Die Erfindung betrifft die Verwendung von umgekehrten Mi¬ zellen und Mi-kroemulsicnen aus Wasser in Oel als Abgabesystem von Arzneimitteln und Verbindungen für den kosmetischen Gebrauch und ins¬ besondere eine neue Vorbe__eitung__τethode einer Lösung, die Stoffe mit p__a__mazeutischer oder kosmetischer Wirkung enthält. Insbesondere han¬ delt es sich um eine Kohlenwasserstoff- oder organische Lösung , die umgekehrte Mizellen enthält ,, die befähigt sind , im Innern der wässrigen Mikrophase hydrophile Substanzen, die pharmako logisch aktiv sind , zu lösen. Die Erfindung ist hauptsächlich dadurch charak¬ terisiert , dass der aktive Stoff gleichartig in einer öligen Lösung solubilisiert wird (z . B. Isopropylpalmitat , Mygliol oder natürliche ölige Substanzen , oder essentiel¬ le Oele, oder natürliche Terpene oder Kohlenwasserstoffe wie Squalan, Squalen und Derivate) .

Es ist bekannt, dass einige Tenside- stabile spherische Aggregate in apolaren Lösungen bilden können. Die polaren Köpfe des Tensids weisen in diesen Aggregaten nach innen; es entsteht somit ein polarer Kern, der sei- nerseits Wasser solubilisieren kann. Im Innern dieser

wässrigen Mikrophase, deren Grosse.zwischen 10-200 Ä liegt, können hydrophile Stoffe solubilisiert werden. Es bilden sich auf diese Weise thermodyna isch stabile und klare Lösungen. Die chemischen und physikalischen Eigen- schaften solcher Aggregate wurden von Autoren wie Fendler, Menger, Eicke in den letzten 10 Jahren ausführlich unter¬ sucht; siehe J.H. Fendler, "Membrane mimetic chemistry", John Wiley and Sons, N.Y. 1982; F.M. Menger et al., J. Amer. Chem. Soc. 9_[, 286 (1983) ; H.F. Heicke und J. Rehak, Helv. Chi . Acta 5_9, 2883 (1976) ; H.F. Heicke

Topics Curr. Chem., %__, 85 (1980). Für eine detaillierte Beschreibung empfehlen wir das Buch "Reverse Micelles" Plenum Press 1984, New York, herausgegeben von P.L. Luisi und B. Straub. Es gibt dagegen wenige pharmazeutische Anwendungen mit Ausnahme von der Anwendung für die Vorbe¬ reitung von "Nanokapseln", wie von Speiser in Zürich vor¬ geschlagen; siehe: P.P. Speiser, in "Applied Biology and Therapeutics" 6_, Lingle und Breimer editors, Elsevier, N.Y. 1983. Das wichtigste Kennzeichen dieses Systems be¬ steht darin, dass die hydrophilen Moleküle, inbegriffen Enzyme, Nukleinsäure und Polysaccharide, in Kohlenwasser¬ stofflösungen solubilisiert werden können. Die in Koh¬ lenwasserstoff gelösten Enzyme können mit Hilfe der umge- kehrten Mizellen ihre Aktivität nicht verlieren; siehe P.L. Luisi und R. Wolf, "Solution behaviour of surfactans" vol. 12, Mittel and Fendler eds., Plenum Press 1982.

Das am meisten untersuchte System mit biologi¬ schen Substanzen ist aus Isooctan/AO /Wasser gebildet. AOT ist die Abkürzung für das wohlbekannte biαkαrςpatabile Tensid, Natrium-l,2-bis (2-Ethylhexyloxycarbonyl) -1- ethansulfonat.

Das organische Lösungsmittel, das bis jetzt zur

Solubilisierung von Proteinen oder Peptiden in mizellaren umgekehrten Lösungen verwendet wurde, ist mit wenigen Ausnahmen ein Kohlenwasserstoff von niedrigem Molekular¬ gewicht und, als solcher, nicht ideal für eine direkte pharmazeutische Anwendung.

In diesem Verfahren wird beschrieben, wie Lö¬ sungen oder Gele von Arzneimitteln oder Verbindungen, die eine kosmetische Aktivität aufweisen können, mittels bio¬ kompatiblen Lösungsmitteln wie Squalan, Miglyol, Estern von Palmitinsäure (insbesondere Isopropylpalmitat) , Pflan¬ zenöle, Vaselinöl, hergestellt werden. Das Tensid AOT wird für mehrere in dieser Erfindung angegebene Beispiele verwendet. Das Verfahren kann auf jeden Fall auch auf andere Tenside erweitert werden, wie in den Beispielen und in den Ansprüchen dieser Erfindung gezeigt wird. Wir haben feststellen können, dass erstaun¬ licherweise mizellare Lösungen solcher Systeme bis jetzt in der Literatur nicht beschrieben wurden. Diese sind thermodynamisch stabil und können wertvolle Anteile von Verbindungen, die eine pharmakologische und kosmetische Wirkung haben, enthalten. Diese Erfindung beschäftigt sich insbesondere mit Verwendungen dieses Systems. Sie erleichtern: i) Die gastrointestinale Absorption von Arzneimitteln ii) Die transdermische Absorption iii) Die kosmetische Anwendung.

Die Arzneimittel- oder Kosmetikakonzentrationen in den mizellaren Lösungen können spektrophotometrisch bestimmt werden (UV oder ORD) . Es können auch chro ato- graphische (z.B. HPLC) oder elektrophoretische Methoden angewendet werden.

Im Falle der Enzyme kann die Konzentration auf eine einfache Weise aus ihrer Aktivität berechnet werden.

die auf ähnliche Weise für wässrige Lösungen bestimmt wird; siehe P.L. Luisi und R. Wolf, "Solution behaviour of surfactans" vol. 12, Mittel and Fendler eds., Plenum Press 1982. Sollte es notwendig sein, die pharmakologische

Aktivität abzuschätzen (z.B. im Falle von Hormonen) , kann das Arzneimittel einfach von der mizellaren in eine wäss¬ rige Lösung mittels "Backward Transfer" Methode versetzt werden; siehe P.L. Luisi et al. in "Topics in Pharmaceu- tical Science", Breimer and Speiser eds. Elsevier (1983). Das Urogastron (human Epidermal Growth Factor, hEGF) ist ein Hormon mit neuer Epitel-bildender Aktivi¬ tät, das die saure Magenabsonderung hemmen kann; siehe R. Hori et al. Chem. Pharm. Bull. 2__, 1974 (1977) ; R. Hori et al. Japan Kokai, 7_6, 95 (1975) . Dank dieser Eigenschaften stellt das hEGF ein gutes Mittel gegen Ge¬ schüre dar. Man hat festgestellt, dass mit der Zugabe von Olivenöl oder einem Glycerol-Derivat die gastroin- testinale Absorption zunimmt. Andererseits ist es be- kannt, dass einige Tenside die Geschwindigkeit der Ab¬ sorption beschleunigen können; siehe G. Levy et al. J. Pharm. Sei., _55, 394 (1966). Die umgekehrten Mizellen (oft auch Mikroemulsionen Wasser/Oel benannt) stellen den idealen Träger für diese Hormone dar. Das Urogastron ist in einfacher Weise in der wässrigen Mikrophase eingegliedert und kann aus dem or¬ ganischen Lösungsmittel diffundieren.

Der bedeutendste Vorteil dieses Systems besteht in der Tatsache, dass der teuere biologische Stoff, in unserem Fall Urogastron, nicht verloren geht, weil das Hormon nur im Wasser im Innern der invertierten Mizellen Platz findet.

Die Herstellung der mizellaren Lösungen, die

Urogastron oder seine Bruchteile, oder das durch kovalente Bindung mit Methoxypolyethylenglykol (PEG) modifizierte Hormon enthalten, verfolgt das klassische Verfahren zur Vorbereitung izellarer Lösungen; siehe: P.L. Luisi und R. Wolf, "Solution behaviour of surf ctans" vol. 12, Mittel and Fendler eds., Plenum Press 1982. Das Tensid (z.B. AOT) wird im Lösungsmittel gelöst, so dass eine Tensidlösung zwischen 50 mM und 300 mM entsteht. Die Auflösung geschieht bei Raumtemperatur und ohne Sonifi- zierung. Zu dieser organischen Lösung kann man die wäss- rige Lösung des Biopolymers zugeben; z.B. 1 ml einer ge¬ pufferten Lösung von Urogastron (Phosphat 50 mM pH 7.0) werden zu 100 ml der vorherigen organischen AOT-Lösung zugefügt. Der Anteil von Wasser im System kann auf jeden Fall zwischen 0 bis 30%, insbesondere zwischen 0,03% bis 3% (v:v) variieren.

Unter diesen Bedingungen entsteht beim Schüt¬ teln von Hand während einigen Minuten und ohne Sonifizie- rung eine klare und durchsichtige Lösung. Als Lösungs- ittel kommen - wie schon erwähnt - niedermolekulare Koh¬ lenwasserstoffe, fluorierte Kohlenwasserstoffe, natürliche und pflanzliche Oele, Squalan, Squalen, Ester von Palmitin¬ säure und von anderen Fettsäuren, Miglyol in Frage. Die schlussendliche Konzentration des Biopolymers (in unserem Fall Urogastron) kann innerhalb der endgültigen Lösung in einem breiten Bereich variieren, gemäss der wässrigen Startlösung und dem Gebrauch. Normalerweise variiert sie zwischen 0,1 - 10 mg/ml, insbesondere 0,1 - 1,0 mg/ml (Konzentration bezüglich totalem Volumen) . Der pH-Wert kann auch breit variiert werden, aber normaler¬ weise werden Lösungen mit einem pH-Wert zwischen 5 und 7 verwendet.

Die auf diese Weise vorbereiteten Lösungen sind

für lange Zeit stabil, im besonderen, wenn sie im Kühl¬ schrank (0-2 C) aufbewahrt werden. Für eine verlängerte Aufbewahrung werden die Lösungen unter 0 C abgekühlt. Ein Niederschlag wird nur bei höherer Wasserkonzentration (zwischen 5% - 10%) beobachtet, aber das System ist re¬ versibel.

Es ist zu bemerken, dass bei niedriger Wasser¬ konzentration (unter 3%) das Wasser nicht bei 0 C ge¬ friert. Medroxyprogesteronacetat wird heutzutage in der

Therapie einiger hormonabhängiger Krebse durch intramus¬ kuläre Spritzen verwendet. Das häufige Auftreten von Geschwüren stellt, verbunden mit dieser Art von Verab¬ reichung, Probleme dar. Eine orale Verabreichung wäre bequemer, wenn die Probleme mit einer kleinen Absorption gelöst werden könnten. Die Verwendung von umgekehrten Mizellen, hergestellt mittels Verwendung eines Lösungs¬ mittels als kontinuierliche Phase, in der das Medroxy¬ progesteronacetat schwer löslich ist, beschleunigt die Absorptions-Geschwindigkeit, möglicherweise wegen direkter Einwirkung der Mizellen auf die biologische Membrane, in der die Permeabilität zum Arzneimittel erhöht wird.

Die Vorbereitung der mizellaren Lösungen, ent¬ haltend Medroxyprogesteronacetat, verfolgt das klassische Verfahren der Zubereitung von mizellaren Lösungen mit der einzigen Variante, dass das Arzneimittel wegen seiner Schwerlöslichkeit in Wasser in einer im voraus vorberei¬ teten mizellaren Lösung gelöst wird; siehe auch: P.L. Luisi und R. Wolf, "Solution behaviour of surfactans" vol. 12, Mittel and Fendler eds., Plenum Press 1982.

Nitrite und Nitrate werden auf transdermischem Weg in Lösungen oder noch besser als Gele von umgekehrten Mizellen vorteilhaft verwendet, um den Schmerz und die

Häufigkeit der anginösen Krisen zu vermindern.

Die aus Vaseline und Lanolinhydrat bestehenden kommerziellen Salben, verwendet als Träger der Nitro- glycerine, werden von den Patienten nicht geschätzt, und es scheint ausserdem, dass sie ein konstantes plasmati- sches Niveau der Arznei nicht halten können; siehe: S. Sved et al. J. Pharm. Sei., 7_0, 1368 (1981).

Das auf einem geeigneten festen Träger transpor¬ tierte Gel, Gegenstand dieser Erfindung, ist mit einem Klebeanteil, der den Kontakt mit der Haut sicherstellt, versehen. Dies ist nicht nur die bequemste Gebrauchsform, sondern kann auch die Verteilung der Arznei steuern, um eine konstante Absorption sicherzustellen.

Endopeptidasen werden in der Kosmetik für die stufenweise Eliminierung überflüssiger Haare verwendet. Dabei stellt sich die Schwierigkeit, die Enzyme zum "bulbus pili" kommen zu lassen. Wegen der FettstoffSchicht, die aus der Talgsekretion stammt, kann das "bulbus pili" von der wässrigen Lösung nicht nass gemacht werden. Die als Mikroemulsionen Wasser/Oel umgekehrten

Mizellen ermöglichen den Kontakt zwischen dem Enzym und der Basis des Haares.

Beispiele: 1. 0,44 g AOT werden in 10 ml Isopropylpalmitat gelöst, so dass eine 100 mM Lösung des Tensides entsteht. Zu dieser Lösung werden mittels einer Mikro- spritze 100 Mikroliter einer wässrigen Urogastron- Lösung zugegeben (1 mg/ml in 50 mM Phosphat-Puffer bei einem pH-Wert von 7) . Die Zugabe wird langsam durchgeführt, und nach Beendigung der Zugabe wird langsam von Hand gerührt.

Am Schluss der Operation erhält man eine klare

Lösung, deren Gehalt an Urogastron spektrophotome- trisch bestimmt werden kann.

2. Eine 6-prozentige Sojalezithin-Lösung wird in gerei- ^• nigtem Sojaöl bei Raumtemperatur hergestellt. In 10 ml dieser Lösung werden langsam 300 Mikroliter einer wässrigen Lösung von mit Methoxylpolyethylenglykol (PEG, 1 mg/ml) modifiziertem Urogastron eingeführt. Man arbeitet wie oben beschrieben. Die end¬ gültige Lösung enthält 3% Wasser und 0,03 mg/ml Hormon.

3. 6 g Sojalezithin werden in 100 ml gereinigtem Sojaöl* gelöst. Zu dieser Lösung werden 7 ml Wasser zugegeben, und es wird von Hand gerührt, bis sich eine klare Mikroemulsion bildet. Es werden dann 20 g Medroxy- progesteronacetat hinzugefügt und es wird bis zu dessen vollständiger Lösung gerührt.

4. 8,8 g AOT werden in 100 ml Isopropylpalmitat gelöst, und zu dieser Lösung werden 6 ml Butan-1-ol als Cotensid zugegeben. Es wird von Hand gerührt, bis eine klare Lösung entsteht, und anschliessend wird bis 45 C erwärmt. 3 g Gelatine werden in 8 ml Wasser suspen¬ diert. Man erwärmt bis 45 C und nach der Solubili- zation wird diese Lösung langsam unter Rühren zu der schon vorbereiteten Lösung hinzugefügt. Nachdem man eine Mikroemulsion erhalten hat, lässt man diese ab¬ kühlen und erhält ein Gel. Auf der Oberfläche dieses Gels, welche nicht mit der Haut in Kontakt kommt, wird Nitroglyzerin zugesetzt, welches an Lactose und kolloidalem Silica absorbiert ist, und zwar derart, dass man eine Konzentration an Arzneimittel von

2 1 mg/cm hat.

5. AOT wird in Squalan gelöst, so dass man eine 200 mM Lösung an Tensid erhält. Zu 100 ml dieser Lösung gibt

man 3 ml einer wässrigen Puffer-Lösung bei pH 8 (Borat 40 mM) , die Papain in einer Konzentration von 10 mg/ml enthält, zu.

Die Erfindung betrifft auch ein Herstellungsver¬ fahren einer neuen Art Lösung für die topische Anwendung, die im Stande ist, die neue Epitelbildung anzuregen, d.h. eine Lösung, die Stoffe mit pharmazeutischer Wirkung für topische Anwendung enthält. Insbesondere.handelt es sich um eine Kohlenwasserstoff- oder organische Lösung, die umgekehrte Mizellen enthält, die befähigt sind, im Innern der wässrigen Mikrophase hydrophile Substanzen, die phar- makologisch aktiv sind, zu lösen. Dieses erfindungsgemässe Verfahren ist haupt¬ sächlich dadurch charakterisiert, dass der aktive Stoff gleichartig in einer öligen Lösung solubilisiert wird (z.B. Isopropylpalmitat, Miglyol, oder natürliche essen¬ tielle Oele oder Kohlenwasserstoffe wie Squalen, Squalan und Derivate) .

Es ist bekannt, dass einige Tenside stabile spherische Aggregate in apolaren Lösungen bilden können. Die polaren Köpfe des Tensids weisen in diesen Aggregaten nach innen; es entsteht somit ein polarer Kern, der sei- nerseits Wasser solubilisieren kann. Im Innern dieser

wässrigen Mikrophase, deren Grosse zwischen 10-200 Ä liegt, können hydrophile Stoffe solubilisiert werden. Es bilden sich auf diese Weise thermodynamisch stabile und klare Lösungen. Die chemischen und physikalischen Eigen- Schäften solcher Aggregate wurden von Autoren wie Fendler, Menger, Eicke in den letzten 10 Jahren ausführlich unter¬ sucht; siehe: J.H. Fendler, "Membrane mimetic chemistry", John Wiley and Sons, N.Y. 1982; F.M. Menger et al., J. Amer. Chem. Soc. 9J5, 286 (1973) ; H.F. Eicke und J. Rehak, Helv. Chim. Acta 5_9, 2883 (1976) . Es gibt dagegen wenige pharmazeutische Anwendungen mit Ausnahme von der Anwendung für die Vorbereitung von "Nanokapseln", wie von Speiser in Zürich vorgeschlagen; siehe: P.P. Speiser, in Applied Biology and Therapeutics, _6, Lingle and Breimer editors, Elsevier, N.Y. 1983.

Das wichtigste Kennzeichen dieses Systems be¬ steht darin, dass die hydrophilen Moleküle, inbegriffen Enzyme, Nukleinsäure und Polysaccharide, in Kohlenwasser¬ stofflösungen solubilisiert werden können. Die in Koh- lenwasserstoff gelösten Enzyme können mit Hilfe der umge¬ kehrten Mizellen ihre Aktivität nicht verlieren; siehe: R. Wolf und P.L. Luisi, Bioch. Bioph. Res. Comm. 8_9_, 209 (1979) .

Das am meisten untersuchte System mit biologi- sehen Substanzen ist aus Isooctan/AOT/Wasser gebildet.

AOT ist die Abkürzung für das wohlbekannte biokompatabile Tensid, Natrium-l,2-bis (2-Ethylhexyloxycarbonyl)-1- ethansulfonat.

Das organische Lösungsmittel, das bis jetzt zur Solubilisierung von Proteinen oder Peptiden in mizellaren umgekehrten Lösungen verwendet wurde, ist mit wenigen Ausnahmen ein Kohlenwasserstoff von niedrigem Molekular¬ gewicht und, als solcher, nicht ideal für eine direkte

pharmazeutische Anwendung.

In diesem Verfahren beschreibt man, wie Lösun¬ gen von Peptiden und Proteinen (insbesondere der epider- ische Wachs umsfaktor: EGF epidermal growth factor) hergestellt werden können, und zwar unter.Verwendung von biokompatibeln Lösungsmitteln wie Squalan, Miglyol, Estern von Palmitinsäure (hauptsächlich Isopropylpa_mitat) , Pflanzenoele, Vaselinoel. Das Tensid AOT wird für mehrere in dieser Erfindung angegebene Beispiele verwendet. Auf jeden Fall kann das Verfahren auf andere Tenside erwei¬ tert werden, wie in den Beispielen und in der Ansprüchen dieser Erfindung gezeigt wird.

Wir haben überraschend feststellen können, dass mizellare Lösungen solcher Systeme bis jetzt in der Literatur nicht beschrieben wurden. Diese sind thermo- dynamisch stabil und können wertvolle Peptid- und Pro¬ teinanteile enthalten. Diese Erfindung beschäftigt sich hauptsächlich mit der Applikation der topischen Anwen¬ dung von EGF. Als Ergänzung beschreibt man das Verfahren, bei welchem in solchen Systemen auch der tryptische Kunitzin- hibitor (Aprotinin) oder Lipoxygenaseinhibitoren oder nicht-steroidales Antiphlogistikum oder Natriumialuronat solubilisiert wird. Die Gesamtheit der zwei mizellaren Systeme

(eines enthält EGF, das andere den Inhibitor oder das nicht-steroidale Antiphlogistikum oder Natriumialurat) kann als stabile Mischung für therapeutische Zwecke ver¬ wendet werden. Es ist schon bekannt, dass EGF eine Wirkung auf die Augen haben kann; siehe P.N. Patil, Trends in Bioch. Sc, 201, Mai 1984. Ausserdem ist es wohlbekannt, dass die gewöhnlichen Augenlösungen grosse Verluste vom Aktiv-

prinzip bewirken. Diese sind normalerweise wässrige Lösungen und werden leicht durch die Tränensekretion ver¬ dünnt und entfernt. Ein öliges Lösungsmittel wäre daher sehr geeignet, in dem es schwieriger ausgewaschen werden kann, aber es ist unmöglich, EGF (oder jedes andere

Protein oder Peptid oder hydrophile Verbindung) in öliger Lösungen zu solubilisieren.

Die invertierte Mizellen (oft Mikroemulsionen Wasser-in-Oel benannt) sind nämlich ein Mittel, um diese Hindernis zu überwinden. Das EGF wird leicht in die wässrige Mikrophase aufgenommen und kann aus der organi¬ schen Phase diffundieren. Die vom Tensid verursachte Abnahme der Oberflächenspannung stellt einen guten Kon¬ takt zu der zu pflegenden Oberfläche und eine gleich- massige Verteilung sicher. Mit Stoffen von relativ kleiner Viskosität, wie die obengenannten organischen Lösungsmittel, kann man Tropfen von winzigen Abmessungen bilden.

Dies ist bei der Herstellung von Augentropfen enorm wichtig, weil das Volumen der Augentropfen norma¬ lerweise 7 Mikroliter beträgt. Grössere Flüssigkeitsan¬ teile werden sofort aus den Augen ausgestossen. Der grosse Vorteil dieses Systems besteht in der Tatsache, dass der teure biologische Stoff, in unserem Fall EGF, nicht verloren geht, wie im Falle von reinen wässrigen Augentropfen. Ein mit der Therapie vieler Verletzungen verknüpftes Problem ist die Tatsache, dass die pro- teinasische Aktivität eine Verlangsamung der Genesung bewirkt. Es wurde indirekt bewiesen, dass Proteinasein- hibitoren diese Probleme erleichtern können, weil sie die Proteinasewirkung eliminieren. Wie oben gesagt, können die Inhibitoren leicht in die umgekehrte Mizellen aufge¬ nommen werden. Das Inhibitoren enthaltende System wird

in der Therapie als Coadiuvant verwendet.

Man kann auf zwei Wegen die gemischten Systeme vorbereiten: EGF und Inhibitor (z.B. Aprotinin; siehe die Beispiele) werden zusammen zu einer wässrigen Lösung zugegeben, und diese Mischung wird zum mizellaren Kohlen¬ wasserstoffsystem hinzugefügt, wie weiter unten besser beschrieben. Es können auch zwei verschiedene mizellare Lösungen hergestellt werden, die später durchgemischt werden, oder sie können äusserlich nacheinander zugegeben werden, wenn immer möglich in geeigneten und verschie¬ denen Dosen.

Es ist ausserdem bekannt - siehe: R. Rocheis und W.D. Busse, Graefe's Arch. Clin. Exp. Ophtalmol. 220, 74 (1983) - , dass einige Lipoxygenaseinhibitoren die neue Epitelbildung bei Kaninchen, deren Hornepitel ausgekratzt worden ist, beschleunigen. Natriumialuronat scheint einen ähnlichen Effekt zu haben. Auch in diesem Fall kann ein gemischtes System die therapeutische Wirkung des EGF günstigen. Bei der Herstellung der mizellaren Lösungen, die EGF oder Aprotinin oder Cyclooxygenaseninhibitoren oder Natriumialuronat enthalten, wird dem klassischen Verfahren zur Herstellung enzymatischer mizellarer Lö¬ sungen gefolgt; siehe: R. Wolf und P.L. Luisi, Bioch. Bioph. Res. Co m. _89_, 209 (1979). Das Tensid (z.B. AOT) wird im Lösungsmittel gelöst, so dass eine Tensidlösung zwischen 50 mM und 300 mM entsteht. Die Auflösung tritt bei Raumtemperatur und ohne Sonifizierung auf.

Zu dieser Lösung kann man die wässrige EGF-Lösung des Biopolymers zugeben, z.B. 1 ml einer gepufferten Lösung von Phosphat (50 mM pH 7,0) wird zu 100 ml der vorherigen organischen AOT-Lösung zugefügt. Der Anteil von Wasser im System kann auf jeden Fall zwischen 0 bis

30%, insbesondere zwischen 0,0% bis 10% (v:v) variieren.

Unter diesen Bedingungen entsteht beim Schütteln von Hand in einigen Minuten und ohne Sonifizierung eine klare und durchsichtige Lösung. Als Lösungsmittel kommen - wie schon erwähnt - niedermolekulare Kohlenwasserstoffe, chlorierte Kohlenwasserstoffe, natürliche und pflanzliche Oele, Squalan, Squalen, Ester von Palmitinsäure und anderen Fettsäuren, Miglyol, natürliche Essenzen in Frage. Die schlussendliche Konzentration des Biopolymers (in unserem Fall EGF oder ein Proteininhibitor) kann innerhalb der schlussendlichen Lösung in einem breiten Bereich variieren, gemäss der wässrigen Startlösung und dem Gebrauch. Nor¬ malerweise variiert sie zwischen 0,1 - 100 mg/ml, insbe¬ sondere 0,1 - 10 mg/ml (Konzentration bezüglich totalem Volumen) . Der pH-Wert kann auch breit variiert werden, aber normalerweise werden Lösungen mit einem pH-Wert zwi¬ schen 4 und 9 verwendet.

Die auf diese Weise vorbereiteten Lösungen sind für lange Zeit stabil, im besonderen, wenn sie im Kühl- schrank (0 - 2 C) aufbewahrt werden. Für eine ver¬ längerte Aufbewahrung werden die Lösungen unter 0 C ab¬ gekühlt. Ein Niederschlag wird nur bei höherer Wasser¬ konzentration (zwischen 5% - 10%) beobachtet, aber das System ist reversibel. Es ist zu bemerken, dass bei niedriger Wasser¬ konzentration (unter 3%) das Wasser nicht bei 0 C gefriert.

Beispiel 1

0,44 g AOT werden in 10 ml Isopropylpalmitat gelöst, so dass eine 100 mM Lösung des Tensides entsteht.

Zu dieser Lösung werden mittels einer Mikro- spritze 100 Mikroliter einer wässrigen EGF-LÖsung zuge¬ geben (1 mg/ml in 50 mM Phosphat-Puffer bei einem pH-Wert

von 7) . Die Zugabe wird langsam durchgeführt, und nach Beendigung der Zugabe wird langsam von Hand gerührt.

Am Schluss der Operation erhält man eine klare ^' Lösung, deren Gehalt an EGF spektrophotometrisch bestimmt werden kann.

Beispiel 2

Eine Natriumlaurat (200 mM) Lösung in Squalan mit 10% Hexan-1-ol wird bei Raumtemperatur vorbereitet. In 10 ml dieser Lösung werden langsam 300 Mikroliter einer wässrigen EGF-Lösung (1 mg/1 ml) eingespritzt. Man arbeitet wie oben beschrieben. Die endgültige Lösung enthält 3 % Wasser in 0,03 mg/ml EGF.

Beispiel 3

100 mg BRIT 56, welches 6% Hexan-1-ol und 1%

Wasser enthält, bilden eine Mikroemulsion in Miglyol

Shell. Zu 10 ml dieser Lösung werden langsam mit einer

Mikrospritze 200 Mikroliter einer EGF-Lösung (1,5 mg/ml) und 200 Mikroliter einer wässrigen Lösung von Aprotinin

(Kunitz Inhibitor) zugefügt. Die Mischung wird langsam von Hand gerührt.

Anstatt Aprotinin kann man abwechslungsweise einen Lipoxygenase- oder Natriumlaurat-Inhibitor verwen- den, so dass das gleiche EGF:Coadiwant molare Verhältnis erhalten bleibt.

Beispiel 4

Tetraethylenglykoldodecylether wird in Squalan gelöst, so dass eine 200 mM Lösung des Tensides entsteht. Zu 100 ml dieser Lösung werden 3 ml einer wässrigen ge¬ pufferten Lösung (Borat 40 mM, pH 8,0), die den Kunitzin- hibitor (Aprotinin) in einer Konzentration von 10 mg/ml enthält, hinzugefügt.

Schliesslich betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von Gelen aus Tensid-enthal- tenden organischen Lösungsmitteln und deren Anwendung in der Biotechnologie, Pharmakologie, Photographie und Kosmetik.

1. Dazu wird ein Verfahren beschrieben, um apolare Lösungen zu gelieren. Dies geschieht durch

Lösungen von Tensiden in Kohlenwasserstoffen, welche auch Wasser und Gelatine enthalten. Bei den Bedingungen, wo Gelatine in wässrigen Lösungen geliert, findet auch in den organischen Lösungsmitteln des Tensides eine Ge¬ lierung statt, wobei das gesamte organische Milieu in ein Gel umgewandelt wird.

2. Es ist bekannt, dass Gelatine in Wasser ge- lieren kann, und feste Gele bildet, die heutzutage eine grosse technologische Bedeutung, besonders in der Lebens¬ mittelindustrie, haben. Diese Gele sind aber auch in anderen Bereichen der Technologie von Interesse, z.B. in der Photographie oder in all jenen Gebieten, in denen hydrophile Filme oder Schichten wichtig' sind. Bekannt¬ lich wird die Gelierung in wässrigen Lösungen so durch¬ geführt, dass eine Lösung von Gelatine (z.B. 10 mg/ml) bei 40 oder höher hergestellt und dann abgekühlt wird.

Unterhalb 37° ca. findet die Gelierung statt. Dieses Phänomen wurde intensiv untersucht. Auch Verbindungen wie Polysaccharide können Gele bilden.

3. Andererseits ist auch bekannt, dass Proteine in apolaren Lösungsmitteln solubilisiert werden können, und zwar durch umgekehrte Mizellen oder Wasser/in Oel Mikroemulsionen. Umgekehrte Mizellen sind spheroidale Aggregate, die von gewissen Tensiden in Kohlenwasserstof¬ fen und anderen organischen apolaren Lösungsmitteln ge- bildet werden, und zwar so, dass die polaren Köpfe der

Tensidmoleküle nach innen gerichtet sind. Somit wird ein polarer Kern in der Mitte des spheroidalen Aggregates gebildet (eben die umgekehrte Mizelle) , wobei die apolaren Ketten der Tensidmoleküle nach aussen in Kontakt mit dem apolaren Lösungsmittel stehen. Der polare Kern kann Wasser solubilisieren. Bei höherem Wassergehalt wird dann meist der Begriff "Mikroemulsion" anstatt "umgekehr¬ te (oder invertierte) Mizelle" gebraucht. Im wässrigen Kern (dem sogenannten "water pool") können hydrophile Moleküle, inklusive Proteine, solubilisiert werden. Mit diesen Methoden wurden in den letzten Jahren ver¬ schiedene Proteine, z.B. in Isooktan mit (2-Ethyl-hexyl) - Natriumsulfosukzinat (AOT) als Tensid solubilisiert, wo¬ bei der Wassergehalt im System nur 1-5% betrug. Man hat also ein System, bei welchen hydrophile Biopolymere in einem apolaren Lösungsmittel solubilisiert werden können. Eine solche Lösung ist thermodynamisch stabil und kann spektroskopisch analysiert werden. Es können damit normale enzymatische Reaktionen durchgeführt werden. 4. Der Hauptpunkt liegt nun darin, die zwei Verfahren, nämlich die Solubilisierung von Pro¬ teinen in apolaren Lösungsmitteln und die Gelierung, z.B. der Gelatine, zusammen zu kombinieren. Die Zubereitung

eines solchen apolaren Gels ist wie folgt zu beschreiben: Gelatine wird in Wasser (oder gepufferte wässrige Lösun¬ gen) gegeben und unter Rühren wird eine Lösung von Gelatine in Wasser erhalten. Zur Gelatinelösung wird ein organisches Lösungsmittel (z.B. Isooktan) , welches das Tensid enthält, zugegeben. Die Konzentration des Tensids variiert zwischen 0 und 1 M, insbesondere zwi¬ schen 5 und 300 mM. Der Volumenanteil des Wassers liegt zwischen 0,5 und 30%. Der Gewichtsanteil von Gelatine in der wässrigen Lösung beträgt 1 - 70%, insbesondere 5 - 50%. Die ganze Operation der Vorbereitung und Mischung der beiden Lösungen erfolgt oberhalb des Gel¬ schmelzpunktes, insbesondere zwischen 20 und 60 C. Beim Abkühlen der resultierenden Mischung entsteht ein Gel. Unter normalen Bedingungen wird der Üebergang bei der gleichen Temperatur beobachtet, bei der die Gelbildung auch in wässriger Lösung erfolgt. Der Vorgang der Gel¬ bildung aus apolaren Lösungen mit umgekehrten Mizellen oder Mikroemulsionen ist reversibel, d.h. das Gel kann beim Erhitzen wieder geschmolzen werden. Unter gewissen Bedingungen, Wassergehalt und Gelatinekonzentration, sind die Gele durchsichtig. Die Gelierung der organischen Phase findet nicht bei jeder beliebigen Kombination von Wassergehalt und Gelatinekonzentration statt. Im allge- meinen gilt, dass wenn der Wassergehalt verkleinert wird, die Gelatinekonzentration dementsprechend erhöht werden muss (siehe Abbildung 1) .

5. Die Bildung des Gels findet auch in Anwesen¬ heit von anderen Molekülen, zusätzlich zur Gelatine, statt. Auf diese Weise können verschiedene Verbindungen in der gelierten Masse homogen verteilt werden. Interes¬ santerweise ist dies der Fall sowohl für hydrophile Mole¬ küle, die im Wasserkern der umgekehrten Mizelle solubili-

siert sind, als auch für ganz hydrophobe Moleküle, die im organischen Lösungsmittel ausserhalb der wässrigen Mikrophasen solubilisiert sind. Dies kann auch mit a phiphilen Molekülen stattfinden, d.h. Molekülen, die in der Wand der Mizelle inkorporiert sind. Es ist somit ersichtlich, dass mit unserer Methode drei wichtige Klassen von Verbindungen, nämlich wasserlösliche, in apolaren Lösungsmitteln lösliche, und solche, die sich in Zwischenphasen aufhalten, homogen in ein Gel einge- bettet werden können. Man kann so z.B. hydrophile

Enzyme oder sogar Zellen in die Gelmasse einbetten. Dies kann von grossem biotechnologischen Interesse sein, weil dieses System eine Methode anbietet, mit welcher Enzyme und Zellen in ein hydrophobes Milieu eingebracht werden können. In die Gelmasse kann man ferner auch Pigmente und Farbstoffe (für die photographische Industrie von besonderer Bedeutung) oder auch Arzneimittel einbetten. Letzteres dürfte für eine kutane Behandlung interessant sein. Schliesslich kann die gelierte Masse auch in der Kosmetik Verwendung finden, wenn ein geeigneter Wirkstoff eingeschlossen wird.

6. Dieser Vorgang der Gelierung von apolaren Lösungsmitteln ist nicht auf das System Isooktan/AOT be¬ schränkt. Andere aliphatische und aromatische Kohlen- Wasserstoffe, sowohl synthetischer wie auch natürlicher Herkunft, können als Lösungsmittel dienen. Es können auch Lösungsmittelmischungen verwendet werden. Andere Tenside anionischer, kationischer und auch nicht ionischer Natur (wie diejenigen, die eine Aethylenoxydstruktur be- sitzen) , können ebenfalls benutzt werden. Anstelle von Gelatine können andere Verbindungen verwendet werden, die in wässrigen Lösungen Gele bilden, z.B. Polysaccharide, wie Agarose, Agar-Agar und andere.

BEISPIELE

Beispiel 1

Herstellung von Gelen aus Kohlenwasserstoffen 220 mg Gelatine (250 Bloom, Fluka) werden unter

Rühren in 0,72 ml Wasser gelöst. Zu dieser Gelatinelö¬ sung werden 2,5 ml 200 mM AOT/Isooktan-Lösung zugefügt und die Mischung anschliessend mit Isooktan auf total 5 ml verdünnt. Alle diese Operationen werden oberhalb 40 C durchgeführt. Die Lösung wird dann unter Rühren auf Raumtemperatur abgekühlt. Es entsteht ein festes Gel.

Beispiel 2

Einschluss eines wasserlöslichen Farbstoffes Wie in Beispiel 1, ausser dass anstelle von

Wasser eine wässrige 1 mM Alizarinrot S Lösung verwendet wird. Es entsteht ein rotes Gel.

Beispiel 3 Einschluss eines Isooktan-löslichen Farbstoffes

Wie in Beispiel 1, ausser dass die 2,5 ml 200 mM AOT/Isooktan-Lösung noch 1 mg Sudanrot 7B ent¬ haltet. Es entsteht ein tiefrotes Gel.

Beispiel 4

Einschluss eines Wirkstoffes

Wie in Beispiel 1, ausser dass anstelle von

Wasser einlee wwäässssrriiggee 00,,55 mmMM VViittaammiinn BB- Lösung verwendet wird. Es entsteht ein rosarotes Gel.

Beispiel 5

Einschluss eines Aromastoffes

Wie in Beispiel 1, ausser dass anstelle von Wasser eine wässrige 3 mM Lösung von Vanillin verwendet wird. Es entsteht ein farbloses transparentes Gel.

Beispiel 6

Einschluss eines Enzyms

Wie in Beispiel 1, ausser dass anstelle von Wasserr eeiiine wässrige 10 M Lipoxygenase Lösung verwendet wird.