Die Erfindung betrifft ein Fermentationsverfahren zur Herstellung eines Pentosanase-Präparats mit erhöhter Backaktivität.

Pentosanasen sind Enzyme, die in der Lage sind, Pentosane abzubauen. Die Pentosane gehören zu den Henricellulosen. Die wichtigste Kompo¬ nente ist Arabinoxylosan, das chemisch aus einem kettigenförmigen Xylan (Polymer der D-Xylose) mit Arabinose in den Seitenketten be¬ steht. Derartige Poiysaccharide finden sich auch in Getreidemehlen als Ballaststoffe.

Das US-Patent 3,512 992 schlägt daher vor, Pentosanasen und insbe¬ sondere Xylanasen in der Bäckerei bei der Zubereitung von Teig ein¬ zusetzen. Es ist bekannt, daß durch den Einsatz von Pentosanase die Teigviskosität gesenkt werden kann. Fernerhin wird Weißbrot beson¬ ders weich und das Altbacken werden kann verzögert werden. Bei Rog¬ gengebäck kann die Krumenelastizität verbessert werden (C. Garns "Der Einsatz von mikrobiellen Enzymen in der Bäckerei in Getreide, Mehl und Brot", 30. Jahrgang, Heft 5, Mai 1976, Seite 113 ff.).

Eine übersichtartige Beschreibung über Xylanasen und ihre Eigen¬ schaften findet sich bei J. Woodward in "Topics in Enzymology and Fermentation, Biotechnology, Vol. 8 (1984), Seite 9 ff.

Die Induktion der Xylanasebildung durch Induktoren, wie ß-Methyl- xylosid, ist in der wissenschaftlichen Literatur bereits mehrfach beschrieben worden, so z.B. in den folgenden Artikeln:

M.J. Bailey, K Poutanen

Production of xylanolytic enzymes by strains of Aspergillus Appl.

Microbiol. Biotechnol. (1989) 30:5-10

CT. Kelly, M.R. O'Mahony, W.M. Fogarty

Extracellular xylanolytic enzymes of paecilomyces varioti

Biotechnology letters, Vol. 11, No. 12, S. 885-890

Morosol , Rolf; Durand, Serge; Letendre, Elaine

Induction of xylanase by beta-methylxyloside in Cryptococcus albidus

FEMS Microbiol. Lett., 48 (1-2), S. 261-266

C. Royer; J.P. Nakas

Xylanase production by Trichoderma longibrachiatum

Enzyme Microb. Technol., 1989, Vol. 11, July

All diese Literaturstellen geben jedoch keinen Hinweis darauf, daß durch ß-Methylxylosid gerade die backaktive Xylanase bevorzugt ge¬ bildet wird.

Die Mehrzahl der Xylan-abbauenden Mikroorganismen bildet mehr als nur einen Xylanase-Typ, die sich u.a. dadurch unterscheiden, back¬ aktiv oder backinaktiv zu sein. In der nahrungsmitteltechnischen Praxis hat sich gezeigt, daß die beim Einsatz von Pentosanasen bzw.

Xylanasen zu erzielende VolumenVergrößerung eines Gebäckstückes direkt mit einer meßbaren Xylanaseaktivität der backaktiven Xylanase korreliert. Es besteht daher der Bedarf nach einem Verfahren, das es gezielt erlaubt, Enzympräparate mit hoher Backaktivität herzustel¬ len.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines backaktiven Pentosanase-Präparats, bei dem man Mikroorganis¬ men, die zur Bildung von Pentosanasen befähigt sind, in einem Fer¬ mentationsmedium züchtet, am Ende der Kulturdauer die Zellmasse ab¬ trennt und das Enzympräparat aus der Fermenterbrühe gewinnt, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Induktion von Backaktivität dem Fermen¬ tationsmedium neben oder anstelle von Xylan und/oder xylanhaltigen Mischungen die Substanz ß-Methylxylosid in Mengen von 0.01 bis 5 Gew.-%, bezogen auf Fermentationsmedium, zusetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Herstellung von backaktiven Pentosanase-Präparaten aus einer Vielzahl von Mikroor¬ ganismenstämmen der verschiedensten Gattungen, so beispielsweise Aspergillus Rhizopus, Trichodema Bacillus und dergleichen . Bevor¬ zugt sind jedoch Stämme der Gattung Aspergillus, speziell von As¬ pergillus niger und Aspergillus awamori und unter diesen Aspergillus awamori DSM 5937.

Der der Erfindung zugrundeliegende Effekt besteht darin, daß das Substrat ß-Methylxylosid als Substratanalogen die betreffenden Mi¬ kroorganismen zur Synthese von Pentosanasen (Xylanasen) anregt - insbesondere auch zur Bildung des backaktiven Enzyms.

Der Kern der Erfindung liegt somit darin, dem Fermentationsmedium bei der Herstellung der Enzymzubereitungen ß-Methylxylosid zuzu¬ setzen. Geeignete Zusatzmengen liegen zwischen 0,01 und 5 Gew.-%, insbesondere zwischen 0,01 und 1 Gew.-%. ß-Methylxylosid kann dabei zusammen mit Xylan oder anstelle von Xylan eingesetzt werden. Be¬ vorzugt ist es, die Substanz anstelle von Xylan einzusetzen. Möglich ist auch, ß-Methylxylosid zusammen mit einer xylanhaltigen Kompo¬ nente, etwa zusammen mit Roggenkleie, einzusetzen oder vorzugsweise anstelle einer solchen Komponente zuzugeben. Durch ß-Methylxylosid werden nicht nur höhere Xylanase-Ausbeuten erzielt, sondern auch die Fermentationszeit bis zum Erreichen maximaler Xylanase-Aktivität deutlich verkürzt.

Sieht man von der Mitverwendung von ß-Methylxylosid ab, so weisen die erfindungsgemäß einzusetzenden Fermentationsmedien eine Zusam¬ mensetzung auf, wie sie bei der Herstellung von Enzymen durch Mikro¬ organismen der Gattung Aspergillus, insbesondere Aspergillus .niger oder Aspergillus awamori üblich ist.

Im einzelnen erhalten die Fer entationsmedien eine C-Quelle, eine N-Quelle sowie Spurenelemente. Als C-Quelle werden polysaccharid- haltige Produkte eingesetzt, so beispielsweise Maisstärke oder ab¬ gebaute Maisstärke oder eine andere Stärkequelle. Als N-Quelle kön¬ nen Sojamehl, aber auch Maisquellwasser eingesetzt werden. Daneben können auch Ammoniumsalze, etwa Ammoniumnitrat, eingesetzt werden. Die als C-Quelle verwendete Substanz ist im Fermentationsmediuni in einer Menge von 0,2 bis 5 Gew.-% vorhanden. Dasselbe gilt auch für die eiweißartigen Substanzen. Darüber hinaus enthält das Feraenta-

tionsmedium noch die üblichen Spurenelemente, wie z.B. Salze von Kalium, Natrium, Magnesium, Mangan, Eisen und dergleichen. Die Menge an Spurenelementen liegt unter 1 Gew.-% und beträgt pro Kationenart etwa 0,01 bis 0,2 Gew.-%, bezogen auf das jeweilige Kation.

Die Spurenelemente liegen vorzugsweise als lösliche Salze vor, so beispielsweise als Phosphate, Nitrate oder Sulfate. Dabei werden die Kombinationen so gewählt, daß Fällungen vermieden werden.

Der Gesamt-pH-Wert des Fermentationsmediums ist schwach sauer bis neutral und kann Werte zwischen pH 4,5 und pH 7,5 einnehmen, insbe¬ sondere um pH 6,0.

Die fermentative Herstellung der Pentosanasen kann in üblichen Fer¬ mentationsanlagen durchgeführt werden, wobei unter aeroben Be¬ dingungen bei Raumtemperatur oder leicht darüber gearbeitet wird. Die Kulturdauer beträgt 24 h bis einige Tage, wobei die Xylanase- bildung analytisch verfolgt werden kann.

Zur Aufarbeitung wird das Pilzmyzel zunächst durch Filtration von der Fermenterbrühe abgetrennt. Die so erhaltene Flüssigphase kann in unterschiedlichen Verfahren weiterverarbeitet werden. So ist es mög¬ lich, aus dieser Flüssigphase das Enzym auszufällen, so beispiels¬ weise mit Ammoniumsulfat, und das ausgefällte Enzym weiter zu rei¬ nigen oder direkt zu verarbeiten. Es ist aber auch möglich, die Flüssigphase zunächst durch Ultrafiltration unter Auswaschen (Dia¬ lyse) niedermolekularer löslicher Bestandteile aufzukonzentrieren und danach einen Fällungsschritt durchzuführen oder das Konzentrat auf einen Träger, wie beispielsweise Sojamehl, aufzusprühen und dann zu trocknen.

Die erfindungsgemäß hergestellten Pentosanase-Konzentrate zeigen hohe Pentosanase-(Xylanase)-Aktivität bei gleichzeitig verbesserter Backaktivitat.

Die Bestimmung der Xylanase-Aktivität kann mit Hilfe der Dinitro- salicylsäure-Methode wie folgt geschehen:

Die enzymhaltige Lösung wird in acetatgepufferter Lösung in Gegen¬ wart von ca. 1% Xylan bei 40°C 15 Minuten inkubiert. Anschließend wird eine alkalische Dinitrosalicylsäure-DNS-Lösung (7g DNS, 12g NaOH, 200g Kaliu natriumtartrat, 5,5g Phenol, 5g Na2S2θs pro 1 1 H2O) zugegeben und die Farbentwicklung bei 540 nm im Vergleich zu einem Xylose-Standard gemessen. Die Enzymeinheit 1 U liegt vor, wenn in 1 min. unter den Reaktionsbedingungen aus dem Xylan Bruchstücke freigesetzt werden, deren Reduktionsäquivalente 1 μMol Xylose entspricht.

Es kann aber auch in der in US-Patent 3 512 992 zitierten Methode gearbeitet werden.

Zur Bestimmung der Backaktivität wird die Volumenzunahme von Bröt¬ chen aus einer definierten Menge eines Standardteigs gemessen. Dazu mißt man Länge, Breite und Höhe von 30 derartiger Brötchen, addiert die Maße in cm und zieht von der erhaltenen Zahl die Maße von eben¬ falls 30 Brötchen ab, die aus der gleichen Menge des gleichen Teigs ohne den Enzymzusatz hergestellt worden sind.

B e i s p i e l e

Beispiel 1

Ku1turbedinounqen:

Impfkultur: Zur Herstellung von Impfkulturen wurden gut versporte Agarkulturen des Stammes 5937 (XY1-A007) mit 0,1 PO/j-Puffer (pH 6,5) abgeschwemmt, die Sporensuspension über sterile Glaswolle fil¬ triert, mit 10 % Glycerin als Schutzreagenz versetzt und portions¬ weise bei -25°C gelagert.

Hauptkultur: Zur Gewinnung der Xylanase wurde der o.g. Stamm unter Submersbedingungen in Schüttelkulturen angezüchtet. 100 ml Nährlö¬ sung (in 500 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen) wurde mit 0,1 ml Sporensuspension beimpft und bei 30°C auf die Schüttelmaschine in¬ kubiert (Schüttelfrequenz: 140 U/Min.).

Medienzusaπroensetzun :

1,00 % Maisquellwasser 0,50 % ß-Methylxylosid 1,00 % Maisstärke (abgebaut) pH 6,5

Zur Isolierung der Pentosanase (Xylanase) wurde das Pilzmyzel durch Filtration abgetrennt und das zellfreie Kulturfiltrat durch Dialyse gereinigt und durch Ultrafiltration aufkonzentriert. Aus dem Konzen¬ trat wurde durch Gefriertrocknung ein Trockenpulver gewonnen, das mit Sojamehl zu einem Produkt mit 15000 U/g aufgemischt wurde.

Beispiel 2

Es wurde ein Teig hergestellt aus 1000 g Weizenmehl, Type 550, 20 g Salz, 60 g Hefe, 580 g Wasser und 30 g Backmittel mit oder ohne En¬ zymzusatz. In einem Spiralkneter wird insgesamt 5 min. geknetet. Nach einer Ruhezeit von 5 min. werden genau 1500 g abgewogen, dieses Teilstück manuell rundgeknetet und in der folgenden Ballengare wei¬ tere 10 min. ruhen gelassen.

In einem Teig-Teilungsautomaten wird der Ballen in 50 g schwere Teiglinge geteilt und rundgewirkt. Die runden Teiglinge werden nach 11/2 min. Ruhezeit in ein» Langwirkautomaten eingedreht.

Im Gärschrank bei 30 ^β C und 85 % relativer Luftfeuchte erfolgt die anschließende Stüc gare (35 min.). Bei 230°C werden die Teigstücke dann im Backofen 20 ein. lang gebacken.

Nach dem Abkühlen werden 30 Brötchen eines Teigansatzes der Länge, der Breite und der Höhe nach gemessen. Bei einem Zusatz von 1500 U Enzym (entsprechend 0,1g) werden 40 cm mehr gemessen als bei einem Vergleichsteig ohne Enzymzusatz.

Beispiel 3

Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde anstelle von ß-Metylxylo- sit Xylan bzw. Roggenmehlkleie eingesetzt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle aufgeführt.

T a b e l l e

Induktorsubstrat