Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen gekenn¬ zeichnete Verfahren.

Es ist bekannt, daß zahlreiche Mikroorganismen (so zum Beispiel solche der Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Protaminobacter, Bacillus, Norcardia, Strepto- yces und insbesondere Mycobacterium) die natürliche Fähigkeit besitzen, natürlich vorkommende 3ß-Hydrαxy-Δ -sterine Cholesterin oder Sitosterin) zu Kohlendiαxyd und Wasser abzubauen und daß bei diesem Abbau intermediär 4-Andrαsten- 3,17-dion und 1,4-Androstadieπ-3 , 17-dioπ gebildet werden.

Ferner ist bekannt, daß es mithilfe von Inhibitorzusätzen oder mutierten Mikroorganismen möglich ist, den Abbau der Sterine so zu lenken, daß ein Abbau des gebildeten 4-Andro- sten- , 17-dions oder 1, -Andros adien-3 , 17-dions vermieden wird (siehe deutsche 0 enlegungsschriften 15 43 269 und 15 93 327 sowie US-Patentschrif 3,684,657).

Für den Fachmann ist es überraschend, daß unter den bekannten Bedingungen auch die Seitenkette von α-Sitosteriπ abgebaut wird, weil bekannt ist, daß der Seitenkettenabbau von Sterinen durch ein sehr komplexes Fermentsystem bewirkt wird und man nicht erwarten konnte, daß alle am Seitenkettenabbau natürlicher Stεrαide mitwirkenden Enzyme die Fähigkeit besitzen, auch den Seitenkettenabbau dieser Verbindung zu bewirken. Darüberhinaus konnte man nicht vorhersehen, daß bei diesem Abbau die Δ -Doppelbindung des -Sitosterins hydriert und die in 4α-Position ständige Methylgruppe ab¬ gespalten wird .

Abgesehen von der Verwendung anderer Ausgangsverbindungen, wird das er iπdungsgemäße Verfahren unter den gleichen Fermen ationsbedingungen durchge ühr , welche man auch

bei den bekannten mikrobiologischen Seitenketteπabbau- Reaktionen von Sterinen anwendet.

Erfindungsgemäß wird die Fermentation unter Verwendung, der Mikroorganismenkultur durchgeführt, welche man üblicher¬ weise zum Seitenkettenabbau von Sterinen verwendet. Geeignete Kulturen sind beispielsweise zum Seitenkettenabbau von Sterinen befähigte Bakterienkulturεn der Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Protamino¬ bacter, Streptα yces oder insbesondere der Gattung Myco¬ bacterium. Als geeignete Mikroorganismen seien beispiels¬ weise genannt: Microbacterium lactum IAM-1640, Protamino¬ bacter alboflavus IAM-1Q40, Bacillus roseus IAM-1257, Bacillus sphäricus ATTC-7055, Norcardia gardneri IAM-105, Norcardia minima IAM-374, Norcardia coralliπa IFQ-3338, Streptomyces rubescens IAM-74-oder insbesondere die Mikroorganismen Mycobacterium avium IFQ-3Q82, Mycobacterium phlei IFO-3158, Mycobacterium phlei (Institut für Gesund¬ heitswesen, Budapest Nr. 29), Mycobacterium phlei ATCC-354, Mycobacterium smegmatis IFO-3084, Mycobacterium smeg atis ATCC-20, Mycobacterium smegmatis (Institut für Gesund¬ heitswesen, Budapest Nr. 27), Mycobacterium smegmatis ATCC-19979 und Mycobacterium fortuitum CBS-49566.

Besonders bevorzugt sind als Mikroorganismen Mycobacterium spec. NRRL B-3805, Mycobacterium spec. NRRL B-3683, Mycobacterium phlei NRRL 8-8154 und Mycobacterium fortuitum NRRL 8-8153 mit deren Hilfe -Sitosterin ohne Verwendung zusätzlicher die 9 -Hydroxylierung hemmender Inhibitoren durchgeführt werden kann.

Unter den für diese Mikroorganismen üblicherweise ver¬ wendeten Kulturbedingungen werden in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften, Submerskultureπ angezüchtet. Dann setzt man den Kulturen das Substrat (in einem ge¬ eigneten Lösungsmittel gelöst oder vorzugsweise in emul- gierter Form) zu und fermentiert, bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist.

Geeignete Substratlösungs ittεl sind beispielsweise Methanol, Äthanol, Glykαlmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd) . Die Emulgierung des Substrats kann beispielsweise bewirkt werden, indem man dieses in ikrαnisierter Form oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (wie Methanol, Äthanol, Acetαπ, Glykol- monomεthyläthεr, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd) ' gelöst unter starker Turbulenz in (vorzugsweise entkalktem) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilfen enthält eindüst. Geeignete Emulgationshilfen sind nichtionαgene Emulgatoren, wie zum Beispiel Äthylenoxyaddukte oder

Fettsäureester von Polyglykolen. Als geeignete Emulgatoren

(R) (R) seien die handelsüblichen Netzmittel Tegin , Tween und Span (R) beispielsmäßig genannt.

Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Fer entatiαnsdauer ist von der Struktur des verwendeten Substrates und der Art des verwendeten Mikroorganismus abhängig. Diese Größen müssen, wie dies bei mikrobio¬ logischen S eroidumwandlungen allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dε Fachmann geläufig sind, ermittelt werden.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren 4-Androsten-3 , 17-dion-Derivate der allgemeinen Formel I sind bekanntlich wertvolle Zwischenprodukte die heute

gewerbsmäßig zur Synthese phamakologisch wirksamer Steroide verwendet werden.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur -Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Be i sp i e l 1

Ein 2 1-Erleπmeyerkolbeπ mit 500 ml sterilem Nährmedium, enthaltend

1 % Hefeextrakt

0 , 45 % D i n atr i __.mhyd roge n p hos pI. at

0,34 % Kai iumdihydrogenphosphat und

0,2 % Tweeπ ^(R) 80

-eingestellt auf pH 6,7 - wird mit einer Suspension einer Mycobacterium spec. NRRL B-3805 Trockenkultur beimpft und 3 Tage lang bei 30°C mit 190 Umdrehun pro Minute geschüttelt.

0 Erleπmeyerkolben (500 ml) mit jeweils 100 ml sterilem Nähr¬ medium, enthaltend

2,5 % Corπsteep liquor 0,3 % Di ammoni umhydrogeπphosphat

0,25 % Sojamehl und _^ -

0,25 % Tween ^(R) 80 eingestellt auf pH 7,0 - werden mit jeweils 5 ml der Mycobacterium spec. -An∑uchtskultur beimpft und 24 Stunden lang bei 3Q°C mit 220 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Dann setzt man jeder Kultur lαα mg α-Sitαst in 3,G ml Dimethylformamid gelöst zu und fermentiert weitere 95 Stunden lang bei 30°C.

Die vereinigten Kulturen werden mit Äthylenc lorid extrahiert, der Extrakt im Vakuum eingeengt, der Rückstand durch Chromato¬ graphie über eine Kieselgelsäule gereinigt und man erhält nach Umkri sta 11 isation aus Di i αpropy läther 160 mg 4-Androsteπ-3, 17 dion.

Daneben werden 385 mg nicht umgesetztes α-Sitosterin zu¬ rückgewonnen .

Beispiel 2

Unter den Bedingungen des Beispiels 1, jedoch unter Verwendung von Mycobacterium spec. NRRl B-3683 werden insgesamt IQQQ mg -Sitosterin umgesetzt, aufbereitet und man erhält neben 63Q mg unumgesetzten α-Sitosterin 140 mg 1,4-Androsta- diεn-3,17-dion.