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Title:
PROCESS FOR PRODUCING BIO-FUNCTIONAL POLYMER PARTICLES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2019/106047
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a process for producing bio-functional polymer particles, comprising the following steps: (i) production of a solution containing at least one polymer, said polymer being a copolymer with integral cross-linking groups, and at least one bio-molecule; (ii) introduction of the solution produced in step (i) into a carrier fluid to form spatially separate droplets; (iii) solidification of the droplets obtained in step (ii) by the activation of the cross-linking groups using a trigger, and subsequent cross-linking of the copolymers leading to bio-molecular bonding.

Inventors:
SCHÖNBERG JAN-NIKLAS (DE)
RUEHE JÜRGEN (DE)
BRANDSTETTER THOMAS (DE)
Application Number:
PCT/EP2018/082896
Publication Date:
June 06, 2019
Filing Date:
November 28, 2018
Export Citation:
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Assignee:
UNIV FREIBURG ALBERT LUDWIGS (DE)
International Classes:
G01N33/543
Domestic Patent References:
WO2010138187A12010-12-02
WO2010138187A12010-12-02
Other References:
CELETTI GIORGIA ET AL: "Functionalized poly(ethylene glycol) diacrylate microgels by microfluidics: In situ peptide encapsulation for in serum selective protein detection", COLLOIDS AND SURFACES. B, BIOINTERFACES, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 145, 24 April 2016 (2016-04-24), pages 21 - 29, XP029640030, ISSN: 0927-7765, DOI: 10.1016/J.COLSURFB.2016.04.036
WON JE JEONG ET AL: "Continuous Fabrication of Biocatalyst Immobilized Microparticles Using Photopolymerization and Immiscible Liquids in Microfluidic Systems", LANGMUIR, vol. 21, no. 9, 1 April 2005 (2005-04-01), US, pages 3738 - 3741, XP055562251, ISSN: 0743-7463, DOI: 10.1021/la050105l
LIU ALLEN L ET AL: "Methods for Generating Hydrogel Particles for Protein Delivery", ANNALS OF BIOMEDICAL ENGINEERING, SPRINGER US, NEW YORK, vol. 44, no. 6, 9 May 2016 (2016-05-09), pages 1946 - 1958, XP035897969, ISSN: 0090-6964, [retrieved on 20160509], DOI: 10.1007/S10439-016-1637-Z
SIGRIST H ET AL: "SURFACE IMMOBILIZATION OF BIOMOLECULES BY LIGHT", OPTICAL ENGINEERING, SOC. OF PHOTO-OPTICAL INSTRUMENTATION ENGINEERS, BELLINGHAM, vol. 34, no. 8, 1 August 1995 (1995-08-01), pages 2339 - 2348, XP000518229, ISSN: 0091-3286, DOI: 10.1117/12.201815
JAN-NIKLAS SCHÖNBERG ET AL: "One-Step Photochemical Generation of Biofunctionalized Hydrogel Particles via Two-Phase Flow", ACS APPLIED MATERIALS & INTERFACES, vol. 10, no. 46, 21 November 2018 (2018-11-21), US, pages 39411 - 39416, XP055560393, ISSN: 1944-8244, DOI: 10.1021/acsami.8b11757
B. LI ET AL.: "Synthesis of Biofunctional Janus Particles", MACROMOL. RAPID COMMUN, vol. 36, 2015, pages 1200 - 1204
K. W. BONG: "Synthesis of Cell-Adhesive Anisotropic Multifunctional Particles by Stop Flow Lithography and Streptavidin-Biotin Interactions", LANGMUIR, vol. 31, 2015, pages 13165 - 13171
Attorney, Agent or Firm:
KALHAMMER, Georg et al. (DE)
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Claims:
Patentansprüche

1. Verfahren zur Erzeugung von biofunktionalen Polymerpartikeln, umfassend die folgenden Schritte:

(i) Herstellung einer Lösung, enthaltend mindestens ein Polymer, wobei es sich bei dem Polymer um ein Copolymer mit eingebauten Vernetzergruppen handelt, und mindestens ein Biomolekül,

(ii) Eintragung der in Schritt (i) hergestellten Lösung in ein Trägerfluid unter gleichzeitiger Bildung räumlich getrennter Tröpfchen,

(iii) Verfestigung der in Schritt (ii) erhaltenen Tröpfchen durch Aktivierung der Vernetzergruppen mittels eines Auslösers und darauf folgende Vernetzung der Copolymere unter Bindung der Biomoleküle.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , wobei es sich bei den in dem Copolymer eingebauten Vernetzergruppen um Benzophenon-Gruppen, Diazocarbonyl-Gruppen, Azid-Gruppen oder Antrachinon-Gruppen, vorzugsweise um Benzophenon-Gruppen, handelt.

3. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich bei der in Schritt (i) hergestellten Lösung um eine wässrige Lösung oder um eine wässrige Pufferlösung handelt.

4. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Biomolekül um Oligo- und Polynukleotide, synthetische Nukleotide, DNA, RNA, Oligo- und Polypeptide, Protein, Antikörper, Enzyme oder Vitamine handelt.

5. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Erzeugung der Tröpfchen in Schritt (ii) dadurch erfolgt, dass die in Schritt (i) hergestellte Lösung (Copolymer/Biomolekül-Lösung) in einem Kanalsystem an einer T-Kreuzung mit dem Trägerfluid zusammengeführt wird, wobei die T-Kreuzung zu einem Zug von Tröpfchen der Copolymer/Biomolekül-Lösung in den Trägerfluid führt.

6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Trägerfluid um Öl oder Luft handelt.

7. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei sich in Schritt (iii) ein Hydrogel netzwerk bildet, in das die Biomoleküle kovalent eingebunden sind.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem in Schritt (iii) verwendeten Auslöser um UV-Licht handelt, vorzugsweise um UV-Licht in einem Wellenlängenbereich von 200-400 nm.

9. Biofunktionale Polymerpartikel, erhältlich nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-8.

10. Biofunktionale Polymerpartikel gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie im Wesentlichen transparent sind.

1 1. Biofunktionale Polymerpartikel gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie lichtdurchlässig sind.

12. Biofunktionale Polymerpartikel gemäß einem der Ansprüche 9 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Biomoleküle im Inneren der Polymerpartikel enthalten oder eingebettet sind.

13. Biofunktionale Polymerpartikel gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sich auch auf der Oberfläche der Polymerpartikel Biomoleküle befinden, die mit dem Polymer verbunden sind.

14. Biofunktionale Polymerpartikel gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Hydrogel-Partikel handelt.

15. Verwendung von biofunktionalen Polymerpartikeln gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14 zur Analyse von Biomolekülen.

Description:
Verfahren zur Erzeugung von biofunktionalen Polymerpartikeln

Die spezifische Anreicherung biologisch relevanter Substanzen aus einer Probe, beispielsweise zur späteren Analyse, kann u.a. durch biofunktionalisierte Partikel erfolgen. Für die Herstellung solcher Partikel sind viele verschiedene Methoden bekannt.

Ein Problem bei bekannten Methoden ist jedoch, dass eine Biofunktionalisierung in einem oder mehreren Reaktionsschritten nach der eigentlichen Partikelherstellung erfolgen muss.

Die Synthese von Janus Partikeln, die mittels Klick-Chemie biofunktionalisiert werden können, ist beispielsweise beschrieben in B. Li et al., "Synthesis of Biofunctional Janus Particles", Macromol. Rapid Commun. 2015, 36, 1200-1204. Darin wird Styrol zusammen mit einem Crosslinker unter Bildung von Polystyrol-Partikeln polymerisiert. Diese werden zu festen Polystyrol/Polyvinylbenzylchlorid-Janus Partikel umgesetzt. Die Janus Partikel können dann in mehreren Schritten mittels Thiol-Klick-Chemie biofunktionalisiert werden.

Die Synthese von biofunktionalisierten Acrylat-PEG Partikeln ist beschrieben in K. W. Bong, "Synthesis of Cell-Adhesive Anisotropie Multifunctional Particles by Stop Flow Lithography and Streptavidin-Biotin Interactions", Langmuir 2015, 31 , 13165-13171. In diesen Partikeln wird eine kovalente Bindung zwischen der Acrylatgruppe eines Acrylat- PEG-NHS Polymers und der NH 2 -Gruppe von Streptavidin mittels Amin-NHS Kupplung erzeugt. Die resultierenden Streptavidin-PEG-Acrylat-Partikel werden anschließend mit PEG (Polyethylenglycol)-Monomeren gemischt und zur Bildung eines PEG-Netzwerks kurz mit UV Licht behandelt (365 nm). Dieses kann dann aufgrund der starken Wechselwirkung von Streptavidin und Biotin mit Biotin funktionalisiert werden.

Wenn die Partikel erst nach ihrer eigentlichen Herstellung mit Biomolekülen funktionalisiert werden können, wie in den obigen Literaturstellen beschrieben, macht dies die Herstellung von Partikeln mit verschiedenartiger Biofunktionalität arbeits- und zeitintensiv. Zudem erschwert die Durchführung von mehreren Oberflächenreaktionen die Reproduzierbarkeit der Oberflächendichte der biofunktionellen Bindestellen. Eine schnelle, unkomplizierte, universelle und kostengünstige Herstellung solcher biofunktionaler Partikel ist wünschenswert. Eine Alternative zur nachträglichen Modifikation (Funktionalisierung) der Polymerpartikel mit Biomolekülen, wie in den obigen Literaturstellen beschrieben, ist die Modifikation von Biomolekülen vor der eigentlichen Partikelherstellung. So offenbart die WO 2010/138187 A1 ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure-modifizierten Polymerpartikeln, wobei im Zuge des Verfahrens eine Reaktionsmischung aus Monomeren, von denen ein Teil ein Oligonukleotid gebunden hat, gebildet wird, die unter Tröpfchenbildung in eine nicht- wässrige Phase überführt und anschließend unter Bildung eines Netzwerkes polymerisiert wird. Bei den Monomeren, welche das Oligonukleotid gebunden haben, handelt es sich insbesondere um Acrydit-Oligonukleotid.

Bisher ist es unmöglich, biofunktionale Festphasen herzustellen, ohne die feste Phase nachträglich und/oder die funktionsbestimmenden Biomoleküle im Vorlauf der Reaktion zu modifizieren. Eine solche Partikelfunktionalisierung umfasst, wie oben gezeigt, mehrere zusätzliche Reaktionsschritte. Der Erfolg dieser Oberflächenreaktionen ist dabei zum Teil nicht einfach zu quantifizieren. Erschwerend kommt hinzu, dass typischerweise für jede einzelne Biofunktionalität ein spezifischer Reaktionsweg entwickelt werden muss. Dies bedeutet, dass für jede analytische Aufgabe neue Partikel entwickelt und hergestellt werden müssen. Zudem beruht die Herstellung der Polymerpartikel typischerweise auf Polymerisationsprozessen, was häufig aufgrund unvollständiger Reaktionen und eventuell benötigter Lösemittel Verunreinigungen mit sich bringt.

Zur Überwindung dieser Probleme schlägt die vorliegende Erfindung nunmehr ein bequemes, einstufiges Verfahren zur Erzeugung von biofunktionalen Polymerpartikeln vor, welches lediglich einen chemischen Reaktionsschritt umfasst, und verunreinigende Lösungsmittel oder sonstige Nebenprodukte vermeidet. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzeugung von biofunktionalen Polymerpartikeln umfasst dabei gemäß Anspruch 1 die folgenden Teilschritte:

(i) Herstellung einer Lösung, enthaltend mindestens ein Polymer, wobei es sich bei dem Polymer um ein Copolymer mit eingebauten Vernetzergruppen handelt, und mindestens ein Biomolekül,

(ii) Eintragung der in Schritt (i) hergestellten Lösung in ein Trägerfluid unter gleichzeitiger Bildung räumlich getrennter Tröpfchen, (iii) Verfestigung der in Schritt (ii) erhaltenen Tröpfchen durch Aktivierung der Vernetzergruppen mittels eines Auslösers und darauf folgende Vernetzung der Copolymere unter Bindung der Biomoleküle.

Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Unteransprüchen definiert. Die Erfindung wird nachfolgend im Detail beschrieben.

Bei "biofunktionalen Polymerpartikeln" handelt es sich um Polymerpartikel, an die ein Biomolekül chemisch, insbesondere kovalent, gebunden ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den biofunktionalen Polymerpartikeln insbesondere um das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens, welches nachfolgend im Detail beschrieben wird. Wenn also in dem erfindungsgemäßen Verfahren Copolymere zur Herstellung der biofunktionalen Polymerpartikel verwendet werden, so ist der Begriff "biofunktionalen Polymerpartikeln" gleichbedeutend mit "biofunktionalen Copolymerpartikeln".

Bei einem "Biomolekül" im Sinne der hierin beschriebenen Erfindung handelt es sich um eine biologische relevante Substanz, also um eine Substanz, welche eine biologische Funktion in einem Organismus erfüllt.

Insbesondere werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung "nicht-modifizierte Biomoleküle" verwendet. Bei einem "nicht-modifizierten Biomolekül" handelt es sich um ein Biomolekül, welches nicht in einer Weise chemisch verändert wurde, um Kupplungsfähigkeit in einer Polymerisierungsreaktion zu erreichen. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens insbesondere verwendeten Biomoleküle sind also nicht dahingehend modifiziert (funktionalisiert), dass sie sich als Monomer in einer Polymerisierungsreaktion eignen.

Bei dem "Copolymer" im Sinne der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Polymer, das aus mindestens zwei (chemisch) verschiedenartigen Wiederholungseinheiten aufgebaut ist. Typischerweise enthält eine dieser Wiederholungseinheiten die Vernetzergruppe, welche demnach in das Copolymer im Zuge der Copolymerisierungsreaktion eingebaut wird.

Bei den "Vernetzergruppen", die in dem Copolymer eingebaut sind, handelt es sich um eine mehrfach im Copolymer vorhandene Struktureinheit, welche durch einen (externen) Auslöser unter Bildung von reaktiven Zwischenstufen wie zum Beispiel Radikalen, Nitren- oder Carbengruppen aktiviert werden kann. Durch die Aktivierung der Vernetzergruppen wird eine Reaktion initiiert, die eine Insertion in C-H Bindungen, die sich in dem Copolymer als auch in den Biomolekülen befinden, ermöglicht. Die Insertionsreaktion kann in einem konzertierten oder nicht konzertierten Mechanismus erfolgen. Bei Radikalen erfolgt zunächst eine Wasserstoffabstraktion. Durch Rekombination erfolgt die Knüpfung kovalenter Bindungen, insbesondere zwischen benachbarten Polymerketten und benachbarten Biomolekülen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Vernetzergruppen um photoaktive Vernetzergruppen, welche durch Licht, insbesondere durch UV-Licht, unter Bildung reaktiver Zwischenstufen angeregt werden können. Die Vernetzergruppen sind typischerweise bereits in einer Wiederholungseinheit des Copolymers vorhanden und werden im Zuge der Herstellung des Copolymers, welche durch Polymerisierung von mindestens zwei verschiedenartigen Wiederholungseinheiten erfolgt, in das Copolymer eingebaut.

Die Aktivierung der Vernetzergruppen unter Radikalbildung erfolgt durch einen "Auslöser". Bei dem Auslöser handelt es sich somit um ein (externes) Mittel zur Aktivierung der Vernetzergruppen, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zu einer dreidimensionalen Vernetzung von Polymerketten und Biomolekülen führt. Vorzugsweise bildet sich dabei ein Hydrogelnetzwerk, in das jedes in der Lösung vorhandene Biomolekül während der Vernetzung kovalent eingebunden wird.

In Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Lösung, enthaltend ein Copolymer mit eingebauten Vernetzergruppen und ein nicht-modifiziertes Biomolekül, hergestellt. Zur Herstellung dieser Lösung (kurz: "Copolymer/Biomolekül-Lösung") können wässrige Lösungsmittel wie auch organische Lösungsmittel verwendet werden. Es funktionieren alle dem Fachmann bekannten Lösungsmittel, die das eingesetzte Copolymer und das Biomolekül lösen. Beispiele für Lösungsmittel, die zur Herstellung der Lösung aus Copolymer und nicht-modifiziertes Biomolekül verwendet werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: Wasser, wässrige Pufferlösungen, Mischungen aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Ethanol, Isopropanol, Aceton, Essigsäure oder Ethylacetat. Voraussetzung für die Verwendung dieser Lösungsmittel ist natürlich, dass das Lösungsmittel die Aktivität der Biomoleküle nicht zerstört oder mindert. Vorzugsweise werden Copolymer und nicht-modifiziertes Biomolekül in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens in Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung gelöst.

Das im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Copolymer umfasst eine Hauptwiederholungseinheit sowie mindestens eine weitere Wiederholungseinheit, welche mit der Vernetzergruppe funktionalisiert ist. Die Hauptwiederholungseinheit ist dabei die Wiederholungseinheit, welche prozentual am stärksten im Copolymer vertreten ist.

Beispiele für Monomere, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Bildung der Hauptwiederholungseinheit in dem Copolymer verwendet werden können umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: Hydroxyethyl methacrylat (HEMA),

Hydroxyethoxyethylmethacrylat (HEEMA), Hydroxydiethoxyethylmethacrylat (HDEEMA), Methoxyethyl methacrylat (MEMA), Methoxyethoxyethylmethacrylat (MEEMA), Methoxydiethoxyethylmethacrylat (MDEEMA), Ethylene glycol dimethacrylat (EGDMA), Acrylsäure (AA), N-vinyl-2-pyrrolidon (NVP), N-isopropyl AAm (NIPAAm), Vinyl acetat (VAc), N-(2-hydroxypropyl)methacrylamid (HPMA), Ethylenglycol (EG), PEG acrylat (PEGA), PEG methacrylat (PEGMA), PEG diacrylat (PEGDA), PEG dimethacrylat (PEGDMA) (wobei PEG = Polyethylenglycol).

Wie oben bereits bemerkt, bildet sich im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vernetzungsschritt (iii) vorzugsweise ein Hydrogel netzwerk, in das die Biomoleküle eingebaut werden. Hydrogele werden aus Polymeren gebildet, die eine große Menge an Wasser absorbieren können oder mit Wasser ein wassergequollenes Polymernetzwerk bildet. Polymere, die mit Wasser ein Hydrogel bilden, sind zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet und bevorzugt. Beispiele für Polymere, die mit Wasser ein Hydrogel bilden, ohne darauf beschränkt zu sein, umfassen: Polyethylenglycole (PEG), Polyacrylsäuren, Polydimethylacrylamide, Polyvinylalkohole, Polyhydroxyethylmethacrylate, Polyvinylpyrrolidone, Alginate. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung leiten sich die entsprechenden Copolymere also von den (zum Teil formalen) Monomeren Ethylenglycol, Acrylsäure, Dimethylacrylamid, Vinylalkohol, Hydroxyethylmethacrylat, Vinylpyrrolidone, und a-L-Guluronsäure/ß-D-Mannuronsäure zur Bildung der Hauptwiederholungseinheit des Copolymers ab.

Der Anteil der prozentual am stärksten im Copolymer vertretenden Wiederholungseinheit beträgt typischerweise 50-99 Mol-%, bezogen auf die Stoffmenge aller im Copolymers vorhandenen Wiederholungseinheiten, wobei ein Anteil von 60-98 Mol-% bevorzugt ist und ein Anteil von 70-95 Mol-% noch stärker bevorzugt ist.

Bei den Vernetzergruppen des Copolymers handelt es sich beispielsweise um Benzophenon-Gruppen, Diazocarbonyl-Gruppen wie beispielsweise Diazoester-Gruppen und Antrachinon-Gruppen, sowie Azid-Gruppen, wobei Benzophenon-Gruppen im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind. Bei Anregung durch den Auslöser gemäß Schritt (iii) des erfindunsggemäßen Verfahrens reagieren die Benzophenon- und Antrachinon-Gruppen radikalisch, die Diazocarbonyl-Gruppen reagieren über Carbene, die Azide über Nitrene. Allen Vernetzergruppen gemein ist die Vernetzung über C,H- Insertionsreaktionen.

Die Vernetzergruppen werden im Zuge der Herstellung des Copolymers eingebaut, indem das Copolymer aus mindestens zwei verschiedenen Monomeren hergestellt wird, wobei mindestens ein Monomer die Vernetzergruppe enthält. Zur Herstellung solcher Copolymere greift der Fachmann auf bekannte Polymerisierungsverfahren zurück, beispielsweise auf die Polykondensation, die Polyaddition, die anionische Polymerisation, auf die kationische Polymerisation oder die radikalische Polymerisation. Die Herstellung eines Copolymers mit N,N-Dimethylacrylamid als Hauptmonomerkomponente und Methacryloyloxybenzophenon als Monomer, welches die Vernetzergruppe in das Copolymer einführt, ist in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindungsbeschreibung offenbart. Weitere Beispiele für Monomere mit Vernetzergruppe sind Acrylamid-3-hydroxy-2- anthrachinon (doi 10.1002/adma.201703469) und Diazomalonsäureester-Monomer (doi 10.1002/anie.201704486).

Der typische Anteil an Wiederholungseinheiten mit Vernetzergruppe in dem Copolymer beträgt 1 -20 Mol-%, bezogen auf die Stoffmenge aller im Copolymer vorhandenen Wiederholungseinheiten, wobei ein Anteil von 2-15 Mol-% stärker bevorzugt ist und ein Anteil von 5-10 Mol-% noch stärker bevorzugt ist.

Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit des Copolymers können im Zuge der Herstellung des Copolymers optional auch weitere hydrophile Gruppen eingeführt werden durch Copolymerisierung mit Monomeren, die entsprechende hydrophile Gruppen, beispielsweise Hydroxy-, Sulfonsäure- oder Carbonsäure-Gruppen enthalten. Das in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindungsbeschreibung hergestellte Copolymer enthält neben N,N-Dimethylacrylamid (Hauptkomponente) und Methacryloyloxybenzophenon (Vernetzungsgruppenkomponente), auch Na-4-Styrolsulfonat, welches der Verbesserung der Wasserlöslichkeit des Copolymers dient.

Der Anteil an Wiederholungseinheiten mit weiterer hydrophiler Gruppe in dem Copolymer beträgt bis zu 10 Mol-%, bezogen auf die Stoffmenge aller im Copolymers vorhandenen Wiederholungseinheiten, ein Anteil von bis zu 5 Mol-% bevorzugt ist. Wenn in dem Copolymer vorhanden, ist ein Mindestanteil der Wiederholungseinheit mit weiterer hydrophiler Gruppe mindestens 0.5 Mol-%, vorzugsweise mindestens 1 Mol-%, noch stärker bevorzugt mindestens 2 Mol-%.

Typische Molekulargewichte des im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Copolymers liegen im Bereich von 100 000 g/mol bis 1 000 000 g/mol, wobei Molekulargewichte zwischen 200 000 und 500 000 g/mol bevorzugt sind.

Wie bereits oben erwähnt, handelt es sich bei dem Lösungsmittel zur Herstellung der Lösung in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise um Wasser oder um eine wässrige Pufferlösung. Die wässrige Pufferlösung dient dazu, einen bestimmten pH Wert einzustellen, bei dem das Biomolekül in Lösung geht. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren pH Bereiche werden damit letztlich durch das Biomolekül selbst bestimmt. Solange dieses bei einem bestimmten pH Wert nicht denaturiert, ist der pH Wert, bei dem das Biomolekül in Lösung geht, auch verwendbar. Typischerweise liegt der pH Wert der Lösung im Bereich von 2 bis 12, stärker bevorzugt zwischen 3 und 1 1. Als Puffer können dem Fachmann bekannte Puffersystem verwendet werden, beispielsweise Natriumacetat, HEPES, Natriumcitrat, Natriumsuccinat, Na-K- Phoshpat, TRIS, TRIS-maleat, Imidazol maleat, Bistrispropan, CAPSO, CHAPS, MES, Imidazol, DI-H20, PBS, PBS-T, NaPi-Tween (0.1 ), TNE oder RiPa. Dabei kann die Pufferphase durchaus an der Vernetzungsreaktion teilnehmen, das erfindungsgemäße Verfahren ist trotzdem durchführbar.

Zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist jegliches Biomolekül, da jedes Biomolekül über C-H-Bindungen verfügt, welche zur Bildung der kovalenten Bindung mit der festen Phase herangezogen werden können. Beispiele für Biomoleküle, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: Oligo- und Polynukleotide, synthetische Nukleotide, DNA (Desoxyribonukleinsäure), RNA (Ribonukleinsäure), einschließlich mRNA und microRNA (miRNA), Oligo- und Polypeptide, Proteine, Antikörper, Enzyme und Vitamine wie z.B. Biotin.

Die Tröpfchen in Schritt (ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden mittels Zweiphasenmikrofluidik erzeugt. Hierzu wird die Lösung, die das nicht-modifizierte Biomolekül und das Copolymer in gelöster Form enthält, in ein Trägerfluid eingetragen.

Bei dem Trägerfluid handelt es sich generell um eine Flüssigkeit oder ein Gas, welches nicht mit der in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellten Lösung mischbar ist, was bedeutet, dass ein Zweiphasensystem erhalten wird. Wenn es sich also bei der in Schritt (i) hergestellten Lösung um eine wässrige Lösung handelt (welche durch Lösen des Copolymers und des Biomoleküls in Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung herstellbar ist), handelt es sich bei dem Trägerfluid beispielsweise um eine hydrophobe Flüssigkeit, insbesondere um Öl, wobei es sich bei dem Öl um fluoriertes Öl wie beispielsweise FC43 (Perfluortributylamin, C I2 F 27 N) ) oder um Silikonöle handeln kann. Auch Luft kann als Trägerfluid verwendet werden, da auch mit Luft ein Zweiphasensystem erhalten wird.

Durch Eintragung der in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellten Copolymer/Biomolekül-Lösung, beispielsweise einer wässrigen Copolymer/Biomolekül- Lösung, in ein Trägerfluid, beispielsweise in eine hydrophobe Flüssigkeit, insbesondere in ein Öl, entsteht ein Zweiphasensystem. Mit der Eintragung werden gleichzeitig räumlich getrennte Tröpfchen erzeugt. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die Lösung, welche das Copolymer und das Biomolekül enthält, in einem mikrofluidischen Kanalsystem an einer T-Kreuzung mit dem Trägerfluid zusammengeführt wird, wobei die T-Kreuzung zu einem Zug von Tröpfchen der Copolymer/Biomolekül-Lösung in dem Trägerfluid führt.

Bisher konnten Polymere nur im trockenen / quasi lösungsmittelfreien und dadurch hoch konzentrierten Zustand vernetzt werden konnten. Es liegt auf der Hand, dass der Einsatz trockener Polymere in einem fluidischen System nicht möglich wäre. Überraschenderweise zeigte sich, dass ein gewisses Fenster für die Konzentration des im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Copolymers zur Lösung in entsprechenden Puffern/Lösemitteln existiert, innerhalb dessen die Copolymerlösung ausreichend niederviskos ist, um in dem mikrofluidischen System die gewünschten Kompartimentierungseffekte zu erzielen und gleichzeitig noch ausreichend Polymerketten pro Volumen vorhanden sind, um intermolekulare Vernetzungen überwiegen zu lassen. Typische Konzentrationen für das Copolymer in der in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugten Lösung betragen 10-1000 mg/mL, stärker bevorzugt 40-500 mg/mL, noch stärker bevorzugt 70-300 mg/mL. Typische Konzentrationen für das Biomolekül in der in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugten Lösung betragen 0.2-2000 mM, stärker bevorzugt 0.5-1500 mM, noch stärker bevorzugt 1 -1000 mM.

In Schritt (iii) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Tröpfchen unter Bildung einer festen Phase gehärtet. Dies erfolgt durch Aktivierung der Vernetzergruppen mittels eines externen Auslösers, wie beispielsweise Licht. Dadurch wird eine Reaktion ausgelöst, die die Spaltung von C-H Bindungen in dem Copolymer und dem Biomolekül bewirkt und damit unter Neuknüpfung von kovalenten Bindungen zur dreidimensionalen Vernetzung von in Lösung befindlichen Copolymer und Biomolekülen führt. Die Biomoleküle werden damit kovalent in ein festes polymeres Netzwerk eingebaut, was die Abwanderung der Biomoleküle aus dem Partikel verhindert. Vorzugsweise wird dabei ein Hydrogelnetzwerk aufgebaut, in das die Biomoleküle eingebaut sind.

Bei dem Auslöser handelt es sich beispielsweise um Licht, insbesondere um UV-Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 200 bis 400 nm, stärker bevorzugt 250 bis 385 nm, noch stärker bevorzugt 300 bis 370 nm. Durch die Bestrahlung durchlaufen die in dem Copolymer enthaltenen Vernetzergruppen im Falle der Benzophongruppen einen h-tt * - Übergang in einen biradikalischen Triplettzustand, der nahezu jedes Wasserstoffatom aus benachbarten C-H-Gruppen in enger Nachbarschaft abstrahiert. Folglich bilden sich zwei Radikale, die sich rekombinieren können, um eine kovalente Bindung zu bilden, welche die beiden Ketten verbindet, was zu einer (formalen) C,H-lnsertionsvernetzungsreaktion (CHic) führt. Ähnliche C,H-lnsertionsreaktionen können auch über Nitren- oder Carbenzwischenstufen erreicht werden. Da grundsätzlich jedes Biomolekül C-H-Gruppen besitzt, wird jedes in der Lösung vorhandene Biomolekül während der Vernetzung kovalent an das Netzwerk gebunden. Wenn beispielsweise DNA, RNA, Polynukleotide, Oligonukleotide oder synthetische Nukleotide als Biomoleküle verwendet werden, erfolgt die Vernetzung über die Base Thymin. Wenn Proteine als Biomoleküle verwendet werden, erfolgt die Vernetzung über die Aminosäuren Tyrosin und Tryptophan, da diese Bausteine über C-H Gruppen mit vernetzenden Eigenschaften verfügen.

Alternativ kann die Vernetzungsreaktion unter Verfestigung der Partikel auch durch eine Erhöhung der Temperatur ausgelöst werden, wobei die Höhe der Temperatur wiederum von der Temperaturstabilität des Biomoleküls bestimmt wird. Ungeeignet sind Temperaturen, bei denen das Biomolekül denaturiert. Ein typisches Temperaturfenster zur Auslösung der Vernetzungsreaktion ist unter der vorherigen Prämisse 60-120°C. Bevorzugter Auslöser ist allerdings die Bestrahlung der Tröpfchen mit UV Licht.

Die aus der Verfestigungsreaktion hervorgehenden festen biofunktionalen Partikel haben typischerweise einen Durchmesser von 50 nm bis 5 mm. Die Größe der Partikel wird bestimmt durch die Größe der Kanäle im mikrofluidischen System, die Flussraten im System, und den Aufbau des mikrofluidischen Systems in dem Bereich, wo die beiden Phasen aufeinandertreffen. Die Messung der Teilchengröße kann optisch mittels Lichtmikroskop oder Rasterelektronenmikroskop erfolgen.

Das Trägerfluid wird nach der Verfestigungsreaktion ausgewaschen und recycelt. Da das Trägerfluid nicht mischbar ist, bildet sich eine saubere Phasentrennung aus und die hergestellten Partikel weisen keinerlei Rückstände auf.

In einer besonderen Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen biofunktionalen Polymerpartikel im Wesentlichen transparent und/oder lichtdurchlässig.

In einer weiteren Ausführungsform sind die Biomoleküle im Inneren der erfindungsgemäßen biofunktionalen Polymerpartikel enthalten oder eingebettet oder eingebaut. Es können sich auch auf der Oberfläche der Polymerpartikel Biomoleküle befinden, die mit dem Polymer verbunden sind.

Die erfindungsgemäßen biofunktionalen Polymerpartikel sind vorzugsweise Hydrogel- Partikel.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich also wie folgt zusammenfassen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die flexible Erzeugung von biofunktionalen Polymerpartikeln direkt in einer Stufe (d.h. in einem chemischen Schritt) aus Copolymer und Biomolekül, ohne dass eine Vor- und Nachbearbeitung der Biomoleküle bzw. der biofunktionalen Partikeln notwendig ist. Da sämtliche Biomoleküle über C-H-Bindungen verfügen, kann die Methode für eine Vielzahl von Biomolekülen herangezogen werden. Da die Biomoleküle zudem kovalent gebunden werden, wird eine Abwanderung der Biomoleküle verhindert. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, dass der Anwender auf technisch anspruchsvolle, zeitlich intensive, teure und mehrstufige Modifikationen zur Biofunktionalisierung und Aufreinigungsschritte verzichten kann. Die Biomoleküle werden durch die Herstellung von biofunktionalen Polymerpartikeln gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren angereichert und können auf diese Weise leichter analysiert bzw. nachgewiesen werden. Dies ist für den Nachweis klinisch relevanter Analyten von Bedeutung.

Ein weiterer Vorteil ist, dass die Polymerpartikel eine hohe Kapazität für die Beladung mit Biomolekülen besitzen, insbesondere da die Biomoleküle auch im Inneren der Polymerpartikel eingebaut sind. Wenn die Polymerpartikel im Wesentlichen transparent ausgeführt sind, kann ein von erfindungsgemäßen Partikeln emittiertes Fluoreszenzsignal von einem Detektor zudem besser nachgewiesen werden als ein Signal von herkömmlichen Partikeln, die nur an ihrer Oberfläche Biomoleküle aufweisen.

Beschreibung der Abbildungen:

Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Erzeugung von biofunktionalisierten Polymerpartikeln nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Die Spritzenpumpen liefern das Trägerfluid (Öl) und die Copolymerlösung mit den Biomolekülen. Beide Flüssigkeiten werden an einer T-Kreuzung zusammengeführt, was zu einem Zug von Copolymerlösungströpfchen innerhalb des Trägerfluids führt. Das Copolymer innerhalb der Tröpfchen enthält photoaktive Einheiten, die mit benachbarten Polymerketten und den Biomolekülen bei der Belichtung in der nachgeschalteten UV-Kammer kovalent vernetzen. Die verfestigten Partikel werden in einem Eppendorf-Röhrchen gesammelt und in den jeweiligen Experimenten eingesetzt.

Abbildung 2: Lichtintensität der Fluoreszenzaufnahme der Polymerpartikel, die entweder mit a) Biotin oder b) DNA-Sonden funktionalisiert sind. Die Einsätze zeigen typische Fluoreszenzmikrographien der jeweiligen Polymerpartikel. Die Graphen werden auf die jeweilige Intensität der Positivkontrollen normiert.

Die folgenden Ausführungsbeispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren illustrieren und weiter erläutern, ohne den erfindungsgemäßen Gegenstand einzuschränken.

Beispiel 1 : Herstellung eines N,N-Dimethylacrylamid-basierten Copolymers mit eingebauten Benzophenon-Gruppen

Ein statistisches Copolymer, bestehend aus drei molekularen Bausteinen, wurde unter Verwendung eines radikalischen Polymerisationsverfahrens synthetisiert. In einem typischen Durchlauf wurden N,N-Dimethylacrylamid (DMAA, 92.5 Mol-%),

Methacryloyloxybenzophenon (MaBP, 5 Mol-%), und Na-4-Styrolsulfonat (SSNa, 2.5 Mol- %) unter Stickstoff in Methanol mit einer Konzentration von 2 mol / 1 gelöst und 0.1 mol% o, g'-Azoisobutyronitril (AIBN) zugegeben. Nach fünf Einfrier- und Tauzyklen wurde die Lösung in ein vorgeheiztes Wasserbad gegeben und bei 60°C für 20 h gehalten. Nach Beendigung der Polymerisationsreaktion wurde das Polymer durch tropfenweise Zugabe der Lösung zu einem großen Überschuss an Diethylether ausgefällt, abfiltriert und durch Umfällung aus Methanol gereinigt. Nach dem Gefriertrocknen wurde das Copolymer als weißes Pulver mit einer typischen Ausbeute von 50% und Mw von etwa 300 000 g/mol erhalten.

Die Hauptkomponente des Copolymers ist N,N-Dimethylacrylamid, welches als hydrophile Matrix dient, um unspezifische Wechselwirkungen mit der biologischen Umgebung zu verhindern (z.B. Proteinadsorption). 4-Methacryloxybenzophenon (MABP, 5 Mol-%) dient als zweiter Baustein und liefert dem Polymer photoreaktive Gruppen. Zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit des fertigen Copolymers wird als dritte Komponente das Natriumsalz von 4-Styrolsulfonat (SSNa, 2.5 Mol-%) verwendet, sodass das resultierende Copolymer eine Löslichkeit von mehr als 300 g/L aufweist.

Beispiel 2: Herstellung biofunktionaler Polymerpartikel

Das für das Ausführungsbeispiel gewählte System basiert auf der Photovernetzung einer wässrigen Lösung des in Beispiel 1 hergestellten Copolymers. Als Biomoleküle werden i) Biotin bzw. ii) DNA (HPV-Oligo 19, 36mer) verwendet. 200 mg Copolymer (100 mg/ml_) und 0.2 mg Biomolekül (0.1 mg/ml_) werden in 2 ml_ in wässriger Phase gelöst. Bei der wässrigen Phase handelt es sich für das Biotin-Beispiel um einen PBS (0.25x) Puffersystem, für das DNA-Beispiel um ein NaPi (100 mM) Puffersystem.

Mittels Mikrofluidik werden 20 pl_ der so erhaltenen wässrigen Lösungen an einer T- Kreuzung in FC 43 in einzelne Tröpfchen abgeschert. Die Photovernetzung der Tröpfchen erfolgt durch UV-Bestrahlung bei 365 nm in einer nachgestalteten UV-Kammer bei einer Dosis von 8 J/cm 2 . Dieser Partikelerzeugungsprozess mit integrierter Biofunktionalisierung ist in Abbildung 1 dargestellt.

Beispiel 3: Analyse der nach obigem Verfahren herqestellten biofunktionalen

Polymerpartikel

Die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltenen biofunktionalen Polymerpartikel sowie unmodifizierte, d.h. nicht biofunktionalisierte, Polymerpartikel (hergestellt aus den Polymeren des Beispiels 1 , wobei die Partikel analog dem obigen Verfahren gemäß Beispiel 2 ohne Biomolekül erhalten wurden), wurden mit einem entsprechenden fluoreszenzmarkierten Gegenstück inkubiert. Für den Proteinassay war das fluoreszenzmarkierte Gegenstück Cyanin 5 markiertes Streptavidin und für den DNA Assay mit Cyanin 5 markiertes HPV-19-Antisense. Die hintergrundkorrigierten Lichtintensitäten der jeweiligen Partikel, die durch Fluoreszenzmikroskopie gemessen wurden, sowie eine schematische Darstellung des jeweiligen Bindungsprinzips sind in Abbildungen 2 a) und 2 b) gezeigt.

Die jeweiligen modifizierten Partikel wirken als Positivkontrollen und die unmodifizierten Partikel als Negativkontrollen.

Die Daten zeigen eine erfolgreiche Immobilisierung und homogene Anfärbung der Biomoleküle. Ein deutlich höheres Positivsignal verglichen mit dem Signal der unmodifizierten Polymerpartikel aus der Negativkontrolle weist auf die geringe unspezifische Adsorption des eingesetzten Polymers hin. Der Variationskoeffizient des Fluoreszenzsignals aus den funktionalisierten Partikeln beträgt für die mit Biotin funktionalisierten Partikel 5 % und für die DNA-funktionalisierten Partikel 3 %. Diese Werte können mit den beschriebenen Werten in der Literatur, in denen die Biofunktionalität über mehrere vor- oder nachgelagerte Schritte herbeigeführt wurde, gut konkurrieren. Die Nachweisgrenze des markierten Proteintargets Streptavidin-Cy5 der biotinylierten Hydrogelpartikel wurde durch allmähliche Verringerung der Konzentration des markierten Proteintargets Streptavidin-Cy5 in der Inkubationslösung untersucht. Dies ergibt eine Nachweisgrenze von 9 pM für den vorgestellten Assay. Zusätzlich zeigt das Fluoreszenzsignal die erwartete lineare Abhängigkeit von der Konzentration, wie in Abbildung 2c zu sehen ist.