PROCESSO DE OBTENÇÃO E USOS DE EXTRATOS PEPTIDICOS E POLISACARIDICOS BIOATIVOS DE EXCEDENTE DE LEVEDURA CERVEJEIRA

Domínio técnico da invenção

A presente invenção refere-se a um processo para produção de concentrados peptidicos e polisacaridicos derivados de um autolisado de levedura de cerveja, através de hidrólise enzimática e técnicas de filtração. Os concentrados resultantes do processo, de acordo com a presente invenção, compreendem na sua constituição péptidos, aminoácidos, polissacarideos , com diversas atividades biológicas, como por exemplo anti-hipertensiva, anti-inflamatória, anti ulcerativa, antioxidante, pré-biótica, antimicrobiana, combate à obesidade e que podem ser aplicados nas indústrias alimentar (humana e animal) e farmacêutica.

Antecedentes da Invenção

A levedura do género Saccharomyces é amplamente utilizada na cultura humana, e em particular na produção de bebidas alcoólicas. Constituem um subproduto da indústria cervejeira, após serem utilizadas na fabricação da bebida para a transformação do açúcar em álcool e dióxido de carbono. Este subproduto representa cerca de 2 a 3% da produção total. Com uma produção mundial de aproximadamente 1575 milhões de hectolitros de cerveja por ano, são acumulados 31.5 - 47 milhões de hectolitros de resíduos de levedura (Jaehrig, et al . , 2008) . Grande parte deste subproduto é vendido a baixo preço para a incorporação em rações de animais, ou então, são depositados como desperdícios de produção, ocasionando desta forma sérios problemas ambientais. No entanto, certos componentes celulares, por exemplo, a estrutura da parede celular - polímero de β-glucana - possuem diversas atividades biológicas e, portanto, representam um potencial valor fisiológico.

Estes componentes celulares têm sido referenciados como mediadores da resposta biológica devido a sua capacidade de ativar o sistema imunológico (Miura et al . , 1996) . Deste modo, acredita-se que polímeros de β-glucanas possuam diversas propriedades imunomoduladoras . Estudos in vitro e in vivo revelam que esta atividade estimulatória depende da estrutura, peso molecular e número de ligações (Mantovani, et al . , 2008), exercendo assim, um efeito benéfico contra um grande leque organismos patogénicos para o homem, entre os quais, bactérias, vírus, fungos e infeções parasitárias (Shim, et al . , 2005) . Estes compostos exibem também propriedades hipocolesterolémicas , antioxidantes e anticoagulantes. Recentemente, estudos têm demonstrado atividades anticitotóxicas , antimutagénicas e antitumorais , tornando-os deste modo como promissores candidatos farmacológicos (Mantovani, et al . , 2008) .

Por outro lado, péptidos biologicamente activos possuem um interesse particular para a ciência alimentar e a nutrição, uma vez que têm evidenciado exercerem papéis fisiológicos, destacando-se ações do tipo antihipertensiva, opióide, imunoestimulatória, antioxidante, antimicrobiana, entre outros (Silva e Malcata 2005, Madureira et al, 2007) . Os péptidos, estando escondidos ou inativos na sequência de aminoácidos das proteínas, podem libertar-se ou ser ativados in vivo após a sua digestão gastrointestinal, ou durante o processamento do alimento através da proteólise mediada por enzimas especificas. Um exemplo deste tipo de enzimas é as cardosinas, as quais, se encontram presentes no extrato aquoso de flores de cardo Cynara cardunculus (Lamas et al, 2001) e geralmente utilizadas na produção de queijo. Estudos comprovados demonstram que as caseínas presentes no leite ou em produtos lácteos (p.ex. o queijo), proteínas do soro, ovo e soja, aquando hidrolisados, são fontes importantes desses péptidos.

O significado biológico, bem como o seu impacto na saúde humana e no desenvolvimento de novos ingredientes funcionais, tem sido alvo de intensa investigação. Deste modo, e devido ao alto teor proteico de resíduos de levedura de cerveja, surge uma nova alternativa para o reaproveitamento deste subproduto, através da obtenção de hidrolisados peptídicos de elevado valor nutritivo e funcional .

Estes péptidos podem ser obtidos através de extrato de leveduras, por métodos de autólise, plasmólise e hidrólise, mas a prática mais frequente é a autólise (Kim et al . , 1999) . Neste processo, enzimas hidrolíticas principalmente proteases e nucleases, quebram macromoléculas (proteínas e ácidos nucléicos) e originam produtos solúveis como péptidos, aminoácidos (principalmente glutamato) , nucleótidos e derivados de aminoácidos (Tanguler e Erten, 2007) .

No entanto, a hidrólise recorrendo a novas enzimas com obtenção de extratos com propriedades bioativas de alto valor acrescentado, ainda não foi alvo de estudo. Isto sugere que podem ser usados como uma potencial fonte de péptidos biologicamente ativos. Porém, a produção de um ingrediente de valor acrescentado, por exemplo, ingredientes funcionais, a partir de β-glucanas e de hidrolisados peptídicos procedentes dos resíduos de leveduras, poderia trazer benefícios na indústria cervejeira, como sendo uma fonte adicional de receitas e pela diminuição dos custos de tratamento de resíduos

Sumário da invenção

A presente invenção descreve um processo de obtenção de extratos peptídicos e/ou polisacarídicos caracterizado por compreender os seguintes passos: a) autólise de levedura de cerveja; de preferência a 60- 80°C, durante 3-4 horas em agitação; ainda mais de preferência a 70°C, durante 3 horas em agitação; b) ultrafiltração do autolisado com membrana, de preferência com membrana com poros de 10000 - 20000 Da; ainda mais de 3000 Da; c) hidrólise das fracções obtidas - filtrado e retido - pela acção de pelo menos uma enzima do extrato de flores de Cynara cardunculus, de preferência durante 3 horas; ainda mais de preferência a concentração do extracto da flor de C . Candunculus variar entre l%-5% (v/v), preferencialmente 3% (v/v) ; d) nanofiltração das frações hidrolisadas com membrana; e) concentração de cada uma das frações por osmose inversa, de preferência com membrana com poros de 1000 - 3000 Da.

Numa realização preferencial, o processo de extracção descrito compreender adicionalmente um processo de extração de betaglucanas/polissacarídeos do referido retido da ultrafiltração e/ou a fração inicial de autolisado de levedura serem submetidos adicionalmente. De preferência o processo de extração de betaglucanas/polissacarideos poderá compreender os seguintes passos: a) centrifugar as fracções, de preferencia a 8000 r.p.m 30 min; b) extração com hidróxido de sódio, de preferência a 80°C durante 2 horas; ; c) lavagem das fracções, de preferência com água por centrifugação 4000 G, durante 10 min; d) extração ácida com ácido acético, de preferência 0.5N, 75°C, durante 1 hora; e) lavagem das fracções, de preferência com água por centrifugação 4000 G, durante 10 min; f) secagem das fracções.

Surpreendentemente extractos obtidos pelo método anteriormente descritos possuem atividade inibidora da ACE; efeito sobre Síndrome metabólica; atividade antimicrobiana; atividade pré-biótica; atividade antioxidante; actividade anticancerígena e actividade anti-ulcerativa .

Outro aspecto da presente invenção são os extratos peptidos/polissacarideos obteníveis pelos processos de extracção anteriormente descritos, o uso dos mesmos na indústria alimentar e medicina. Nomeadamente, no tratamento de doenças hipertensiva, doenças infecciosas, doenças gástricas ou neoplasias. Outro aspecto da presente invenção são composições que extractos peptidos/polissacarideos anteriormente descritos e obteníveis pelos processos de obtenção de extratos peptídicos e polisacarídicos anteriormente descritos, nomeadamente composições farmacêuticas e/ou cosméticas.

Outro aspecto da presente invenção são alimentos ou suplementos alimentares ou aditivos alimentares que por compreenderem os extractos peptidos/polissacarideos anteriormente descritos e obteníveis pelos processos de obtenção de extratos peptídicos e polisacarídicos anteriormente descritos.

Descrição geral da invenção

A presente invenção diz respeito a um processo para a obtenção de extratos peptídicos e polisacarídicos, pela autólise, ultrafiltração, e hidrólise pela ação de enzimas presente num extrato aquoso de Cynara cardunculus, de levedura de cerveja.

A concentração de extrato enzimático deve estar compreendida entre 1 e 5 % (v/v) preferencialmente ser de

"39o- .

O processo de obtenção compreende os seguintes passos:

- Autólise de levedura de cerveja a 70 °C durante 4 horas em constante agitação.

- Ultrafiltração do autolisado com membrana de 10000 - 20000 Da, obtendo-se assim duas frações - retido e filtrado, frações ricas em proteínas, péptidos, aminoácidos, vitaminas, polissacarídeos , entre outros constituintes celulares. - Hidrólise das frações - retido e filtrado, com enzimas do extrato de flores de Cynara cardunculus durante 3 horas.

- Nanofiltração das duas frações hidrolisadas com membrana de 1000 - 3000 Da, preferencialmente de 3000, de forma a concentrar os péptidos e aminoácidos.

- Concentração de cada uma das frações por osmose inversa, tendo-se desta forma 4 frações ricas em péptidos, proteínas, aminoácidos, vitaminas, polissacarídeos , entre outros constituintes celulares.

Frações obtidas:

Nano-Retido do Retido da Ultrafiltração (NRet-Ret)- A

Nano-filtrado do Retido da Ultrafiltração (NFil-Ret)-B

Nano-Retido do filtrado da Ultrafiltração (NRet -Fil)- C

Nano-filtrado do filtrado da Ultrafiltração (NFil-Fil)- D

Por outro lado, as frações resultantes do retido da ultrafiltração, assim como a fração inicial de autolisado de levedura foram submetidas a um processo de extração de betaglucanas/polissacarídeos , sendo o processo descrito da seguinte forma:

- Centrifugação das frações 8000 RPM 30 min, de forma a obter resíduo sólido de parede celular

- Extração com hidróxido de sódio, 80°C durante 2 horas. Lavagem com água (centrifugação 4000 g 10 min) .

Extração ácida com ácido acético 0.5N 75°C 1 hora. Lavagem com água (centrifugação 4000 g 10 min) .

- Secagem das frações A presente invenção diz ainda respeito à atividade biológica que estes extratos apresentam como por exemplo inibição da atividade da enzima conversora da angiotensina, antioxidante, anti-ulcerativa, prébiotica, diminuição do ganho de peso corporal e antimicrobiana .

Os referidos extratos poderão ser utilizados: na preparação de um extractos com atividade anti- hipertensiva, ou de preparados com atividade antioxidante, pre-biotica; antimicrobiana

na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de patologias associadas à hipertensão, a condições oxidativas e a neoplasias, ou

na preparação de suplementos e/ou aditivos alimentares humanos e animal.

Ao analisarem-se os extractos obtidos pelo método anteriormente descritos verificou-se que tinham actividades biológicas surpreendentes, tais como: atividade inibidora da ACE; efeito sobre Síndrome metabólica; atividade antimicrobiana; atividade pré-biótica; atividade antioxidante; actividade anticancerígena e actividade anti- ulcerativa .

Atividade antihipertensiva :

Os estudos iniciais demonstraram uma ação inibidora da enzima conversora de angiotensina in vitro dos extratos obtidos, especialmente nos extratos contendo péptidos originários da hidrólise da fração C.

In vivo, houve diminuição da pressão arterial, sobretudo a sistólica, em animais adultos espontaneamente hipertensos. Atividade antimicrobiana e prebiótica

O concentrado peptidico - fração D, apresenta atividade antimicrobiana in vitro para Escherichia coli, Staphylococcus aureus (MRSA) meticilina resistente, Salmonella enteritidis (ATCC 3076) e Listeria innocua (11288 NCTC) .

Relativamente à ação prebiótica sobre

Bifidobacterium lactis Bbl2 e Lactobacillus acidophillus Ki, todas as frações resultantes deste processo possuem atividade potenciadora de crescimento das estirpes anteriormente mencionadas .

Atividade anticancerigena

Dos estudos efetuados respeitantes à atividade anticancerigena, verificou-se que nenhum dos extratos peptidicos apresenta atividade citocida, sendo que apresentam atividade citostática em praticamente todas as linhagens. Os hidrolisados não apresentam toxicidade para as células normais analisadas.

Atividade antiulcerogenica

No estudo da atividade antiulcerogénica in vivo, no modelo de úlcera induzida por etanol absoluto, da fração NF RUF e administradas por gavagem, observou-se uma inibição do índice de lesão ulcerativa, apresentando desta forma atividade antiulcerativa . O tratamento agudo de toma única apresentou efeitos para uma concentração de 800mg/kg _pc

Atividade antioxidante

Todas as frações apresentaram potencial atividade antioxidante, sendo mais evidente na fração C.

Efeito no síndrome metabólico A fração B apresentou diminuição do ganho de peso corporal e ingestão energética nos animais expostos a dieta de cafetaria .

Breve descrição das figuras

A figura 1 - Representação esquemática dos vários passos do processo de obtenção de extratos peptidicos bioativos e polisacaridicos através do aproveitamento de levedura de cerve a .

A presente invenção refere-se a um processo de preparação de péptidos, extratos peptidicos e polisacaridicos bioativos, a partir da autólise de levedura de cerveja, posterior filtração por membranas e hidrólise das frações por ação hidrolitica de cardosinas e enzimas similares. Também ao desenvolvimento e otimização de um processo de filtração, o qual permite obter concentrados proteicos, peptidicos e polisacaridicos com atividades biológicas. Um aspeto da presente invenção é a utilização destes extratos na alimentação humana e animal, e produtos farmacêuticos que apresentem benefícios para a saúde, designadamente no tratamento e/ou prevenção de patologias

Obtenção do Autolisado

A levedura excedente da indústria cervejeira é submetida a um intervalo de temperatura de entre 60 e 80°C, preferencialmente 70°C num tanque com agitação durante 3 - 4 horas, de preferência 3 horas.

Segue processo de filtração seletiva, associada a hidrólise de enzimas existentes no extrato de cardo de acordo com o descrito na figura 1. As condições experimentais de hidrólise são as descritas anteriormente

- 3% durante 3 horas.

Obtenção de hidrolisado e ração de polissacarideos

- Ultrafiltração do autolisado com membrana de 10000 - 20000 Da, obtendo-se assim duas frações - retido e filtrado, frações ricas em proteínas, péptidos, aminoácidos, vitaminas, polissacarídeos , entre outros constituintes celulares.

- Hidrólise das frações - retido e filtrado, com enzimas do extrato de flores de Cynara cardunculus durante 3 horas.

- Nanofiltração das duas frações hidrolisadas com membrana de 1000 - 3000 Da, preferencialmente de 3000, de forma a concentrar os péptidos e aminoácidos.

- Concentração de cada uma das frações por osmose inversa, tendo-se desta forma 4 frações ricas em péptidos, proteínas, aminoácidos, vitaminas, polissacarídeos, entre outros constituintes celulares.

Frações obtidas:

Nano-Retido do Retido da Ultrafiltração (NRet-Ret)- A Nano-filtrado do Retido da Ultrafiltração (NFil-Ret)-B Nano-Retido do filtrado da Ultrafiltração (NRet -Fil)- C Nano-filtrado do filtrado da Ultrafiltração (NFil-Fil)- D

Por outro lado, as frações resultantes do retido da ultrafiltração, assim como a fração inicial de autolisado de levedura foram submetidas a um processo de extração de betaglucanas/polissacarideos , sendo o processo descrito da seguinte forma:

-Centrifugação das fracções, de preferência a 8000 RPM 30 min, de forma a obter resíduo sólido de parede celular

-Extração com hidróxido de sódio, de preferência 80°C durante 2 horas;

-Lavagem das fracções preferência com água por centrifugação 4000 G 10 min;

-Extração ácida com ácido acético, de preferência 0.5 N 75°C 1 hora;

-Lavagem das fracções de preferência com água por centrifugação 4000 G 10 min;

-Secagem das fracções.

Caracterização da fração polisacaridica

Cada uma das frações obtidas foi avaliada estruturalmente pela quantidade e tipos de açúcares, através de uma hidrólise ácida e derivatização da quantidade de resíduos de açúcar convertidos a acetato de alditol e de seguida analisado por GC-FID (Coimbra et al . , 1996) . O tipo de ligações das glucanas foi analisado por espectrometria de massas (MS) (Reis et al . , 2003) .

Ao analisarem-se os extractos obtidos pelo método anteriormente descritos verificou-se que tinham actividades biológicas surpreendentes, tais como: atividade inibidora da ACE; efeito sobre Síndrome metabólica; atividade antimicrobiana; atividade pré-biótica; atividade antioxidante; actividade anticancerígena e actividade anti- ulcerativa . Atividade antihipertensiva - Atividade inibidora da ACE :

O potencial inibidor da ACE dos extratos ricos em biopéptidos foi efetuado através do método de Sentandreu e Toldrá (2006) modificado, que se baseia na hidrólise do substrato fluorescente o-aminobenzoilglicil-p- nitrofenilalanilprolina por ação da ACE. Tal inibição foi avaliada para todos os extratos resultantes da hidrólise.

O composto usado como substrato da ACE foi o Abz-Gly- Phe (NO2) -Pro ( o-aminobenzoilglicil-p- nitrofenilalanilprolina) , o qual foi dissolvido em tampão Tris-HCl a 150 mM e pH 8,3, com cloreto de sódio a 1125 mM, de forma a obter uma concentração final de 0,45 mM de substrato a pH 8,3. Para a realização do ensaio, misturaram-se 160 μΐ, de substrato, com 40 μΐ, de cada uma das amostras para as quais se pretendia determinar a atividade inibitória da ACE, e adicionou-se 2 mU da enzima ACE, dissolvida em glicerol a 50% e preparada numa solução tampão Tris-HCl a 150 mM com 0,1 μΜ de ZnCl ₂ a pH 8,3, numa microplaca de poliestireno preta (Nunc, Denmark) . A reação foi levada a efeito a 37°C durante 30 min. Fizeram-se medidas da fluorescência ao fim de 30 min num fluorimetro FluoSTAR ÓPTIMA (BMG Labtech, Offenburg, Alemanha) (Fig. 2), tendo-se usado o comprimento de onda de excitação de 355 nm e o de emissão de 405 nm. O software utilizado foi Fluostar Control v. 1.32 R2.

A atividade inibitória da ACE foi calculada como a quantidade de proteína solúvel necessária para inibir 50% da enzima (IC ₅₀ ) (em \iq de proteína/mL) . Para ser realizado esse cálculo, foi feito um ajuste não linear dos dados, com o software PRISM v. 4.02 para Windows (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EUA) . A atividade de cada amostra foi determinada em triplicado. Para calcular a atividade inibitória de cada amostra, utilizou-se a seguinte fórmula (3) :

. . , , (Fcontrolo - Fbranco) - (Famoslra - Fbranco amostra)

Actividade imbit—ria=

Fcontrolo - Fbranco

Sendo F _contr oio a Fluorescência emitida pelo grupo o- aminobenzoilglicina através da acção da ACE sobre o substrato fluorescente Abz-Gly-Phe (NO2 ) -Pro sem inibidor, Fbranco a Fluorescência emitida pelo substrato fluorescente Abz-Gly-Phe (N0 ₂ ) -Pro, F _amostr a a Fluorescência emitida pelo grupo o-aminobenzoilglicina através da acção da ACE sobre o substrato fluorescente Abz-Gly-Phe (NO2 ) -Pro na presença de inibidor, e F _branco amostra a Fluorescência emitida pelo substrato fluorescente Abz-Gly-Phe (NO2 ) -Pro na presença de inibidor .

O branco recebeu o mesmo tratamento que as amostras, mas em vez de se adicionar a enzima, adicionou-se água; o controlo positivo foi também submetido ao mesmo tratamento, colocando-se 40 μΐ, de água em vez da amostra.

- Efei to in vivo

Usou-se ratos SHR (espontaneamente hipertensos), machos, jovens adultos (10 semanas de vida, com hipertensão instalada) . Os extratos testados foram administrados aos animais, de forma aguda por gavagem (sonda metálica, oro- gástrica) na dose de 300 mg/kg peso corporal, em dose única . A pressão arterial foi monitorizada por telemetria, com registos dos valores das pressões arteriais sistólica e diastólica ao final de 2h, 4h, 8h e 24h.

Efeito sobre Síndrome Metabólica

Em ensaios crónicos, de exposição crónica a dieta de cafetaria (ração high-fat; D1245 Research Diets; 41% glícidos (m/m) , 24% proteínas (m/m) e 24% lípidos (m/m) ) durante 17 semanas, ad libitum, foram tratados ratos Wistar, jovens adultos (com 13-14 semanas e com 369,8 ± 22,3 g de peso corporal), em 4 grupos de tratamento: animais controlo (dieta padrão; Teklad 2014; 48% glícidos (m/m), 14,3% proteínas (m/m) e 4% lípidos (m/m)), animais expostos ao extrato (300 mg/kg peso corporal por dia), animais expostos a dieta high-fat, e animais expostos a dieta high-fat e a extrato (300 mg/kg por dia) . O extrato foi disponibilizado também ad libitum (tal como a ração), solubilizado na bebida (água) .

Durante o tempo de tratamento foi colhido sangue para prova de tolerância à glicose e à insulina (4 ^a e 10 ^a semana de tratamento) , monitorizada a pressão arterial por tail cuff (2 ^a , 8 ^a e 11 ^a semana de tratamento) e recolhido tecido adiposo, pâncreas, fígado, urina e fezes (no final do tratamento) .

Atividade Antimicrobiana

A atividade inibitória foi inicialmente estudada através de um screening em microplaca a 37 °C durante 24 h, para todas as frações e utilizando quatro estirpes de referencia de patogénicos alimentares (Escherichia coli, Staphylococcus aureus (MRSA) meticilina resistente, Salmonella enteritidis (ATCC 3076) e Listeria innocua (11288 NCTC) . Como controlo positivo colocou-se as diferentes bactérias a crescer em meio Muller Hinton. Foi lida a absorvância num leitor Fluostar óptima ^® a λ=660 nm

Atividade pré-biótica

Estudou-se através de um screening em microplaca a 37 °C durante 48 h para todas as frações obtidas no processo, dissolvidos em MRS broth utilizando duas estirpes de referência probiótica, Lactobacillus acidophilus Ki e Bifidobacterium lactis Bbl2 e um prebiótico de referência, o Fosfooligossacarideo (FOS) integrado como um controlo positivo. Foi lida a absorvância num leitor Fluostar óptima ^® a λ=660 nm.

Atividade antioxidante

O screening da atividade antioxidante foi executada através de método fluorométrico (método ORAC) , tendo sido feitas avaliações para todas as frações obtidas ao longo do processo .

A capacidade de absorção do radical de oxigénio (ORAC - Fluoresceina) foi determinada segundo o método desenvolvido por Ou et al . (2001), adaptado por Dávalos et al . (2004), utilizando um leitor de fluorescência de microplacas, com algumas modificações. Este método, baseia-se na oxidação da fluoresceina pelos radicais peroxilos produzidos in situ por decomposição térmica do 2 , 2 ' -azo-bis- ( 2- metilpropionamidina) dihidrocloro (AAPH) . A oxidação da fluoresceina causa um decréscimo da fluorescência; no entanto, este processo pode ser evitado ou retardado na presença de substâncias antioxidantes. A solução de fluoresceina foi preparada diariamente a uma concentração de 116,66 nM, a partir de uma solução mãe de fluoresceina 1166,1 μΜ em tampão fosfato a 75 mM (pH 7,4) . Como antioxidante de referência, foi utilizado o ácido 6- hidroxi-2, 5, 7, 8-tetrametilcromano-2-carboxílico (Trolox)

(análogo solúvel da vitamina E) , que foi preparado a 0,1 mM em tampão fosfato (solução mãe) . Esta foi diluída por forma a obter diferentes concentrações (0,0002, 0,0004, 0,0006, 0, 0008, 0, 0010, 0, 0012, 0, 0014 e 0,0016 μπιοΐ), para a construção de uma curva de calibração de referência

(Trolox) conforme a seguir se explica. O AAPH foi dissolvido em tampão fosfato até uma concentração final de 46,6 mM.

Para a realização do ensaio, misturaram-se 20 μΐ, da amostra ou tampão fosfato (no caso do controlo) com 120 μΐ, de fluoresceina e 60 μΐ, de AAPH, numa microplaca de poliestireno preta (Nunc) , que foi incubada a 40°C. Fizeram-se 104 medidas da fluorescência durante 137 min num fluorímetro FluoSTAR ÓPTIMA (BMG Labtech) , tendo sido o comprimento de onda de excitação de 485 nm e o de emissão de 520 nm. O software utilizado foi Fluostar Control v. 1.32 R2. Todas as análises foram feitas em triplicado.

As medidas de fluorescência foram normalizadas, tendo por base uma curva de calibração (sem oxidante) . A partir das curvas normalizadas, a área calculou-se da seguinte forma:

AUC= 1+ ∑ fi /fo onde fo é a fluorescência inicial medida ao tempo 0 min e fi é a fluorescência medida num ciclo i. 0 AUC da amostra foi calculado segundo a fórmula:

AUC = AUC antioxidante - AUC controlo

Construiu-se um gráfico de AUC em função da quantidade de oxidante, e calculou-se a regressão linear. 0 valor final de 0RAC-F1 foi expresso como o quociente entre o declive da curva da amostra e a de Trolox (μπιοΐ de equivalentes de Trolox/mg de proteina/péptido) .

Atividade anticancerigena

Foi determinada a atividade anticancerigena para todos os extratos, através da realização da triagem in vitro _r usando as linhagens K562 (leucemia), MCF-7 (mama), NCI-ADR (mama com fenótipo de resistência a múltiplas drogas), UACC-62

(melanoma) , NCI460 (pulmão), PC03 (próstata), HT29 (cólon), OVCAR (ovário) e 786-0 (rim), expostas aos péptidos a testar. Foi também determinada a citotoxicidade dos extratos peptidicos sobre linhagens de células normais VERO

(fígado), V79 ( fibroblasto ) e 3T3 ( fibroblasto ) .

Atividade antiulcerativa .

Foi feita a avaliação clínica e anatomopatológica em ratos (com administração tópica dos péptidos a testar) , com úlceras induzidas por etanol (Robert, 1979) , os quais foram sacrificados por deslocamento cervical, sendo os estômagos retirados, abertos ao longo da maior curvatura e lavados em solução salina, para realização de contagens e avaliação das lesões produzidas. O índice de Lesões Ulcerativas (ILU) foi calculado, de acordo com a metodologia descrita por Gamberini (1991) . Determinação da dose efectiva 50% (DE ₅₀ )

A dose efectiva 50% (DE ₅₀ ) corresponde à dose necessária para produzir inibição de 50% nas lesões observadas, em comparação com o controlo negativo.

Participação das substâncias sulfidrilo na citoprotecção gástrica

Para estudar a possível participação de compostos sulfidrilo na citoprotecção gástrica, utilizou-se o modelo de úlcera induzida por etanol (Robert, 1979) .

Foram utilizados ratos wistar machos, pesando entre 200 e 250 g, divididos em grupos de 6 animais. Após jejum de 16 h, com livre acesso à água, um grupo controlo negativo e os grupos teste receberam tratamentos prévios com uma solução aquosa de N-etilmaleimida (NEM) a 10 mg/kg (2,5 mL/kg _pc ) de peso corpóreo, por via subcutânea, de acordo com a metodologia descrita por Szabo, Trier, Frankel (1981) . O posterior procedimento foi de acordo como realizado para o cálculo do índice de lesões Ulcerativas (ILU) .

Participação de prostaglandinas na citoproteção gástrica

Para estudar a possível participação de prostaglandinas na citoproteção gástrica, utilizou-se o modelo de indução de úlcera por etanol absoluto (Robert, 1979) .

Para tal, foram utilizados ratos wistar machos, pesando cada um entre 200 e 250 g, divididos em grupos de 6 animais. Após jejum de 16 h, o grupo controlo negativo e os grupos teste receberam tratamentos prévios de indometacina, numa dose de 5 mg/kg _pc , em solução aquosa, na forma de 10 mL/kg _pc por via subcutânea, de acordo com a metodologia descrita por Szabo, Trier, Frankel (1981) . O posterior procedimento foi de acordo como realizado para o cálculo do índice de lesões Ulcerativas (ILU) .

Participação do óxido nítrico (NO) na citoproteção gástrica

Para estudar a possível participação do óxido nítrico na citoproteção gástrica, utilizou-se o modelo de úlcera induzida por etanol (Robert, 1979) .

Foram utilizados ratos wistar machos, pesando cada um entre 200 e 250 g, divididos em grupos de 6 animais. Após jejum de 16 h, com livre acesso à água, um grupo controlo negativo e os grupos teste receberam tratamentos prévios com uma solução aquosa de L-Name na dose de 5 mg/kg _pc , por via intraperitoneal , de acordo com a metodologia descrita por Konturek e Pawlink (1986) . O posterior procedimento foi de acordo, como realizado para o cálculo do índice de lesões Ulcerativas (ILU) .

Todos os resultados dos ensaios envolvendo as frações proteicas, relativos à proteção da mucosa gástrica, foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e ao teste de Duncan, para os quais foi utilizado como critério de significância estatística o nível de 5% de probabilidade (p<0, 05) .

As realizações preferenciais acima descritas são obviamente combináveis entre si. As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais da presente invenção .