CAMPO DA INVENÇÃO

[001]. A presente invenção refere-se a um processo de isolamento de microrganismos produtores de enzimas ligninolíticas, especialmente fungos filamentosos, a partir dos resíduos agroindustriais, principalmente do bagaço da cana de açúcar, e a estruturação de uma coleção de cultura.

[002]. Ainda, a presente invenção refere-se ainda à produção de derivados da lignina, de um agente cosmético de coloração capilar e produção de enzimas, como a lacase.

[003]. Ainda, a presente invenção trata de composições cosméticas para coloração capilar e para alisamento capilar compreendendo o referido agente cosmético.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[004]. Lacases são oxidorredutases comumente produzidas por fungos “white-rot”, mas que também podem ser encontrados em plantas, bactérias e insetos (1 a; 1 b; 1 c).

[005]. Estas enzimas contêm quatro átomos de cobre catalíticos distribuídos em três sítios redox e estão envolvidos na degradação da lignina em seu ambiente natural. Apresentam múltiplas funções fisiológicas, que incluem, além da degradação da lignina, lignificação vegetal, cicatrização de feridas, síntese de pigmento, regulação anti-estresse e morfogênese fúngica (2). Além de degradar a lignina, lacases são capazes de catalisar a oxidação de vários compostos orgânicos (o- e p-difenóis, aminofenóis, polifenóis, metoxi fenóis, aril-diaminas, poliaminas) e alguns íons inorgânicos (3, 4), com redução simultânea de oxigénio molecular em água (sem produção intermediária de peróxido de hidrogénio). Devido a essas características, as lacases podem ser utilizadas em diferentes áreas, como deslignificação da polpa de papel, branqueamento de corantes têxteis, desintoxicação de efluentes, modificação de biopolímeros, células de biocombustível, biosensores, biorremediação de solos e síntese de fármacos.

[006]. No entanto, quantidades significativas de lacase devem ser produzidas para uso em escala industrial, a fim de competir eficientemente com os agentes oxidantes tradicionais ou outros agentes químicos, ou seja, alta produção com baixo custo.

[007]. A fermentação é o método mais atrativo e viável para a produção de lacase e, durante a última década, vários esforços têm sido feitos para encontrar condições adequadas que intensifiquem a produção de enzimas.

[008]. As lacases normalmente ocorrem como glicoproteínas extracelulares, sendo produzidas nas células e, em seguida, secretadas e acumuladas fora dos filamentos da hifa (5). Muitos fungos ligninolíticos produtores da lacase secretam múltiplas isoformas com diferentes propriedades físico-químicas e catalíticas (6). As isoformas podem estar presentes em diferentes frações, e a proporção de enzimas produzidas depende da composição da cultura e das condições operacionais empregadas (7).

[009]. Os fungos “white-rot”, geralmente produzem baixas concentrações de várias lacases quando cultivados em cultura submersa ou em madeira.

[001]. O uso de mediadores químicos (indutores) na reação enzimática das lacases expandiram enormemente suas capacidades de oxidação (8). Os mediadores atuam como“transportadores” de elétrons entre a enzima e o substrato, possibilitando a oxidação de substratos complexos que não poderiam ser oxidados pela própria enzima (9). Concentrações mais altas podem ser obtidas pela adição de compostos aromáticos (2,5-xilidina, ácido ferúlico, álcool veratrílico, guaiacol), preparações de lignina ou cobre ao meio de fermentação (10).

[002]. As lacases geralmente são produzidas durante o metabolismo secundário de fungos“white-rot” que crescem em substrato natural ou em cultura submersa.

[003]. Vários parâmetros de cultivo podem influenciar a produção e atividade da lacase, incluindo limitação de carbono, fonte e concentração de nitrogénio, teor de vitaminas e microelementos, temperatura, pH, aeração e agitação (1 1 ). A produção de lacase em biorreatores de tanque agitado é às vezes limitada pela falta de um sistema de produção eficiente. As diferentes formas de crescimento morfológico dos fungos filamentosos têm efeito significativo na reologia do caldo de fermentação e, consequentemente, no desempenho do biorreator (12). Culturas com fungos filamentosos geralmente exibem viscosidade e reologia não newtoniana que podem afetar a transferência de oxigénio e massa, comprometendo a produtividade geral. Por esta razão, o controle da extensão das hifas é uma questão crucial para operar com sucesso no processo em biorreator (13). A fermentação submersa geralmente resulta em crescimento descontrolado do micélio.

[004]. Muitas cepas fúngicas têm sido relatadas como boas produtoras de lacases na escala de biorreatores, incluindo Trametes pubescens, Pycnoporus sanguineus e Pleurotus sp. (14a; 14b; 14c).

[005]. Fontes:

[006]. 1 a. Yoshida, H., (1883). Chemistry of lacquer (Urushi), Part 1 . J.

Chem. Soc. 43, 472 - 486;

[007]. 1 b. Claus, H., (2004) Laccases: structure, reactions, distribution.

Micron 35, 93 - 96;

[008]. 1 c. Dwivedi, U.N., Singh, P., Pandey, V.P., Kumar, A., (201 1 )

Structure-function relationship among bacterial, fungai and plant laccases. J. Mol. Catai. B Enzym. 68,1 17 - 128; [009]. 2. Sharma, K.K., Kuhad, R.C., (2008) Laccase: enzyme revisited and function redefined. Indian J. Microbiol. 48, 309 - 316;

[0010]. 3. Gianfreda L, Xu F, Bollag J (1999) Laccases: a useful group of oxidoredutive enzymes. Biorem J 3:1 -26;

[0011]. 4. Hofer C, Schlosser D (1999) Novel enzymatic oxidation of

Mn ²⁺ to Mn ³⁺ catalyzed by a fungai laccase. FEBS Lett 451 :186— 190;

[0012]. 5. Mougin C, Jolivalt C, Briozzo P, Madzak C (2003) Fungal laccases: from structure-activity studies to environmental applications. Environ Chem Lett 1 :145 -148;

[0013]. 6. Moldes D, Lorenzo M, Sanromán MA (2004) Different proportions of laccase isoenzymes produced by submerged cultures of Trametes versicolor grown on lignocellulosic wastes. Biotechnol Lett 26:327-330;

[0014]. 7. Salas C, Lobo S, Larraín J, Salas L, Cullen D, Vicunã R (1995)

Properties of laccase isoenzymes produced by the basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora. Biotechol Appl Biochem 21 :323 - 333;

[0015]. 8. Bourbonnais, R., Paice, M.G., (1990) Oxidation of non- phenolic substrates. An expanded role for laccase in lignin biodegradation. FEBS Lett. 267, 99 - 102;

[0016]. 9. Canãs, A.I., Camarero, S., (2010) Laccases and their natural mediators: biotechnological tools for sustainable eco-friendly processes. Biotechnol. Adv. 28, 694 - 705;

[0017]. 10. Palmieri G, Giardina P, Bianco C, Fontanella B, Sannia G

(2000) Copper induction of laccase isoenzymes in the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus. Appl Environ Microbiol 66:920-924;

[0018]. 1 1. Shraddha, Shekher R, Sehgal S, Kamthania M, Kumar A

(201 1 ) Laccase: microbial sources, production, and potential biotechnological applications. Enzyme Res. doi:10.4061/2011/217861 ;

[0019]. 12. Couto SR, Toca-Flerrera JL (2007) Laccase production at reactor scale by filamentous fungi. Biotechnol Adv 25:558-569; [0020]. 13. Moreira MT, Feijoo G, Lema JM (2003) Fungai bioreactors: applications to white-rot fungi. Rev Environ Sei Bio/Technol 2:247-259;

[0021]. 14a. Galhaup, C., Wagner, H., Flinterstoisser, B., Haltrich, D.,

(2002) Increased production of Laccase by the wood-degrading basidiomycete Trametes pubescens. Enzym. Microb. Technol. 30, 529 - 536;

[0022]. 14b. Bettin, F., Rosa, L.O., Montanari, Q., Calloni, R., Gaio, T.A.,

Malvessi, E., da Silveira, M.M., Dillon, A.J.P., (201 1 ) Growth kineties, production, and characterization of extracellular Laccases from Pleurotus sajor-caju PS-2001 . Process Biochem. 46, 758 - 764;

[0023]. 14c. Saat, M.N., Annuar, M.S.M., Alias, Z., Chuan, L.T., Chisti,

Y., (2014) Modeling of growth and Laccase production by Pycnoporus sanguineus. Bioproc. Biosyst. Eng. 37, 765 - 775.

[0024]. A estrutura do cabelo é muito complexa e há certas diferenças na estrutura do cabelo de várias etnias, como caucasianos, africanos e asiáticos.

[0025]. O cabelo é composto de proteína insolúvel em água conhecida como queratina, que, como proteína, consiste de muitos aminoácidos como suas unidades primárias.

[0026]. A forma física do cabelo, ou seja, seus componentes morfológicos, tem principalmente três partes, sendo uma delas a cutícula, a segunda sendo o córtex e a terceira a medula.

[0027]. Estas partes estão unidas por camadas do cimento intercelular ou complexo de membrana celular (CMC) (Cell Membrane Complex), e seus espaços intercelulares. Existem três tipos de complexos de membrana celular (CMC):

[0028]. - O primeiro tipo de CMC está apenas entre as cutículas

(cutícula-cutícula CMC);

[0029]. - O segundo tipo de CMC está entre a camada mais interna da cutícula e as células corticais (cutícula-cortex CMC); [0030]. - O terceiro tipo de CMC é entre as próprias células corticais

(célula cortical-célula cortical CMC).

[0031]. Todas essas três CMCs são um pouco diferentes em suas composições. Geralmente são compostas por ácidos graxos livres, esteróis, colesteróis e desmosteróis (fonte: Rieger, M. M. (2000). Harry’s Cosmeticology, eighth edition, Chemical Publishing Co., Inc. New York., Robbins, C. (2009), The cell membrane complex: Three related but component cellular cohesion components of mammalian hair fibers. J. Cosmet. Sei., 60, 437-465.)

[0032]. Com relação à coloração de cabelos, há três tipos de coloração no mercado:

[0033]. Coloração Temporária - a penetração do corante no fio capilar é bem superficial, podendo ser removido em uma única lavagem.

[0034]. Coloração semi-permanente - a penetração do corante no fio capilar é superficial, duram de 6 a 8 lavagens.

[0035]. Coloração permanente - a coloração não sai do cabelo durante a lavagem, realizada normalmente em salão de cabeleireiros.

[0036]. A coloração permanente é a coloração mais utilizada pela consumidora e pelos cabeleireiros profissionais nos salões de beleza, e este é o segmento da presente invenção.

[0037]. A água oxigenada ou peróxido de hidrogénio utilizada em tintura capilar tradicional danifica os cabelos, deixando os fios capilares quebradiços, opacos e desidratados. (Hipótese validada por mais de 95% dos cabeleireiros e consumidores entrevistados).

[0038]. Isto porque a água oxigenada (peróxido de hidrogénio) ataca os lipídeos do complexo da membrana celular (CMC). Cada camada de cutícula do fio capilar é colada à próxima camada de cutícula com a ajuda do material chamado cimento intercelular ou complexo de membrana celular (CMC) e seus espaços intercelulares.

[0039]. A degradação da CMC entre as cutículas pode fazer com que as camadas da cutícula se desvaneçam, enfraqueçam mais rapidamente e não desempenhem um papel efetivo como protetor do córtex.

[0040]. A estrutura da cutícula em si é bastante complexa e subdividida em partes, como epicutículas, camada A, exocutículas (ou camada B) e endocutículas. A epicutícula é uma membrana muito fina que cobre a cutícula como uma camada mais externa e tem cerca de 5 a 7 nanômetros (nm) de espessura. É muito hidrofóbica por natureza.

[0041]. A F-Layer (18-MEA) que está acima da epicutícula, revestindo a mesma, funciona como um lubrificante diminuindo o atrito entre as fibras capilares e sua ausência influencia a percepção sensorial do cabelo, como cabelos ressecados ou dificuldade de pentear. A F-Layer (18-MEA) não é muito resistente a álcalis como os hidróxidos, agentes oxidantes como o peróxido de hidrogénio (água oxigenada) e agentes proteolíticos, e em exposição prolongada, alterações químicas significativas também ocorrem na camada epicuticular, tornando assim as fibras capilares mais porosas e aumentando a fricção entre as fibras.

[0042]. Na coloração permanente de mercado, são utilizados dois tipos de produtos:

[0043]. a) uma solução de corante (corantes oxidativos);

[0044]. b) um agente oxidante (sendo o mais utilizado o peróxido de hidrogénio).

[0045]. No momento da coloração mistura-se a + b na presença de pH alcalino, utilizando como base amónia ou etanolamina.

[0046]. A oxidação seguida da polimerização ocorre dentro do fio capilar, impedindo a saída do“corante polimerizado” durante a lavagem.

[0047]. Por este motivo este tipo de coloração é chamado de permanente, pois os corantes oxidativos penetram dentro da fibra capilar e não saem facilmente durante as lavagens. Nas demais colorações, o pigmento fica somente depositado sobre a fibra capilar, por este motivo não resiste a várias lavagens.

[0048]. Córtex - Existem dois tipos de células corticais: as células para- corticais e orto-corticais, diferindo na composição de seus aminoácidos e apresentando diferenças na absorção de corantes. As células para- corticais possuem uma forma de fuso uniforme, enquanto as células orto- corticais não apresentam uma forma uniforme.

[0049]. Os cabelos caucasianos orientais/mongóis e do leste asiático tendem a ter todas as células para-corticais que são mais uniformes em diâmetro e forma, e com uma elipticidade baixa. Consequentemente, o cabelo tem forma reta e diâmetro relativamente uniforme, contêm mais cistina e são mais estáveis ao calor.

[0050]. O cabelo de ascendência africana consiste em uma quantidade significativa de células orto-corticais que são inerentemente irregulares em forma e tamanho. O cabelo de ascendência africana tem fileiras iguais de células para-corticais e orto-corticais e é por isso que o cabelo de ascendência africana tem forma ondulada/encaracolada com uma tremenda quantidade de variação de diâmetro ao longo da haste capilar. Sabe-se que tem uma elipticidade muito alta. A introdução significativa de mais células orto-corticais em cabelos de descendentes de africanos os torna mais propensos a danos térmicos e ataque químico do que a sua parte em cabelo de descendência asiática e europeia. No lado para-cortical, a espessura total das cutículas é maior do que o lado orto-cortical, onde as camadas da cutícula podem ser tão baixas quanto um a dois em número.

[0051]. Os cabelos de raça mista têm uma quantidade leve a moderada de ondulação e são mais uniformes em diâmetro ao longo da haste do cabelo, quando comparados com os cabelos de descendência africana. Mesmo o cabelo de raça mista com células predominantemente para- corticais e uma fileira estreita de células orto-corticais é mais resistente a modificações químicas, como alisamento de cabelo, etc.

[0052]. As células corticais consistem em macrofibrilas que contêm filamentos intermediários (microfibrilas). O filamento intermediário (ou microfibrilas) consiste de protofibrilas. E protofibrilas consistem de protofilamentos. Cada protofilamento consiste de dímeros que são duas cadeias de proteínas enroladas.

[0053]. Os Filamentos Intermediários (IFs) contém cadeias proteicas de material helicoidal muito organizadas torcidas juntas como uma corda.

[0054]. Matriz: As microfibrilas/filamentos intermediários são incorporados na matriz de macrofibrilas e células corticais. O papel principal da matriz é unir as microfibrilas (Filamentos Intermediários) em um estado estável estacionário com alguma liberdade de movimento, também conhecida como a elasticidade das fibras capilares. O grau de perda de resistência à tração das fibras capilares durante os tratamentos químicos corresponde à extensão do dano à matriz. Se as microfibrilas e a matriz proteica são desnaturadas parcial ou totalmente, a fibra capilar perde suas propriedades mecânicas (resistência à tração e elasticidade) relativamente.

[0055]. Também a camada de endocutícula pode facilmente se deteriorar a partir dos agentes proteolíticos e outros produtos químicos reativos, como álcalis. (Fonte: Rieger, M. M. (2000). Flarry’s Cosmeticology, eighth edition, Chemical Publishing Co., Inc. New York., AN Syed, TN Ventura, and MN Syed. (2013). Hair ethnicity and ellipticity: A preliminary study. Cos & Toil, 128, (4), 250-259., Cruz, C. F.; Costa, C.; Gomes, A. C.; Matamá, T. and Cavaco-Paulo, A. (2016), Fluman Hair and the Impact of Cosmetic Procedures: A Review on Cleansing and Shape-Modulating Cosmetics, Cosmetics, 3, 26).

Alisamento capilar

[0056]. O alisamento capilar é um procedimento que altera a aparência física do cabelo, no que diz respeito à forma, de forma durável.

[0057]. Podemos ter dois tipos de alisamento:

[0058]. - Alisamento temporário;

[0059]. - Alisamento permanente.

[0060]. Existe uma diferença essencial entre esses procedimentos e o ajuste do cabelo.

[0061]. Alisamento Temporário [0062]. O alisamento temporário exige técnicas físico-químicas como secador, chapinha, pente quente e dura apenas até a próxima lavagem. O cabelo deve ser molhado para quebrar as ligações de hidrogénio da queratina, permitindo uma abertura temporária de sua estrutura original, passando da conformação a-queratina (a-helicoidal) para a conformação b-queratina (estrutura b-estendida). A secagem rápida e a ajuda mecânica mantêm o fio do cabelo liso (estrutura b-estendida). Consequentemente, a nova forma é sensível à umidade.

[0063]. Alisamento Permanente

[0064]. O alisamento permanente do cabelo requer mudanças nas ligações dissulfeto do cabelo. Estas técnicas envolvem a manipulação das interações físico-químicas que estabilizam a estrutura da queratina, através do amolecimento da queratina, moldando-se à forma pretendida e proporcionando uma nova geometria. Isso ocorre por quebra de ligações dissulfeto entre os filamentos de queratina e seu rearranjo posterior na forma desejada, afetando a integridade estrutural e o conteúdo de cistina do cabelo.

[0065]. Existem duas classes de agentes nucleofílicos que são aplicados ao cabelo para o alisamento: a) agentes redutores, como mercaptanas e sulfitos e b) agentes contendo hidróxido (álcalis).

[0066]. a) agentes redutores como mercaptanas e sulfitos

[0067]. As mercaptanas e sulfitos clivam as ligações dissulfeto seletivamente, de modo que possam ser recombinados no final do processo, em vez de comprometer toda a proteína. Por exemplo, no procedimento com a mercaptana tioglicolato de amónia, as ligações dissulfeto são convertidas em grupos sulfidrilo/tiol (-SH) para permitir o relaxamento mecânico das queratinas. Após o relaxamento, os grupos sulfidrila livres são reoxidados pela utilização de um agente oxidante como o peróxido de hidrogénio (água oxigenada) para restabelecer as ligações dissulfeto com a conformação desejada. Um ferro quente/chapinha pode ser usado para induzir estresse adicional o suficiente para deixar o cabelo permanentemente reto, alisado. Utilizando mercaptanas ou sulfitos, retém- se 90% do teor de cisteína com 10% de cistina adicional transformada em ácido cistérico. Este processo causa menos perda de proteína do que o uso de agentes alcalinos.

b) Agentes alcalinos

[0068]. Agentes alcalinos contendo hidróxidos, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de lítio, etc, geralmente com pH superiores a pH 9,0, clivam ligações dissulfeto menos seletivamente com uma fissão permanente. O pH elevado induz o inchaço dos cabelos, a abertura das escamas das cutículas e, consequentemente, induz uma penetração profunda do agente alcalino até o córtex capilar. Lá, os íons hidroxila rompem as ligações dissulfeto das queratinas capilares para que um rearranjo de pontes dissulfeto possa ocorrer. Em alguns casos, em condições tão drásticas, há uma conversão das ligações dissulfeto em ligações cruzadas de monossulfito. A reação tardia, a lantionização, consiste na substituição de parte do aminoácido cistina pela lantionina. Este processo resulta num alisamento mais eficaz, embora com um enfraquecimento da integridade da fibra capilar, uma vez que aproximadamente um terço das ligações dissulfeto são permanentemente convertidas em ligações de lantionina. Isso resulta em uma diminuição da elasticidade e resistência à tração, juntamente com danos cuticulares. Com este procedimento, devido à supercontração, não há necessidade de calor. Este fenômeno fornece estresse suficiente para endireitar/alisar a fibra permanentemente.

[0069]. No nível molecular, a supercontração de fibras é o resultado de mudanças na estrutura secundária, devido à transição da fase a para b. Acredita-se que as mudanças conformacionais moleculares irreversíveis devido à supercontração levam ao alisamento permanente do cabelo. (Fonte: Rieger, M. M. (2000). Harry’s Cosmeticology, eighth edition, Chemical Publishing Co., Inc. New York., Cruz, C. F.; Costa, C.; Gomes, A. C.; Matamá, T. and Cavaco-Paulo, A. (2016), Fluman Hair and the Impact of Cosmetic Procedures: A Review on Cleansing and Shape-Modulating Cosmetics, Cosmetics, 3, 26).

Derivados de Lignina - Novos Ativos da Biomassa

[0070]. A lignina está presente na composição da parede celular secundária do bagaço da cana de açúcar, na ordem de 10-25%. Atualmente o bagaço da cana de açúcar é utilizado para geração de energia na própria usina. Na produção de etanol de 2- geração, que parte do bagaço de cana, a lignina é um subproduto ainda sem utilização definida, sendo um resíduo do processo. Portanto, a lignina é um resíduo do processo de Etanol, tanto na Primeira como na Segunda Geração (Etanol Celulósico).

[0071]. A lignina é um polímero complexo de alcoóis aromáticos denominados monolignóis. Os monolignóis são os monômeros que compõe a estrutura da lignina e são eles: álcool p-coumaril, álcool coniferil e álcool sinapil. Estes lignóis são incorporados na lignina na forma dos fenilpropanóides p-hidroxifenil (H), guaiacil (G), and siringil (S), respectivamente.

[0072]. Destaca-se a seguir alguns documentos do estado da técnica:

[0073]. O artigo Bioprocess Biosyst Eng (2013) 36:365-373 Laccase production by free and immobilized mycelia of Peniophora cinerea and Trametes versicolor a comparative study” trata da comparação entre o cultivo para a produção da lacase em biorreator em meio líquido com o micélio livre e imobilizado em uma fibra sintética comercial (Green Heavy Duty Scour Pad-Scotch BriteTM, 3 M Company). Para o cultivo em placa de Petri utilizaram o meio de cultura denominado TaK (Tien and Kirk médium) em g/L: glicose (10), extrato de malte (10), peptona (2), extrato de levedura (2), asparagina (1 ), KH2PO4 (2), MgS04 (1 ), tiamina-HCI (1 ), e ágar (20), diferindo do cultivo da presente invenção que não utiliza ingredientes deste meio para cultivo em placa de Petri, como glicose, extrato de malte, asparagina, KH2PO4, MgS04 e tiamina-HCI. A preparação do pré-inóculo em meio líquido em erlenmeyers e no shaker também difere da presente invenção quanto ao período de incubação (3 dias) e quanto ao meio de cultura utilizado que é o meio TaK sem o agar. O cultivo em biorreator também difere quanto ao tempo e o meio utilizado, que é o meio TDM composto por: glicose (83 mM), glutamina (5 mM), NaCI (5 mM), KH2PO4 (5 mM), MgS04.7H20 (1 mM), CaCl2 (0.1 mM), dimetil succinato (10 mM), tiamina-HCI (2.4 mM), e 1 mL por cada litro de meio de uma solução de traços de metais contendo (mM): FeS04.7H20 (20), MnS04.H20 (20), C0CI2.6H2O (6), ZnCI ₂ (5), CuS04.5H ₂ 0 (2), (NH ₄ )6Mq7q24.4H ₂ 0 (0.5), e NÍCI2.6H2O (0.1 ). O período também diverge sendo de 15 dias de cultivo, e uma parte do inoculo é imobilizada em fibra sintética. O pH do processo no biorreator do artigo é pH 5,0, enquanto na presente invenção 0 pH é de pH 6,0. O processo de produção da lacase na presente invenção não utiliza 0 inoculo imobilizado, e a atividade enzimática da lacase do extrato bruto foi praticamente equivalente ao processo utilizando 0 inoculo imobilizado para 0 fungo Peniophora, com uma maior produtividade, uma vez que 0 tempo de processo é de 9 a 10 dias, enquanto no artigo foram necessários 15 dias, indicando que é um processo mais robusto, com maior viabilidade técnica e económica, sem a necessidade de imobilização, 0 que para um processo industrial de larga escala em biorreator viria a ser um problema. A atividade enzimática da lacase do micélio livre no meio líquido foi aproximadamente de 100U/L, bem inferior ao mesmo processo na presente invenção (cerca de 2800 U/L), com a utilização de outro meio de cultivo. Ainda, 0 fungo utilizado no artigo foi isolado da floresta tropical no ecossistema costeiro sob influência marinha (Floresta de Restinga, São Vicente, São Paulo, Brasil), e 0 microrganismo da presente invenção foi isolado do bagaço de cana de açúcar.

[0074]. O documento PI BR 10 2014 008502 5, e 0 artigo Fungai Biology, 122 (2018) 302 a 309 _ Laccase production in bioreactor scale under saline condition by the marine-derived basidiomycete Peniophora sp. CBMAI 1063, descrevem 0 cultivo do fungo Peniophora sp, isolado de uma esponja marinha Amphimedon viridis, coletada na região de São Sebastião, São Paulo, Brasil. O fungo da presente invenção foi isolado do bagaço de cana de açúcar. O fungo do documento e artigo acima foi cultivado em placa de petri contendo 2% de extrato de malte por 7 dias, diferindo do meio de cultura utilizado na presente invenção e também do período de cultivo. O pré-inóculo foi produzido com o meio de cultura, diferindo também do meio de cultura utilizado na presente invenção, contendo (g/L): extrato de levedura (2), peptona (2,74), extrato de malte (1 ,36) e glicose (2,74), adicionados em 65% (v/v) de água do mar artificial (ASW) (Kester et al., 1967). O meio foi suplementado com uma solução aquosa de 1 ,00 M de CuS04 para uma concentração final de 2,00mM. O pH inicial foi de pH 4,5, já na presente invenção foi de pH 6,0. A temperatura e rotação são as mesmas: 28°C e 140 rpm respectivamente e o período de cultivo de 7 dias. Os frascos (erlenmeyers) inoculados foram então usados como inoculo de biorreatores numa proporção equivalente de 8,5% (v / v) do volume de trabalho do biorreator estipulado. Os experimentos em escala de erlenmeyers foram realizados para avaliar a influência da condição salina e do CuS04 na produção de lacase. O fungo Peniophora sp. CBMAI 1063 foi cultivado no meio otimizado (ver acima) formulado com 65% (v / v) de ASW (água do mar artificial) e suplementado com CuS04 (2,00 mM). Os experimentos foram realizados, considerando a presença(+) e ausência(-) de ASW e CuS0 ₄ : ASW (+) / CuS04 (-), ASW (-) / CuS04 (-), ASW (+) / CuS04 (+) e ASW(-) / CuS04 (+). Os experimentos foram realizados em duplicatas durante 7 dias a 28°C e sob uma taxa de agitação constante de 140 rpm. Os erlenmeyers contendo solução salina e CuS04 _ ASW (+) / CuS04 (+) foram os que apresentaram maior atividade enzimática da lacase e maior concentração de biomassa. Foram utilizados biorreatores de tanque agitado (stirred tank - ST) e de elevação de ar (air-lift - AL), sendo que a atividade enzimática da lacase no biorreator com agitação (ST) foi bem maior do que com air-lift (AL). Foi utilizado o meio otimizado (ver acima) formulado com 65% (v / v) de ASW (água do mar artificial) e suplementado com CuS04 (2,00 mM). A atividade enzimática da lacase e a produtividade com este meio salino ficaram idênticas à atividade obtida pelo meio de cultura e processo da presente invenção, com a enorme vantagem deste último por não precisar da etapa de lavagem e filtração em membrana seguida de concentração para a retirada do sal do meio de cultivo, o que é inviável tecnicamente em produção industrial de larga escala, além de onerar o processo. Foi realizada a concentração e a purificação da lacase para caracterização através de cromatografia de troca iônica, seguida da cromatografia de exclusão de tamanho (size exclusion chromatography), diferindo da presente invenção onde a purificação foi realizada somente em cromatografia de troca iônica.

[0075]. O documento BR 9814732-3 descreve uma composição pronta para o uso para a tintura de oxidação das fibras queratínicas, em particular das fibras queratínicas humanas como os cabelos que compreende em um meio apropriado para a tintura, pelo menos um colorante de oxidação, pelo menos um colorante direto catiônico, e pelo menos uma enzima de tipo lacase, bem como o processo de tintura que utiliza essa composição.

[0076]. Já, o documento PI 9814740-4 revela uma composição pronta para o uso destinada à tintura das fibras queratínicas humanas e mais particularmente dos cabelos humanos que compreende, em um suporte apropriado para a tintura das fibras queratínicas: (a) pelo menos uma enzima de tipo lacase; (b) pelo menos um polímero substantivo catiônico ou anfótero particular; (c) pelo menos um colorante de oxidação, bem como os processos de tintura dos cabelos que utilizam essa composição.

[0077]. E o documento BR 10 2013 026715 5 descreve micro- organismos para produção de enzimas e um processo para a produção de complexo enzimático pelo fungo filamentoso P. echinulatum para ser utilizado na hidrólise enzimática de biomassa de bagaço e palha de cana- de-açúcar pré-tratados ou não. Também é descrita a modulação do referido complexo enzimático considerando suas atividades enzimáticas, bem como outras proteínas relevantes à hidrólise enzimática, secretadas ao meio de fermentação, mediante a variação ou combinação de qualquer proporção da biomassa utilizada.

[0078]. Destaca-se que não foi detectado ensinamento no estado da técnica que antecipe, ensine ou sugira solução equivalente à apresentada aqui na presente invenção que alia diferenciais técnicos, vantagens económicas, segurança e confiabilidade.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

[0079]. Assim, é um objetivo da presente invenção, proporcionar um processo de isolamento de microrganismos produtores de enzimas ligninolíticas a partir de resíduos agroindustriais.

[0080]. É outro dos objetivos da presente invenção, proporcionar a um processo de produção de derivados da lignina.

[0081]. É outro dos objetivos da presente invenção, proporcionar um processo de preparação de um agente cosmético de coloração capilar.

[0082]. É outro dos objetivos da presente invenção, proporcionar um processo de preparação de um agente cosmético de alisamento capilar.

[0083]. É outro dos objetivos da presente invenção, proporcionar um processo de produção/isolamento de enzimas.

[0084]. É outro dos objetivos da presente invenção, proporcionar uma composição cosmética de coloração capilar.

[0085]. É outro dos objetivos da presente invenção, proporcionar novos produtos oriundos da quebra do polímero da lignina (ligninólise) pela lacase.

[0086]. É outro dos objetivos da presente invenção, proporcionar novos produtos a serem utilizados nos mercados cosmético e farmacêutico.

[0087]. É outro dos objetivos da presente invenção, proporcionar um agente cosmético de coloração capilar e/ou de alisamento capilar que apresente desempenho superior àquele atingido pelos produtos atualmente disponíveis no mercado e ainda agrida menos as fibras capilares.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0088]. A presente invenção, atinge esses e outros objetivos por meio de um processo de cultivo do fungo da família Peniophoraceae, gênero Peniophora sp, que compreende as seguintes etapas:

a) Isolamento do fungo;

b) Semeadura do fungo na placa de Petri;

c) Inoculação do fungo em meio líquido e obtenção do extrato enzimático;

d) Produção de pré-inoculo em meio líquido;

e) Produção do fungo em biorreator e obtenção do extrato enzimático;

f) Concentração e purificação da lacase obtida para caracterização.

[0089]. Ainda, a presente invenção atinge esses e outros objetivos por meio de uso de lacase, obtenível em processo acima, para preparação de uma composição cosmética para coloração capilar.

[0090]. Ainda, a presente invenção atinge esses e outros objetivos por meio de uma composição cosmética para coloração capilar que compreende a referida lacase, ou outras lacases comerciais ou não, e uma solução corante.

[0091]. Ainda, a presente invenção atinge esses e outros objetivos por meio de uso da referida lacase, ou outras lacases comerciais ou não, para preparação de uma composição cosmética para alisamento capilar.

[0092]. Ainda, a presente invenção atinge esses e outros objetivos por meio de uma composição cosmética para alisamento capilar que compreende um agente oxidante sendo a dita lacase, ou outras lacases comerciais ou não, e um agente redutor sendo protease.

[0093]. Ademais, a presente invenção atinge esses e outros objetivos por meio de um processo de delignização de bagaço de cana de açúcar que compreende as seguintes etapas:

a) Preparação do bagaço de cana de açúcar;

b) Separação da Hemicelulose; c) Extração da Lignina e eliminação da Celulose;

d) Precipitação e obtenção da Lignina após secagem e moagem.

[0094]. Por fim, a presente invenção atinge esses e outros objetivos por meio de processos de ligninólise particularmente para lignina do bagaço de cana de açúcar da biomassa da indústria sucro-alcooleira e/ou para lignina Kraft da biomassa da indústria de papel e celulose.

DESCRIÇÃO DETALHADAS FIGURAS

[0095]. A presente invenção será mais bem detalhada com base nas figuras anexas:

[0096]. Figura 1. - ilustra um esquema de inoculação do isolado puro em meio liquido;

[0097]. Figura 2. - ilustra uma foto do pêlo de Yaque utilizado para coloração capilar;

[0098]. Figura 3. - ilustra uma comparação visual entre as colorações Preta com lacase e com peróxido de hidrogénio: (a) "ponto zero”, (b) após 7 lavagens, (c) após 14 lavagens e (d) após 28 lavagens;

[0099]. Figura 4. - ilustra uma comparação visual entre as colorações Loira com lacase e com peróxido de hidrogénio: (a) "ponto zero”, (b) após 7 lavagens, (c) após 14 lavagens e (d) após 28 lavagens.

[00100]. Figura 5. - são fotos do processo de delignização: (a) lignina solúvel em meio alcalino, (b) lignina precipitada em pH ácido e (c) a lignina seca e moída.

[00101 ]. Figura 6. - são fotos de lotes em pH ácido nas três condições de temperatura na fase metanol com a coloração vermelha, e nas respectivas três condições de temperatura na fase acetato de etila com a coloração amarela (processo de ligninólise).

[00102]. Figura 7. - são fotos das placas de CCD da Lignina dissolvida em metanol e em acetato de etila (a) e dos lotes após a ligninólise nas três condições da fase acetato de etila. As placas foram realizadas em placas de alumina e com a fase móvel de CH2Cl2:MeOH (9:1 ), e revelados em luz UV de 254nm e posteriormente com a solução de anisaldeído (5%) e ácido sulfúrico (5%) em etanol absoluto.

[00103]. Figura 8. - é uma foto da placa de CCD com o padrão de álcool coniferílico na lateral à esquerda, e o padrão de podofilotoxina aplicado na lateral à direita, o qual não é revelado por este revelador de anisaldeído, aparece somente na luz UV 254nm. Foram aplicadas as frações isoladas Fr 4 e Fr 9 do lote 120717 da fase acetato de etila. A placa foi realizada em placa de alumina, com a fase móvel de CH2Cl2:MeOH (9:1 ) e revelados em luz UV de 254nm e posteriormente com a solução de anisaldeído (5%) e ácido sulfúrico (5%) em etanol absoluto.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00104]. A presente invenção se refere ao isolamento de microrganismos produtores de enzimas ligninolíticas, especialmente fungos filamentosos, a partir dos resíduos agroindustriais, principalmente do bagaço da cana de açúcar, e a estruturação de uma coleção de cultura. Após a seleção e produção da enzima ou das enzimas ligninolíticas, utilizando resíduos agroindustriais, através de um planejamento experimental e da análise estatística, as mesmas serão utilizadas na geração de quatro produtos principais com enfoque comercial: a produção de enzimas (lacase), a produção de derivados da lignina, de um agente cosmético de coloração capilar e de um agente cosmético de alisamento capilar.

[00105]. Um dos objetivos da presente invenção, se refere a um processo de isolamento de um fungo pertencente à família Peniophoraceae, do genêro Peniophora sp.

[00106]. A metodologia de caracterização utilizada compreende:

Extração de DNA Genômico

Amplificação da região ITS1 -5.8S-ITS2

Sequenciamento

Análise Filogenética

Isolamento do fungo de interesse

[00107]. O fungo foi isolado do bagaço de cana de açúcar por meio da técnica de“Diluição Seriada”.

[00108]. As colónias dos microrganismos incubados na etapa de isolamento foram semeadas em novas placas de Petri, utilizando a alça em L, contendo o mesmo meio de cultivo utilizado no isolamento para a purificação dos isolados.

Semeadura do fungo de interesse na placa de Petri

[00109]. O processo de cultivo do fungo de interesse da presente invenção compreende as seguintes etapas:

[00110]. - O fungo de interesse produtor da enzima lacase foi cultivado em placas de Petri contendo de 0,5 a 2,0%, sendo preferencialmente 0,5%, de açúcar refinado (sacarose), 2% de ágar bacteriológico, de 0,5 a 2,0%, sendo preferencialmente 2%, de bagaço de cana de açúcar moído em moinho de facas e esterilizado (previamente auto clavado), de 0,2 a 0,5%, sendo preferencialmente 0,2%, de peptona, de 0,2 a 0,5%, sendo preferencialmente 0,2%, de extrato de levedura e com ou sem adição de solução de sulfato de cobre (CUSO4.5H2O) de modo a ficar a 2 ou 5 mM no meio de cultivo. O bagaço de cana de açúcar também foi substituído pela lignina (2%) obtida do processo de delignização;

[00111]. - O bagaço de cana de açúcar, a lignina e 0 sulfato de cobre (CUSO4.5H2O) foram utilizados como indutores na produção da lacase;

[00112]. - Com ou sem a adição de aproximadamente 80% do volume da água de batata previamente preparada, sendo preferencialmente sem adição, e 0 meio de cultura foi fundido no micro-ondas até a completa dissolução do Ágar;

[00113]. - A seguir 0 meio foi transferido para uma proveta e completado 0 volume para 100% com água destilada, 0 qual em seguida foi transferido para um frasco de vidro tipo Schott, vedado e autoclavado;

[00114]. - Após autoclavar foi aguardado 0 resfriamento parcial do meio (temperatura de mamadeira) e adicionado 100 mg/L do antibiótico. Preferencialmente, utiliza-se neste processo um antibiótico selecionado dentre Cloranfenicol e Rifamicina;

[00115]. - As placas foram incubadas a uma temperatura de 28°C, por 7 a 15 dias, sendo preferencialmente 9 a 10 dias.

[00116]. Destaca-se que segundo literatura, o açúcar (sacarose) geralmente reprime a produção de lacase na maioria dos fungos, e muitos destes microrganismos não conseguem metabolizar este nutriente. Por este motivo, inicialmente foi utilizado a glicose (dextrose) como nutriente no meio de cultura para o cultivo do fungo isolado e a produção de lacase.

[00117]. Após testar e substituir a glicose pelo açúcar (sacarose) no meio de cultura, foi verificado que o fungo isolado não só metabolizava bem o açúcar (sacarose), como aumentou a produção de lacase. Sendo o açúcar refinado bem mais barato que a glicose (dextrose) importada, percebeu-se então um diferencial no cultivo do fungo e produção da enzima.

Inoculação do fungo de interesse em meio líquido e obtenção do Extrato Enzimático

[00118]. O extrato enzimático foi obtido a partir do crescimento dos fungos no meio líquido. Os fungos, em triplicata, foram crescidos em 50 mL do meio de isolamento (sem adição de antibiótico) que compreende contendo de 0,5 a 2,0%, sendo preferencialmente 0,5%, de açúcar refinado (sacarose), de 0,5 a 2,0%, sendo preferencialmente 2%, de bagaço de cana de açúcar moído em moinho de facas e esterilizado (previamente auto clavado), de 0,2 a 0,5%, sendo preferencialmente 0,2%, de peptona e de 0,2 a 0,5%, sendo preferencialmente 0,2%, de extrato de levedura e com ou sem adição de solução de sulfato de cobre (CUSO4.5H2O) de modo a ficar a 2 ou 5 mM no meio de cultivo, em erlenmeyers de 125 mL. . O bagaço de cana de açúcar também foi substituído pela lignina (2%) obtida do processo de delignização;

[00119]. Para tanto 4 quadrados (cubos) de aproximadamente 0,5 cm por 0,5 cm da borda da colónia dos isolados purificados em placa de Petri, crescidos previamente em meio sólido por 7 a 1 5 dias (melhor 9 a 10 dias), foram transferidos para os meios líquidos, conforme figura 1 .

[00120]. Os ensaios foram incubados à uma agitação de 140 rpm e temperatura de 28°C, por 7 a 15 dias (melhor 9 a 10 dias) em uma incubadora tipo shaker.

Processo de extração da enzima

[00121]. Após a incubação, todo o conteúdo do crescimento fúngico foi centrifugado a 10.000 rpm por 30 minutos a 4 °C, visando obtenção dos extratos enzimáticos. Os sobrenadantes foram transferidos para outro tubo do tipo Falcon de 50 ml e utilizados para a avaliação da atividade enzimática utilizando-se substratos específicos para lacase. A centrifugação pode ser substituída com sucesso por outras tecnologias como, por exemplo, filtração tangencial.

Informação sobre a enzima extraída

[00122]. A avaliação da atividade enzimática da lacase foi realizada para dois substratos: ABTS (2,2-azino-bis-etilbenthiazolina) e Siringaldazina.

[00123]. A partir dos extratos obtidos, a atividade enzimática de lacase foi determinada utilizando como substrato enzimático 2,2-azino-bis- etilbenthiazolina (ABTS). A mistura foi composta de 0,3 mL de tampão acetato de sódio 0,1 M (pH 4,5), 0,1 mL de solução de ABTS a 0,03% (p/v) e 0,6 mL da solução enzimática (Buswell et al. 1995). A oxidação do ABTS foi medida pelo monitoramento do aumento da absorbância a 420 nm.

[00124]. O segundo método avaliou a oxidação da Siringaldazina a 525 nm. A mistura da reação continha 0,2 mL de tampão citrato-fosfato (0,05 M; pH 5,0), 0,1 mL de água deionizada, 0,6 mL da solução enzimática e 0,1 mL de Siringaldazina (1 nM) em etanol 100% (Manole et al. 2008 modificado).

[00125]. A atividade enzimática dos extratos brutos é expressa em U/Litro (pmoles produto/m in. x Litro), obtidas através da fórmula:

D Abs = absorbância (final - inicial) U/Litro = AAbs x 106 e = absorção molar

e x R x T R = quantidade de caldo enzimático (ml)

T = tempo de reação (minutos)

[00126]. Uma unidade de enzima é definida como a quantidade de enzima necessária para oxidar 1 prmol de substrato por minuto e por litro da solução de enzima. Sendo e420 para ABTS = 36.000 M ¹ x cm ^-1 e e525 para Siringaldazina = 65.000 M ¹ x cm ^-1 .

[00127]. Todas as leituras dos ensaios foram realizadas em duplicata para cada triplicata do isolado.

Preparação do Pré-inoculo

[00128]. O pré-inoculo foi preparado com o meio citado acima, de 0,5 a 2,0%, sendo preferencialmente 0,5%, de açúcar refinado (sacarose), de 0,5 a 2,0%, sendo preferencialmente 2,0%, de bagaço de cana de açúcar moído em moinho de facas e esterilizado (previamente auto clavado), de 0,2 a 0,5%, sendo preferencialmente 0,2%, de peptona e de 0,2 a 0,5%, sendo preferencialmente 0,2%, de extrato de levedura e com ou sem adição de solução de sulfato de cobre (CUSO4.5H2O) de modo a ficar a 2 ou 5 mM no meio de cultivo, em erlenmeyers de 125 mL. . O bagaço de cana de açúcar também foi substituído pela lignina (2%) obtida do processo de delignização;

[00129]. Alternativamente, com 0 meio 2% de sacarose, 0,2% de peptona e 0,2% de extrato de levedura. O objetivo desta composição do meio do pré-inóculo foi prover 0 aumento da massa fúngica sem necessidade de produção de enzima. O cultivo foi realizado por 7 dias. Sendo realizado com 4 repetições de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL do meio, onde foram inoculados em cada frasco 8 quadrados (cubos) de aproximadamente 0,5 cm por 0,5 cm da colónia dos isolados purificados em placa de Petri.

[00130]. Com 0 intuito de melhorar a dispersão das hifas no biorreator, melhorando a reologia durante 0 processo, foi realizado um procedimento que consiste em agitar 0 material produzido em um tubo Falcon de 50 ml com pérolas de vidro, por menos de 1 minuto. Este procedimento é viável em escala industrial através da utilização de Moinho de Pérolas.

[00131]. De forma estéril, em capela de fluxo laminar, o conteúdo líquido do frasco de Erlenmeyer de 250 mL foi descartado, cuidadosamente de forma a manter a massa de hifas: descartou-se até que todo conteúdo de cada Erlenmeyer coubesse em um tubo Falcon de 50 mL (estéreis). Os tubos Falcon previamente continham pérolas de vidro, lavadas e esterilizadas até atingir a marcação de 5mL do tubo. O conteúdo da massa celular, resto de meio e pérolas de vidros presentes no Falcon foram agitados em Vortex, por menos de 1 minuto para não ocorrer rompimento celuar, até que as hifas ficassem dispersas no meio, permitindo, dessa forma, que se multiplicassem os pontos de crescimento do fungo no biorreator, melhorando a reologia do processo.

[00132]. O conteúdo de hifas dispersas dos 4 Erlenmeyers (vortexados em 4 Falcons diferentes) foram unidos em um mesmo frasco Erlenmeyer vertendo cuidadosamente para que as pérolas de vidro permanecessem no Falcon e fosse para o Erlenmeyer somente o conteúdo de massa do fungo, resultando em cerca de 150 mL de inoculo, o qual foi transferido para o biorreator.

Produção no Biorreator

[00133]. Preferencialmente, utilizou-se um biorreator de 5L da Infors, operando em dorna de vidro borosilicato, jaquetada, autoclavável, com sensores de pH, oxigénio dissolvido e turbidez, sensor de temperatura da jaqueta de água, com controle da temperatura máxima da jaqueta, com impelidor Marine Impellor 25° NW200 D=1 15x12 left.

[00134]. Foram produzidos 2 L de meio de cultura composto por , de 0,5 a 2%, sendo preferencialmente 0,5%, de açúcar refinado (sacarose), de 0,5 a 2,0%, sendo preferencialmente 2%, de bagaço de cana de açúcar moído em moinho de facas e esterilizado (previamente auto clavado), de 0,2 a 0,5%, sendo preferencialmente 0,2%, de peptona e de 0,2 a 0,5%, sendo preferencialmente 0,2%, de extrato de levedura e com ou sem adição de solução de sulfato de cobre (CUSO4.5H2O) de modo a ficar a 2 ou 5 mM no meio de cultivo, em erlenmeyers de 125 mL. . O bagaço de cana de açúcar também foi substituído pela lignina (2%) obtida do processo de delignização;

[00135]. Após a incubação, todo 0 conteúdo do crescimento fúngico foi centrifugado a 10.000 rpm por 30 minutos a 4 °C, visando obtenção dos extratos enzimáticos. Os sobrenadantes foram transferidos para outro tubo do tipo Falcon de 50 ml e utilizados para a avaliação da atividade enzimática utilizando-se substratos específicos para lacase. A centrifugação pode ser substituída com sucesso por outras tecnologias como, por exemplo, filtração tangencial.

Concentração da enzima

[00136]. Após a centrifugação, 0 extrato enzimático do biorreator foi filtrado em papel dejiltro Whatman® n ^Q 1 em funil de buchner. Após a filtração 0 extrato enzimático foi concentrado no equipamento da GE com membrana Hollow Fiber Cartridge, Model UFP -10-E-4MA, com corte de 10KDa. Os produtos do extrato com massa molecular (MM) igual ou menor do que 10 KDa foram retirados. Foi concentrado cerca de 10 vezes, e a atividade enzimática do extrato bruto de cerca de 2800 U/L foi para cerca de 22000 U/L.

Purificação da Enzima

Após a concentração a enzima foi purificada no equipamento AKTA purifier da GE, por cromatografia de troca iônica, utilizando uma coluna Fast Flow QFF de 5 mL, com gradiente binário com solução NaCI de 0 a 200mM e tampão FIEPES (C8FI18N2O4S). Foram isoladas três frações de lacase para caracterização.

Perfil Proteico

[00137]. Foi realizado 0 perfil proteico, através da eletroforese em gel, para verificar os pontos isoelétricos e as massas moleculares das proteínas geradas na fermentação. Esta é uma informação importante para uma futura prospecção, pois quanto mais produtos passíveis de comercialização forem encontrados no extrato bruto, maior a viabilidade na diminuição dos custos da extração enzimática.

[00138]. A eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS - PAGE) é geralmente usada na análise da massa molecular das proteínas. Combinando resolução e sensibilidade, a eletroforese bidimensional (2D) se tornou uma técnica importante para detecção e análise das proteínas. Esta técnica permite a separação de milhares de proteínas simultaneamente, separando por ponto isoelétrico (PI) e massa molecular (MM).

[00139]. Inicialmente foi realizada a eletroforese de primeira dimensão (1 D) por focalização isoelétrica utilizando o Ettan IPGphor 3 (GE). A amostra foi reidratada e focalizada seguindo um procedimento em etapas de voltagem (1 h a 500V, 1 h a 1000V seguida de 8000V até um total de 35- 45Kvh ser atingido para fitas de IPG de 13 cm e 15 Kvh para de 7 cm, sendo este um exemplo de corrida, mas alterações poderão ocorrer de acordo com cada tipo de amostra). As fitas focalizadas foram então equilibradas em solução contendo SDS e ureia (solução de equilíbrio contendo 50 mmol L-1 Tris, 6.000 mmol L-1 ureia, 2% SDS, 30% glicerol, pH 8.8) contendo primeiramente DTT e posteriormente iodoacetamida.

[00140]. Foi realizado um segundo teste (Zimograma) correndo o gel na presença do reagente ABTS, o qual reagindo com a lacase apresentaria uma coloração esverdeada, identificando a (s) banda (s) característica (s) para esta enzima.

Fungo Isolado

[00141]. Inicialmente, o fungo isolado vinha sendo cultivado em meio contendo 80% de água de batata, 2% de glicose (dextrose) e 2% de ágar para placas de Petri, conhecido na literatura como meio BDA. Com este meio de cultura inicial, o fungo isolado na presença de ABTS obteve atividade de 41 1 ,3 Ul/L e com Siringaldazina atividade de 252,6 Ul/L. Siringaldazina é o substrato principal de lacase, mas estudos recentes demonstraram que a quinona produzida a partir de Siringaldazina não é solúvel em meio aquoso ao longo do tempo dificultando os ensaios experimentais. Neste sentido, embora o ABTS não seja o substrato mais específico para essa enzima, ele tem sido usado para quantificar a atividade de lacase especialmente nas etapas iniciais (Bonugli-Santos et al. 2010).

[00142]. Uma vez que os resultados com Siringaldazina foram praticamente a metade do que com ABTS, confirma a possibilidade da produção pelo fungo de lacase“verdadeira” e não outras poli-fenol oxidases (grupo das enzimas que oxidam compostos fenólicos) que podem reagir com ABTS. Cabe ainda ressaltar que alguns fungos podem produzir mais de uma isoenzima e estas podem apresentam preferência por substratos (Bonugli-Santos et al. 2010). Frente aos resultados obtidos o fungo isolado foi selecionado para a continuidade das avaliações.

[00143]. Com o intuito de otimizar o processo de produção das enzimas lignolíticas, assim como conseguir meios de cultura de baixo custo viabilizando economicamente o processo, foram realizadas semeaduras em meios contendo novos nutrientes como açúcar refinado (sacarose) substituindo a dextrose, e a farinha de mandioca, farinha de milho, além de fécula de batata como fontes de amido substituindo a batata, e outros nutrientes. A relação dos meios está na tabela 1 .

Tabela 1 - Meios alternativos

Meios Alternativos

[00144]. Todos os meios de culturas foram complementados com antibióticos (100 mg/L) para impedir os crescimentos de possíveis bactérias gram-positiva e gram-negativas presentes na amostra.

[00145]. Foram introduzidos também 2% de extrato de malte no meio BDA, uma vez que houve crescimento do fungo isolado, mas bem incipiente se comparado ao meio BDA, denominado meio MA. O extrato de malte foi utilizado para atuar como um indutor.

[00146]. Foi introduzido 1 % do bagaço de cana de açúcar também como indutor, no meio contendo água de batata (80%) e açúcar (2%), denominado meio BS + B.

[00147]. Nas placas com o meio BS (meio de batata, açúcar e ágar) e BS + B (meio de batata, açúcar, bagaço e ágar) houve crescimento bem significativo, tal qual nas placas do meio BDA, os quais foram inoculados, respectivamente, no meio liquido BS (50 mL) e no meio liquido BS + B (50 mL). Os extratos enzimáticos centrifugados do meio líquido BS e do meio líquido BS + B do fungo isolado foram avaliados diretamente frente aos substratos específicos para lacase, obtendo-se atividade de 526,39 Ul/L (meio BS) e 1 194,44 Ul/L (meio BS + B) na presença de ABTS, conforme a tabela 2. Podemos observar que o bagaço de cana de açúcar foi um forte indutor, praticamente mais que dobrando a atividade da lacase na presença de ABTS.

[00148]. Outra tentativa de aumentar a produção da lacase pelo fungo isolado foi adicionar ao meio BS + B {água de batata (80%), açúcar (2%) e ágar (2%) e bagaço de cana de açúcar (1 %)} novos nutrientes como 0,5% de peptona e 0,5% de extrato de levedura, denominado meio BS + B + P + EL. Os extratos enzimáticos centrifugados deste novo meio líquido avaliados diretamente frente aos substratos específicos para lacase, obtendo-se atividade de 2043,98 Ul/L na presença de ABTS, conforme a tabela 2. Pode-se observar que com o aumento de nitrogénio fornecido pela peptona e pelo extrato de levedura, dobrou a atividade da lacase na presença de ABTS.

[00149]. Outra otimização realizada foi a retirada da água de batata, o aumento do bagaço de 1 para 2%, o qual pode ser substituído pela lignina, a diminuição da sacarose de 2 para 0,5%, e a diminuição das fontes de nitrogénio como a peptona e o extrato de levedura de 0,5 para 0,2%, com o objetivo de aumentar a produção de lacase com a diminuição de nutrientes. Houve também adição de sulfato de cobre (CUSO4.5H2O) de modo a ficar a 2 ou 5 mM no meio de cultivo, melhorando a produção de lacase, como indutor. O meio otimizado (BS + B + P + EL Otimizado), foi 0 meio de cultura selecionado para prosseguir com os experimentos

[00150]. Após a concentração do extrato bruto, 0 valor obtido foi ainda maior, cerca de dez vezes, para a atividade enzimática da lacase (BS + B + P + EL Concentrado).

Tabela 2 - Resultados do fungo isolado frente aos meios de cultura testados e aos substratos específicos para a Lacase, como 0 ABTS.

[00151]. Reduzir os custos dos nutrientes do meio de cultura é bastante desejável, tornando 0 processo biotecnológico economicamente viável. O bagaço de cana de açúcar tem um baixíssimo custo, e somada a utilização do açúcar (sacarose) em substituição a glicose torna 0 processo fermentativo ainda mais viável economicamente. Formulação de tintura capilar natural

[00152]. Na metodologia desenvolvida, foi substituído o peróxido de hidrogénio pela enzima lacase como agente oxidante, conforme descrição abaixo:

Coloração permanente utilizando a lacase (fungo isolado)

[00153]. São utilizados também dois tipos de produtos:

[00154]. a) uma solução de corante (corantes oxidativos);

[00155]. b) enzima lacase (extrato enzimático do fungo isolado)

[00156]. No momento da coloração misturamos a + b na presença de pH alcalino, utilizando como base amónia ou etanolamina sendo preferencialmente etanolamina (pois mantém o pH alcalino sendo uma base mais suave que a amónia).

[00157]. A coloração dos cabelos vai ocorrer através da polimerização enzimática pela lacase como agente oxidativo, impedindo a saída do “corante polimerizado” durante a lavagem.

[00158]. Os corantes oxidativos utilizados foram os mesmos para coloração permanente de mercado e para os testes de coloração utilizando a lacase como agente de coloração.

[00159]. A coloração foi realizada em pêlo de Yaque, como ilustrado na figura 2, um animal nativo do norte da Europa, cuja pelagem em algumas regiões do corpo é branca.

[00160]. Os testes de coloração capilar foram realizados com os corantes de mercado para a coloração Preto, Castanho Natural, Vermelho e Loiro Natural. Na tabela 3 temos os corantes oxidativos que compõe a formulação de coloração oxidativa para cada tipo de coloração, sempre ordenados da maior para a menor concentração na formulação.

Tabela 3 - Corantes oxidativos que compõe a formulação de coloração oxidativa para cada tipo de coloração.

[00161]. Vale ressaltar que quase todos os corantes oxidativos se repetem nas diversas colorações, com exceção do vermelho, variando somente a sua concentração na formulação.

[00162]. Além dos corantes oxidativos, as formulações para todas as colorações também contêm água, etanolamina, álcool cetoestearílico, laureth-12, propilenoglicol, etc. Esta formulação com os corantes oxidativos, a etanolamina e os demais componentes são envasados em bisnaga fechada, porque o contato com o ar de forma prolongada acaba provocando a oxidação dos mesmos, inviabilizando para as aplicações de coloração capilar. O envase destes corantes oxidativos nas bisnagas é feito em equipamentos especiais sob atmosfera de nitrogénio.

[00163]. Inicialmente os testes de coloração capilar foram realizados com os corantes de mercado somente para visual, e em seguida foram medidos no equipamento Espectrofotômetro, marca Konica Minolta, Modelo CM-5, para comparação entre a coloração obtida com a utilização do extrato enzimático do fungo isolado como agente de coloração e a metodologia tradicional, utilizando meio alcalino e peróxido de hidrogénio, conforme descrito acima.

Testes de Lavagem

[00164]. Como as colorações permanentes de mercado indicam que a coloração resiste até pelo menos 28 lavagens, foram feitos testes com o “ponto zero”, após 7 lavagens, 14 lavagens e 28 lavagens. No“ponto zero” foi realizada somente uma lavagem para retirar o excesso da coloração sem uso de xampu. Já nas demais lavagens foi utilizado xampu para cabelos normais (Johnson’s baby), contendo cocoamidopropil betaína como tensoativo anfótero (betaína), coco-glucosídeo alquil poliglicosídeo (APG) como tensoativo não-iônico e metil 2-sulfolaurato de sódio/ 2- Sulfolaurato dissódico como tensoativo aniônico, também ordenados pela maior concentração no xampu.

[00165]. Foram preparados 8 testes para cada tipo de coloração: 4 testes para a formulação de mercado e 4 testes para a formulação com a lacase. Para cada teste, com a formulação com a lacase (fungo isolado) e com a formulação tradicional (de mercado), foram pesados 1 g do pêlo de Yaque e 1 g da formulação oxidativa para cada tipo de coloração (preta, castanho, vermelho e loiro).

[00166]. Na coloração tradicional (de mercado) foram adicionados a 1 g do pêlo de Yaque e 1 g da formulação com os corantes oxidativos, mais 1 ,5 ml_ da formulação do peróxido de hidrogénio 15%. A formulação do peróxido de hidrogénio 15% também contém além do peróxido, na ordem da maior para a menor concentração: álcool cetoestearílico, estanato de sódio, trideceth-2 carboxiamida MEA, pentasódio pentetato, ácido fosfórico, ceteareth-25, tetrasódio pirofosfao e glicerina. A mecha do pêlo de Yaque foi misturada aos corantes oxidativos e ao peróxido de hidrogénio 15% em pH alcalino e mantido por 25 minutos, tempo indicado pelos fabricantes da coloração permanente de mercado. Após este período foram realizadas 4 lavagens:

[00167]. - sem xampu denominada“ponto zero“;

[00168]. - 7 lavagens com xampu (segundo teste);

[00169]. - 14 lavagens com xampu (terceiro teste);

[00170]. - 28 lavagens com xampu (quarto teste).

[00171]. Na coloração com a lacase (fungo isolado) foram adicionados a 1 g do pêlo Yaque e 1 g da formulação com os corantes oxidativos, mais 10 a 30 ml_ (melhor 10 ml_) do extrato enzimático agitado e deixado por 45 minutos, e verificado a eficiência da coloração. Após este período foram realizadas 4 lavagens, conforme item acima: [00172]. - sem xampu denominada“ponto zero";

[00173]. - 7 lavagens com xampu (segundo teste);

[00174]. - 14 lavagens com xampu (terceiro teste);

[00175]. - 28 lavagens com xampu (quarto teste).

[00176]. Os 4 testes foram realizados para avaliação da perda da cor durante a lavagem, comparando-se com o processo tradicional de coloração permanente.

[00177]. O teste de medição de cor foi realizado no equipamento Espectrofotômetro, marca Konica Minolta, Modelo CM-5, geometria d/8 e abertura de 8 mm. Os testes foram, gentilmente, realizados no laboratório do próprio fornecedor do equipamento (representante Brasil), T&M Instruments.

[00178]. O“STRENGTH: APPARENT {%)" (App. Str%:) é um método para calcular o Poder de Tingimento de um corante ou pigmento. Poder de Tingimento ou Força Tintorial é a habilidade de um corante ou pigmento em absorver luz. Quando a concentração do corante aumenta, a habilidade do material em absorver luz também aumenta. Os cálculos de Poder de Tingimento medem a habilidade relativa de um corante em alterar a cor de um meio (como tecido não tingido, tinta branca, plástico branco, líquidos transparentes, etc.), no caso o pêlo de Yaque. O Poder de Tingimento é expresso em porcentagem, onde 100% indica que o corante em teste tem o mesmo poder tintorial que o corante padrão, < 100% indica que o corante possui poder tintorial mais fraco e > 100% indica que o corante possui poder tintorial mais alto do que o padrão. Foram realizadas medições dentro da mesma série, tendo como padrão os respectivos“ponto zero”.

Estudo do Potencial Reestruturante da Fibra Capilar

[00179]. Foi realizada avaliação de danos causada pela coloração capilar utilizando a lacase como agente oxidante em comparação com a metodologia convencional de mercado, das mechas de coloração Preta no Ponto Zero de ambas as metodologias. Para as colorações com as metodologias de mercado e da enzima foi utilizada a mesma mecha dividida em duas.

[00180]. Foram avaliados por meio da microscopia eletrónica de varredura (MEV), aliada à análise de imagens, os níveis de danos na superfície da fibra capilar submetida aos dois tratamentos de coloração citados acima.

[00181]. Nesta avaliação, mechas de cabelos, fornecidas pela empresa, foram divididas em dois grupos de estudos, como descrito abaixo:

[00182]. - coloração preta processo tradicional ponto zero - grupo

T01 ;

[00183]. - cor preta teste - grupo T02

[00184]. Foram coletados fios de cabelos aleatoriamente para a realização da análise de MEV. A partir dos fios recolhidos, retiraram-se da região central segmentos com 5 mm de comprimento. Utilizando fita adesiva condutora à base de carbono, estes segmentos foram fixados aos porta-amostras do microscópio. As amostras foram recobertas com uma camada condutora de 90 Á de Ouro utilizando-se o equipamento Spulter Balzers SCD-050 Coater. Na obtenção das micrografias, utilizou-se o microscópio eletrónico de varredura ZEISS™ 940-A, a 15 kV. As micrografias obtidas foram submetidas ao software de análise de imagens Scion® for Windows, buscando quantificar as diferenças morfológicas observadas. Para tanto, utilizou-se um algoritmo desenvolvido para padronizar as imagens com relação aos parâmetros de brilho, contraste e intensidade, detectar e quantificar como porcentagem de Pixels brancos as áreas mais claras da imagem, correlacionadas a elevações na superfície, tais como fragmentos e bordas de cutículas levantadas.

Testes de Coloração

[00185]. Os testes de coloração capilar tendo como agente de coloração a lacase (extrato enzimático) do fungo isolado em comparação com a metodologia de mercado, que utiliza o peróxido de hidrogénio como agente oxidativo em pH alcalino foram realizados com as colorações preta, castanha, vermelha e loira.

[00186]. Os testes de coloração capilar foram realizados com os corantes oxidativos de mercado, e medidos no equipamento Espectrofotômetro, marca Konica Minolta, Modelo CM-5. A coloração foi realizada em pêlo de Yaque, cuja textura é muito próxima do cabelo humano, e sendo totalmente branco não sofre os efeitos dos cabelos naturais, que mesmo grisalhos podem ter alguns fios coloridos e interferir na avaliação da tintura. Os coloristas de grandes empresas também utilizam pêlo de Yaque, o qual é citado em muitas literaturas do gênero (Jeon, Jong-Rok et al, 2010). O tempo de coloração tendo como agente oxidativo a lacase (extrato enzimático) do fungo isolado se mostrou eficaz aos 45 minutos. Pelos testes ficou comprovada a viabilidade técnica da lacase (extrato enzimático do fungo isolado) como agente oxidativo de coloração capilar. Os testes de lavagem com a lacase, visualmente não perderam a tonalidade totalmente mesmo com as 28 lavagens, indicando que realmente houve a polimerização dos corantes oxidativos pela enzima no fio capilar. Os testes de lavagem do processo tradicional também indicaram a ocorrência da polimerização, uma vez que as sucessivas lavagens praticamente não perderam a tonalidade totalmente, comprovando a garantia do mercado de resistência até 28 lavagens.

[00187]. Nas figuras 3 e 4 tem-se a comparação entre as lavagens nos processos oxidativos para a lacase e o peróxido de hidrogénio em pH alcalino para as colorações Preta e Loira.

[00188]. Na tintura de cor Preta as colorações das mechas ficaram praticamente idênticas tanto para a tintura de mercado quanto para a enzima. No Loiro, as mechas coloridas pela lacase ficaram com uma coloração mais intensa que a de mercado. Embora não seja perceptível pelas imagens, tanto a coloração Preta quanto o Loira, principalmente este último, com a lacase ficaram bem mais naturais e com brilho do que as utilizadas como controle. O mesmo ocorreu para as demais colorações Castanha e Vermelha. Avaliação por meio da microscopia eletrónica de varredura

[00189]. O objetivo deste teste é avaliar por meio da microscopia eletrónica de varredura, aliada à análise de imagens, os níveis de danos na superfície da fibra capilar submetida aos dois tratamentos de coloração capilar, utilizando a lacase como agente oxidante em comparação com a metodologia convencional de mercado.

[00190]. No presente estudo mechas de cabelos foram divididas em grupos de estudos, como descrito abaixo:

[00191]. - Coloração Preta Processo Tradicional Ponto Zero - grupo

T01 ;

[00192]. - Cor Preta Teste Ponto Zero - grupo T02.

[00193]. Os grupos de estudo T01 e T02 foram estatisticamente comparados entre si utilizando o método do Teste-t de Student, bimodal, não pareado, considerando-se um intervalo de confiança de 95%.

[00194]. Como resultado do teste, o grupo T02 apresentou 10% menos danos superficiais em relação ao grupo T01 .

[00195]. Este resultado é muito interessante, porque comprova a vantagem competitiva da coloração utilizando a lacase como agente oxidativo em relação à coloração convencional de mercado, comprovando que a utilização da enzima não danifica os cabelos, ao contrário da água oxigenada.

Testes de Alisamento

[00196]. Foram utilizadas mechas de cabelo caucasiano com cachos naturais pesando 35 g.

[00197]. O benchmarking utilizado foi um “creme de alisamento” para cabelos naturais contendo o tioglicolato de amónia como agente redutor e o fixador“creme neutralizante” contendo peróxido de hidrogénio como agente oxidante.

[00198]. Foi utilizado este produto como benchmarking por ser identificado como um dos cremes de alisamento mais suaves do mercado, ou seja, que produz menos danos aos cabelos comparados aos da categoria, principalmente com relação aos produtos contendo álcalis na sua composição como ativo principal, como por exemplo hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de lítio, etc. O produto escolhido apresenta ainda um alisamento de longa duração com alta performance.

[00199]. Composição do creme de alisamento, na ordem da maior para a menor concentração: água, tioglicolato de amónia (ativo principal), álcool cetoestearílico, cloreto de behentrimônio, ceteh-2, ditiodiglicolato de amónia, etanolamida, cloreto de cetrimonio, hidróxido de amónia, pentasodio pentetato, perfume/fragrância.

[00200]. Composição do creme neutralizante, na ordem da maior para a menor concentração: água, estearet-2, peróxido de hidrogénio (ativo principal), glicerina, cloreto de behentrimônio, etidronato de tetrasodio, pirofosfato tetrassódico, salicilato de sódio, ácido fosfórico e fragrância.

[00201]. Teste com o kit de mercado (controle)

[00202]. Para os testes de alisamento foi utilizada uma mecha de cabelo caucasiano com cachos naturais pesando cerca de 4,0 g, e foi adicionado o creme de alisamento com o tioglicolato de amónia de forma que cobrisse toda a mecha, conforme indicado no cartucho do creme de alisamento.

[00203]. O procedimento seguido foi o de escova para longa duração e compreende as etapas:

[00204]. - Após aplicação do creme de alisamento foi feita uma pausa de 45 minutos;

[00205]. - Durante este período a mecha foi alisada com um pente e com os dedos;

[00206]. - Após este período a mecha foi lavada de forma abundante para retirar todo o creme contendo o tioglicolato de amónia (agente redutor);

[00207]. - A mecha foi secada com secador de cabelo (escova) e depois aplicada a prancha de chapinha (10 passadas);

[00208]. - Em seguida foi pesado 4,0 g do fixador creme neutralizante contendo peróxido de hidrogénio (agente oxidante) e aplicado de forma a cobrir toda a mecha;

[00209]. - Foi feita uma pausa de 10 minutos após a aplicação do creme contendo peróxido de hidrogénio. Durante este período a mecha foi alisada com um pente e com os dedos;

[00210]. - A mecha foi lavada novamente de forma abundante para retirar todo o creme fixador contendo peróxido de hidrogénio;

[00211]. A mecha foi seca com secador de cabelo.

[00212]. Teste com a enzima protease como agente redutor e a lacase como agente oxidante

[00213]. O procedimento seguido foi o mesmo do teste anterior, ou seja, de escova para longa duração. Foi utilizada uma mecha pesando cerca de 4,0 g e foi adicionado diretamente à mecha 10 a 30 mL da enzima protease (melhor 30 ml). Após aplicação do creme de alisamento foi feita uma pausa de 45 a 55 minutos (melhor 55 minutos) e seguiu-se conforme o procedimento anterior.

[00214]. O fixador creme neutralizante contendo peróxido de hidrogénio foi substituído pela enzima lacase. Foram utilizados de 5 a 15 mL da enzima lacase (melhor 15 mL) e feita uma pausa de 10 a 25 minutos (melhor 25 minutos).

[00215]. Pelo fato das enzimas serem líquidas e adicionadas diretamente na mecha, a mesma teve que ser colocada num pirex para que fosse totalmente coberta pelas enzimas durante os tempos de pausa de 45 a 55 minutos para a protease e de 10 a 25 minutos para a lacase.

[00216]. A protease teve uma boa performance para o alisamento, embora tenha que melhorar as condições de concentração da enzima utilizada e tempo de pausa, para atingir uma performance mais próxima do produto de mercado (Fig. 5). A mecha com a enzima ficou com algumas poucas ondulações, enquanto que a mecha com o produto de mercado ficou totalmente alisada.

[00217]. Já a lacase funcionou como substituto do peróxido de hidrogénio como agente oxidante.

[00218]. Com relação ao sensorial das mechas após o tratamento de alisamento, a mecha tratada com as enzimas ficou com um sensorial muito melhor do que as mechas tratadas com kit de mercado, as quais ficaram mais ásperas e mais difíceis de pentear. Este fato é um indicativo de que o processo natural com as enzimas não danificou a fibra capilar, o que já havia sido demonstrado nos testes de coloração, indicando que as camadas mais externas da cutícula, como a F-Layer (18-MEA) e a epicutícula, e a mais interna como a endocutícula ficaram mais preservadas, assim como a cistina da queratina do córtex, em comparação com as mechas tratadas com o kit de mercado.

[00219]. A protease teve uma boa performance para o alisamento, rompendo a ligação dissulfeto da queratina.

[00220]. A lacase funcionou para a regeneração da ligação de dissulfeto da queratina nas fibras capilares, apresentando uma boa performance como agente oxidante em substituição ao peróxido de hidrogénio.

[00221]. Apesar do kit do produto de mercado apresentar vários ingredientes como catiônicos (cloreto de behentrimônio e cloreto de cetrimônio) entre outros para nutrição capilar, e no creme neutralizante a glicerina para hidratação e também catiônico (cloreto de behentrimônio), o sensorial e a facilidade de pentear das mechas tratadas com as enzimas foram muito superiores aos das mechas tratadas com estes produtos de mercado (controle). Indicando desta forma, que o alisamento natural com as enzimas provocou muito menos danos à fibra capilar do que o produto de mercado, mesmo sendo este o benchmarking mais suave.

Processo de produção de produtos de alto valor de biomassa

Obtenção dos derivados de Lignina

Isolamento da Lignina (Delignização)

[00222]. Para realizar o teste da ligninólise, é realizado inicialmente o isolamento da lignina do bagaço de cana de açúcar, processo também conhecido como delignização (Moubarik et al., 2013).

[00223]. O processo de delignização desenvolvido para o bagaço de cana de açúcar apresenta quatro etapas:

[00224]. A) Preparação do bagaço de cana de açúcar;

[00225]. B) Separação da Hemicelulose;

[00226]. C) Extração da Lignina e eliminação da Celulose;

[00227]. D) Precipitação e obtenção da Lignina após secagem e moagem.

A) Preparação do bagaço de cana de açúcar

[00228]. O bagaço de cana de açúcar foi moído em moinho de facas, e depois submetido ao processo de delignização.

B) Separação da Hemicelulose

[00229]. Neste processo, foram pesados cerca de 20 g do bagaço seco e moído, o qual foi hidratado com 400 mL de água destilada, aquecido sob agitação para 70 ^Q C, e mantido nestas condições por 2 horas em reator de vidro de 1 L.

[00230]. Após este período, o material foi resfriado a temperatura ambiente e filtrado em papel de filtro faixa branca. O material filtrado corresponde à Hemicelulose, e foi reservado para futuros testes, já o material retido voltou para um béquer de 1 L para sofrer nova lavagem com 400 mL de água destilada. Tanto o líquido da primeira filtração quanto a água de lavagem da segunda filtração foram liofilizados para testes posteriores.

C) Extração da Lignina e eliminação da Celulose

[00231]. O bagaço sem a presença da hemicelulose foi transferido para o balão reacional no qual foram adicionados 400 mL de uma solução de NaOH 15% (p/v). O material foi aquecido sob agitação para 98 ^Q C, e mantido nestas condições por 90 minutos. A lignina é solúvel em pH levemente alcalino. Após este período, o material foi resfriado a temperatura ambiente e filtrado. O filtrado, líquido negro, corresponde à lignina, e o resíduo sólido possivelmente à celulose, a qual deve ser descartada.

D) Precipitação e obtenção da Lignina após secagem e moagem

[00232]. Foi adicionado ao líquido negro (lignina) uma solução de H2S04 5N até pH 2,0, no qual ocorreu a precipitação da lignina. A lignina precipitada foi lavada até que a água de lavagem tivesse pH neutro. Após atingir o pH neutro e terminada as lavagens a solução contendo a lignina precipitada foi transferida para tubos Falcon de 50 mL e centrifugados a 6.000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o precipitado contendo a lignina isolada foi seco e moído em moinho de bola. Esta lignina seca e moída será utilizada nos testes de ligninólise.

Testes de Ligninólise

[00233]. O processo de Ligninólise desenvolvido pode ser aplicado tanto para a Lignina do bagaço de cana de açúcar da Biomassa da Indústria Sucro-Alcooleira, quanto para a Lignina Kraft da Biomassa da Indústria de Papel e Celulose.

[00234]. Foram realizados alguns testes iniciais para definir as melhores condições de processo. Foram testados dois processos de Ligninólise em pH diferentes: um em meio ácido (pH entre 4,0 e 5,0) e outro em meio alcalino (pH entre 8,0 e 9,0).

[00235]. Além de testar as condições de pH do meio, foram testadas também as condições de temperatura. Para os dois processos pH ácido e pH alcalino foram testadas as condições de temperatura: Gelo (0°C a 4°C), 37 °C e temperatura ambiente (T.A.).

[00236]. Todas as Biocatálises com a lacase foram acompanhadas por placas de Cromatografia em Camada Delgada (CCD), com gradiente de solventes, a qual além de simples é bem mais acessível. A placa utilizada para CCD foi de Alumina.

[00237]. Foram utilizados padrões Sigma-Aldrich de álcool coniferílico e podofilotoxina, o primeiro sendo um dos monômeros da lignina, e o último uma lignana, os quais serviram como referências para os produtos formados durante o processo de ligninólise, através das comparações de seus respectivos valores de Rfs (“ration to front”).

[00238]. Os padrões acima foram aplicados em placas de alumina, juntamente com as amostras coletadas durante o processo de quebra da Lignina pela lacase produzida pelo fungo isolado, em uma fase móvel de CH2Cl2:MeOH (9:1 ), e revelados em luz UV de 254nm e posteriormente com a solução de anisaldeído (5%) e ácido sulfúrico (5%) em etanol absoluto.

[00239]. Foram retiradas alíquotas para serem analisadas por CCD na presença dos padrões e nas condições citadas acima.

Processo em meio ácido

[00240]. Em três balões de fundo redondo de 50 mL foram adicionados em cada um deles 1 ,5 g de Lignina seca e moída e 0,5 a 30 mL da enzima lacase (melhor 1 a 10%) produzida pelo fungo isolado. Os três balões foram mantidos sob agitação por 24 a 48 hs (melhor 48 hs), nas seguintes condições: um a temperatura ambiente (T.A.), o segundo de 0 a 4 °C (Gelo) e o terceiro a 37 °C.

Processo em meio alcalino

[00241]. Em três balões de fundo redondo de 50 mL foram adicionados em cada um deles 1 ,5 g de Lignina seca e moída, 10 mL de uma solução alcalina de acetato de sódio (pH entre 8,0 e 9,0) e 0,5 a 30 mL da enzima lacase (melhor 1 a 10%) produzida pelo fungo isolado. Os três balões foram mantidos sob agitação por 24 a 48 hs (melhor 48 hs), nas seguintes condições: um a temperatura ambiente (T.A.), o segundo de 0 a 4 °C (Gelo) e o terceiro a 37 °C.

Processo alternativo para obtenção dos derivados da lignina

[00242]. Este processo alternativo é aplicável somente para a lignina do bagaço de cana de açúcar.

[00243]. Este processo consiste em utilizar a ligninólise realizada pela lacase no meio reacional no biorreator. A lacase é produzida para consumir a lignina do bagaço, ou a lignina livre, presentes no meio de cultivo. Após a retirada do extrato enzimático do biorreator, este será centrifugado, filtrado novamente e concentrado. Durante a concentração, os compostos com massa molecular igual ou menor que 10KDa são separados. Este material foi tratado com solventes orgânicos (acetato de etila e metanol) para a extração dos derivados da lignina, conforme as etapas de extração abaixo.

[00244]. Como são obtidos do processo reacional no biorreator, com a temperatura e pH já definidos, não poderão ser realizados testes de variação destes parâmetros.

[00245]. A grande vantagem deste processo, é que a produção da lacase e a ligninólise são efetuadas em uma só etapa, com redução de custo e de tempo, obtendo-se a enzima de interesse e os derivados da lignina.

Etapa de extração

[00246]. Após o término das reações enzimáticas (Ligninólise), os conteúdos dos três balões reacionais foram transferidos para três funis de extração de 125 mL cada, onde foram realizadas as extrações, primeiramente com acetato de etila, e depois com metanol.

Fase acetato de etila

[00247]. Após o término das reações enzimáticas (Ligninólise), os conteúdos dos três balões reacionais foram transferidos para três funis de extração de 125 mL cada. A seguir os balões foram lavados duas vezes com 50 mL de acetato de etila, totalizando 100 mL de acetato de etila, e transferidos para os respectivos funis de extração. Após agitação e separação das fases, a fase inferior foi transferida para os respectivos balões originais, e as fases de acetato de etila de cada balão foram transferidas para um balão de fundo redondo de 100 mL para posterior rota- evaporação.

[00248]. Após a rota-evaporação, o conteúdo de cada balão foi pesado e transferido para uma coluna cromatográfica de vidro contendo sílica para o isolamento dos produtos obtidos, através de gradiente de solventes. Os produtos obtidos serão caracterizados por ressonância magnética de prótons (RMN de ¹ H), ressonância magnética de carbono 13 (RMN de ¹³ C), infravermelho (IV), ponto de fusão, rotação ótica, etc, e em alguns casos difração de raio-X.

Fase metanol

[00249]. Após o término das extrações com acetato de etila, os conteúdos dos três balões reacionais foram transferidos para três funis de extração de 125 mL cada. A seguir os balões foram lavados duas vezes com 50 mL de metanol, totalizando 100 mL de metanol, e transferidos para os respectivos funis de extração. Após agitação e separação das fases, a fase inferior foi descartada, e as fases de metanol de cada balão foram transferidas para um balão de fundo redondo de 100 mL para posterior rota-evaporação.

[00250]. Após a rota-evaporação, o conteúdo de cada balão foi transferido para uma coluna cromatográfica de vidro contendo sílica para o isolamento dos produtos obtidos, através de gradiente de solventes. Os produtos obtidos serão caracterizados por ressonância magnética de prótons (RMN de ¹ H), ressonância magnética de carbono 13 (RMN de ¹³ C), infravermelho (IV), ponto de fusão, rotação ótica, etc, e em alguns casos difração de raio-X.

[00251]. As etapas de extração são idênticas para os três processos descritos acima: processo em meio ácido, processo em meio alcalino e processo alternativo.

[00252]. A figura 5 (a) mostra a lignina após tratamento em meio alcalino (NaOH 15% p/v), filtrada já sem o bagaço (celulose), na figura 5 (b) a foto após a precipitação em pH ácido, e na figura 5 (c) a lignina seca e moída em moinho de bola.

[00253]. A média dos rendimentos nos processos de obtenção da Lignina é de cerca de 29,0 %, até um pouco acima da composição da Lignina da parede celular secundária do bagaço da cana de açúcar, na ordem de 10- 25%, citada na literatura. Com este resultado, pode-se concluir que o processo desenvolvido foi muito bem-sucedido.

[00254]. Na fase Acetato de Etila, o meio com pH ácido obteve maior rendimento em massa na condição Gelo (Tabela 4), já em meio com pH alcalino a condição que obteve maior rendimento em massa foi na temperatura de 37°C (Tabela 5).

[00255]. Tabela 4 - Comparação do rendimento em massa do Lote 120717 (meio ácido) nas condições de temperatura

[00256]. Tabela 5 - Comparação do rendimento em massa do Lote 261017 (meio alcalino) nas condições de temperatura

[00257]. A fase de acetato de etila apresentou uma coloração amarela em todas as condições de temperatura e pH, enquanto a fase metanol apresentou uma coloração vermelha, também em todas as condições de temperatura e pH (Fig. 6). Porém os lotes com pH ácido apresentaram uma coloração mais intensa tanto na fase acetato de etila quanto na fase metanol do que os lotes com pH alcalino.

[00258]. Através da placa de CCD verifica-se que o lote de Lignina dissolvido em metanol e em acetato de etila antes de se submeter ao processo de ligninólise não apresentou nenhum composto (Fig. 7a), e que depois da ligninólise podemos notar os compostos nos lotes nas condições T.A., Gelo e 37 °C na fase de acetato de etila como na figura 7b.

[00259]. Através das análises das placas de CCD pode-se concluir que a enzima lacase obtida do fungo isolado foi eficaz na quebra da lignina, produzindo novos compostos.

[00260]. Estes compostos devem ser inéditos pois na comparação em placa de CCD com alguns padrões Sigma-Aldrich de álcool coniferílico e podofilotoxina, o primeiro sendo um dos monômeros da lignina, e o último uma lignana, não apresentaram os mesmos Rfs (“ration to front”), indicando se tratarem de outros compostos, conforme a figura 8.

[00261]. Foram isolados até o momento 14 novos produtos somente da fase acetato de etila com o pH ácido e 1 1 novos produtos também da fase acetato de etila com o pH alcalino, com diferentes massas moleculares.

[00262]. Em seguida, este processo compreende as etapas de término do isolamento da fase metanol de todas as condições e a caracterização de todos os produtos isolados por ressonância magnética de prótons (RMN de ¹ H), ressonância magnética de carbono 13 (RMN de ¹³ C), infravermelho (IV), ponto de fusão, rotação ótica, etc, e em alguns casos difração de raio- X.

[00263]. O mesmo processo utilizando a enzima lacase produzida pelo fungo isolado do bagaço de cana de açúcar será utilizado para a Ligninólise da Lignina Kraft da indústria de papel e celulose.

[00264]. Após a caracterização os novos compostos obtidos são submetidos a testes farmacológicos, como antitumorais in vitro e anti- inflamatórios para o mercado farmacêutico, e também para aplicações no mercado cosmético.

[00265]. A média dos rendimentos nos processos de obtenção da Lignina foi de 29,0 %, até um pouco acima da composição da Lignina da parede celular secundária do bagaço da cana de açúcar, na ordem de 10-25%, citada na literatura. Com estes resultados podemos concluir que o processo desenvolvido foi muito bem-sucedido. Além disso, o processo desenvolvido permite isolar a Hemicelulose como um subproduto, a qual também será trabalhada posteriormente.

[00266]. Através das análises das placas de CCD podemos concluir que a enzima lacase obtida do fungo isolado foi eficaz na quebra da lignina, produzindo novos compostos.

[00267]. Estes compostos obtidos da Ligninólise devem ser inéditos pois na comparação em placa de CCD com alguns padrões Sigma-Aldrich de álcool coniferílico e podofilotoxina, o primeiro sendo um dos monômeros da lignina, e o último uma lignana, não apresentaram os mesmos Rfs (“ration to front”), indicando se tratarem de outros compostos.

[00268]. Foram isolados até o momento 14 novos produtos somente da fase acetato de etila com o pH ácido e 1 1 novos produtos também da fase acetato de etila com o pH alcalino.

[00269]. A presente invenção apresenta inúmeras vantagens técnicas e económicas quando comparada com o estado da arte, sendo algumas listadas abaixo:

[00270]. - a presente invenção se refere a um agente cosmético de coloração capilar que preserva as fibras capilares e apresenta desempenho superior quando comparado com os produtos atualmente disponíveis tanto para coloração capilar quanto para alisamento dos fios de cabelo;

[00271]. - o uso da enzima isolada/produzida apresenta resultado superior ao alcançado com o uso tradicional de agua oxigenada na tintura capilar por não danificar os fios de cabelo;

[00272]. - a presente invenção proporciona desenvolvimento de novos produtos a partir de resíduos industriais como bagaço da cana de açúcar, trazendo valor agregado ao que seria descartado e ainda baixo custo de produção já que parte de matéria prima sendo resíduo;

[00273]. - a presente invenção apresenta, em sua versão cosmética, sensorial agradável, deixando os cabelos sedosos e naturais.

[00274]. Tendo sido descrito um exemplo de uma concretização preferida da presente invenção, deve ser entendido que o escopo da presente invenção abrange outras variações possíveis do conceito inventivo descrito, sendo limitadas tão somente pelo teor das reivindicações apensas, aí incluídos os possíveis equivalentes.