Verfahren zur Herstellung des stabilen, amorphen Calciumsalzes von (6S) -N (5) -Methyl-5 ,6,7,8- tetrahydrofölsäure

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfah- ren zur Herstellung des stabilen, amorphen Calciumsalzes von (6S) -N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolsäure der Formel V.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von stabiler, kristalliner (6S) -N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofölsäure der Formel IV.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Lösung des Calciumsalzes von (6S) -N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydro- folsäure der Formel III.

In der vorliegenden Erfindung wird für 5, 6, 7, 8-Tetrahydrofolsäure manchmal die Abkürzung THF verwendet .

Eine kurze Zusammenfassung über die pharmako- logische Bedeutung von N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydro- folsäure - hierin teilweise mit N (5) -Methyl-THF abgekürzt - und Derivaten davon ist in der Beschreibungseinleitung von EP 0 455 013 Al gegeben. Im gleichen Dokument wird auch auf die Bedeutung der individuellen (6S)- und (6R) -Diastereoisomeren der N (5) -Methyl-THF hingewiesen. Ebenso wird hierin der Stand der Technik betreffend die Herstellung der reinen (6S)- und (6R) -Diastereoisomeren der N (5) -Methyl-THF beschrieben.

In EP 1 044 975 Al werden stabile kristalline Salze von N (5) -Methyl-THF beschrieben. Ebenso werden hierin auch kristalline Calciumsalze von (6S) -N (5)- Methyl-THF beschrieben, wobei diese Salze im entspre- chenden Pulverröntgendiagramm klar definierte 2-Theta- Werte haben.

Beim Herstellungsverfahren dieser Salze werden als Ausgangsmaterialien entweder das (6RS) -Diastereo- isomerengemisch oder die bereits aufgetrennten (6S)- oder (6R) -Diastereoisomeren verwendet. Dieses Verfahren beinhaltet eine Temperaturbehandlung von über 60 ⁰ C, vorzugsweise von über 85 ⁰ C, wobei in den Ausführungsbeispielen Temperaturen von 90 ⁰ C bis 100 ⁰ C erwähnt sind.

Eine solche Temperaturbehandlung ist selbst- verständlich für eine industrielle Herstellung dieser Salze wenig geeignet.

In EP 1 044 975 Al ist nicht angegeben, wie die einzelnen (6S)- oder (6R) -Diastereoisomeren von N (5) -Methyl-THF erhalten worden sind.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein industriell anwendbares Verfahren zur Herstellung eines stabilen Calciumsalzes von (6S) -N (5) -Methyl- 5, 6, 7, 8-tetrahydrofölsäure der Formel V zur Verfügung zu stellen.

Das mit diesem Verfahren erhältliche Produkt soll eine Diastereoisomerenreinheit von wenigstens 99 % haben.

Dieses Verfahren soll einfach sein und soll insbesondere keine thermische Behandlung beinhalten.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung stabiler, kristalliner ( 6S) -N (5 ) -Methyl-5 ,6,7, 8-tetrahydrofölsäure der Formel IV zur Verfügung zu stellen.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Lösung des Calciumsalzes von (6S) -N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8- tetrahydrofölsäure der Formel III zur Verfügung zu stellen. Bei diesem Verfahren soll eine wässrige Lösung des Calciumsalzes von N (5) -Methyl-THF erhalten werden, in welcher das (6S) -Diastereoisomere stark angereichert ist (> 98 %) .

Mit der vorliegenden Erfindung werden diese Ziele erreicht.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Lösung des Calciumsalzes von (6S)- N(5)-Methyl-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure der Formel III,

wobei man (6S) -5, 6, 7, 8-Tetrahydrofölsäure der Formel II mit einem Anteil des entsprechenden (6R)- Diastereoisomers im Bereich von 4 Gew.-% bis 8 Gew.-% in Wasser methyliert,

ist dadurch gekennzeichnet, dass man

- zum erhaltenen methylierten Reaktionsgemisch von 0,70 bis 0,82 äquivalente, bezogen auf die einge- setzte Menge an THF, an Calciumchlorid hinzugibt,

- aus der erhaltenen wässrigen Lösung das CaI- ciumsalz von (6RS) -N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydro- folsäure selektiv auskristallisiert und abtrennt, und

- die wässrige Lösung des Calciumsalzes von (6S) -N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolsäure der Formel III mit einem Anteil des entsprechenden (6R) -Diastereo- isomers von ≤ 2 Gew.-% gewinnt.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von stabiler, kristalliner (6S) -N (5) -Methyl- 5, 6, 7, 8-tetrahydrofolsäure der Formel IV

ist dadurch gekennzeichnet, dass man

- zu einer wässrigen Lösung des Calciumsalzes von (6S)-N(5)-Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolsäure der Formel III mit einem Anteil des entsprechenden (6R) -Dia- stereoisomers von ≤ 2 Gew.-% entweder Essigsäure oder eine Sulfonsäure in einer solchen Menge hinzugibt, bis ein pH-Wert von 5,5 erhalten wird,

- die so erhaltene Lösung auf eine Temperatur im Bereich von 44 ⁰ C bis 46 ⁰ C erwärmt,

- zu dieser erwärmten Lösung entweder Essigsäure oder eine Sulfonsäure in einer solchen Menge hinzugibt, bis ein pH-Wert im Bereich von 4,3 bis 4,4 er- halten wird, wobei die Kristallisation von (6S) -N (5)-

Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolsäure der Formel IV beginnt, wobei während dieser Kristallisation der pH-Wert im Bereich von 4,3 bis 4,4 durch kontinuierliche Hinzugabe von entweder Essigsäure oder einer Sulfonsäure aufrecht erhalten wird, und

- den so erhaltenen kristallinen Festkörper bei einer Temperatur im Bereich von 44 ⁰ C bis 46°C abfiltriert und isoliert.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des stabilen, amorphen Calciumsalzes von (6S)-N(5)- Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolsäure der Formel V

ist dadurch gekennzeichnet, dass man

- kristalline (6S) -N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetra- hydrofolsäure der Formel IV, hergestellt gemäss dem Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, in Wasser suspendiert, wobei das Wasser eine Temperatur von 35 ⁰ C bis 41 ⁰ C hat,

- zu dieser Suspension eine NaOH Lösung in einer solchen Menge portionenweise hinzugibt, bis ein pH- Wert im Bereich von 6,7 bis 6,9 erhalten wird,

- zur so hergestellten Lösung 0,90 äquivalente an Calciumchlorid, bezogen auf die eingesetzte Menge an Verbindung der Formel IV, hinzugibt,

- in der so hergestellten Lösung die Konzentration an Verbindung der Formel IV entweder durch Hinzugabe oder durch Entfernung von Wasser auf einen Wert im Bereich von 14 Gew.-% bis 16 Gew.-% einstellt,

- die Fällung des Calciumsalzes von (6S) -N (5)-

Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolsäure der Formel V durch die Hinzugabe einer kleinen Menge an vorgängig hergestellter Verbindung der Formel V startet,

- das so hergestellte Gemisch während 1 Stunde bei einer Temperatur von 40 ⁰ C hält,

- danach innerhalb von 2 Stunden die Temperatur von 40 ⁰ C auf eine Temperatur von 23 ⁰ C senkt,

- die genannte Temperatur von 23°C während 16 bis 18 Stunden aufrecht erhält, und

- den erhaltenen Festkörper isoliert.

Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.

Im folgenden Teil werden mögliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.

Dabei wird auch Bezug auf die Figuren genommen.

Figur 1 zeigt ein Reaktionsschema, beginnend mit der Verbindung der Formel I und endend mit der Verbindung der Formel V.

Figur 2a zeigt das "Differential Scanning Ca- lorimetric" Profil, DSC, der Verbindung der Formel IV. Auf der Abszisse ist die Temperatur in °C aufgetragen, und auf der Ordinate ist der endotherme Wärmefluss in mW aufgetragen.

Figur 2b zeigt das thermogravimetrische Profil, TGA, der Verbindung der Formel IV. Auf der Abszisse ist die Temperatur in ⁰ C aufgetragen. Auf der linken Ordinate sind Gewichtsprozente und auf der rechten Ordinate ist die Ableitung dieser Gewichtsprozente gegenüber der Zeit t (Minuten) aufgetragen. Die ausgezogene Linie bezieht sich auf die linke Ordinate, und die gestrichel- te Linie bezieht sich auf die rechte Ordinate.

Figur 3a zeigt das Pulverröntgendiagramm der Verbindung der Formel IV. Auf der Abszisse sind die 2

Theta-Werte aufgetragen, und auf der Ordinate ist die Intensität (counts) aufgetragen.

Figur 3b zeigt die 2 Theta-Werte mit einem Fehler von etwa + 0,2 Grad des in Figur 3a gezeigten Pulverröntgendiagramms .

Figur 4a zeigt das "Differential Scanning Ca- lorimetric" Profil, DSC, der Verbindung der Formel V.

Auf der Abszisse ist die Temperatur in ⁰ C aufgetragen, und auf der Ordinate ist der endotherme Wärmefluss in mW aufgetragen.

Figur 4b zeigt das thermogravimetrische Profil, TGA, der Verbindung der Formel V. Auf der Abszisse ist die Temperatur in ⁰ C aufgetragen. Auf der linken Ordinate sind Gewichtsprozente und auf der rechten Ordina- te ist die Ableitung dieser Gewichtsprozente gegenüber der Zeit t (Minuten) aufgetragen. Die ausgezogene Linie bezieht sich auf die linke Ordinate, und die gestrichelte Linie bezieht sich auf die rechte Ordinate.

Figur 5 zeigt das Pulverröntgendiagramm der Verbindung der Formel V. Auf der Abszisse sind die

2 Theta-Werte aufgetragen, und auf der Ordinate ist die Intensität (counts) aufgetragen.

Figur 6 zeigt das Raman Spektrum der Verbindung der Formel V. Auf der Abszisse sind die Wellenzah- len in cm ^"1 aufgetragen, und auf der Ordinate ist die Raman Intensität aufgetragen.

(6S) -5, 6,7, 8-Tetrahydrofölsäure der Formel II mit einem Anteil des entsprechenden (6R) -Diastereo-

isomers im Bereich von 4 Gew.-% bis 8 Gew.-% wurde ge- mäss EP 0 600 460 hergestellt.

Es war ganz überraschend, dass man eine wäss- rigen Lösung des Calciumsalzes von (6S) -N (5) -Methyl- 5, 6, 7, 8-tetrahydrofolsäure der Formel III mit einem erhöhten Gehalt des (6S) -Isomers erhalten konnte, und zwar durch selektives Auskristallisieren des 1:1 Gemisches der diastereoisomeren Salze aus der Lösung.

Routinemässig konnte man eine Lösung isolie- ren, welche einen Gehalt des (6S) -Isomers von wenigstens 98% hatte.

Es war auch ganz überraschend, die entsprechende stabile, kristalline freie Säure der Formel IV aus der oben beschriebenen Lösung zu erhalten: zudem wurde während dieses Schrittes eine weitere Erhöhung der diastereoisomeren Reinheit von wenigstens 99% erreicht.

Die stabile, kristalline (6S) -N (5) -Methyl- 5, 6, 7, 8-tetrahydrofolsäure der Formel IV kann in einer solchen diastereoisomeren Reinheit isoliert werden, dass diese Säure als wenigstens ein aktiver Bestandteil in einem Nährungsergänzungsmittel oder in einem Medikament verwendet werden kann.

Aus der Säure der Formel IV wird das überraschend stabile, amorphe Calciumsalzes der Formel V her- gestellt.

Aus dem Pulverröntgendiagramm der Verbindung der Formel V - siehe Figur 5 - geht hervor, dass diese Verbindung praktisch amorph ist.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele illustriert.

Beispiel 1 (Herstellung der wässrige Lösung des Calciumsalzes von (6S) -N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetra- hydrofölsäure der Formel III)

100 g (6S) -5, 6,7, 8-Tetrahydrofölsäure der Formel II mit einer Diastereoisomerenreinheit von (6S): (6R) von 92:8 - hergestellt gemäss EP 0 600 460 - wurden in Wasser, welches eine Temperatur von 7 ⁰ C hatte, unter ei- ner Stickstoffatmosphäre suspendiert.

Die Verbindung der Formel II wurde durch die Hinzugabe von 65 ml 20%-iger (w/w) wässriger NaOH Lösung aufgelöst. Der pH-Wert betrug dann 9,05.

Zu dieser Lösung wurden 23,7 g 36%-ige (w/w) wässrige Formaldehydlösung innerhalb von 5 Minuten bei einer Temperatur von 8 ⁰ C unter Rühren hinzugegeben.

Nach 15 Minuten wurde eine wässrige NaBH ₄ - Lösung, hergestellt durch Auflösen von 21,3 g NaBH ₄ in 50 ml Wasser und 1 ml 20%-iger (w/w) wässriger NaOH Lösung, während 1 Stunde bei einer Temperatur von 8 ⁰ C unter Rühren hinzugegeben.

Dieses Gemisch wurde während 30 Minuten bei einer Temperatur von 8 ⁰ C und anschliessend während 20 Minuten bei einer Temperatur von 61 ⁰ C gerührt.

Die Reaktionstemperatur wurde dann innerhalb von 2 Stunden auf 20 ⁰ C erniedrigt.

Dann wurden 79 ml 18%-ige (w/w) wässriger HCl Lösung tropfenweise hinzugegeben. Der pH-Wert betrug dann 8 , 03.

Das Gemisch wurde auf eine Temperatur 4 ⁰ C ab- gekühlt, um die Borat-Ausfällung zu ermöglichen. Nach 2 Stunden wurden die Borate durch Filtration entfernt.

Der pH-Wert der resultierenden Lösung wurde durch die Hinzugabe von 10 ml 18%-ige (w/w) wässriger HCl Lösung auf einen Wert von 7,03 eingestellt.

Diese Lösung wurde auf eine Temperatur von

20 ⁰ C erwärmt, und dann wurden zuerst 1,62 g an Di- natrium-EDTA und dann 0,82 äquivalente (25,44 g) an CaCl ₂ -2H ₂ θ hinzugegeben.

Dann wurde der pH-Wert auf einen Wert von 6, 9 durch die Hinzugabe von 2 ml 20%-iger (w/w) wässriger NaOH Lösung eingestellt.

Die selektive Kristallisation des Calciumsal- zes von (6RS) -N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolsäure erfolgte durch Animpfen der Lösung mit 100 mg von vorgän- gig hergestellten Kristallen des Calciumsalzes von

(6RS) -N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolsäure, gefolgt von einer Temperaturerniedrigung von Raumtemperatur auf eine Temperatur von 4 ⁰ C innerhalb von 40 Minuten.

Die resultierende Suspension wurde unter Rüh- ren während 18 Stunden bei einer Temperatur von 4 ⁰ C gehalten.

Die erhaltenen Kristalle wurden abfiltriert.

Das so erhaltene wässrige Lösung des Calcium- salzes von ( 6S) -N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolsäure der Formel III hatte einem Anteil des entsprechenden (6R) -Diastereoisomers von ≤ 2 Gew.-%, bestimmt mittels HPLC an einer chiralen Säule.

Beispiel 2 (Herstellung von kristalliner (6S)- N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolsäure der Formel IV)

Zur wässrigen Lösung des Calciumsalzes von (6S) -N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofölsäure der Formel III mit einem Anteil des entsprechenden (6R) -Diastereoisomers von ≤ 2 Gew.-%, hergestellt gemäss obigem Beispiel 1, wurden innerhalb von 20 Minuten 6 ml 100% Essigsäure hinzugegeben, bis ein pH-Wert von 5,5 erhalten wurde.

Danach wurde die Temperatur auf 45 C erhöht

Bei dieser Temperatur wurden nacheinander 1,35 g Natrium-dithionit und 1,9 g Di-natrium-EDTA.

Zu dieser Lösung wurden 25 ml 100% Essigsäure innerhalb von 15 Minuten hinzugegeben.

Bei einem pH-Wert von 4,5 begann die Kristallisation von (6S) -N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofölsäure der Formel IV.

Der pH-Wert wurde im Bereich von 4,3 bis 4,4 durch kontinuierliche Hinzugabe von 100% Essigsäure (10 ml) gehalten.

Diese Suspension wurde 30 Minuten gerührt und anschliessend abfiltriert.

Der so erhaltene kristalline Festkörper wurde mit Wasser, welches eine Temperatur von 40 ⁰ C hatte, gewaschen.

Es wurden 106,9 g an feuchtem kristallinen Festkörper erhalten.

Zur Bestimmung der Reinheit und des Verhältnisses der Diastereoisomeren wurde eine Probe der Verbindung der Formel IV mit 94%-igem (v/v) wässrigem Ethanol gewaschen und dann unter reduziertem Druck ge- trocknet. Dabei wurden folgende Resultate erhalten:

HPLC Reinheit: 96,45 %

Verhältnis von (6S) /(6R) = 99,1 : 0,9 (bestimmt mittels chiraler HPLC) .

Das so erhaltene Produkt der Formel IV hatte die folgenden Stabilitätsdaten (gelagert bei einer Temperatur von 4 ⁰ C):

Beispiel 3 (Herstellung des amorphen Calcium- salzes von (6S) -N (5) -Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofölsäure der Formel V)

106,9 g des feuchten kristallinen Festkörpers, hergestellt gemäss obigem Beispiel 2, wurden in 400 ml Wasser, welches eine Temperatur von 40 ⁰ C hatte suspendiert .

Zu dieser Suspension wurden 65 ml einer 20%- igen (w/w) wässrigen NaOH Lösung langsam hinzugegeben, bis eine klare Lösung mit einem pH-Wert von 6,8 erhalten wurde.

Zu dieser Lösung wurden 0,90 äquivalente an CaCl2-2H ₂ θ (22,7 g, bezogen auf die Menge an isolierter trockener Verbindung der Formel IV) hinzugegeben.

Die HPLC Bestimmung von (6S) -N (5) -Methyl-

5, 6, 7, 8-tetrahydrofolsäure ergab eine Konzentration in Lösung von c = 14,7 % w/w.

Der pH-Wert wurde auf einen Wert von 6,8 durch die Hinzugabe von 1 ml 20%-iger (w/w) wässriger NaOH Lö- sung eingestellt.

Die Fällung des Calciumsalzes von (6S) -N (5)- Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofölsäure der Formel V wurde durch die Hinzugabe von 100 mg an vorgängig hergestellter Verbindung der Formel V gestartet.

Das so hergestellte Gemisch wurde während 1

Stunde bei einer Temperatur von 40 ⁰ C gehalten.

Danach wurde innerhalb von 2 Stunden die Temperatur von 4O ⁰ C auf eine Temperatur von 23 ⁰ C gesenkt, und die Temperatur von 23 ⁰ C wurde während 18 Stunden aufrecht erhalten.

Wenn die Konzentration des Calciumsalzes von

(6S) -N(5)-Methyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofölsäure der Formel V in der Mutterlauge unter 7,5 % war, wurde die Suspension abfiltriert.

Der erhaltene Festkörper wurde mit 50 ml Was- ser, welches eine Temperatur von 10 ⁰ C hatte, gewaschen.

Die nasse Verbindung der Formel V wurde in 250 ml mit 94%-igem (v/v) wässrigem Ethanol bei einer Temperatur von 22 ⁰ C suspendiert und während 30 Minuten gerührt .

Dann wurde diese Suspension abfiltriert und zweimal mit 50 ml 94%-igem (v/v) wässrigem Ethanol gewaschen.

Man erhielt 95 g an nassem Festkörper, welcher unter reduziertem Druck getrocknet wurde. Man erhielt 47,3 g der Verbindung der Formel V.

Dabei wurden folgende analytische Daten erhalten:

HPLC Reinheit: 98,75 %

Verhältnis von (6S) /(6R) = 99,75 : 0,25 (be- stimmt mittels chiraler HPLC) .

Das so erhaltene Produkt der Formel V hatte die folgenden Stabilitätsdaten (gelagert bei einer Temperatur von 25°C unter Vakuum [2 mbar] ) :