本发明涉及酯的制备， 特别是涉及一种羟基脂肪酸甘油酯的制备方法 。

背景技术

内酯，英文名 latctones,是指在含有羟基的羧酸分子中的羟基� �羧基脱去一分水生 成的环状结构的酯。 常见的内酯为 x=2，3或 4， 分别称为 β -、 γ—或 内酯。 低级 （环 较小） 内酯为具有香味的液体， 可作为食用香料使用 （如表 ）， 易溶于水、 乙醇及乙 醚。

表 1 部分可诈为食 ^香料的内酉 I

内酯的性质与开链羧酸酯相似， 与水 （酸或碱存在下） 、 醇或氨反应， 生成 相应的羟基脂肪酸、 羟基脂肪酸酯或羟基酰胺。 内酯与甘油反应， 可生成相应的 羟基酸 油酯 （包括单酯、 二酯和三酯） 。

羟基酸 油酯可作为食用香料替代相应的内酯应用于食 用香精中， 高温加热 或烘焙时产生相应的内酯， 提高香精的耐温性， 增强香精的厚实逼真感， 改善口 感， 同时羟基脂肪酸 油酯亦有表面活性剂的作用， 改善香精的理化状态。

以 δ-癸内酯和 δ-十二内酯与 i油形成的 5-羟基癸酸 油酯和 5-羟基十二酸甘油酯 为例：

5-羟基癸酸甘油酯 ( Glycetyl 5-hydroxydecanoate )和 5-羟基十二酸甘油酯 （Glyceryl 5-hydroxydodecanoate) 是两种人们最新发现的可食用香料成分， 2007年 4月 11日中华人 们共和国卫生部第 8号公告刚刚被列为食品用香料名单。 国际上也是在 200 !年世界卫生 组织和国际粮农组织联合食品添加剂专家委员 会（JECFA)经过安全性评估可作为香料 使用后为才逐渐被美国食品香料与萃取者协会 (FEMA)、国际食品香料工业组织（K)F1:)、 欧盟食用香料委员会 （FLAVIS) 等相关 构收录。

表 2 5-羟基癸酸甘油酯和 5-羟基十二酸甘油酯代码

5-羟基癸酸甘油酯为淡黄色黏状液体， 溶于乙醇、 - 1†油、植物油， 不溶于水， 常温 下香气较弱， 但高温加热或烘培时会产生 δ-癸内酯， 散发出甜的、 牛奶样的香气。

5-羟基十二酸 油酯为微黄色黏状液体， 溶于乙醇、 甘油、 植物油， 不溶于水， 常 温 T香气较弱， 但高温加热或烘培时会产生 δ-十二内酯， 散发出奶油香味和果香香气。

5-羟基癸酸甘油酯和 5-羟基十二酸甘油酯可作为香料用于奶类香精� ��， 替代目前在 奶类香精中广泛使用的 δ-癸内酯和 δ-十二内酯， 提高香精的耐温性， 同^增强香精的厚 实逼真感， 改善口感。

目前国内外酯类物质的合成主要有化学合成和 生物催化合成两种方法， 而且隨着现 代生物催化技术， 特别是非水相酶催化技术的发展， 同时面对石化资源日益枯竭、 环境 污染不断加剧的形势， 反应条件温和 （常温常压、 中性 ρΗ)、 环境友好和专一性强的生 物催化工艺有逐步取代反应条件苛刻 （高温高压、 强酸强碱）、 重污染和无选择性的传 统酯类合成工艺的趋势。

自从 1990年， fflgrand等报道了 来自于毛霉、 黑曲霉、 假丝酵母、 根霉等的脂 肪酶在有机溶剂中催化合成了 35种短链芳香酯， 底物包括 5种酸（乙酸、丙酸、丁酸、 戊酸、 己酸） 和 7种醇 （甲醇、 乙醇、 丁醇、 戊醇、 己醇、 香茅醇、 香叶醇）， 证明有 机体系中脂肪嗨催化合成芳香酯是一个行之有 效的方法。 非水相脂肪嗨催化合成酯类 香料的研究也越来越多。 在非水相体系中， 利用脂肪酶催化合成酯类香料， 已成为香 料行业的研究热点。非水相介质是酯合成的理 想体系， 在 IgP较高的溶剂中， 利¾醇和 羧酸为底物， 醇与酸酐为底物或者转酯反应， 以特定的脂肪酶为催化剂， 都可以实现 酯的合成。

但以上所有的研究均限于普通短链脂肪酸酯的 研究。 5-羟基癸酸甘'油酯和 5-羟基十 二酸 油酯等羟基脂肪酸甘油酯的非水相生物酶催化 ， 涉及到内酯水解、 转酯反应、 油羟基的空间位阻、羟基酸与—甘油之间羟基 酯化选择性等问题， 难度较普通短链脂肪酸 酯的非水相生物催化大的多。 因此关于生物催化制备羟基脂肪酸首油酯的方 法， 国内外 未见任何报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是： 提供一种羟基脂肪酸甘'油酯的制备方法。

本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解 决：

一种羟基脂肪酸 i油酯的制备方法， 包括如下步骤：

混合步骤： 在酶反应器中加入内酯、 0.5- 10倍内酯物质的量的甘油、 0.05〜10倍内 酯物质的量的水、 0-200倍内酯物质的量的主溶剂、 0〜20倍内酯物质的量的辅助溶剂， 以及 0,01% 5.0%内酯重量的脂肪酶；

反应步骤： 30至 80°C条件下反应， 达到平衡状态后， 获取包含羟基脂肪酸甘油酯 的反应液。

优选的， 所述混合步骤中， 水的用量为内酯物质的量的 0. ^2倍。

优选的， 所述混合步骤中， 所述辅助溶剂的用量为内酯物质的量的 0〜1倍。

优选的， 所述主溶剂包括选自下列群组中的至少一种： 叔丁醇、叔戊醇、 丙酮和离 子液体。

优选的， 所述辅助溶剂 量为所述主溶剂重量的 0〜10%, 包括选自下列群组中的 至少一种： 甲基叔丁基醚、 二甲基亚砜和四氢呋喃。

优选的， 所述内酯包括选自下列群组中的一种： 丁内酯、 戊内酯、 γ-己内酯、 γ- 庚内酯、 γ-辛内酯、 γ-壬内酯、 γ -癸内酯、 γ-十一内酯、 γ-十二内酯、 δ-己内酯、 δ-辛内 酯、 δ-壬内酯、 δ-癸内酯、 δ-十一内酯、 δ-十二内酯、 δ-十:三内酯、 δ-十四内酯和 δ-十 六内酯。

优选的，所述脂肪酶包括选自下列群组中的一 ；来源于猪胰脏、假丝酵母、根霉、 毛霉、 青霉和红曲霉其中之一的游离或固定化脂肪酶 。

优选的， 还包括如下步骤： 分离歩骤： 将所述反应液灭酶、 过滤， 通过常压或减压 蒸馏去除部分易挥发溶剂成分和部分反应底物 ， 然后进行分子蒸馏， 收集含有羟基脂 肪酸 油酯的分子蒸馏组分。

进一歩优选的， 还包括如下步骤： 提纯步骤： 将所述含有羟基脂肪酸†油酯的分子 蒸馏组分， 进行萃取或柱层析纯化， 对萃取液或柱层析洗脱液进行常压或减压蒸馏 ， 以去除萃取溶剂或洗脱溶剂， 获得含有羟基脂肪酸甘油酯的产物。

进一步优选的， 所述萃取溶剂包括选自下列群组中的至少一种 ： 水、 甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯、 丙酮、 氯仿、 二氯甲烷、 环己烷、 正己烷、 石油醚和甲基叔丁基醚； 所述 洗脱溶剂包括选自下列群组中的至少一种： 水、 甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯、 丙酮、 氯仿、 二氯甲烷、 环己烷、 正己烷和正庚烷。

本发明与现有技术相比的有益效果是：本发明 通过选择合适的反应溶剂体系和具有 特异催化性的酶， 以及使内酯和甘油保持适当的摩尔比， 一方面使反应在适当的水分活 度条件下进行， 使酶具有最大的催化活力， 同时避免甘油吸附于酶载体的表面或在酶表 面形成亲水层， 影响酶微环境的水分活度， 保证内酯水解和转酯反应的顺利进行： 另一 方面利用不同反应溶剂体系的溶解性和极性不 同， 改变反应平衡点， 使内酯的水解产物 (羟基酸）更趋向于与—甘油酯化， 降低其自身内酯化的反应趋势， 提高内酯的转酯率和 羟基脂肪酸甘油酯的得率。 采 ¾上述技术方案， 能够制备出羟基脂肪酸 油酯， 与传统 的化学合成技术相比，上述技术方案具有反应 条件温和、节能降耗、反应效率高等优点； 另外， 本发明的合成反应以脂肪酶作为催化剂， 反应的特异性强、无副产物、安全性高, 同时反应没有经过强酸强碱和高温高压过程， 产品的品质也比较高。

附图说明

图 1是本发明实施例 1的产品 I的气相色谱图；

图 2是本发明实施例 2的产品 U的气相色谱图；

图 3是本发明实施例 3的产品 m的气相色谱图。

具侔实施方式

下面对照附图并结合优选的实施铜对本发明作 进一步说明。

本发明公开了生物催化首油和内酯反应制备羟 基脂肪酸甘油酯的方法， 首先， 于 甘油具有较高的亲水性， 为了溶解甘油， 反应体系必须是亲水性溶剂， 但亲水性溶剂往 往容易造成酶的失活， 为了保持酶的稳定性和底物的溶解性之间的平 衡， 本发明中采用 了无有机溶剂或混合溶剂反应体系， 使酶具有持久的催化活力， 其次， 水分活度对于酶 的催化活性和羟基脂肪酸甘油酯的产率影响很 大， 因为反应涉及到内酯的水解， 水作为 反应底物是不可缺少的， 但同时水又是酯化反应产物， 是酯化反应的抑制剂， 虽然最终 的反应结果不会产生水， ¾不会消耗水， 但在反应动态进行过程中， 如何保持合适的含 水量直接决定了羟基脂肪酸甘油酯的产率， 同时， 酶分子的构象主要由静电作用力、 范 德华力、 疏水作 以及氢键等作用构成的一个复杂网络来维持， 水分子直接或间接地参 与这些非共价作用力的形成或维持， 其作用类似于润滑剂或增塑剂， 因此为了使醸在有 机溶剂中也能具有催化活性， 必须在微环境中保持酶与一些 "必需水"的牢固结合， 保 持它在催化反应中的调节作用， 本反应的底物甘油由于含有多羟基， 具有与水争夺酶蛋 白的特点， 容易吸附于酶载体的表面或在嗨表面形成亲水 层， 影响酶微环境。 所以根据 以上特点， 本发明通过选择合适的反应有机溶剂体系和具 有特异催化性的酶， 以及使内 酯和甘 '油保持适当的摩尔比， 特别是保持最佳的水分添加量， 一方面使反应在适当的水 分活度条件下进行， 使酶具有最大的催化活力， 同时避免甘油吸 于酶载体的表面或在 酶表面形成亲水层， 影响酶微环境的水分活度， 保证内酯水解和酯化反应的同步顺利进 行； 另一方面利用不同反应溶剂体系的溶解性和极 性不同， 改变反应平衡点， 使羟基酸 更趋向于与甘油酯化， 降低其自身内酯化的反应趋势， 提高内酯的转酯率和羟基脂肪酸 i油酯的得率。

在一个实施例中， 羟基脂肪酸甘 '油酯的制备方法， 包括如下步骤- 混合步骤： 在酶反应器中加入内酯、 0.5- 10倍内酯物质的量的甘油、 （).05~ 0倍内 酯物质的量的水、 0-200倍内酯物质的量的主溶剂、 0〜20信内酯物质的量的辅助溶剂， 以及 0.01%- 5.0%内酯重量的脂肪酶；

反应步骤； 30至 80Γ条件下反应， 达到平衡状态后， 获取包含羟基脂肪酸甘油酯 的反应液。

其中，所述的主溶剂是指至少能溶解内酯和 油中的一种的有机溶剂，一般为亲水 性溶剂， 可以是叔丁醇、 叔戌醇、 丙酮和离子液体中的一种或多种混合， 所述的辅助 溶剂是指能促进反应底物在主溶剂中的溶解性 ， 又能降低其对脂肪酶的毒害的有机溶 齐 ^ 可以是甲基叔丁基醚、 二甲基亚砜和四氢呋喃中的一种或多种混合， 辅助溶剂^ 量为所述主溶剂重量的 0〜10% _; 反应步骤中， 反应一段时间后可以采用 GC- MS动态 测试反应液， 以确定是否达到反应平衡。 在另一些实施倒中， 可以优选：

水的用量为内酯物质的量的 0J〜2倍。

辅助溶剂的用量为内酯物质的量的 0〜1倍。

本发明选择可以作为香料的内酯作为原料， 与甘油酯化得到的产物可以用作香料， 内酯包括选自下列群组中的一种： γ-丁内酯、 γ-戊内酯、 γ-己内酯、 γ-庚内酯、 γ-辛内 酯、 γ-壬内酯、 γ-癸内酯、 γ-十一内酯、 γ-十二内酯、 δ-己内酯、 δ-辛内酯、 δ-壬内酯、 δ-癸内酯、 δ-十一内酯、 δ-十二内酯、 δ-十三内酯、 δ-十四内酯和 δ-十六内酯。

脂肪醮包括选自下列群组中的一种： 来源干猪胰脏、 假丝酵母、 根霉、 毛霉、 青霉 和红曲霉其中之一的游离或固定化脂肪酶。

还包括分离步骤： 将所述反应液灭酶、过滤， 通过常压或减压蒸權去除部分易挥发 溶剂成分和部分反应底物， 然后进行分子蒸镏， 收集含有羟基脂肪酸甘油酯的分子蒸 馏组分。

还包括提纯步骤：将所述含有羟基脂肪酸 i油酯的分子蒸馏组分，进行萃取或柱层 析纯化， 对萃取液或柱层析洗脱液进行常压或减压蒸馏 ， 以去除萃取溶剂或洗脱溶剂， 获得含有羟基脂肪酸甘油酯的产物。

萃取溶剂包括选自下列群组中的至少一种： 水、 甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯、 丙酮、 氯 仿、 二氯甲烷、 环己烷、 正己烷、 石油醚和甲基叔丁基醚。

柱层析填料为硅胶、凝胶、 大孔吸附树脂、 离子交换纤维素、氧化铝和聚酰胺中的 一种。

洗] S溶剂包括选自 T列群组中的至少一种： 水、 甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯、 丙酮、 氯 仿、 二氯甲烷、 环己烷、 正己烷和正庚烷。

采 分子蒸镏可以使得产物收率提高， 分子蒸馏条件可以是温度 30- 100'Ό , 真空 度为 1- 1000Pa。

以下通过更优选的实施 对本发明进行详细阐述。

实施例 1 :

将 170.250g( lmol)S-癸内酯、920.090 g( lOmol)甘油、 18.016g( lmol)水、 7412.160g lOOmol) 叔丁醇和 7.812g (O.lmol) 二甲基亚砜加入到酶反应器中， 再加入 5g固定 化的假丝酵母脂肪酶， 在 60Ό条件下搅拌反应 24小时， 反应基本达到平衡， 产生 5- 羟基癸酸—甘油酯 （单酯、 二酯）， 剩余未反应的 δ-癸内酯 112,458g (0.66mol), δ-癸内 酯的转酯率达到 34%。

结束反应， 灭酶、 过滤除去脂肪酶， 将反应液进行减压蒸馏除去叔丁醇、 水以及 大部分二甲基亚讽和甘油， 将蒸馏残余部分在温度 50Γ , 真空度 200Pa的条件下进行 分子蒸熘， 甘油、 二曱基亚砜和部分 δ-癸内酯被蒸出， 分子蒸馏剩余部分用环己垸进 行萃取， δ-癸内酯大部分被萃取到环己垸相中， 静置分层， 取 Τ层蒸馏去除少量的环己 烷， 得到最终产品 ΐ 。 将产品进行 GC和 GC- MS分析， 气相色谱图如图 1所示， 其 5- 羟基癸酸 油酯单酯（峰 2) 的含量达到 73,25%, 二酯（峰 3 ) 的含量达到 25,29% (5- 羟基癸酸 油酯含量合计 98.54%)， δ-癸内酯 （峰 1 ) 的含量为 i.36%。

实施例 2:

将 114.140g ( lmol) y-己内酯、 92.090g ( lmol)甘油、 1.802g (O.imol)水和 580.800g

( lOmol) 丙酮加入到酶反应器中， 再加入 0.2g猪胰脂肪醸， 在 50Γ条件下搅拌反应 96小时， 反应基本达到平衡， 产生 4-羟基己酸甘油酯（单酯、 二酯、 三酯）， 剩余未反 应的 γ-己内酯 5 i.07:! g (0.45mol), γ-己内酯的转酯率达到 55%。

结束反应， 灭酶、 过滤除去脂肪酶， 将反应液进行常压和减压蒸馏除去丙酮、 水、 部分 γ-己内酯和首油，将蒸熘残余部分在温度 80Ό ,真空度 201¾的条件下进行分子蒸 镏， 油、 γ-己内酯和 4- 基己酸首油酯被蒸出， 将蒸出部分进行硅胶柱层析， 用不 同比例的正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水混合溶剂进 行分步洗脱， 选择含有 4-羟基己酸甘'油 酯的洗脱液， 蒸熘除去洗脱溶剂， 得到最终产品 II。 将产品进行 GC和 GC- MS分析， 其气相色谱图如图 2所示， 其 4-羟基己酸甘'油酯单酯 （峰 2) 的含量达到 71,13%, 二 酯 (峰 3) 的含量达到 20.91%， ―；三酯的含量 (峰 4)达到 7.32% (4-羟基己酸首油酯含 量合计 99.36%), γ-己内酯 (峰 1 ) 的含量为 0,59%。

实施例 3:

将 198.31 Og Π mol ) δ-十二内酯、 184.180g (2raoi )甘'油、 3.6()3g ( 2mol )水、 2841.800g ( lOmol) 离子液体 1-丁基- 3-甲基咪唑六氟磯酸盐 (BM1MPF6) 加入到酶反应器中， 再加入 lg固定化的根霉脂肪酶，在 40Ό条件下搅拌反应 48小时， 反应基本达到平衡， 产生 5-羟基十二酸甘 '油酯（单酯、二酯），剩余未反应的 δ-十二内酯 102.586g(0.52mo! ), δ-癸内酯的转酯率达到 48%。

结束反应， 灭醮、 过滤除去脂肪酶， 将反应液进行减压蒸镏除去水以及大部分甘 油， 将蒸馏残余部分在温度 90Ό , 真空度 2: ¾的条件下进行分子蒸馏， 甘油、 δ-十二 内酯和 5-羟基十二酸甘油酯被蒸出， 将蒸出部分进行珪胶柱层析， 用不同比飼的正己 烷-丙酮-氯仿-乙酸乙酯-乙醇-水混合溶剂进行� ��步洗脱，选择含有 5-羟基十二酸甘油酯 的洗脱液， 蒸馏除去洗脱溶剂， 得到最终产品 III。 将产品进行 GC和 GC- MS分析， 其 气相色谱图如图 3所示， 其 5羟基十二酸†油酯单酯 （峰 2) 的含量达到 81.83%， 二 酯（峰 3 )的含量达到 16.74% (5-羟基十二酸甘油酯含量合计 98.57%), δ-十二内酯（峰 1 ) 的含量为 1.27%。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明 所作的迸一歩详细说明， 不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本 发明所属技术领域的普通技术人员来说， 在不] S离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 而 ϋ性能或 ^途相 同， 都应当视为属于本发明的保护范围。