Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von endständigen Aminocarbonsäuren und Aminoaldehyden aus Diaminen unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Gamma-Aminobuttersäure (GABA) oder Gamma- Aminobutyraldehyd (ABAL) unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen, die DNA-Moleküle in einer deregulierten Form umfassen, welche die Herstellung von Gamma-Aminobuttersäure verbessern, sowie rekombinante DNA-Moleküle und Polypeptide, die verwendet werden um den Mikroorganismus herzustellen. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Bereitstellung entsprechender Mikroorganismen. Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem einen Mikroorganismus bereit, welcher im Vergleich zu dem nativen Level einen gesteigerten Level einer Putrescine:2-Oxoglutarat- Aminotransferase oder einen gesteigerten Level einer Gamma-Glutamyl-Putrescin-Synthase und einer Gamma-Glutamyl-Putrescine-Oxidase, oder einer Kombination der beschriebenen Merkmale aufweist.

Soweit ein Verfahren zur Herstellung einer endständigen Aminocarbonsäure betroffen ist Vergleich zu dem nativen Level einen gesteigerten Level einer Putrescine:2-Oxoglutarat- Aminotransferase und einer Gamma- Aminobutyraldehyd-Dehydrogenase aufweist.

Desweiteren stellt die vorliegende Erfindung insbesondere einen Mikroorganismus bereit, welcher im Vergleich zu einem nativen Level einen gesteigerten Level einer Gamma- Glutamyl-Putrescin-Synthase und einer Gamma-Glutamyl-Putrescine-Oxidase und einer Gamma-Glutamyl-Gamma-Aminobutyraldehyd-Dehydrogenase und einer Gamma-Glutamyl- Gamma-Aminobuttersäure-Hydrolase aufweist. Darüber hinaus wird mit der vorliegenden Erfindung ein Mikroorganismus bereitgestellt, welcher gegenüber einem nativen Level einen gesteigerten Level einer Putrescine:2- Oxoglutarat-Aminotransferase und einer Gamma-Glutamyl-Putrescine-Oxidase aufweist.

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus, wie oben beschrieben, und ein Verfahren zur Herstellung von Gamma- Aminobuttersäure durch Kultivieren des Mikroorganismus, bereit.

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus, wie oben beschrieben, und ein Verfahren zu Herstellung von Gamma-Aminobutyraldehyd durch Kultivieren des Mikroorganismus, bereit.

In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus vor, der eine gesteigerte Putrescin-bildende Aktivität aufweist. In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus bereit, der eine beliebige Kombination von oben beschriebenen erfindungsgemäßen Ausgestaltungen aufweist und keine oder eine gegenüber einem nativen Level verringerte Aktivität der Ornithine-Carbamoyltransferase und/oder keine oder eine gegenüber einem nativen Level verringerte Aktivität des Arginine Repressors, keine oder eine gegenüber einem nativen Level verringerte Aktivität der GCN5-verwandte N-Acetyltransferase und/oder keine oder eine gegenüber einem nativen Level verringerte Aktivität einer Permease der Major Facilitator Superfamilie aufweist.

Erfindungsgemäß kann es dabei vorgesehen sein, dass zur Steigerung bzw. Erhöhung des Levels eines bestimmten Enzyms gegenüber dem nativen Level des Enzyms ein Plasmid in einen Mikroorganismus eingebracht wird, welches wenigstens eine Sequenz enthält, die für das entsprechende Enzym codiert. Insbesondere kann es dabei erfindungs gemäß vorgesehen sein, dass ein Plasmid wenigstens eine Sequenz der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 13 aufweist.

Im Sinne der Erfindung ist unter dem Begriff„nativer Level" mit Bezug auf ein Enzym der Level bzw. die Konzentration eines Enzyms in einem gentechnisch nicht veränderten Organismus der gleichen Spezies zu verstehen. Dabei kann der native Level auch null sein. Die nachfolgende Liste stellt dabei die erfindungs gemäß bevorzugten Deregulationen zur Beeinflussung des Levels eines Enzyms dar.

Ein bevorzugter Weg der Deregulation der Gene von Putrescine:2-Oxoglutarat Aminotransferase, Gamma-Aminobutyraldehyd-Dehydrogenase, Gamma- Aminobutyraldehyd-Dehydrogenase, Gamma-Glutamyl-Putrescin-Synthase, Gamma- Glutamyl-Putrescine-Oxidase, Gamma-Glutamyl-Gamma-Aminobuttersäure-Hydrolase ist eine „Hoch"-Mutation, welche die Genaktivität, z.B. durch Gen- Verstärkung unter Verwendung starker Expressionssignale und/oder Punktmutationen, welche die enzymatische Aktivität steigern, erhöht. Ein bevorzugter Weg der Deregulation der Gene von Ornithine Carbamoyltransferase, Arginine Repressor, GCN5 -verwandte N-Acetyltransferase ist eine „Runter"-Mutation, welche die Genaktivität, z.B. durch Gendeletion oder -disruption, Verwendung schwacher Expressionssignale und/oder Punktmutationen, welche die enzymatische Aktivität zerstören oder verringern, senkt.

Erfindungsgemäß kann es dabei vorgesehen sein, dass in einem nativen oder gentechnisch veränderten Mikroorganismus wenigstens eine Sequenz der Gruppe bestehend aus SEQ ID. Nr. 15, SEQ ID. Nr. 17, SEQ ID. Nr. 19, SEQ ID. Nr. 21, SEQ ID. Nr. 23 und SEQ ID. Nr. 25 deletiert oder disruptiert wird.

Zum Erhöhen der Ausbeute an Gamma-Aminobuttersäure ist ein bevorzugter Teil der Erfindung die Deregulation der Acetyl-CoA-abhängigen GCN5 -verwandte N- Acetyltransferase, die für die Acetylierung des hergestellten Putrescins verantwortlich ist, speziell die Senkung der Aktivität z.B. durch Deletion oder Disruption des Gens.

Es ist beobachtet worden, dass die Produktionskapazität eines Mikroorganismus für Ornithin durch Deregulieren der Aktivität des Arginine Repressors ArgR des Gamma- Aminobuttersäure produzierenden Mikroorganismus, vorzugsweise durch Verringern seiner Aktivität durch Deletion oder Disruption des für den Arginine Repressor kodierenden Gens, verbessert werden kann.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung besitzt der Mikroorganism eine reduzierte Kapazität zum Export von Putrescin durch Deregulieren der Aktivität der Permease der Major Facilitator Superfamilie des Gamma-Aminobuttersäure produzierenden Mikroorganismus, vorzugsweise durch Verringern seiner Aktivität durch Deletion oder Disruption des für die Permease der Major Facilitator Superfamilie kodierenden Gens. Zum Erhöhen der Ausbeute an Gamma- Aminobuttersäure stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt einen Mikroorganismus bereit, der keine oder eine verringerte Aktivität der 4-Aminobutyrate Aminotransferase, welche für die Umwandlung der gebildeten Gamma- Aminobuttersäure zu Succinat-Semialdehyd katalysiert, aufweist.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung besitzt der Mikroorganismus eine reduzierte Kapazität zum Import und/oder Abbau von Gamma-Aminobuttersäure durch Deregulieren der Aktivität der Aminosäure Permease GabP oder der Aminotransferase GabT des Gamma-Aminobuttersäure produzierenden Mikroorganismus, vorzugsweise durch Verringern seiner Aktivität durch Deletion oder Disruption des für die Permease bzw. Transferase kodierenden Gens.

Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Kultivieren oder die Kultivierung der hierin beschriebenen rekombinanten Mikroorganismen, so dass das gewünschte Produkt Gamma-Aminobuttersäure hergestellt wird.

Daher umfasst eine Ausführungsform der Erfindung ein Gamma- Aminobuttersäure- Produktionssystem, umfassend einen Mikroorganismus, umfassend eine deregulierte Ornithin-Decarboxylase und eine deregulierte Putrescin:2-Oxoglutarat Aminotransferase und eine deregulierte Gamma-Aminobutyraldehyd-Dehydrogenase und/oder eine deregulierte Gamma-Glutamyl-Putrescine Synthase, eine deregulierte Gamma-Glutamyl-Putrescine Oxidase, eine deregulierte Gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyraldehyd-Dehydrogenase und eine deregulierte Gamma-Glutamat-GABA Hydrolase, ein zum Kultivieren dieses Mikroorganismus geeignetes Fermentationsmedium und technische Systeme zur Unterstützung der Produktion von Gamma-Aminobuttersäure.

Die Produktion von GABA aus Glutamat mit Hilfe der Aktivität einer Glutamat- Decarboxylase (GAD; EC 4.1.1.15) wurde bereits in der Literatur beschrieben. Gene, die für Glutamat-Decarboxylasen kodieren, wurden in Escherichia coli, verschiedenen Lactobacillus- Spezies (De Biase et al., 1996; Hiraga et al., 2008; Komatsuzaki et al., 2008) und in Enterokokken (Tamura et al., 2010) eingebracht. Bei Milchsäurebakterien wurde die Bildung von GABA unter der Zugabe von Glutamat ins Fermentationsmedium beobachtet (Hanya et al., 2007; Bo et al., 2013; Gao und Jiang, 2014). Je nach verwendetem Stamm variieren die optimalen Bedingungen zur GABA-Fermentation. Die wichtigsten Faktoren, die die GABA- Produktion beeinflussen, wie Kohlenstoffquelle, Glutamat-Konzentration, Temperatur, Pyridoxal-5-Phosphat und pH wurden bereits charakterisiert (Ran et al., 2007; Li et al., 2010; Lu et al., 2008; Komatsuzaki et al., 2005; Yang et al., 2008). Ein weiterer Ansatz beschreibt die Umwandlung von Glutamat zu GABA unter der Verwendung immobilisierter E. coli Glutamat-Decarboxylase (S. Lee et al., 2013).

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der GABA-Biosynthese in einem rekombinaten Corynebacterium glutamicum.

Als Kosten-effizientere Alternative wurde die Produktion von GABA direkt aus Kohlenhydraten durch Expression einer Glutamat-Decarboxylase etabliert (Takahashi et al., 2012; Shi et al., 2013; Shi und Li, 2011; Li et al., 2013; Lee et al., 2012; Liao und Cho, 2011). Um eine effektive Produktion von GABA in C. glutamicum zu Erreichen wurde das gadB- Gen aus E. coli in dem Glutamat-produzierenden C. glutamicum ATCC 13032 überexprimiert. Dieser Stamm erzielte in GABA-Produktionsmedium mit 50 g/L Glucose und ohne Zugabe von Glutamat eine Ausbeute von 8,07 + 1,53 g/L extrazellulärem GABA nach 96 Stunden. Durch Zugabe von 0,1 mM Pyridoxal-5-phosphat konnte die GABA-Produktion auf eine Ausbeute von 12,37 + 0.88 g/L nach 72 h gesteigert werden, was einer Produktivität von 0,172 g/L/h entspricht (Takahashi et al., 2012). In einer auf diesen Arbeiten aufbauenden Studie zur weiteren Optimierung der GABA-Synthese wurden rekombinante C. glutamicum Stämme zur Verbesserung der intrazellulären Glutamat-Konzentration verwendet. Um den Fluss von 2-Oxoglutarat zu Glutamat zu steigern wurde das für die Serin/Threonin- Proteinkinase G kodierende Gen pknG deletiert. Dieses Enzym ist an einem regulatorischen Mechanismus beteiligt, welcher die Aktivität der 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase kontrolliert (Kimura, 2002; Schultz et al., 2009; Niebisch et al., 2006). Frühere Arbeiten haben bereits gezeigt, dass eine Reduktion des 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase Komplexes, der als Teil des TCA-Zyklus die Umwandlung von 2-Oxoglutarat zu Succinyl-CoA katalysiert, einen wichtiger Faktor bei der Glutamat- Produktion mit C. glutamicum darstellt (Schultz et al., 2007; Boulahya et al., 2010). Durch Überexpression von E. coli GadB in einem C. glutamicum Stamm mit einer pkn-Deletion in Medium mit 100 g/L Glucose und 0,1 mM Pyridoxal-5-phosphat konnte die GABA-Produktion im Vergleich zum Vorläufer mit intaktem PnkG um einen Faktor von 2,3 auf 31.1 + 0.41 g/L (0.26 g/L/h) nach 120 Stunden gesteigert werden. Die Ausbeute von GABA aus Glucose erreichte einen Wert von 0,89 mol/mol (Okai et al., 2014).

Neben der Überexpression der Glutamat-Decarboxylase gadB aus E. coli wurde auch die Glutamat-Decarboxylasen gadBl und gadB2 aus LactobaciUus brevis Lb85 in C. glutamicum überexprimiert (Shi und Li, 2011; Shi et al., 2013). Dabei wurde jedes Glutamat- Decarboxylase kodierende Gen Plasmid-basiert sowohl einzeln als auch gadB2 in Kombination mit dem upstream liegenden L-glutamate/GABA Antiporter gadC (gadC- gadB2) und gadC-gadB2 mit dem upstream liegenden Regulatorgen gadR (gadR-gadC- gadB2) überexprimiert. Schüttelkolbenkultivierungen dieser vier rekombinanten C. glutamicum-Stämme zeigten nach 72 Stunden den höchsten GABA-Titer für den Stamm mit der gadR-gadC-gadB2-Überexpression (2,15 gL ^-1 ), im Vergleich zu 1,25 gL ^-1 für gadC- gadB2 und 0,88 gL ^"1 für gadB2 (Shi und Li, 2011). Einen weitereren Ansatz zur Optimierung der GABA-Produktion stellte die gemeinsame Überexpression der beiden Glutamat- Decarboxylasen aus LactobaciUus brevis Lb85 GADBl und GADB2 dar. Verglichen mit der GABA-Produktion der Stämme mit alleiniger Expression von gadBl oder gadB2 lag diese in dem Stamm mit gadBl- und gadB2-Coexpression mehr als doppelt so hoch. Durch Optimierung der Harnstoff-Zugabe konnte der GABA-Titer von 4,02 + 0,95 auf 18,66 + 2,11 gL ^-1 nach 84 Stunden gesteigert werden. In einer Fed-batch Fermentation lag der Titer nach 60 Stunden bei 26,32 gL ^-1 (Shi et al., 2013).

Neben dem Einsatz der Glutamat-Decarboxylasen von E. coli und Lactobacillus brevis gibt es noch weitere Ansätze, die die Verwendung von pflanzlichen oder chimären Glutamat- Decarboxylasen betreffen (Zelder et al., 2010).

Als Alternative zu den bisher gezeigten Wegen zur biotechnologischen Produktion von GABA beschreibt diese Erfindung die Synthese von GABA aus Putrescin, welches in C. glutamicum aus Ornithin mittels Decarboxylierung durch eine heterologe Ornithin- Decarboxylase gebildet wird. Durch die heterologe Expression der Gamma- Aminobutyraldehyd Dehydrogenase (PatD) sowie der Putrescin:2-Oxoglutarat Aminotransferase (PatA), bevorzugt aus E. coli, wird die anschließende Umwandlung von Putrescin zu GABA gewährleistet.

Als weitere Alternative zu den bisher gezeigten Wegen zur biotechnologischen Produktion von GABA beschreibt diese Erfindung die Synthese von GABA aus Putrescin, welches in C. glutamicum aus Ornithin mittels Decarboxylierung durch eine heterologe Ornithin- Decarboxylase gebildet wird. Durch die heterologe Expression einer Gamma-Glutamyl- Putrescine Synthase (PuuA), einer Gamma-Glutamyl-Putrescine Oxidase (PuuB), einer Gamma-Glutamyl-gamma-Aminobutyraldehyd-Dehydrogenase (PuuC) und einer Gamma- Glutamayl-GABA Hydrolase (PuuD), bevorzugt aus E. coli, wird die anschließende Umwandlung von Putrescin zu GABA gewährleistet. Als weitere Alternative zu den bisher gezeigten Wegen zur biotechnologischen Produktion von GABA beschreibt diese Erfindung die Synthese von GABA aus Putrescin, welches in C. glutamicum aus Ornithin mittels Decarboxylierung durch eine heterologe Ornithin- Decarboxylase gebildet wird. Durch die heterologe Expression der Putrescin:2-Oxoglutarat Aminotransferase (PatA) sowie einer Gamma-Glutamyl- gamma- Aminobutyraldehyd- Dehydrogenase (PuuC), bevorzugt aus E. coli, wird die anschließende Umwandlung von Putrescin zu GABA gewährleistet. Als Alternative zu den bisher gezeigten Wegen zur biotechnologischen Produktion von ABAL (Gamma-Aminobutyraldehyd) beschreibt diese Erfindung die Synthese von ABAL aus Putrescin, welches in C. glutamicum aus Ornithin mittels Decarboxylierung durch eine heterologe Ornithin-Decarboxylase gebildet wird. Durch die heterologe Expression der Aminotransferase (PatA), bevorzugt aus E. coli, wird die anschließende Umwandlung von Putrescin zu ABAL gewährleistet.

Als weitere Alternative zu den bisher gezeigten Wegen zur biotechnologischen Produktion von ABAL beschreibt diese Erfindung die Synthese von ABAL aus Putrescin, welches in C. glutamicum aus Ornithin mittels Decarboxylierung durch eine heterologe Ornithin- Decarboxylase gebildet wird. Durch die heterologe Expression einer Gamma-Glutamyl- Putrescine Synthase (PuuA), einer Gamma-Glutamyl-Putrescine Oxidase (PuuB), bevorzugt aus E. coli, wird die anschließende Umwandlung von Putrescin zu ABAL gewährleistet.

Mikroorganismen und Plasmide, die in bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung verwendet wurden, sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 aufgeführt. Der Ornithin-produzierende Stamm C. glutamicum ORN1 (ATCC 13032 mit argF und argR Deletion) kann bevorzugt als Ausgangsstamm für das Einbringen weiterer Modifikationen dienen. Als Stamm für die Klonierung von PCR-Produkten kann bevorzugt der E. coli DH5a verwendet werden. Die Plasmide pVWxl und pEKEx3, die in C. glutamicum replizieren, können erfindungs gemäß zur Plasmid-basierten Überexpression von Genen dienten. Die episomalen Expressionsvektoren enthalten bevorzugt eine Multiple Cloning Site, einen Replikationsursprung für E. coli und C. glutamicum sowie eine Kanamycin- bzw. eine Spectinomycin-Resistenz als Selektionsmarker. Die in C. glutamicum nicht-replizierenden, integrativen Plasmide pK18mobsacB und pK19mobsacB mit einer Multiple Cloning Site, einem Replikationsursprung für E. coli sowie einer Kanamycin-Resistenz und dem Bacillus subtilis Levansucrase-Gen sacB als Selektionsmarker dienten bevorzugt als Vektoren zur genomischen Integration von Gen-Deletionen. Dabei können bevorzugt die korrespondierenden Plasmide mit der verkürzten Gensequenz verwendet werden, um das Wild-Typ-Gen chromosomal durch das mutierte Gen zu ersetzen.

Tabelle 1: In dieser Studie verwendete Stämme.

Tabelle 2: In dieser Studie verwendete Plasmide.

Medien

Für die Kultivierung von E. coli-Stämmen kann bevorzugt routinemäßig LB-Medium mit 10 gL ^-1 Trypton, 5 gL ^-1 Hefeextrakt und 10 gL ^-1 Natriumchlorid verwendet werden. Die Vorkulturen für Kultivierungen von C. glutamicum können bevorzugt in BHI- Komplexmedium mit 37 gL ^-1 BHI durchgeführt werden. Für die Hauptkultur kann bevorzugt CGXII Minimalmedium mit folgenden Konzentrationen (pro Liter) verwendet werden: 20 g (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 5 g Harnstoff, 1 g KH ₂ PO ₄ , 1 g K ₂ HPO ₄ , 42 g MOPS, 0,25 g MgSO ₄ ● 7 H ₂ O, 10 mg CaCl ₂ , 20 mg Biotin, 1 mg FeSO ₄ ● 7 H ₂ O, 1 mg MnS0 ₄ ● H ₂ O, 0,1 mg ZnSO ₄ ● 7 H ₂ O, 20 μg CuS0 ₄ , 2 μg NiCl ₂ ● 6 H ₂ O, 30 μg Protocatechusäure. Zur Optimierung der GABA- Produktion kann bevorzugt das modifizierte Minimalmedium CGXII1/2 verwendet werden, bei dem die Ammonium- und die Harnstoffkonzentration im Vergleich zum Ausgangsmedium halbiert wurden; alle anderen Medienkomponenten können unverändert bleiben. Die Medien für die Kultivierung von Stämmen mit episomal replizierenden Plasmiden kann vorteilhafter Weise zusätzlich 25 μg mL ¹ Kanamycin bzw. 100 μg mL ¹ Spectinomycin sowie 1 mM Isopropyl-ß-D-l-thiogalactopyranosid (IPTG) enthalten.

Kultivierungen

Einzelkolonien von C. glutamicum und E. coli können bevorzugt als Inokulum für die Vorkultur verwendet und bei 30 °C bzw. 37 °C in 500 mL Schikane-Kolben mit 50 mL BHI- bzw. LB-Medium auf einem Rotationsschüttler (120 rpm) über Nacht inkubiert werden. Für die Hauptkulturen der C. glutamicum Kultivierungen kann CGXII Minimalmedium eingesetzt werden [1]. Beispielsweise wurden jeweils 50 mL CGXII Medium mit einer OD von 1 beimpft und bei 30 und 120 rpm inkubiert.. Das Wachstum wurde durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm verfolgt. Bei dieser Wellenlänge entspricht eine optische Dichte von 1 einem Zelltrockengewicht (CDW) von 0,25 g/L. Die Gamma- Aminobutters äure (GABA) Toleranz-Tests wurden in einem BioLector (m2p Labs, Baesweiter, Deutschland) durchgeführt, während das Wachstumsverhalten und die GABA-Produktion in Schikane-Kolben untersucht wurden. Dabei wurden 50 mL LB-Medium mit einer Einzelkolonie von einer Agarplatte angeimpft und über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (4000 x g, 10 min) geerntet und zweimal mit CGXII- Minimalmedium ohne Kohlenstoffquelle gewaschen. Danach wurden 50 mL CGXII-Medium mit einer entsprechenden Glucose-Konzentration und den entsprechenden Medienzusätzen versetzt und mit einer Start-OD von 1,0 angeimpft.

GABA Toleranztest

Um die Toleranz von C. glutamicum gegenüber GABA zu untersuchen wurde das Wachstum des C. glutamicum Wildtyps in CGXII Minimalmedium unter Zugabe verschiedener Konzentrationen an GABA verfolgt. Dazu wurden 5 mL LB-Medium von einer Agarplatte angeimpft und über Nacht inkubiert. Anschließend wurden 50 mL LB mit der Übernacht- Kultur inokuliert und bis zur exponentiellen Phase kultiviert. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugation (4000 x g, 10 min) geerntet und zweimal mit CGXII-Minimalmedium ohne Kohlenstoffquelle gewaschen. Schließlich wurde je 1 mL CGXII-Minimalmedium mit Kohlenstoffquelle und den entsprechenden Medienzusätzen sowie 50 mM, 100 mM, 200 mM bzw. 500 mM GABA (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) mit einer optischen Dichte von 1,0 angeimpft. Der Test wurde im BioLector (m2p Labs, Baesweiler, Deutschland) in einer FlowerPlate (48 well MTP, flower, m2p Labs, Baesweiler, Deutschland) durchgeführt.

Rekombinante DNA-Techniken

Für PCRs und die Aufreinigung von PCR-Fragmenten sowie für die Konstruktion, Aufreinigung und Analyse von Plasmid-DNA sowie die Transformation von E. coli können erfindungsgemäß bevorzugt Standard-Protokolle verwendet werden. Die Extraktion chromosomaler DNA aus E. coli und C. glutamicum erfolgt beispielsweise mittels Phenol- Chloroform-Isoamyl-Alkohol. Die zur Vektorkonstruktion bevorzugt verwendbaren Oligonukleotide (Primer) sind in Tabelle 3 aufgelistet. Standard-Methoden, wie PCR, Restriktion und Ligation können wie an anderer Stelle beschrieben durchgeführt werden (Sambrook & Russell, 2001). Alle Plasmide können bevorzugt in E. coli DH5a kloniert und vermehrt werden. Zur Amplifikation von speC und patDA können bevorzugt genomische DNA von E. coli MG 1655 als Template dienen. Die PCR kann beispielsweise mit Hilfe der KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen, Darmstadt, Deutschland) durchgeführt werden. Das Amplifikationsprodukt patD kann bevorzugt in pEKEx3 über die Restriktions stellen Pstl/BamHI kloniert werden, was in dem Plasmid pEKEx3 patD resultierte. Danach kann das Plasmid mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) auf gereinigt werden und das patA-Amplifikationsprodukt über BamHI/SacI in pEKEx3 patD kloniert werden. Das Startcodon des Gens patA kann bevorzugt von TTG zu ATG geändert werden. Für die Deletion des gabTDP Operons (cg0566-0568) kann bevorzugt der integrative Vektor pK19mobsacB verwendet werden (Schäfer et al., 1994). Die zur Integration über homologe Rekombination notwendigen flankierenden Genombereiche von gabT und gabP können aus der genomischen DNA des C. glutamicum Wildtyps unter Verwendung der Primerpaare gabTDP_A/gabTDP_B und gabTDP_C/gabTDP_D amplifiziert werden (Tabelle 3). Nach Aufreinigung können die beiden PCR-Produkte durch Crossover-PCR unter Verwendung des Primerpaares gabTDP_A/gabTDP_D verknüpft werden. Das resultierende Produkt wird bevorzugt über die Smal-Schnittstelle in pK19mobsacB kloniert, was das Deletionsplasmid pK19mobsacBDgabTDP ergibt (Tabelle 2). Dieses Plasmid kann bevorzugt zur gerichteten Deletion des gabTDP-Operons durch zweistufige, homologe Rekombination eingesetzt werden. Nach der ersten Rekombination kann die Integration des Vektors über die Kanamycinresistenzkassette selektioniert werden. Die Integration des Vektors in das Genom kann bevorzugt in einer Saccharose-Empfindlichkeit aufgrund des sacB Genprodukts Levansucrase resultieren. Die Selektion der Klone, die den Deletionsvektor in einem zweiten Rekombinationsereignis s wieder herausgeschnitten haben, können durch eine Resistenz gegenüber Saccharose nachgewiesen werden. Die Deletion des gabTDP Operons kann durch PCR-Analyse unter Verwendung des Primerpaares gabTDP_A/gabTDP _D verifiziert werden.

E. coli Zellen können bevorzugt durch Hitzeschock transformiert werden (Sambrook & Russell, 2001) und C. glutamicum-Zellen können durch Elektroporation bei 2,5 kV, 200 Ω und 25 μF transformiert werden (van der Rest, Lange, & Molenaar, 1999). Alle klonierten DNA-Fragmente können bevorzugt durch Sequenzierung überprüft werden.

Tabelle 3: Zur Klonierung verwendbare Primer.

Fig. 6 zeigt eine zur Herstellung eines erfindungs gemäßen Mikroorganismus geeignete Plasmidkarte von pEKEx3 deren DNA-Sequenz als SEQ ID Nr. 27 aufgeführt ist: E. coli/C. glutamicum Shuttle Vector zur IPTG-induzierbaren Genexpression (Ptac, laclq, pBLl oriVCg, specR); Fig. 7 zeigt eine zur Herstellung eines erfindungs gemäßen Mikroorganismus geeignete Plasmidkarte von pEKEx3patDA deren DNA-Sequenz als SEQ ID Nr. 28 aufgeführt ist: pEKEx3 Derivat zur IPTG-induzierbaren Genexpression von patD und patA aus E. coli MG1655;

Fig. 8 zeigt eine zur Herstellung eines erfindungs gemäßen Mikroorganismus geeignete Plasmidkarte von pK18mobsacB_de\cgl722 deren DNA-Sequenz als SEQ ID Nr. 29 aufgeführt ist: pK18mobsacB mit cgl722 Deletionskonstrukt;

Fig. 9 zeigt eine zur Herstellung eines erfindungs gemäßen Mikroorganismus geeignete Plasmidkarte von pK19mobsacB_delgabTDP deren DNA-Sequenz als SEQ ID Nr. 30 aufgeführt ist: pK19mobsacB mit gabTDP Deletionskonstrukt; Fig. 10 zeigt eine zur Herstellung eines erfindungs gemäßen Mikroorganismus geeignete Plasmidkarte von pK19mobsacB_de\cgmA deren DNA-Sequenz als SEQ ID Nr. 31 aufgeführt ist 31: pK19mobsacB mit cgmA Deletionskonstrukt;

Fig. 11 zeigt eine zur Herstellung eines erfindungs gemäßen Mikroorganismus geeignete Plasmidkarte von pK19mobsacB_delcgmR deren DNA-Sequenz als SEQ ID Nr. 32 aufgeführt ist: pK19mobsacB mit cgmR Deletionskonstrukt;

Fig. 12 zeigt eine zur Herstellung eines erfindungs gemäßen Mikroorganismus geeignete Plasmidkarte von pKl9mobsacB_delargFR deren DNA-Sequenz als SEQ ID Nr. 33 aufgeführt ist: pKl9mobsacB mit argFR Deletionskonstrukt. Fig. 13 zeigt eine zur Herstellung eines erfindungs gemäßen Mikroorganismus geeignete Plasmidkarte von pEKEx3patA deren DNA-Sequenz als SEQ ID Nr. 34 aufgeführt ist: pEKEx3 Derivat zur IPTG-induzierbaren Genexpression von patA aus E. coli MG 1655 Fig. 14 zeigt eine zur Herstellung eines erfindungs gemäßen Mikroorganismus geeignete Plasmidkarte von pEKEx3puuAB deren DNA-Sequenz als SEQ ID Nr. 35 aufgeführt ist: pEKEx3 Derivat zur IPTG-induzierbaren Genexpression von puuA und puuB aus E. coli MG1655 Fig. 15 zeigt eine zur Herstellung eines erfindungs gemäßen Mikroorganismus geeignete Plasmidkarte von pEKEx3patApuuC deren DNA-Sequenz als SEQ ID Nr. 36 aufgeführt ist: pEKEx3 Derivat zur IPTG-induzierbaren Genexpression von patA und puuC aus E. coli MG1655 Fig. 16 zeigt eine zur Herstellung eines erfindungs gemäßen Mikroorganismus geeignete Plasmidkarte von pEKEx3puuADCB deren DNA-Sequenz als SEQ ID Nr. 38 aufgeführt ist: pEKEx3 Derivat zur IPTG-induzierbaren Genexpression von puuA, puuB, puuC und puuD aus E. coli MG 1655 Fig. 17 zeigt eine zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus geeignete Plasmidkarte von pVWExl deren DNA-Sequenz als SEQ ID Nr. 37 aufgeführt ist: E. coli/C. glutamicum Shuttle Vector zur IPTG-induzierbaren Genexpression (Ptac, laclq, pBLl oriVCg, kanR) Fig. 18 zeigt eine zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus geeignete Plasmidkarte von pVWExlspeC deren DNA-Sequenz als SEQ ID Nr. 39 aufgeführt ist: pVWExl Derivat zur IPTG-induzierbaren Genexpression von speC aus E. coli MG1655 Quantifizierung von GABA, Putrescin, N-acetyl-Putrescin und Aminosäuren

In einer Ausgestaltung der Erfindung wurden für die Quantifizierung von GABA während der Kultivierung Proben genommen und die Zellen durch Zentrifugation (13000 x g, 10 min) entfernt. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt, mit L-Asparagin als internem Standard verdünnt und mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) (1200 Serie, Agilent Technologies Deutschland GmbH, Böblingen, Deutschland) mit Vorsäulen-Derivatisierung mit ortho-Phthaldialdehyd (OPA) und Fluoreszenz-Detektion (FLD G1321A, Serie 1200, Agilent Technologies) analysiert. Das verwendete System war mit einer Vorsäule (LiChrospher 100 RP 18 ΕC5μ (40 x 4 mm), CS-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Deutschland) und einer Hauptsäule (LiChrospher 100 RP 18 Ε^5μ (125 x 4 mm), CS-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Deutschland) ausgerüstet. Für den für die Elution nötigen Gradient wurden 0,25 % Na-Acetat (pH 6) sowie Methanol als Eluenten bei einer Flussrate von 0,7 mL min-1 verwendet. Das Injektionsvolumen betrug 5 μL·.

Transkriptomanalyse

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wurden zur Durchführung von vergleichenden Transkriptomanalysen eines GABA-Produzenten mit einem Stamm der kein GABA produzieren kann, die C. glutamicum Stämme GAB A4 und PUT21 (pEKEx3patA) in modifiziertem Minimalmedium bis zum Erreichen der mittleren exponentiellen Phase kultiviert, durch Zentrifugation geerntet und bei -80°C bis zur RNA-Isolierung gelagert. Die Isolierung der RNA und ihr Labeling erfolgten wie von Wendisch (2003) beschrieben. Zur Bestimmung der relativen Expressionslevel durch Hybridisierung an DNA Microarrays des gesamten Genoms von C. glutamicum (Wendisch, 2003) wurden drei Microarrays mit DNA von drei unabhängigen Kultivierungen durchgeführt. Die Hybridisierung erfolgte wie von Hüser et al. (2003) beschrieben. Die Auswertung der Rohdaten erfolgte mit dem Programm ImaGene Premium. Gene mit einem signifikant veränderten mRNALevel (P < 0.05) um einen Faktor von mindestens 2,0 wurden als differentiell exprimiert betrachtet. Messung von Enzymaktivitäten

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wurden Enzymaktivitäten in Rohextrakten gemessen, die aus in LB-Medium (mit 1 mM IPTG) angezogenen Zellen aus der späten exponentiellen Phase hergestellt wurden. Die Zellen wurden geerntet (4000 x g, 4 °C, 10 min), zweimal mit 150 mM NaCl gewaschen und bei -80 °C eingefroren. Die Zellpellets wurden in 1 ml Resuspendierungspuffer (0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,5, 1 mM DTT) resuspendiert und mittels Ultraschall (Ultraschalldesintegrator Sonoplus GM 200, Sonotrode M72, Bandelin Electronic GmbH & Co KG, Berlin, Deutschland) für 6 min (Zyklus 0,5, Amplitude 55) aufgeschlossen und anschließend 90 min bei 4 °C und 13200 rpm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Zelldebri-freie Überstand in den enzymatischen Umsetzungen eingesetzt. Die Proteinkonzentrationen wurden nach der Methode von Bradford mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt (Bradford, 1976). Bei den angegebenen Enzymaktivitäten entspricht ein Unit der Enzymmenge, die die Bildung von 1 μιηοΐ Produkt in 1 min katalysiert.

Die Aktivität der Putrescin Transaminase wurde nach einem Protokoll von Albrecht and Vogel (1964), mit folgenden Modifikationen, bestimmt: ein 0,5 mL Ansatz enthielt 0,1 M Tris-HCl Puffer pH 8,0, 15 mM a-Ketoglutarat, 25 mM Putrescin, 1 mM Pyridoxal-5'- phophat und 10 mM EDTA. Ein Ansatz wurde für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Putrescin gestartet und die Änderung der Absorption mit dem Shimadzu Spectrophotometer UV1700 bei 440 nm gemessen.

Die Aktivität der γ-Aminobutyraldehyd-Dehydrogenase wurde wie bereits beschrieben bestimmt (Schneider und Reitzer, 2012). Die Assay-Lösung enthielt 50 mM Glycin-Puffer, pH 9,5, 0,28 mM NAD und 0,5 mM γ-Aminobutyraldehyd (frisch angesetzt und am Ende zugegeben). Die Reaktion wurde bei 37 °C durchgeführt und die Änderung der Absorption bei 340 nm (ε340nm = 6.22 mM ^-1 cm ^-1 ) gemessen. GABA Toleranztest

Die Auswirkungen erhöhter Edukt- und Produkt-Konzentrationen auf den Produktionsstamm sind in biotechnischen Verfahren mit Ganzzellbiokatalysatoren von großer Bedeutung. Bisher sind keine Untersuchungen über die Wirkung von GABA auf das Wachstum von C. glutamicum bekannt. Um den Effekt von GABA auf das Wachstum von C. glutamicum zu untersuchen, wurde der Wildtyp im BioLector in Minimalmedium unter Zugabe verschiedener Konzentrationen an GABA (0 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 500 mM und 1 M) kultiviert (Fig. 2).

Fig. 2 zeigt die Untersuchung der GABA Toleranz des C. glutamicum Wildtyp bei Kultivierung in CGXII Minimalmedium bei 30 °C unter Zugabe verschiedener GABA- Konzentrationen. Die Daten repräsentieren Mittelwerte von Doppelbestimmungen mit den zugehörigen Standardabweichungen.

In Gegenwart von Konzentrationen bis zu 200 mM GABA war das Wachstum von C. glutamicum WT vergleichbar zu dem der Kontrolle ohne GABA. Ab einer Zugabe von 500 mM GABA konnte eine Verringerung der Wachstumsrate um ca. 25 % sowie eine leichte Verringerung der Biomassebildung (7 %) beobachtet werden. Zudem war die lag-Phase bei der Zugabe von 500 mM GABA um ca. 2 h verlängert und die Wachstumsrate um knapp 30 % reduziert (Fig. 3). Aus der in Fig. 3 angegebenen Werte konnte die GABA-Konzentration Ki, bei der die Wachstumsrate um die Hälfte reduziert ist, mit 1050 mM berechnet werden.

Fig. 3 zeigt die Untersuchung der Toleranz des C. glutamicum Wildtyp ATCC13032 gegenüber GABA.

GABA Produktion in C. glutamicum durch Überexpression von speC und patDA Da GABA kein natürliches Produkt des Stoffwechsels von C. glutamicum ist, stellt die Expression heterologer Gene die Schlüsselmodifikation für die Produktion von GABA, sowohl aus Glutamat als auch aus Putrescin, dar. Durch heterologe Überexpression der Glutamat-Decarboxylase aus E. coli wurde ein Stamm für die Produktion von GABA aus Glutamat konstruiert (Takahashi et al., 2012). Eine bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung sieht die Synthese von GABA über Putrescin vor. Da auch Putrescin kein natürliches Stoffwechselprodukt von C. glutamicum ist, ist für diese Route zunächst eine heterologe Expression der Ornithin-Decarboxylase nötig, die die Umwandlung von Ornithin zu Putrescin katalysiert. Für die Synthese von GABA aus Putrescin sind zwei verschiedene Wege bekannt: der glutamylierte Putrescin Weg, der aus vier Enzymen besteht, sowie der Transaminase- Weg, der in zwei Schritten die Umwandlung von Putrescin zu GABA über Aminobutyraldehyd katalysiert.

Als eine erfindungs gemäße Ausgangsstrategie für die GABA-Produktion wurden die Gene des Transaminase-Weges patDA plasmid-basiert unter dem IPTG-induzierbaren Promotor Ptac in dem Putrescin-Produzenten C. glutamicum PUT21 (AargRF pVWExl-speC-5' 2i-argF) überexprimiert. Der daraus resultierende Stamm C. glutamicum GABA1 (AargRF pVWExl- speC-5' 2i-argF pEKEx3patDA) wurde in CGXII Minimalmedium mit 4 % Glucose und 1 mM IPTG kultiviert und die Wachstums- und Produktionseigenschaften mit denen von PUT21 pEKEx3 verglichen (Tabelle 4) (Fig. 4 und 5).

Tabelle 4: Akkumulation von GABA und Putrescin bei Kultivierung von C. glutamicum GABA1 und seinem Vorläufer PUT21 (pEKEx3) in CGXII Minimalmedium mit 4 % (w/v) Glucose und 1 mM IPTG. Der Stamm GABA1 akkumulierte bei Kultivierung in CGXII Minimalmedium mit 4 % (w/v) Glucose und 1 mM IPTG 5,3 gL ^-1 GABA. Es konnte kein Putrescin im Überstand nachgewiesen werden, was auf eine vollständige Umsetzung des zur Verfügung stehenden Putrescins zu GABA schließen lässt. Somit konnte gezeigt werden, dass durch heterologe Überexpression der Gene patDA des Transaminase- Weges aus E. coli in einem Putrescin- Produzenten die Produktion von GABA in C. glutamicum ermöglicht wurde. Unter der Annahme, dass die Glucose zum Ende der Kultivierung komplett verbraucht war, lässt sich daraus eine Ausbeute von 0,13 g g ^"1 berechnen. Die maximale Produktivität von 0,18 g L ^"1 h ^{" 1} nach 30 h ist der höchste Wert, der bisher für die biotechnologische GABA-Produktion auf Glucose als Haupt- Kohlenstoffquelle erreicht wurde. Erwartungsgemäß konnte im Überstand von PUT21 (pEKEx3) kein GABA sondern nur Putrescin detektiert werden.

Fig. 4 zeigt das Wachstumsprofil des Ausgangstamms C. glutamicum PUT21 pEKEx3 sowie der daraus generierten GABA-Produzenten GABA1 (AargRF pVWExl-speC-5' 2i-argF pEKEx3patDA), GABA2 (AargRFAcgmA pVWExl-speC-5' ₂ i-argF pEKEx3patDA) und GAB A3 (AargRFAcgmR pVWExl-speC-5' ₂ i-argF pEKEx3patDA) in CGXII- Minimalmedium mit 4 % (w/v) Glucose und 1 mM IPTG.

PUT21 (pEKEx3) wies mit μ=0,17 h ^-1 eine etwas geringer Wachstumsrate als GABA1 (0,19 h ^-1 ) auf. Die Biomasse-Endkonzentration nach 26 Stunden lag für GABA1 bei 20 gL ^-1 , während die für den Putrescin-Produzenten PUT21 (pEKEx3) deutlich darunter lag (Fig. 5).

Fig. 5 zeigt den GABA Titer der verschiedenen C. glutamicum GABA-Produktionsstämme nach 30 Stunden. Alle Stämme wurden in Schikane-Kolben in CGXII Minimalmedium mit 4 % Glucose (w/v) und 1 mM IPTG kultiviert. Die Daten repräsentieren Mittelwerte von Doppelbestimmungen mit den zugehörigen Standardabweichungen. Die in Fig. 5 angegebenen Werte stellen die Endpunkte der Kultivierungen nach 30 Stunden dar. Wie bereits zuvor gezeigt, konnte im Kulturüberstand von PUT21 (pEKEx3), der als Negativkontrolle diente, keinerlei GABA nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurde im Kulturüberstand von GABA1 eine stete Zunahme der GABA-Konzentration bis zu einem Endwert von 5,3 g L ^-1 GABA beobachtet; Putrescin als Nebenprodukt konnte nicht nachgewiesen werden. Das für die Putrescin-Produktion mit C. glutamicum beschriebene Nebenprodukt N-Acetylputrescin (Nguyen et al., 2014), welches in der PUT21 (pEKEx3)- Kultivierung eine End-Konzentration von 3,2 gL ^-1 erreichte, konnte auch im Überstand der GABA 1 -Kultivierung detektiert werden. Die End- Konzentration lag hier mit 1,2 gL ^-1 jedoch deutlich unter der des Ausgangsstamms.

Eliminierung des Putrescin-Exports durch Deletion von cgmA

Um den Export von Putrescin, dem Vorläufer von GABA, zu verhindern und damit den Abfluss von Kohlenstoff sowie die Bildung unerwünschter Nebenprodukte zu unterbinden, wurde das Gen cgmA, das für die hauptsächlich am Putrescin Export beteiligte Permease der „Major Facilitator Superfamilie" kodiert (Nguyen et al., 2014; Schneider, 2012), in GABA1 deletiert. Da durch Deletion von cgmA die Putrescin-Konzentration im Kulturüberstand drastisch gesenkt wird, sollte dadurch intrazellulär mehr Putrescin für die Umwandlung zu GABA zur Verfügung stehen. Die Produktionseigenschaften des daraus resultierenden Stamms GABA2 wurden ebenfalls in Minimalmedium mit Glucose als alleinige Kohlenstoffquelle untersucht. Durch die zusätzlich eingebrachte Modifikation konnte allerdings keine Verbesserung der Produktionseigenschaften im Vergleich zum Vorläuferstamm GABA1 erreicht werden. Nach 30 h wurde ein Titer von 5,1 gL ^-1 GABA gemessen, was unter der Annahme eines vollständigen Glucose- Verbrauchs einer Ausbeute von 0,13 g (GABA) g ^-1 (Glucose) entspricht (Fig. 5). Auch die End- Konzentration des Nebenprodukts N-Acetyl-Putrescin war mit 1,2 gL ^-1 vergleichbar zu der des Vorläuferstamms GABA1. Im untersuchten Stammhintergrund GABA1 konnte somit keine positive Auswirkung auf die GABA-Produktion durch Unterbindung des Putrescin-Exports gezeigt werden. Da bei der Schüttelkolben-Kultivierung von GABA1 in Minimalmedium kein Putrescin im Überstand detektiert werden konnte, ist diese Beobachtung nicht verwunderlich. Durch weitere Stammoptimierung oder unter modifizierten Kultivierungsbedingungen in anderem Medium kommt es jedoch zur Bildung von Putrescin als Nebenprodukt kommen und somit kann die Deletion von CgmA eine wichtige Rolle spielen.

Die leichte Abnahme des GABA Titers bei GABA2 im Vergleich zu GABA1 mit intakter Permease könnte jedoch auch darauf hindeuten, dass CgmA auch für den Export von GABA in C. glutamicum verantwortlich ist.

Export von GABA in C. glutamicum

Im Stand der Technik wurde bisher in C. glutamicum kein Protein identifiziert, das für den Export von GABA verantwortlich ist. Zur Identifizierung eines putativen GABA-Export- Proteins wurde ein vergleichender DNA-Microarray mit dem GABA-Produzenten GABA4 und dem nicht-produzierenden Stamm PUT21 (pEKEx3-patA) durchgeführt. Tabelle 5 zeigt alle Gene mit einer unterschiedlichen Expression (P<0,05 und mindestens zweifacher Hochoder Runterregulierung (M>1 entspricht 2-fach)) in beiden Stämmen, welche in mindestens zwei von drei Replikaten nachgewiesen werden konnte. Tabelle 5: Vergleichende Transkriptomanalyse des GABA-produzierenden Stamms C. lutamicum GAB A4 und des Nicht-GABA-Produzenten PUT21 ( EKEx3- atA).

Eine der höchsten Hochregulierungen im GABA-Produzenten GABA4 im Vergleich zu einem Stamm, der kein GABA produzieren kann, zeigte das für einen Transkriptionsregulator der TetR-Familie kodierende Gen cgmR (cg2984). Eine Hochregulation dieses Gens wurde durch vergleichende Transkriptomanalysen bereits für Putrescin- und Cadaverin- produzierende C. glutamicum-Stämme nachgewiesen (Kind et al., 2011; Nguyen et al., 2014). Erfindungsgemäß wurde nun cgmR in PUT21 pEKEx3-patDA deletiert, was in C. glutamicum GABA3 resultierte. Die Produktionseigenschaften dieses Stamms wurden ebenfalls in CGXII Minimalmedium untersucht und mit denen seines Ausgangsstamms GABAl verglichen (Tabelle 6).

Tabelle 6: Akkumulation von GABA, Putrescin, N-Acetyl-Putrescin, Glutamat und Ornithin der GABA-produzierenden C. glutamicum GABAl und GAB A3 bei Kultivierung in CGXII Minimalmedium.

Durch die Deletion von cgmR im GABA-Produzenten GABAl konnte keine Verbesserung der Produktionseigenschaften erreicht werden. Im Gegenteil, der finale GABA-Titer lag bei der Kultivierung in CGXII Minimalmedium bei 3,3 gL ^"1 und damit 40 % niedriger als beim Vorläufer-Stamm GABAl. Während die Konzentrationen der anderen Nebenprodukte unverändert blieb, konnte eine deutliche Erhöhung der extrazellulären Putrescin- Konzentration beobachtet werden. Eliminierung der Bildung von N-Acetyl-Putrescin

Untersuchungen von Putrescin-produzierenden C. glutamicum-Stämmen haben gezeigt, dass ein Großteil des produzierten Putrescins vor dem Export acetyliert wird. Dieses für die Putrescin-Produktion unerwünschte Nebenprodukt ist auch bei der GABA-Produktion nachteilig, da das gebildete N-Acetyl-Putrescin nicht mehr für die Umwandlung zu GABA zur Verfügung steht. Für die Bildung von N-Acetyl-Putrescin ist, ebenso wie für die Acetylierung von Cadaverine (Kind et al., 2012) die von cgl722 kodierte GCN5-ähnliche N- Acetyltransferase verantwortlich (Nguyen et al., 2014). Die Deletion der N-Acetyltransferase im Putrescin-Produzenten PUT21Acgl722 führte zu einer Steigerung der Putrescin- Produktion um mehr als 50 % bei vollständiger Unterbindung der N-Acetyl-Putrescin- Bildung. Auch bei den Kultivierungen von GABA1 und GAB A3 wurde das Produktspektrum im Hinblick auf die Bildung von N-Acetyl-Putrescin untersucht. Die in Tabelle 7 aufgeführten Ergebnisse zeigen, das auch in den getesteten GABA-Produzenten ein beträchtlicher Anteil von rund 20 % der gebildeten Produkte auf N-Acetyl-Putrescin ausfallen. Die Deletion von cgl722 stellt somit überraschend ein Target für die Produktion von GABA in C. glutamicum dar. Die Deletion von cgl722 in GABA1 resultierte in C. glutamicum GABA4, dessen Produktionseigenschaften mit denen seines Vorläufers verglichen wurden. Tabelle 7: Akkumulation von GABA und Putrescin von C. glutamicum GAB A4 und seinem Vorläufer GABA1 bei Kultivierung in CGXII Minimalmedium mit 4% (w/v) Glucose und 1 mM IPTG.

Der Vergleich der erreichten Titer der beiden Stämme verdeutlicht, dass es sich bei der Deletion der N-Acetyl-Transferase cgl722 um eine für die GABA-Produktion vorteilhafte Modifikation handelt; mit einem Wert von 5,6 gL ^-1 lag der Titer von GABA4 um fast 10% über dem von GABA1.

Analyse der Enzymaktivitäten von PatD und PatA

Um die funktionale Expression von patD und patA zu verifizieren wurden die spezifischen Aktivitäten der Gamma-Aminobutyraldehyd Dehydrogenase (PatD) sowie der Putrescin:2- Oxoglutarat Aminotransferase (PatA) bestimmt. Dazu wurden der GABA-Produzent GABA4 sowie sein Vorläuferstamm PUT21Acgl722 (pEKEx3) in LB Medium mit 1 mM IPTG kultiviert und die Zellen in der späten exponentiellen Phase geerntet. Nach dem Zellaufschluss per Ultraschall wurden die Zelltrümmer abzentrifugiert und der Überstand als Proteinrohextrakt zur Bestimmung der Enzymaktivität eingesetzt. Die Proteinkonzentration im Rohextrakt wurde nach der Methode von Bradford mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Tabelle 8: Spezifische in vitro Aktivität von PatD (Gamma-Aminobutyraldehyd Dehydrogenase) und PatA (Putrescin:2-Oxoglutarat Aminotransferase) im GABA- Produzenten C. glutamicum GAB A4 und seinem Vorläuferstamm, dem Putrescin- Produzenten C. glutamicum PUT21Acgl722 (pEKEx3).

Für beide Enzyme konnte überraschend im Rohextrakt von GABA4 Enzymaktivität nachgewiesen werden, wohingegen der Kontrollstamm PUT21Acgl722 (pEKEx3) weder PatD- noch PatA Aktivität zeigte. Somit konnte durch den Enzymtest eine erfolgreiche Expression der beiden für die GABA-Synthese in C. glutamicum essentiellen Gene gezeigt werden. Überexpression von puuC in Kombination mit patDA

Da die Aktivität der Gamma-Aminobutyraldehyd Dehydrogenase PatD im Vergleich zur Putrescin:2-Oxoglutarat Aminotransferase PatA geringer ist handelt sich bei dieser Reaktion um einen limitierenden Schritt für die GABA-Produktion in C. glutamicum. Um die Gamma- Aminobutyraldehyd Dehydrogenase- Aktivität zu erhöhen, wurde puuC zusammen mit patDA überexprimiert. Untersuchungen von (Schneider & Reitzer, 2012) haben gezeigt, dass in E. coli PatD und PuuC für 55 bzw. 30 % der Gamma-Aminobutyraldehyd Dehydrogenase- Aktivität verantwortlich sind. Die Restaktivität von 15 % wird einem oder mehreren bisher nicht bekannten Enzymen zugeschrieben. Um eine gemeinsame Überexpression zu ermöglichen, wurde erfindungsgemäß der Vektor pEKEx3-puuCpatDA konstruiert und verschiedene C. glutamicum damit transformiert. Die Produktionseigenschaften wurden mit denen von Stämmen mit alleiniger Überexpression von patDA verglichen.

Eliminierung von GABA-Import und Abbau

GabP (Cg0568) wurde von Zhao et al. (2012) als GABA-Importer in C. glutamicum identifiziert und es konnte gezeigt werden, dass eine Deletion des kodierenden Gens ein Wachstum von C. glutamicum auf GABA als alleinige C- oder N-Quelle unterbindet und gleichzeitig zu einer Steigerung der Produktion von GABA aus Glutamat führt (Zhao et al., 2012). Die Deletion der für den Abbau verantwortlichen Gene ist eine erfindungsgemäße Strategie, um die Produktionseigenschaften eines Stamms für das gewünschte Produkt zu verbessern. Im Falle der GABA-Produktion mit C. glutamicum werden die im Genom von C. glutamicum kodierten Enzyme γ-Aminobutyrat-Aminotransferase (GabT, Cg0566) und Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase (gabD, Cg0567) in der Literatur als Teil des Putrescin- Transaminase-Weges in E. coli beschrieben, die für den Abbau von GABA zu Succinat verantwortlich sind (Schneider & Reitzer, 2012; Schneider et al., 2013). Da in C. glutamicum alle drei Gene (gabT, gabD (Succinat-semialdehyde Dehydrogenase) und gabP) in einem Operon liegen, wurde das komplette Operon erfindungs gemäß in den GABA-Produzenten GABA1 und GAB A4 deletiert, was in der Entstehung von GABA5 (PUT21 AgabTDP (pEKEx3-patDA)) und GABA6 (PUT21Δcgl722AgabTDP (pEKEx3-patDA)) resultierte. Die erfolgreiche Deletion wurde mittels PCR nachgewiesen.

Um die Auswirkungen der eingeführten Modifikation auf die GABA-Produktion zu untersuchen, wurden C. glutamicum GABA5 und GABA6 im Schüttelkolben in CGXII Minimalmedium kultiviert und die Produktionseigenschaften mit denen ihrer Vorläufer verglichen (Tabelle 9). Durch Deletion des Operons gabTDP konnte der GABA Titer in GABA6 im Vergleich zum Vorläuferstamm GABA4 um 10 % auf 7,7 gL ^-1 gesteigert werden. Die maximale Produktivität lag bei dieser Kultivierung bei 0,31 gL ^_1 h ^_1 nach 26 h. Neben Produktivität und Titer konnte auch die Ausbeute auf einen Wert von 0,20 g g ^"1 Glucose gesteigert werden.

Tabelle 9: Vergleich von GABA-Titer und GABA-Produktivität von C. glutamicum GAB A4 und GABA6 bei Kultivierung in CGXII Minimalmedium mit 4% (w/v) Glucose und 1 mM IPTG.

Medienoptimierung

Das verwendete Minimalmedium CGXII, das für die Produktion von L-Lysin optimiert wurde, enthält einen Überschuss an Stickstoff (Eggeling and Bott, 2005). Da GABA im Gegensatz zu L Lysin und seinem Vorläufer Putrescin nur eine Aminogruppe besitzt und die Umwandlung von Putrescin zu GABA mit der Bildung von Glutamat aus 2-Oxoglutarat einhergeht, wurde der Einfluss der hohen Stickstoff-Konzentration im Medium auf die GABA-Produktion untersucht. Um den Einfluss der Stickstoff-Konzentration auf die GABA-Produktion zu untersuchen wurde die Ammonium-Konzentration im Minimalmedium CGXII von 20 auf 10 gL ^-1 und die Harnstoff-Konzentration von 5 gL ^-1 auf 2,5 gL ^-1 um die Hälfte reduziert; alle anderen Medien-Komponenten blieben unverändert. Die GABA-Produzenten GABA1, GAB A4, GABA5 und GABA6 wurde vergleichend in CGXII und im modifizierten CGXIIl/2 Minimalmedium kultiviert (Tabelle 10). Unter den getesteten Bedingungen konnte eine deutliche Steigerung des GABA Titers und der GABA-Produktivität im Minimalmedium mit reduzierter Ammonium- Konzentration beobachtet werden. Für C. glutamicum GABA1 und GAB A4 betrug die Steigerung von Titer und Produktivität ca. 20 bzw. 15 %. Eine noch deutlichere Optimierung der Produktionseigenschaften wurde in den Kultivierungen von GABA5 erreicht. Hier wurden sowohl Titer als auch Produktivität um fast 40 % gesteigert. Auch für GABA6 lagen Titer (9,9 gL ^"1 ) und Produktivität (0,38 gL ^" V) im CGXIIl/2 Minimalmedium ca. 20 % höher als im Ursprungsmedium. Tabelle 10: Vergleich der GABA-Konzentrationen und -Produktivitäten verschiedener C. glutamicum Stämme bei Kultivierung in CGXII und CGXIIl/2 Minimalmedium mit 4%

(w/v) Glucose und 1 mM IPTG nach 26 h.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von endständigen Aminoaldehyden aus Diaminen unter Verwendung rekombinanter Mikroorganismen. Synthese von γ-Aminobutyraldehyd (ABAL)

Zur Synthese des C4-Aminobutyraldehyds γ-Aminobutyraldehyd (ABAL) wurde das patA- Gen aus E. coli, welches für eine Putrescine:2-Oxoglutarat Aminotransferase kodiert, in einem C. glutamicum-Stamm, der durch Expression des speC-Gens aus E. coli zur Synthese von Putrescin (C4-Diamin) befähigt ist, überexprimiert.

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