Verfahren zur oxidativen Spaltung von Vinylaromaten

Die Erfindung betrifft Verfahren zur oxidativen Spaltung von mit aromatischen Ringen konjugierten ethylenischen Doppelbindungen unter Verwendung von Enzymkatalysa- 5 toren.

Milde und selektive Oxidationsmethoden sowie neue ökologische und ökonomische chemische Verfahren sind aufgrund der wirtschaftlichen Gegebenheiten und des höheren Umweltbewusstseins gefragt wie nie zuvor. Die oxidative Spaltung von Alke-

0 nen zu den entsprechenden Aldehyden bzw. Ketonen ist eine häufig verwendete Synthesemethode in der organischen Chemie, (i) um Sauerstoff-Funktionalitäten in Moleküle einzuführen, (ii) um komplexe Moleküle in kleinere Bausteine zu teilen und (iii) um Schutzgruppen zu entfernen. Unter den derzeit verfügbaren Methoden für die chemische oxidative Spaltung von Alkenen wird die reduktive Ozonolyse als die

5 "sauberste" angesehen. Jedoch birgt diese Methode in der Praxis einige Nachteile, wie z.B. die Notwendigkeit der Verwendung spezieller Ausrüstung (Ozonisator), Tieftemperaturtechnik (normalerweise -78 °C) und der zusätzliche Bedarf stöchiometri- scher Mengen an Reduktionsmitteln (z.B. Dimethylsulfid, Zink, Wasserstoff, Phosphi- nen usw.) für die reduktive Aufarbeitung. Zusätzlich sind spezielle Sicherheitsvorkeh-

0 rungen zu treffen, um schweren Unfällen, etwa durch Explosionen, vorzubeugen.

Für andere Methoden unter Verwendung von Metalloxiden als Oxidationsmittel werden (zumindest) stöchiometrische Mengen an Salz oder Peroxiden benötigt. Diese Varianten zeigen jedoch mäßige bis niedrige Chemo-, Regio- und Stereoselektivität.

5 In vielen Fällen ist die überoxidation der intermediär erhaltenen Aldehyde zu den entsprechenden Säuren eine nur schwer zu unterbindende Neben reaktion. So wird etwa die Verwendung von OsO ₄ und NaIO ₄ ^[1] , von OsO ₄ und Oxon ^® (2 KHSO ₅ + KHSO ₄ + K ₂ SO ₄ ) ^[2] , von RuCI ₃ in Kombination mit NaIO ₄ oder Oxon ^{® t3]} , und von Ruthenium-Nanopartikeln mit NaIO ₄ ^[4] beschrieben.

^■ 0

Somit wäre ein Oxidationsverfahren für Alkene wünschenswert, mit dem die obigen Nachteile vermieden werden und in dem vor allem ein nichttoxisches, leicht verfüg-

bares Oxidationsmittel, wie z.B. Sauerstoff, zum Einsatz kommen kann.

Die einzige bekannte chemisch-katalytische Methode, die als Oxidationsmittel molekularen Sauerstoff nutzt, erfordert jedoch wiederum eine Co(ll)-Verbindung als Kata- lysator, ist nur mäßig selektiv und darüber hinaus auf Isoeugenol-Derivate limitiert ^[5] .

Eine mögliche Alternative schien in der Biokatalyse zu liegen. Allerdings werden en- zymatische Alkenspaltungen lediglich unter Verwendung eines Gemischs aus Lipo- xygenasen und Hydroperoxid-Lyasen für wenige, sehr spezifische Substrate be- schrieben ^[6] .

Weiters werden selbige als unerwünschte Nebenreaktionen, d.h. mit Oxidationspro- dukten in analytischen Mengen, für Peroxidase-katalysierte Prozesse beschrieben ^{[7]" [13]} . Bei allen diesen Reaktionen wird freilich kein molekularer Sauerstoff als Oxida- tionsmittel eingesetzt.

Enzymatische Alkenspaltung mit Sauerstoff unter Enzymkatalyse wurde zwar ebenfalls bereits versucht, allerdings lediglich mit bestimmten Mono- und Dioxygenasen als Enzyme und mit Ausbeuten in analytischen Mengen ^[14H17] . Dazu kommt, dass Oxygenasen sehr hohe Substratspezifität aufweisen ^[18]"[29] , so dass nur eine äußerst eingeschränkte Auswahl an Substraten infrage kommt.

Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes und ihre Mitarbeiter hatten vor diesem Hintergrund bereits in früheren Forschungen herausgefunden, dass be- stimmte Arylalkene unter Nutzung von molekularem Sauerstoff als Oxidationsmittel zu den entsprechenden Aldehyden bzw. Ketonen oxidiert werden können, indem Zellen oder Zellextrakte eines bestimmten Pilzes, nämlich von Trametes hirsuta (striegelige Tramete), zugesetzt werden, welche die Oxidation katalysieren ^{[30] [31]} . Es handelte sich dabei somit um eine biokatalysierte Reaktion, wahrscheinlich mittels enzyma- tischer Katalyse, es konnte jedoch nicht geklärt werden, welche(s) Enzym(e) dafür verantwortlich waren.

In Weiterführung dieser Forschungen wurde von den Erfindern nunmehr überraschenderweise herausgefunden, dass bestimmte Peroxidasen und Laccasen, und zwar keineswegs nur solche fungalen Ursprungs, unter spezifischen Bedingungen in der Lage sind, die oxidative Spaltung spezieller ethylenischer Doppelbindungen durch Sauerstoff zu Aldehyden und Ketonen zu katalysieren. Dieses Ergebnis war deshalb überraschend, weil Sauerstoff normalerweise kein (oder, im Fall von Laccasen, zumindest kein bevorzugtes) Substrat für derartige Enzyme darstellt und andererseits die erhaltenen Oxidationsprodukte jene sind, die üblicherweise bei Ozonoly- se-Reaktionen entstehen. Beispielsweise können Peroxidasen eigentlich - wie der

0 Name angibt - nur Peroxid-Bindungen verarbeiten, und Halogenperoxidasen ergeben darüber hinaus nur halogenierte, z.B. chlorierte oder bromierte Oxidationsprodukte.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Verfahrens zur oxidativen Spaltung von mit aromatischen Ringen konjugierten ethylenischen Doppelbindungen, d.h. von gegebenenfalls substituierten Vinylaromaten der nachstehenden Formel (1), welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine oder mehrere Verbindungen der For¬

!0 mel (1) in Gegenwart von molekularem Sauerstoff mit zumindest einem aus Peroxidasen und Laccasen ausgewählten Enzym als Katalysator gemäß nachstehendem allgemeinem Reaktionsschema zu Aldehyden bzw. Ketonen der Formeln (2) und (3) oxidiert wird bzw. werden:

worin n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist, so dass der aromatische Ring in Ortho-, meta- und/oder para-Stellung zur Vinylgruppe mit 0 bis 5 Substituenten R ¹ substitu-

iert sein kann, die gleich oder unterschiedlich sein können und ausgewählt sind aus: a) gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, in denen gegebenenfalls ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch ein Heteroatom, ausgewählt aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, ersetzt sind und die gegebenfalls mit einem oder mehreren Substituenten, ausgewählt aus Ci _-6 -Alkyl- gruppen, Ci _-6 -Alkylengruppen, Ci_6-Alkoxygruppen, Amino-, Ci _-6 -Alkylamino- und Ci- ₆ - Dialkylaminogruppen, Halogenen, Hydroxy, Oxo und Cyano weiter substituiert sind, b) Amino-, d _-6 -Alkylamino- und Ci _-6 -Dialkylaminogruppen, sowie c) Halogenen, Hydroxy und Cyano, wobei zwei beliebige der Substituenten R ¹ zu einem alicyclischen oder aromatischen Ring verbunden sein können, und worin die Substituenten R ² und R ³ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine der unter a), b) und c) beschriebenen Optionen sind, wobei R ² und/oder R ³ jeweils mit einem Substituenten R ¹ zu einem alicyclischen Ring verbunden sein können, wobei in diesem Fall R ² bzw. R ³ jeweils für eine chemische Bindung zwischen dem Kohlenstoffatom der Vinylgruppe, an das sie gebunden sind, und dem Substituenten R ¹ stehen können.

Auf diese Weise wird ein Oxidationsverfahren für die oben genannten Verbindungen bereitgestellt, mit dem das zuvor definierte Ziel erreicht werden kann. Das heißt, Aryl- alkene können unter Verwendung von Sauerstoff, eines allgegenwärtigen, harmlosen Oxidationsmittels, und von speziellen natürlichen Enzymen, die auf biologischem oder biotechnologischem Wege leicht und kostengünstig erhältlich sind, zu den gewünschten Aldehyden und Ketonen, wie z.B. Vanillin, oxidiert werden. Es sind somit weder teure bzw. toxische (Schwermetalle) Katalysatoren noch komplizierte und ebenfalls kostspielige Ausrüstung (Ozonisator, Tieftemperaturkühlsysteme) erforderlich, und es fallen keine aufwändig zu entsorgenden Abfallprodukte an.

In bevorzugten Ausführungsformen wird das zumindest eine Enzym aus fungalen Peroxidasen und Laccasen, Halogenperoxidasen, Lignin-Peroxidasen, Meerrettich- Peroxidase und Rindermilch-Peroxidase, noch bevorzugter aus fungalen Peroxidasen von Coprinus cinereus (struppiger Tintling), aus Laccasen von Coriolus versi-

- A -

color (Schmetterlingstramete), Agaricus bisporus (Zuchtchampignon) und Candida rugosa (einer Hefeart), Laccase von Rhus vernicifera (japanischer Lackbaum), Chlor- peroxidase von Caldariomyces fυmago (einem Fadenpilz) und Bromperoxidasen, z.B. von Streptomyces aureofaciens (einem Bakterium) oder Corallina officinalis (Ko- rallenmoos), insbesondere aus Meerrettich-Peroxidase, aus Peroxidasen von Copri- nus cinereus sowie aus Laccasen von Coriolus versicolor und Agaricus bisporus, ausgewählt. Allgemein können als bevorzugte Peroxidasen jene aus der EC-Klasse 1.11.1.x angegeben werden. Mit den obigen Enzymen sind - unter jeweils optimierten Bedingungen, wie nachstehend erläutert wird - sehr gute Ergebnisse erzielbar.

Das Verfahren wird bevorzugt in einem Puffer durchgeführt, um die Reaktionsbedingungen, insbesondere den pH, während der Oxidation stabil halten zu können. Vorzugsweise erfolgt die Reaktion in Bis-Tris-Puffer, AcetatpufTer, Formiatpuffer oder Phosphatpuffer. Der pH-Wert des Reaktionsgemischs wird vorzugsweise auf 2 bis 7, noch bevorzugter auf 2 bis 4, eingestellt, da in diesen Bereichen die jeweiligen Enzyme ihr Aktivitätsmaximum aufweisen.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird das erfindungsgemäße Verfahren unter unter O ₂ -überdruck durchgeführt, um so die Ausbeuten zu erhöhen. Es wird dabei jedoch nicht einfach das Reaktionsgleichgewicht verschoben, was daran zu erkennen ist, dass manche Enzyme nach Erreichen eines Aktivitätsmaximums bei höheren Drücken wiederum geringere Ausbeuten ergeben. Vorzugsweise wird die Oxidation unter einem unter O ₂ -überdruck von 1 bis 6 bar, vorzugsweise 2 bis 3 bar, durchgeführt. Noch höhere Werte ergeben keine oder kaum zusätzliche Verbesse- rungen, oftmals sogar niedrigere Umsätze, und würden den apparativen Aufwand deutlich erhöhen. In den obigen Druckbereichen ist beispielsweise eine herkömmliche Parr-Apparatur problemlos einsetzbar.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird das Verfahren unter Lichteinwir- kung, d.h. unter Bestrahlung durchgeführt, da so die Ausbeuten, speziell bei Verwendung von Laccasen als Enyzme, um ein Vielfaches gesteigert werden können.

In zusätzlichen bevorzugten Ausführungsformen wird das Verfahren in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemischs durchgeführt, das vorzugsweise aus C-ι-4-Alkanolen, Dimethylsulfoxid, Toluol, Aceton, Dioxan, Tetra- hydrofuran, Dimethylformamid und Gemischen davon ausgewählt wird und vorzugs- 5 weise in einem Anteil von 1 bis 20, noch bevorzugter 5 bis 15, Vol.-% des Reaktions- gemischs enthalten ist.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung somit die Verwendung von fungalen Peroxidasen und Laccasen, fungalen Halogenperoxidasen, bakteriellen Halogenper-

0 oxidasen, Lignin-Peroxidasen, Meerrettich-Peroxidase oder Rindermilch-Peroxidase zur Katalyse der oxidativen Spaltung von mit dem aromatischen Ring konjugierten ethylenischen Doppelbindungen gegebenenfalls substituierter Vinylaromaten mit molekularem Sauerstoff, wobei dieselben Enzyme bevorzugt werden, wie zuvor für das Verfahren des ersten Aspekts der Erfindung beschrieben wurde.

5

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Fig. 1 bis 3 zeigen die änderung des Umsatzes im erfindungsgemäßen Verfahren bei Zusatz verschiedener organischer Lösungsmittel. !0

Die Erfindung wird nun anhand von spezifischen Beispielen detaillierter beschrieben, die lediglich zur Illustration dienen und nicht als Einschränkung aufzufassen sind.

BEISPIELE

.5

Nachdem in Vorversuchen die Reaktivität unterschiedlicher Enzyme als Katalysatoren der Oxidation von Arylalkenen mit molekularem Sauerstoff festgestellt worden war, wurde zunächst das pH-Optimum der einzelnen Enzyme für derartige Reaktionen in einer Modellreaktion mit trans-Anethol als Vinylaromat der Formel (1) ermittelt. 0 Zur Einstellung von pH-Werten von 2 bis 7 wurden bekannte Puffersysteme eingesetzt.

Beispiele 1 bis 16

Oxidation von trans-Anethol bei unterschiedlichem pH

trans-Anethol p-Anisaldehyd Acetaldehyd

Die jeweiligen Enzyme (je 3 mg der durchwegs festen Präparate) wurden in die Wells von "Riplate LV" 5 ml Deep Well Plate (HJ-Bioanalytik GmbH) gefüllt. Danach wurden 900 μl des jeweiligen Puffers und 6 μl (0,04 mmol) trans-Anethol zugesetzt. Die Platten wurden anschließend in aufrechter Position in einen O ₂ -Druckreaktor gestellt.

0 Der Reaktor wurde mit reinem molekularem Sauerstoff gespült, und der Druck wurde auf 2 bar Sauerstoff eingestellt. Nach 24 h bei 170 U/min und 25 ⁰ C wurden die Reaktionsgemische in 2-ml-Eprouvetten übergeführt, und die Wells wurden mit EtOAc (600 μl) nachgewaschen. Diese 600 μf wurden zu den jeweiligen Eprouvetten zugesetzt, um damit auch eine erste Extraktion der wässrigen Reaktionsgemische durch-

5 zuführen. Nach einer zweiten Extraktion mit reinem EtOAc (600 μl) wurden die vereinigten organischen Phasen über Na ₂ SO ₄ getrocknet und mittels GC bezüglich des Umsatzes zu p-Anisaldehyd (4-Methoxybenzaldehyd) analysiert.

Die Puffer zur Einstellung des pH-Werts waren folgende: !0 pH 2 - Trimethylammoniumformiat/Ameisensäure, 20 mM pH 3 - Trimethylammoniumformiat/Ameisensäure, 20 mM pH 4 - Natriumacetat/Essigsäure, 50 mM pH 5 - Natriumacetat/Essigsäure, 50 mM pH 6 - Bis-Tris-Puffer, 50 mM »5 pH 7 - Bis-Tris-Puffer, 50 mM

Die in den jeweiligen Beispielen eingesetzten Enzyme und die bei unterschiedlichen pH-Werten erzielten Umsätze von trans-Anethol zu p-Anisaldehyd sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben. JO

n.b.: nicht bestimmt

Aus dieser Tabelle geht bereits eindeutig die überraschende katalytische Wirkung der getesteten Peroxidasen, Halogenperoxidasen und Laccasen in der obigen Oxida- tionsreaktion hervor. Peroxidasen sind im Vergleich zu Halogenperoxidasen und Laccasen zwar klar reaktiver, jedoch reichen auch die Umsätze mancher anderer Enzyme, insbesondere von Agaricus bisporus-Laccase, durchaus für eine präparative Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens aus, ohne eine der später beschriebenen Optimierungen vornehmen zu müssen.

Als nächstes wurde der Einfluss des Sauerstoffdrucks auf die Wirksamkeit der Enzyme als Biokatalysatoren getestet.

Beispiele 17 bis 31

Oxidation von trans-Anethol bei unterschiedlichem Sauerstoffdruck

Die Reaktion und GC-Messung erfolgte im Wesentlichen wie in den Beispielen 1 bis 16, nur dass der Druck für jedes getestete Enzym zwischen 2 und 6 bar variiert wurde. Aufgrund des zu hohen apparativen Aufwands wurden keine höheren Drücke untersucht. Die Ergebnisse der Tests sind in nachstehender Tabelle 2 angeführt.

Tabelle 2

*) Flüssiges Präparat, von dem 20 μl (anstelle von 3 mg) eingesetzt wurden.

Auffällig ist, dass keine generelle Präferenz für höhere oder niedrigere Drücke feststellbar ist. Die Erwartung, höhere Sauerstoffdrücke würden das Reaktionsgleich- gewicht zur Produktseite verschieben, hat sich somit nicht erfüllt. Vielmehr scheint jedes Enzym nicht nur einen optimalen pH-, sondern auch einen optimalen Druckbereich aufzuweisen.

In weiteren Versuchen wurden die verschiedenen Enzyme mit unterschiedlichen Substraten, d.h. Arylalkenen der Formel (1), unter ansonsten im Wesentlichen gleichen Bedingungen getestet, um Substratspezifitäten ableiten zu können. Die Ausnahme war lediglich die Durchführung der Reaktionen beim zuvor festgestellten pH- Optimum des jeweiligen Enzyms

Beispiele 32 bis 36

Enzymvergleich anhand der Oxidation von trans-Anethol

trans-Anethol p-Anisaldehyd Acetaldehyd

Die Reaktionen, Aufarbeitungen und GC-Messungen erfolgten wie für die Beispiele 1 bis 16 beschrieben (2 bar Sauerstoff) und mit dem jeweils dem pH-Optimum entsprechenden Puffer. Die eingesetzten Enzyme, Puffer, pH-Werte und die Umsätze von trans-Anethol zu p-Anisaldehyd sind in der nachstehenden Tabelle 3 angegeben.

Es zeigte sich erneut klar, dass trans-Anethol mittels Enzymkatalyse in mitunter sehr guter Ausbeute zu p-Anisaldehyd oxidiert werden kann und dass Peroxidasen Lacca- sen klar überlegen sind, obwohl auch Letztere durchaus für präparative Zwecke eingesetzt werden können.

Beispiele 37 bis 40

Enzymvergleich anhand der Oxidation von 4-Aminostyrol

4-Aminostyrol 4-Aminc ibenzalde Formaldehyd

Analog zu den Beispielen 32 bis 36 wurde anstelle von trans-Anethol 4-Aminostyrol mit verschiedenen Enzymen und in unterschiedlichen Puffern zu 4-Aminobenzalde- hyd oxidiert. Zusätzlich wurde bei der Aufarbeitung der pH der wässrigen Phase auf 10 eingestellt, um eine Salzbildung der Aminogruppen zu verhindern. Die Ergebnisse der Versuche sowie der GC-Messungen sind in Tabelle 4 angeführt.

Tabelle 4

Es zeigt sich, dass unter den Versuchsbedingungen von den vier getesteten Enzy- men nur Laccase von Coriolus versicolor die Oxidation von 4-Aminostyrol mit gutem Umsatz katalysieren konnte. Dieser Umstand, sowie die Tatsache, dass dieses Enzym hier mehr als das Doppelte seiner Leistungsfähigkeit im Falle von trans-Anethol entwickelte, belegen eindeutig eine Substratspezifität der Enzyme.

Beispiel 41

Oxidation von 4-Methoxystyrol

4-Methoxystyrol p-Anisaldehyd Formaldehyd

Analog zu Beispiel 32 wurde anstelle von trans-Anethol 4-Methoxystyrol mit der Per- oxidase von Coprinus cinereus, Charge 1 zu p-Anisaldehyd oxidiert. Die Ergebnisse der beiden Versuche sind in Tabelle 5 angeführt.

Tabelle 5

BeiEnzym Puffer pH Umsatz zu spiel Anisaldehyd (%)

32 Peroxidase von Coprinus cinereus, Charge 1 Me ₃ N/HCOOH 2 61

41 Peroxidase von Coprinus cinereus, Charge 1 Me ₃ N/HCOOH 2 3

Dieses Beispiel belegt erneut die Substratspezifität der Enzyme. Die getestete Peroxidase kann offensichtlich die Oxidation der beidseitig substituierten Doppelbindung von trans-Anethol sehr gut katalysieren, die einseitig unsubstituierte von Methoxy- styrol jedoch kaum. Die Substituenten an der Vinylgruppe üben somit einen wesentlichen Einfluss auf die Katalysereaktion aus.

Beispiele 42 und 43

Oxidation von 2-Bromstyrol

2-Bromstyrol 2-Br ombenzald« Formaldehyd

Analog zu den Beispielen 32 und 33 wurde anstelle von trans-Anethol 2-Bromstyrol mit der Peroxidase von Coprinus cinereus, Charge 1 und der Meerrettich-Peroxida- se, Charge 1 , oxidiert, in diesem Fall zu 2-Brombenzaldehyd. Die Ergebnisse der vier Versuche sind in Tabelle 6 angeführt.

Dieses Ergebnis belegt erneut, dass auch die Substituenten am Aromaten einen wesentlichen Einfluss auf die Katalysereaktion ausüben.

Beispiel 44

Oxidation von ω.co-Dimethylstyrol (2-Methyl-1-phenyl-1-propen)

ω,ω-Dimethylstyrol Benzaldehyd Aceton

Analog zu Beispiel 33 wurde anstelle von trans-Anethol ω,ω-Dimethylstyrol mit Meer- rettich-Peroxidase, Charge 1 oxidiert, in diesem Fall zu Benzaldehyd. Die Ergebnisse der beiden Versuche sowie jener von Beispiel 43 sind zu Vergleichzwecken in Tabelle 7 angeführt.

Wiederum wird die Substratspezifität belegt. Die Gegenwart zweier Methylgruppen am ω-Kohlenstoff von Styrol anstatt nur einer und das Fehlen von Substitution am Aromaten wirken sich spürbar auf die Katalyse aus.

Beispiele 45 bis 47

Oxidation von Inden

Inden 2-(Formylmethyl)benzaldehyd

Analog zu den Beispielen 32, 33 und 36 wurde anstelle von trans-Anethol Inden mit der Peroxidase von Coprinus cinereus, Charge 1 , Meerrettich-Peroxidase, Charge 1 , und der Laccase von Coriolus versicolor oxidiert, in diesem Fall zu 2-(Formylmethyl)- benzaldehyd. Die Ergebnisse der sechs Versuche sind in Tabelle 8 angeführt.

Während die beiden Peroxidasen deutlich geringere katalytische Aktivität mit Inden als Substrat zeigen, gibt es bei der (weniger aktiven) Laccase kaum Unterschiede zu trans-Anethol zu beobachten. Jedenfalls wird jedoch belegt, dass auch in zyklischen Strukturen enthaltene ethylenische Doppelbindungen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren oxidierbar sind.

Vergleichsbeispiele 1 und 2

Oxidation der nichtkoniugierten Doppelbindung von 5-o-Tolyl-2-penten

Enzym

5-o-Tolyl-2-penten 3-o-Tolylpropionaldehyd Acetaldehyd

Analog zu den Beispielen 32 und 33 wurde anstelle von trans-Anethol 5-o-Tolyl-2- penten mit der Peroxidase von Coprinus cinereus, Charge 1 und Meerrettich-Peroxi- dase, Charge 1 oxidiert, in diesem Fall zu 3-o-Tolylpropionaldehyd. Die Ergebnisse der beiden Versuche sind in Tabelle 9 angeführt.

Tabelle 9

Diese Ergebnisse zeigen, dass Arylalkene mit nichtkonjugierten Doppelbindungen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht oxidierbar sind. Die Oxidationspro- dukte sind lediglich in analytischen Mengen (< 1 %) zu detektieren.

Beispiele 48 bis 51

Oxidation von trans-Anethol unter unterschiedlichen Lichtverhältnissen

Die Reaktionen und GC-Messungen erfolgten für jedes getestete Enzym in doppelter Ausführung im Wesentlichen wie in den Beispielen 32 bis 36 in den dort angegebenen Puffern für das jeweilige Enzym. Allerdings wurde nun in einer ersten Versuchsreihe eine Lampe (PAR 38 EC Spot, Osram Concentra, 120 W, 230 V, 448) in einem Abstand von 50 cm oberhalb des Reaktors angeordnet, um die Reaktionsgemische während der Oxidation zu beleuchten, während in einer zweiten Versuchsreihe der Reaktor zur Verdunkelung mit einer Aluminiumfolie abgedeckt wurde, die perforiert war, um Sauerstoffaustausch mit der Umgebung zu ermöglichen. Die Ergebnisse der vier besten aller getesteten Enzyme sind in nachstehender Tabelle 10 angeführt.

Tabelle 10

Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Steigerung der katalytischen Aktivität aller vier Enzyme unter Lichteinstrahlung. Dieser Effekt ist bei den beiden Laccasen besonders stark ausgeprägt, da deren Wirksamkeit auf das Acht- bis Neunfache erhöht wurde. So können auch mit den tendenziell weniger aktiven Laccasen sehr gute Umsätze für präparative Zwecke erzielt werden.

Beispiele 52 bis 85

Oxidation von trans-Anethol in Gegenwart verschiedener organischer Lösungsmittel

Analog zu dem für die Beispiele 1 bis 16 beschriebenen Verfahren wurde trans-Anethol mittels Peroxidase von Coprinus cinereus, Charge 1 oder Meerrettich-Peroxida- se, Charge 1 als Katalysator oxidiert. Die so erhaltenen Umsätze zu p-Anisaldehyd von 44 % bzw. 58 % dienten als Blindwerte für nachfolgende Wiederholungen der Verfahren, wobei jedoch jeweils 17 μl eines organischen Lösungsmittels zu den 900 μl des wässrigen Trimethylammoniumformiat/Ameisensäure-Puffers (20 mM) zugesetzt wurden.

Die Ergebnisse sind in nachfolgenden Tabellen 11 und 12 angeführt und in den Fig. 1 und 2 grafisch dargestellt, wobei die waagrechten Linien die Werte der Versuche ohne Lösungsmittel ("Blindwert") angeben.

Tabelle 11

Tabelle 12

DMSO: Dimethylsulfoxid; DMF: Dimethylformamid; Tween 80: Polyoxyethylen(20)sorbitanmonooleat; THF: Tetrahydrofuran

Sämtliche Ergebnisse belegen, dass die Gegenwart eines organischen Lösungsmittels prinzipiell möglich ist, ohne die Oxidationsreaktion gänzlich zu hemmen. Wie aus Tabelle 11 und Fig. 1 zu erkennen ist, reagiert Peroxidase von Coprinus cinereus empfindlicher auf den Lösungsmittelzusatz, da die Umsätze durch die Lösungsmittel

I O - mit Ausnahme von DMSO - durchwegs niedriger ausfallen.

Im Gegensatz dazu führt der Lösungsmittelzusatz bei Meerrettich-Peroxidase als Katalysator in den meisten Fällen zu einer Umsatzerhöhung. Lediglich bei Cyclohexanol und Tween 80 kommt es zu einem Rückgang, und 2-Propanol liefert denselben Wert wie die Blindprobe.

Ohne sich auf eine spezielle Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, dass das Lösungsmittel hier als Lösungsvermittler für die zu oxidierende Verbindung der Formel (1) dient, obwohl nur 1 ,8 Vol.-% Lösungsmittel zum wässrigen Puffer zugesetzt wurden. Um zu überprüfen, ob bei Meerrettich-Peroxidase auch größere Mengen an Lösungsmittel positive Wirkung auf den Umsatz zeigen, wurde eine weitere Testreihe mit zunehmenden Mengen an DMSO, dem einzigen Lösungsmittel, das bei Peroxidase von Coprinus cinereus positive Wirkung gezeigt hatte, durchgeführt.

Beispiele 86 bis 96

Oxidation von trans-Anethol in Gegenwart zunehmender Mengen an DMSO

Analog zu den obigen Beispielen 69 bis 85 wurde trans-Anethol mit Meerrettich-Peroxidase als Katalysator oxidiert, wobei die 900 μl an wässrigem Puffer durch zunehmende Prozentsätze an DMSO ersetzt wurden. In Tabelle 13 ist der beim jeweiligen Gehalt an DMSO erzielte Umsatz angegeben. Die Daten sind in Fig. 3 auch grafisch dargestellt.

Tabelle 13

Es ist ersichtlich, dass Meerrettich-Peroxidase bei einem Gehalt von 40 % DMSO im

Medium etwa genauso aktiv ist wie ohne organisches Lösungsmittel. Bei höheren Konzentrationen fällt die Aktivität rasch ab, und ab 60 % DMSO ist im Wesentlichen keine enzymatische Wirkung mehr feststellbar. Mit 20 bis 30 % DMSO im Medium wurde der Umsatz um etwa 20 % gesteigert. Die besten Ergebnisse, d.h. eine rund 40%ige Umsatzerhöhung, wurden aber mit 5 bis 15 % Lösungsmittel erzielt.

Zur überprüfung, ob diese Wirkung auch bei anderen Reaktionen beobachtbar ist, wurden die folgenden Testreihen zur Herstellung von Vanillin (4-Hydroxy-3-methoxy- benzaldehyd), eines der möglichen, wertvollen Reaktionsprodukte des erfindungsgemäßen Verfahrens, durchgeführt.

Beispiele 97 bis 104

Oxidation von Isoeuqenol in Gegenwart von DMSO

Isoeugenol Vanillin Acetaldehyd

Analog zu den Beispielen 52 bis 85 wurde anstelle von trans-Anethol Isoeugenol (2-Methoxy-4-propen-1-ylphenol) mit Peroxidase von Copήnus cinereus oder Meer- rettich-Peroxidase als Katalysator oxidiert. Der wässrige Puffer wurde dabei durch 10 bis 20 Vol.-% DMSO ersetzt. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 14 angegeben.

Tabelle 14

Es zeigte sich, dass DMSO bei Coprinus c/nereus-Peroxidase in allen getesteten Konzentrationen eine etwa 15-20%ige Umsatzerhöhung bewirkte, während Meerrettich-Peroxidase bei dieser Reaktion kaum (d.h. maximal 5 %) von der Gegenwart von DMSO profitierte.

Beispiele 105 bis 114

Oxidation von Coniferylalkohol in Gegenwart von DMSO

Coniferylalkohol Vanillin Glykolaldehyd

Analog zu den Beispielen 97 bis 104 wurde anstelle von Isoeugenol Coniferylalkohol (4-Hydroxy-3-methoxyzimtalkohol) mit den beiden Enzymen oxidiert, was einen alternativen Syntheseweg zu Vanillin unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitstellt und zusätzlich Glykolaldehyd (Hydroxyacetaldehyd) als Nebenprodukt liefert, der ein nützliches Reagens in der Proteinchemie darstellt. Der wässrige Puffer wurde erneut, in diesem Fall durch 5 bis 20 % DMSO ersetzt. Tabelle 15 ent-

hält die dabei erzielten Ergebnisse.

Tabelle 15

Hier werden mehrere Umstände deutlich erkennbar. Zum einen wurde Coniferylalko- hol mit beiden Enzymen als Katalysator quantitativ zu Vanillin oxidiert, solange kein organisches Lösungsmittel enthalten war. Während zum anderen Meerrettich-Peroxidase 5 % DMSO noch gut vertrug (6 % Verschlechterung) und erst danach deutliche Aktivitätseinbußen (40 bis 70 %) erlitt, fiel Coprinus c/nereus-Peroxidase schon bei 5 % DMSO auf 50 % ihrer Aktivität ab. Bei 15 % DMSO waren bereits rund 90 % der Aktivität verlorengegangen. Diese Ergebnisse beweisen einmal mehr die hohe Spezifität der Enzymkatalysatoren im Verfahren der vorliegenden Erfindung.

Somit wurde die Wirksamkeit der Enzyme im erfindungsgemäßen Verfahren eindeutig belegt. Der einschlägige Fachmann kann anhand der obigen Lehre durch Optimierungsreihen leicht die optimalen Bedingungen bezüglich pH, Druck, Lichteinstrahlung und organischer Lösungsmittel für einzelne, spezielle Enzyme in spezifischen Oxidationsreaktionen ermitteln. Die Erfindung erweitert daher das Gebiet der Bio- katalyse zur Herstellung organischer Verbindungen um einen bedeutenden Beitrag.

Materialien und Bezugsquellen trans-Anethol: Sigma-Aldrich, Cat. 11 ,787-0, Lot.: S16146-283 4-Aminostyrol: Lancaster, 11845, 216-185-8, Batch FA008716 2-Bromstyrol: Sigma-Aldrich, 132683

5 2-Methyl-1-phenyl-1-propen: Sigma-Aldrich, 282510, 13028 BE Inden: Merck-Schuchard, S17014 843, 8.20701.0005 Isoeugenol: Sigma-Aldrich, 117206 Conferylalkohol: Sigma-Aldrich, 223735

0 Peroxidase von Coprinus cinereus, Charge 1 : NovoNordisk A/S, Peroxidase SP 502, Batch PPX 3829

Peroxidase von Coprinus cinereus, Charge 2: Novozymes, 51004, OON00008, (produziert in Asp. oryzae) Peroxidase von Coprinus cinereus, Charge 3: Biesterfeld Chemiehandel GmbH & Co. KG,

5 "Baylase"

Meerrettich-Peroxidase, Charge 1 : Sigma-Aldrich, P2088 Meerrettich-Peroxidase, Charge 2: Sigma-Aldrich, P8250, 031 K74711 Meerrettich-Peroxidase, Charge 3: Sigma-Aldrich, P6140, 051 K7490 Meerrettich-Peroxidase, Charge 4: Roche, POD10108090001 , Lot.: 93350720

!0 Meerrettich-Peroxidase, Charge 5: Sigma-Aldrich, P8125, 031K7465

Meerrettich-Peroxidase, Charge 6: Roche, POD10814407001 , Lot.: 93396221 Lignin-Peroxidase: Fluka, Lot. & Fillingcode 1239384, 32506 171 , 42603 Rindermilch-Peroxidase: Sigma-Aldrich, Lactoperoxidase from bovine milk, L-2005, Lot. 16H38311

!5 Chlorperoxidase von Caldaromyces fumago: Biochemika, 25810

Bromperoxidase from Corallina officinalis: Sigma-Aldrich, B2170, 123K3783

Laccase von Rhus vernicifera: Sigma-Aldrich, L-2157, Lot.: 67H0281

Laccase von Coriolus versicolor. Fluka, 38429, Lot. & Filling code 414571/1 , 43001

Laccase von Candida rugosa: Jülich Fine Chemicals Life Science Technology, Laccase CV,

IO Ord.No. 14.10

Laccase von Agaricus bisporus: Fluka, 40452, Lot. & Filling code 443928/1 42703431 Laccase DeniLite Il Base: Novozymes, OM30402613, Chemical Abtracts Service (CAS) Registry No.: 80498-15-3

Literaturzitate

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