Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekenn¬ zeichneten Gegenstand.

Es ist bekannt, daß sich bestimmte, Pep idbausteine enthaltende Diacylamine zur Synthese von Peptiden eignen. So wurde beispielsweise das N-(ιM ' -Phthaly1-glycyl)-N-diphenylacety1- 4-methylanilin zur Synthese von N-Phthalylglycyl-glycyl- glycin-ethylester verwendet (-J .Am. Chem.Soc . , 8.0, 1958, 4069). Demgegenüber haben die erfindungsgemäßen Diacylamine der Formel IV den Vorzug, daß ihre Herstellung wesentlich weniger aufwendig ist. Zudem liefern sie bei der Umsetzung mit den A inα-Komponenten der allgemeinen Formel V in über¬ raschend hohen Ausbeuten und hoher Reinheit die Peptide der allgemeinen Formel I. Es ist für den Fachmann überraschend, daß man mithilfe der erfindungsgemäßen Diacylamine der allgemeinen Formel IV Peptide synthetisieren kann, denn die diesen Verbindungen en sprechenden in den PhenyIgruppen unsubstituierten Verbindungen (d.h. von Verbindungen der allgemeinen Formel IV mit Y und Z jeweils in der ßedeutung von Wasserstoff) sind zur Peptidsynthese ungeeignet, wie literaturbekanπt ist (Biochemistry 3_, 1966, 2468 ff) und eigene Versuche zeigen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in der Weise durchgeführt, daß man in einem ersten Reaktionsschritt eine Carbonsäure der allgemeinen Formel II mit einem Carbonsäureimidchlorid der allgemeinen Formel III umsetzt. Dieser Reaktioπsschri t wird vorzugsweise in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart von Basen durchgeführt. Geeignete Lösungsmittel sind bei¬ spielsweise niedere Alkohole, wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol, niedere Carbonsäureester, wie Ethylacetat, polare Ether, wie Dioxan, Te ahydro furan , Glykol onomethy1-

ether oder Glykoldi ethylether, Ketαne wie Acetαn, Methy- lethylketαn oder Methylisobutylketon oder dipolare aprotische Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, N-Methylacetamid, Sulfolan oder Hexamethylphosphαrsäuretriamid. Geeignete ösungsmittel sind ferner Gemische der obengenannten Lösungsmittel mit inerten unpolaren Lösungsmitteln, wie chlorierten Kohlen¬ wasserstoffen (Dichlorme han, Trichlormethan oder Tetrachlorethan etc.) oder aromatische Kohlenwassers offe (Benzol, Toluol etc.). Geeignete Basen sind beispielsweise tertiäre A ine, wie Triethylamin, Tributylamin, N-Methylmαrphαlin oder N- Ethylpiperazin, Alkali etallhydroxide wie Natronlauge oder Kalilauge, Alkalimetallcarbona e, wie Natriumcarbαna , Natriu - hydrogencarbonat, Kaliumcarbonat oder Kaliumhydrogencarbonat oder Alkali etallalkoholate, wie Natriu ethylat oder Kaliu - methylat. Dieser erste Reaktionsschritt wird üblicherweise bei einer Reaktionstemperatur von -20° C bis 100° C durchgeführt, wobei eine Temperatur von 0° C bis 30° C bevorzugt angewendet wird .

In der zweiten Stufe des e findungsge äßen Verfahrens werden die erhaltenen Diacylamine der allgemeinen Formel IV mit einem Amin der allgemeinen Formel V umgesetzt. Auch diese Stufe wird vorzugsweise in einem inerten Lösungsmittel durch¬ geführt. Als Lösungsmittel können die gleichen Solventien wie in dem ersten Verfahrensschri t verwendet werden. Die Reaktiαnstemperatur beträgt bei diesem Ve fahrensschritt beispielsweise -20° C bis 100° C, wobei eine Temperatur von -10° C bis 30° C bevorzugt ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Synthese von Peptiden ebenso universell anwendbar, wie die vαrbekannten Verfahren (Houben-Weyl "Methoden der organischen Chemie", Georg Thie e Verlag, Stuttgart SB-Deutschland, Band XV/1 "Synthese von Peptiden" Teil I, 1974 und Band XV/2 "Synthese von Peptiden" Teil II, 1974). Ebenso wie bei den vorbekannten Verfahren ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zweckmäßig,

die Aminogruppen, sowie gegebenenfalls auch vorhandene Hydroxygruppen , Thiogruppen und nicht umzusetzende Car- boxylgruppen der als Ausgangsmaterialien verwendeten Car- bαπsäuren in an sich bekannter Weise zu schützen. Als Carbon¬ säuren, die sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen seien beispielsweise Peptid-Derivate der allgemeinen Formel II a

V-(Am, -Am .Amx)-0H (Ha)

worin

Am. , Am„-..Am maximal 16 Reste einer natürlichen oder

1 ' 2 x synthetischen Aminosäure darstellen und V eine Aminschutz- gruppe, wie zum Beispiel die Benzyloxycarbonylgruppe oder die tert . -Butyloxycarbonylgruppe symbolisiert, genannt.

Als Reste Am, , Am„...Am seien beispielsweise die in Hoppe- Seyler's Z. Physiol. Chem. 348, 1967, 256-261 aufgeführten A inosäurn soweit deren gegebenenfalls vorhandene Hydroxy¬ gruppen, Thiolgruppεn , Aminogruppen und nicht zur Umsetzung bestimmte CarboxyIgruppen durch geeignete Schutzgruppen blockiert sind, genannt.

Bei den A inen der allgemeinen Formel V werden die Car- boxylgruppen und gegebenen alls auch vorhandene Hydroxygruppen und Thiogruppen und nicht zur Umsetzung bestimmte Aminogruppen in an sich bekannter Weise geschützt.

Geeignete Amine sind beispielsweise Peptid-Derivate der

allgemeinen Formel V a

worin

A , ,Am ₉ ...AM die obengenannte Bedeutung besitzen und W eine Carboxylschutzgruppe , wie zum Beispiel niedere Alkαxy- gruppeπ mit maximal 4 Kohlens o fatomen, wie die Methoxygruppe, Ethoxygruppe oder die ert . -Butyloxygruppe oder die Benzyloxy- gruppe oder ein Alkalimetallatom, wie Natrium oder Kalium beziehungsweise ein Trialkylammonium-Kation mit maximal 4 Kohlenstoffatomen pro Alkylgruppe symbolisiert.

Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens benö¬ tigten Carbonsäureimidchloride der allgemeinen Formel III können aus den entsprechend substituierten N-8enzoylanilinen durch Umsetzung mit Chlorierungsmitteln wie Phosphαrpenta- chlorid oder Thionylchlorid hergestellt werden.

Die nachfolgenden Aus ührungsbeispiele dienen zur näheren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

I. Synthese von Carbonsäureimidchloriden ^'

Beispiel 1:

12.0 g N-(2-Nitroben∑αyl)-anilin und 10.0 g Phosphorpentachlorid werden im Rundkolben mit Rückflußkühler gemischt und unter Ausschluß von Feuchtigkeit vorsichtig erwärmt. Beide Substanzen lösen sich unter starker KCl-Eπtwickluπg auf. Die Lösung wird 1 Stunde zum Sieden . erhitzt. Danach wird das Phosphoroxychlorid abdestilliert und das verbleibende braunfarbiαe öl zweimal mit 10 ml wasserfreiem Toluol abgedampft. Dar Rest von Toluol wird danach bei 10 -2 Torr Druck und 8Q°C abgesaugt. Man erhält 12,8 g des N-Phenyl-N-(2-nitro- benzimid) -chlor id als braune Masse. ,

(Literatur: R .A .Abramαvitsch e t . al ., J . Org . Chem . 4.8, 4391 (1983)

Beispiel 2:

22.0 g N-(2-Chlorbeπzoyl)-anilin wird mit 20.0 g Phαsphorpentachlorid gemischt und wie im Beispiel 1 erhitzt. Nach der HCl-Entwicklung wird das Phosphoroxychlorid abdestilliert und das ölige

Benzimidoylc lorid unter 10 ^*" ~ Torr Druck durch Destillation gersiπigt (Siedep. c=. 140°C). Das so erhaltene farblose öl des N-

P _h enyl-N-(2-chlorbenzim ^' id)-chlαrid erstarrt in der Vorlage und schmilzt bei 54° C.

(Literatur: A.W. Chapman, J. Chem. Soc, 2296 (192S)).

Beispiel 3:

23.0 g N-(2,6-Dichlorbeπzoyl)-aniIiπ (erhalten aus 2,6-Dichlorbenzoyl- chlαrϊd und Anilin, Schmelzpunkt. 176-177°) und 18.0 g

P ^' πosphorpentachlorid läßt man zusammen reagieren wie im Beispiel 2.

Das ölige Produkt wird unter 10 ^_:: Torr bei 135°C destilliert.

Man erhält 21.0 g kristallines N-Pheπyl- ^' N-(2,6-dichlorbenzimid) -chlor

Der Schmelzpunkt liegt bei 35°C.

Beispiel 4:

15.0 g N-(2,5-Dichlαri]eπ∑ yl)-anilin wird in 20 ml Thioπylchlorid

4 Stunden lang gekocht, danach der Überschuß an Chiorierungsmitύel abdestilliert und das erπa eπe ölige Produkt wird wie im

Beispiel 3 weiter verarbeitet. Die Ausbeute beträgt 15.0 g N-P _h enyl-

N-( 2, 6-dichlorbenzimid) -chlorid.

II. Darstellung von Diacylaminen

Beispiel 5:

1 mM (= 175 mg) tert-Bu yloxycarbonylglycin (BOC-GlyOH) wird in 2 ml Methanol gelöst und mit M Triäthylamin (0,14 ml) neutralisiert. Die Lösung wird auf 0° C abgekühlt. Dazu tropft man 1,1 mM (286,5 mg) N-Phenyl-N-2-nitrobenz- imid)-chlorid (nach Beispiel 1) in 1 ml Toluol und rührt den Ansatz 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Lösungsmittel werden unter geringem Druck verdampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und nacheinander mit 0,5 n HCl, Wasser, gesättigter NaHC0-.-L ösung und wieder mit Wasser gewaschen, über MgSO. getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Ausbeute: 409,0 mg N-(2-Nitrobenzoyl)- -(N '- tert-butyloxycarbonyl-glyciny1)-anilin als gelber Schaum.

Beispiel 6 :

1 mM (189 mg) tert-Butyloxycarbony1-L-alanin (BQC-L-Ala-OH) wird in 2 ml Essigester und 0,14 ml Triäthylamin gelöst. Nach Abkühlung im Eisbad fügt man 255 mg N-Phenyl-N-(2- chlorbenzimid)-chlorid hinzu und rührt die Lösung bei Raum¬ temperatur 30 Minuten. Danach wird die Lösung mit 0,5 n HCl, Wasser NaHC0,-L ösung und nochmals mit VJasser gewaschen, über MgSO. getrocknet und unter geringem Druck verdampft. Man erhält 400 mg N-(2-Chlorbenzoy1)-N-( '-tert-butyloxy¬ carbony1-L -alanyl)-anilin als weißen Schaum.

Beispiel 7:

1 mM (= 265 mg) N-tert-Butyloxycarbony1-L -phenylalanin

(BQC-L-PheQH) wird in 5 ml Essigester gelöst und mit 1 n K0H neutralisiert. Bei +4° C wird es mit 1 mM (284 mg)

N-Pheny1- -(2, 6-dichlorbenzimid)-chlorid versetzt und 4

Stunden bei Raumtempera ur gerührt, danach die wässrige

Schicht abgetrennt. Die organische Phase wird zunächst mit NaHCO,-Lösung und danach mit Wasser gewaschen, über

Na_S0. getrocknet und im Vakuum eingeengt. Die ölige Verbindung wird in Isopropanol k is allisiert. Ausbeute: 413 mg N-(2,6-

Dichlorbenzoyl)-N-(.. '-tεrt-bufcyloxycarbonyl-L-Phenylalanyl)- anilin vo Schmelzpunkt 154° C.

87/05292

Beispiel 8 :

1 mM (= 175 mg) N-tert-Butylαxycarbαnylglycin wird in 2 ml Aceton gelöst und mit 0,14 ml Triäthylamin neutralisiert. Die Lösung kühlt man im Eisbad. Danach werden 290 mg N-Phenyl- N-(2, 6-dichlorbenzimid)-chlorid hinzugefügt und die Kühlung entfernt. Nach 3 Stunden wird das Aceton im Vakuum zur Trockne eingedampft und das neutrale Produkt wie im Beispiel 5 herausgezogen. Das Produkt wird danach in Toluol kristal¬ lisiert. Ausbeute: 410 mg N-(2 , 6-Dic lα^beπzoyl)-N-(N ^, - tert-butyloxycarbonyl-L -phenylalanyD-anilin vom Schmelzpunkt 109-111° C. III. Darstellung von Peptiden

Beispiel 9:

Zu einer auf 4°C gekühlten Lösung von 1 mM (399 mg) N-(2-N_trobenzoyl}- r.-(80C-GIycyl)-aπilin (erhaltene Substanz nach Beispiel 5) in 5 ml

Aceton fügt man 1 mM (155 mg) Glyciπäthylester-Hydrσchlorid und

0,14 ml Triäthylamin hinzu. Danach wird die Lösung bei Raumtemperatur

1 Stunde gerührt. Man verdampft das Aceton bei geringem Druck.

Die ölige Mischung wird mit 5 ml Benzol behandelt. Die ausgefallenen

Kristalle werden abgesaugt und die Benzollösuπg zu dickem δl eingeengt. Ausbeute: 270 mg ölige 80C-Gly-GIy-0Et; die Substanz enthält noch 15-20 mg N-(2-nitrobenzoyl)-aniIiπ.

Einen reinen Dipeptid-Ester kann man mit Hilfe der folgenden Prozedur darstellen:

a) Das rohe Produkt wird in Äther gelöst und von ungelösten Teilen durch Filtration getrennt, danach der Äther verdampft und die Substanz aus einer Mischung Benzol/Petrolether kristallisiert. So erhält man 215 mg Kristalle, die bei 60°C schmelzen. ^v

b) Das Produkt wird durch Säuleπchrcmatαgraphie auf Silicagel gersinlgt (Laufmittal: Benzol bzw. Benzol :Acetαπ 6:1). Ausbeute: 255 mg reiner 8CC-0ipeptid-cster.

c) Das rohe Produkt wird in 2 ml Aceton gelöst, mit'l ml ]n NaOH

versetzt und 1 Stunde bei 20°C gerührt. Oaπn wird das Aceton verdampft und die wassrige Phase mit Essigester ausgewaschen, danach das

Hydrolysat in Wasser mit Essigester bedeckt und mit 3n Citrosäure

(ph 3) angesäuert. Die organische Phase wird über MgSO^getrocknet und im Vakuum eingedampft. Ausbeute: 198 mg BGC-Gly-Gly-H.

Der Schmelzpunkt liegt bei 125-127°C, Kristalle wurde aus Aceton kristallisiert.

d) Das rohe Produkt wird in 2 ml 1π HCl in Essig gelöst und 45 min. bei 20°C belassen. Dann wird das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und d^r Rückstand aus Äthanol -Äther kristallisiert. Ausbeute: 178 mg H-Gly-Gly-OEt.HCl..--

Beispiel 10: Zu einer auf 4°C gekühlten Lösung von 1 mM (175 mg) BOC-Gly-OH In 5 ml Essigester wird 0,14 ml Triäthylamin und 255 mg des unter Beispiel 2 beschriebenen N-?henyl- -(2-chlorben-zi id)-chlαrid gegeben Nach 4 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird die Lösung wieder abgekühlt. Man gibt 1 mM (353 mg) H-Phe-Phe-OMe.KCl und danach 0,14 ml Triäthylamin hinzu. (Literatur: K. Eisele et al., Z. Phys. Chem.355, 843 (1975)). Die Reaktionsmischung wird ncch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann das ausgefallene Triäthylamiπ-Hydrσchlorid mit wenig Wasser herausgelöst, die Essigesterphase über NaSO^getrockπet und im Vakuum eingeengt. Das BOC-Gly-Phe-Phe-Q.e wird von 2-Chlorbeπzanilid gemäß der ^' Ir. Beispiel 9a-9d beschriebenen Methoden gereinigt. Man erhielt beispiels¬ weise gemäß der in Beispiel 9a oder 9b beschr ebenen Methode 410-430 mg reines Produkt, das bei 153°-155 ^α C schmilzt.

Beispiel 11:

1 mM (165 mg) L-Pheπylalaπin wird in 1π KGH in Methanol gelöst und auf -20°C abgekühlt. Danach fügt man 550 mg (1,3 M) des unter Beispiel 8 beschriebenen aktiven N-3CC-Gly-N-(2,β-dichlorbenzαyl)- aniliπ hinzu und rührt 1 Stunde. Im Anschluß daran wird das Reaktiαnsgemisch 2 Stunden bei Q°C und eine weitere Stunde bei

Raumtemperatur gerührt. Nach dieser Zeit wird das Methanol im Vakuum eingedampft, der Rückstand mit Essigester versetzt und mit Wasser herausgezogen. Die ässrige Phase wird mit 5 ml Essigester bedeckt und mit 3n Citrosä ^' ure auf pH 3 angesäuert. Die Esterphase wird getrennt und über MgSO/getrocknet, dann im Vakuum zu weißem Schaum verdampft. Nach der Kristallisation in Aceton erhält man 202 mg BOC-Gly-1-Phe-OH. das sich bei 135°C zersetzt.