von der Ziege gegen menschliche Immunglobuline, auf aktivierte Kieselgur (Produkt der Fa. Boehringer Mannheim GmbH) gekoppelt in einem einzigen Arbeitsschritt, diese immunbiolo¬ gisch hochrelevanten Antigene, die im LMI-Test und im Hauttest hochaktiv sind, um den Faktor 100 an¬ reichern. Als Berechnungsgrundlage diente der Ge¬ samteiweißgehalt des resuspendierten Tumorsedimen¬ tes.

Wird eine Tumorsedimentfraktion von Cytosol-Resten durch Ausverdünnen und erneutes Abzentrifugieren freigewaschen, so besteht die Möglichkeit, diese prognostisch relevanten tumorassoziierten Antikör¬ per, z.B. mit einem Radioimmunoassay, oder mit Hilfe von Techniken der Enzymimmunoassays qualitativ nach¬ zuweisen und semiquantitativ auszutitrieren, um auch für diese Form der tumorassoziierten Immunantwort ein Kontrollsystem in der Hand zu haben.

10. Selbstverständlich ist das Tumorzellsediment aus der Hormonrezeptoranalytik oder unabhängig davon, z.B. bei anderen Krebsformen, wie beim Dickdarmkrebs, in der gleichen erfinderischen Weise präpariert, ein geeignetes Ausgangsmaterial für das weitere Präpa¬ rieren von Tumorantigenen herkömmlicher, bekannter Weise, oder mit neuen zukünftigen Technologien, wie Techniken der Molekularbiologie. So eine bekannte alte Technik ist das Verfahren der 3M KCL-Extrak- tion.

Oben wurde dargelegt, wie problematisch es beim Mamma- karzinom sein kann, inbesondere bei kleinen Tumoren, alle notwendigen onkobiochemischen und tumorimmunbiolo- gischen Eingangsuntersuchungen zur Biotypisierung si¬ cherzustellen. Neben den onkobiochemischen und tumor- immuπbiologischen Untersuchungen sind zwischenzeitlich auch molekularbiologische Untersuchungsmethoden hinzu¬ gekommen, wie zum Beispiel die Bestimmung des HER-2/neu- Onkogens im Mammakarzinomgewebe (D.J. Sla on et al., "Human Breast Cancer: Correlation of Relapse and Sur- vival with Amplification of the HER-2/neu Oncogene", Science 235, 1987, 177-182) . Üblicherweise muß für die¬ se molekularbiologische Untersuchung aus einem getrenn¬ ten Tumorgewebsstück DNA und/oder m-RNA isoliert wer¬ den. Es wird eine Methode beschrieben, die es erlaubt, auch diese und ähnliche molekularbiologischen Untersu¬ chungstechniken in ein integriertes onkologisches Ein¬ gangsuntersuchungsprogramm zusammenzufassen.

Beim Mamma- und zum Beispiel Ovarialkarzinom beinhaltet dieses integrierte onkologische Eingangsuntersuchungs- programm auch die Hormonrezeptoranalyse, wobei die Hor¬ monrezeptoranalyse das Ausgangsmaterial liefert.

Bei bestimmten Tumoren, bei denen die Hormonrezeptor¬ analyse keine klinische Relevanz besitzt, jedoch die Gewinnung von lösbaren und nicht-lösbaren (Zellwandbe¬ standteile) Tumorgewebefraktionen als Antigen für tu- morimmunbiologische Eingangs- und Kontrolluntersuchun¬ gen und die Bestimmung der Tumormarkerkonzentrationen (zum Beispiel CEA und Ca-19-9) im lösbaren Tumoranteil (Cytosol-Fraktion) von immenser Wichtigkeit für die Klinik sind, wie zum Beispiel bei den kolorektalen Kar¬ zinomen, wird man die ergänzenden molekularbiologischen Untersuchungen mit den bereits etablierten Untersu¬ chungstechniken zusammenfassen und vorzugsweise in

diese Untersuσhungsabläufe integrieren, um möglichst rationell zu arbeiten.

Das Verfahren wird am Beispiel des Mammakarzinoms mit dem HER-2/neu-Onkogen demonstriert.

Die Grundlage der Hybridisierunstechnik besteht darin, daß DNA und/oder m-RNA aus dem Gewebe bzw. Tumorgewebe isoliert wird, und zwar solche mit hohem Molekularge¬ wicht. Die isolierte DNA wird mit mindestens einem ge¬ eigneten Restriktionsenzym, aus jeder Probe gleichmäßig geschnitten, durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufge¬ trennt und mit Hilfe einer copy-DNA-Sonde, die bevor- zugt mit P 32 Isotopen marki.ert ist, hybri.di.si.ert, nach¬ dem die DNA-Proben aus dem Elektrophoresegel auf einen geeigneten Träger, zum Beispiel eine Nylonmembran, überführt worden sind. Die qualitative und quantitative Auswertung erfolgt durch Autoradiographie und Densito- metrie des Filmmaterials. Hierdurch wird festgestellt, ob der gesuchte DNA/Genabschnitt in der Probe vorhanden ist, und wenn ja, mit welcher Kopienzahl. Liegt eine Genamplifikation vor, d.h. man findet zwei oder mehrere Kopien dieses Gens in dem Tumorgewebe, so ist dies von höchster prognostischer Relevanz, wie beispielsweise im Falle des HER-2/neu-Onkogens beim Mammakarzinom.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, die ersten Schritte der Tumorgewebeverarbeitung so zu ge¬ stalten, daß das integrierte Vorgehen, in diesem Falle die DNA-Isolierung, sichergestellt werden kann. Diese Voraussetzung erfüllt die Cytosol-Präparationstechnik, die in der EP-A-0 092 223 beschrieben ist. Die dort beschriebene Präparationstechnik arbeitet ausschlie߬ lich mit Pufferzusatzen und Chemikalien, die die DNA im nativen Zustand belassen. Die DNA der Probe befindet

sich fast quantitativ in der Cytosolfraktion. Die Ul- trazentrifugation, 105000 G 45 Min. bzw. unter äquiva¬ lenten Bedingungen, macht die Cytosolfraktion de facto partikelfrei. Die DNA für die weitergehenden molekular¬ biologischen Untersuchungen wird aus dieser Tumorcyto- sol-Fraktion präpariert.

Die nachstehend beschriebene Präparationstechnik stellt eine geeignete DNA-Isolierungstechnik für diese Aufgabe dar:

Für die quantitative HER-2/neu-Onkogen-Hybridisierung benötigt man 12 μg Tumor-DNA. Eine Tumorzeile enthält bei normalem diploiden Chromosomensatz ca. 6 pg DNA pro

Zelle. So werden für die Isolierung von 12 μg Tumor-DNA g 20x10 Tumorzellen benötigt, bei einer 100% DNA-Ausbeu¬ te und reiner Tumorzellsuspension. Dies setzt die Ver¬ arbeitung von ca. 20 mg Tumorzellsuspension, bzw. unter Berücksichtigung der histopathologischen Besonderheiten des Mammakarzinoms und die Ausbeuterate bei der DNA-Iso¬ lierung, 100 bis 200 mg tumorgewebeäquivalente Tumor- cytosolfraktion mit einem durchschnittlichen korrigier¬ ten Tumorproteinanteil von 5 mg/ml voraus. 1 g Mamma- karzinomgewebe ergibt im Durchschnitt 15 bis 25, im Mittel 20 mg Tumorprotein. So ist es der Standardisie¬ rung der DNA-Hybridisierung dienlich, wenn einheitlich soviel präpariertes Tumorcytosol, ausgedrückt in ml, für die DNA-Isolierung weiterverarbeitet wird, das gleichzeitig 5 mg korrigiertes Tumorprotein enthält. Die hieraus isolierte Tumor-DNA reicht in der Regel aus, die Untersuchung (DNA-Hybridisierung) im doppelten Ansatz durchzuführen.

Die Schritte der DNA-Isolierung aus dem präparierten Tumorcytosol (Beispiele) :

1. Das Tumorcytosol wird mit TBS (Tris-buffered Saline) auf eine korrigierte Tumorproteinkonzentration von 1,0 mg/1 verdünnt, jedoch mindestens mit dem zwei¬ fachen Volumen TBS pH 7,4.

2. Danach 10 x Volumen von 0,5 M EDTA (pH 8,0), 100 μg/ml Proteinase K, 0,5% Sarcosyl.

3. Inkubation bei 50°C im Wasserbad 3 h. Periodenweise Mischen/Schütteln der viskosen Flüssigkeit.

4. Dreifache Extraktion der DNA mit gleichem Volumen Phenol. Nach der Zentrifugation liegt das Phenol wegen der hohen Salzkonzentration in der oberen Pha¬ se. Die Phenolfraktion soll möglichst exakt an der Flüssigkeitsphase abgetrennt werden. Gegebenenfalls (bei wenig Ausgangsmaterial) Reextraktion der Über¬ gangsphase mit zusätzlichem Phenol und Puffer.

5. Nach der dritten Phenolextraktion Dialyse der DNA gegen mindestens 200 x Volumen der Lösung 50 mM Tris-Cl (pH 8,0) , 10 mM EDTA und -10 mM NaCl mit wie¬ derholtem Wechseln der Dialyselösung, bis OD-»- (Op¬ tische Dichte bei 270 nm Wellenlänge) weniger als 0,05 wird.

6. Behandlung der dialysierten Probe mit 100 μg/ml DNase-freier RNase 3 h bei 37°C.

7. Intensive Extraktion der Probe zweimal mit 1/1 Volumen Phenol/Chloroform.

8. Erschöpfende Dialyse der Probe gegen TE (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA, ph 8,0).

9. Messen der Konzentration der extrahierten DNA mit an sich bekannten Methoden. Falls notwendig, weitere Reinigung und Konzentration der DNA durch Ethanol- oder Isopropanol-Präzipitation, oder Konzentrierung mit Butanolextraktion in an sich bekannter Weise, oder einfach durch Zentrifugation, wie nachstehend beschrieben.

In einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten (p = 1,70) wird die DNA beispielsweise in einem Beckmann Typ-40 Rotor bei 33000 rpm 60 bis 70 h bei 15°C zentrifu- giert. Die viskosen DNA enthaltenden Fraktionen wer¬ den aus dem Gradienten isoliert und erschöpfend dialy- siert gegen Tris-Puffer, pH 8,0, Zusammensetzung s.o.

10. Durchführung und quantitative Auswertung der DNA-Hy¬ bridisierung mit HER-2/neu-Onkogensonde, wie bei D.J. Slamon et al., Science 235, 1987 (177-182) be¬ schrieben.

Vergleich der Ergebnisse der Her-2/neu-Onkogen-Hy- bridisierung beim Mammakarzinom mit DNA-Isolierung klassisch aus getrenntem Tumorstück versus mit DNA- Isolierung aus Tumorcytosol, gewonnen aus den Cyto- solresten der Hormonrezeptoranalyse:

Einzel¬ 2-5 5-20 mehr als kopie Kop. Kop. 20 Kop.

Einzelkopie 15 1 0 0

2-5 Kopien 1 8 1 0

5-20 Kopien 0 2 3 0 mehr als

20 Kopien 0 0 0 2

horizontal: Ergebnisse der Hybridisierung mit DNA aus getrenntem Tumorstück vertikal: Ergebnisse der Hybridisierung mit DNA aus ^' Cytosol

Die EP-A-0 092 223 beschreibt ein Konzept, wie im vor¬ aus, bereits zum Zeitpunkt der Primärtherapie, diejeni¬ gen Mammakarzinompatienten definiert werden können, bei denen man mit den fortlaufenden Serum-CEA-Bestimmungen mit einem hohen positiven Vorhersagewert (praedictive value) eine Progression/Rezidiv frühzeitig, früher oder zumindest gleichzeitig mit den klinischen und radiolo¬ gischen Untersuchungen erkennen kann.

Zwischenzeitlich sind mehrere neue Tumormarker eta¬ bliert worden, wie TPA, Ca-15-3 und MCA für das Mamma- karzinom oder Ca-12-5 für das Ovarialkarzinom und Ca-19-9 für die gastrointestinalen Tumoren. Bei Tumoren wie zum Beispiel Ovarialkarzinom, bei denen in 80 bis 85% der Fälle der neue Tumormarker Ca-12-5 von dem je¬ weiligen Tumor produziert wird und zum Zeitpunkt der klinischen Diagnose meistens eine bereits relativ große Tumormasse gegeben ist, ist die Ca-12-5-Bestimmung im Tumor, zum Beispiel histochemisch oder in die Hormonre¬ zeptoranalyse integriert, aus dem Cytosol onkobioche- misch, ohne klinisches Interesse, da bereits eine ein¬ fache Serum-Ca-15-3-Bestimmung eine Aussage über die Verwendbarkeit des Tumormarkers Ca-12-5 erlaubt.

Beim Mammakarzinom ist die Situation für TPA, Ca-15-3 und MCA grundsätzlich anders. Auch kleine Mammakarzino- men können rezidivieren. Bei kleineren Tumoren wie Mam- makarzinomen kann nicht erwartet werden, daß es zum Zeitpunkt der Diagnose/Primärtherapie bereits zu einer Erhöhung des jeweiligen Tumormarkerspiegels kommt, auch

dann nicht, wenn vom Tumor der fragliche Tumormarker in ausreichendem Umfang produziert und sezerniert wird. So bedarf es umfangreicher Untersuchungen prospektiv oder retrospektiv gut dokumentierter Serum- und Tumor(Cyto¬ sol)-Archive, um eine Aussage darüber treffen zu kön¬ nen, inwieweit durch einen prädiktiven Test auf histo- chemischer Basis oder die quantitative Bestimmung die¬ ses Tumormarkers in einer Fraktion des Tumors, zum Bei¬ spiel im Cytosol oder in einer Membranfraktion, der neue Tumormarker in seiner Brauchbarkeit oder Verwend¬ barkeit für Rezidivfrüherkennung, in welchem Umfang auf den einzelnen Patienten bezogen, eingesetzt werden kann bzw. eingesetzt werden sollte.

Die in der EP-A-0 092 223 beschriebene Cytosol-CEA-Be- stimmung kann nicht ohne weiteres auf neue Tumormarker übernommen werden. So stellten sich für die Tumormarker TPA einerseits und für MCA Ca-15-3 andererseits beim Mammakarzinom grundlegend neue Erkenntnisse heraus:

TPA gehört als Substanz/Antigen zu der Gruppe der zel¬ lulären Stützsubstanzen, zu den sogenannten . Cytoske- lett-Proteinen. Erhöhte Serum-TPA-Werte treten auch nicht nur im Falle eines Tumorwachstums/Rezidives auf, sondern auch zum Beispiel bei der Regeneration von Darm¬ schleimhaut nach einer Durchfallerkrankung. Trotzdem stellte sich beim Mammakarzinom für TPA heraus, daß die standardisierte TPA-Bestimmung im Tumorcytosol ein zu¬ sätzliches Aggressivitätskriterium darstellt. Je höher die Konzentration von TPA im Tumorcytosol ist, um so aggressiver ist der Tumor. Standardisiert man die Cyto- sol-TPA-Bestimmung auf die Reagenzien der Firma Sangtec (Schweden) mit der IRMA-Technik, so liegt der Mittel¬ wert bei 155 Unit/mg korrigiertes Tumorprotein, und der Mediän beträgt 120 Unit/mg korrigiertes Tumorprotein,

mit einer Variationsbreite der TPA-Konzentrationen von 22 bis 1500 Unit/mg korrigiertes Tumorprotein. Damit stellt die TPA-Cytosolkonzentration einen wichtigen Prognosefaktor dar.

Andererseits stellte sich für die Ca-15-3- und MCA-Be- stimmung im Cytosol beim Mammakarzinom heraus, daß eine klinische Relevanz nur im negativen Sinne gegeben ist, d.h. durch die Cytosol-Ca-15-3- und MCA-Bestimmungen nur diejenigen Mammakarzinomfälle identifiziert werden können, die mit gewisser Wahrscheinlichkeit (negativer Vorhersagewert, negative praedictive value, gleich oder kleiner als 0,7) im Falle eines Rezidives/Progression keine pathologisch erhöhten Werte zeigen bzw. deren pathologisch erhöhte Werte erst deutlich später auftre¬ ten, als ein Rezidiv klinisch und/oder radiologisch erkannt werden kann. Eine positive Vorhersage für die beiden Tumormarker Ca-15-3 und MCA beim Mammakarzinom ist nicht möglich, d.h. diejenigen Mammakarzinomfälle im voraus festzulegen, bei denen für die Rezidivfrüher¬ kennung die fortlaufenden Serum-Ca-15-3- und MCA-Be¬ stimmungen geboten waren. Diese Feststellung ist vom Prinzip der Cytosol-CEA-Bestimmung grundsätzlich ab¬ weichend.

Auch die obigen Aussagen, Cytosol-TPA-Konzentration als Aggressivitätskriterium beim Mammakarzinom und Cytosol- Ca-15-3- und -MCA-Konzentration als Ausschlußkriterium für den Einsatz dieser Tumormarker in der Mammakarzinom- nachsorge, sind nur möglich, wenn die Cytosol-TPA-, Ca-15-3- und MCA-Konzentration standardisiert, d.h. von Labor zu Labor einheitlich, möglichst mit den Reagen¬ zien des gleichen Herstellers bestimmt und die Reagen¬ zien dieses Herstellers durch einen Cytosol-Standard stets kontrolliert und geeicht werden.

Die Interpretation der Werte der standardisierten Cyto- sol-TPA -, Ca-15-3- und -MCA-BeStimmung beim Mammakar¬ zinom ist für den klinischen Einsatz grundsätzlich an¬ ders als bei der beschriebenen Cytosol-CEA-Bestimmung. -Diese Erkenntnisse können auch auf weitere bekannte Tumormarker wie Ca-19-9 oder sogar auf zukünftige neue Tumormarker übertragen werden. Ob die Bestimmung eines Tumormarkers im Cytosol sinnvoll oder wertlos ist und wie die Ergebnisse für die Klinik zu interpretieren sind, setzt erstens die Bestimmung dieses Tumormarkers im Cytosol unter standardisierten Bedingungen voraus und zweitens ist es zwingend notwendig, an einem größe¬ ren Patientenkollektiv und über einen längeren Zeitraum Erfahrungen zu sammeln, inwieweit aus diesen Werten für die Prognose und für die Brauchbarkeit des jeweiligen Tumormarkers als Serumspiegelbestimmung Grenzwerte/Dis¬ kriminierungswerte abgeleitet werden können oder nicht.

So konnte für den -Tumormarker Ca-15-3 beim Mammakarzi¬ nom nach dem oben beschriebenen Prinzip im Tumorcytosol der Grenzwert 10,0 mE Ca-15-3/mg korrigiertes Tumorpro¬ tein ermittelt werden, von welchem Punkt/Grenzwert an der Einsatz von Ca-15-3 als Tumormarkerbestimung in der Nachsorge als Blutuntersuchung kritisch, d.h. unwirt¬ schaftlich wird. Dieser Grenzwert wurde unter standar¬ disierten Bestimmungen für die RIA-Reagenzien der Firma Isotopendienst-West (CIS)/Bundesrepublik Deutschland ermittelt.