Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biolo gischer Zellen, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von getrockneten Hydrogel-Partikeln. Des Weiteren betrifft die Erfindung Trägerpartikel für eine Kultivierung biologischer Zellen, insbe sondere getrocknete Hydrogel-Partikel, die mit dem genannten Verfahren hergestellt sind, und Anwendungen der Trägerpartikel. Anwendungen der Erfindung sind bei der Kultivierung biologi scher Zellen, insbesondere bei der Kultivierung (Expansion) von multipotenten und pluripotenten Stammzellen oder von differenzierten Zellen, z.B. für das Tissue engineering, gegeben.

In der vorliegenden Beschreibung wird auf den folgenden Stand der Technik Bezug genommen, der den technischen Hintergrund der Erfindung darstellt:

[1] Dissertation "Untersuchung von strukturbildenden zellulären Prozessen im Kontext des Tissue Engineerings: Alginat-basierte Gerüststrukturen" Michael Gepp, Universität des Saarlandes, 2017;

[2] EP 2361968 Al;

[3] US 6642363 Bl; und

[4] M. Gepp et al. in J. Appl. Phycol." (2017) 29:2451-2461.

Die Verwendung von Polysaccharid-Polymeren, insbesondere von Alginat-Hydrogelen (auch kurz als Alginate bezeichnet), als Träger für Zellkulturen ist allgemein bekannt (siehe [1] und darin zi tierte Literatur). Alginate können schichtförmig auf zweidimensionalen Substraten oder als Zell- Carrier (kugelförmige Partikel, Kügelchen, Carrier-Beads, Micro-Carrier) in Suspensionen verwen det werden (siehe z. B. [1], [2]). In Abhängigkeit von der konkreten Kultivierungsaufgabe und den zu kultivierenden Zellen können Alginate durch Zusatzstoffe modifiziert werden. Zusatzstoffe um fassen z. B. Peptide oder Kollagen, welche die Zelladhäsion beeinflussen (siehe z. B. [3] oder [4]). Die Zellkultivierung auf Micro-Carriern in Suspensionen, z. B. in Bioreaktoren, hat Vorteile für die Bildung von dreidimensionalen Zellanordnungen (z. B. 3D-Aggregate, Sphäroide, Mikro-Carrier- Zell-Hybride) unter nahezu physiologischen Bedingungen, und sie erlaubt eine effiziente Prozess führung, da ein günstigeres Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis eingestellt werden kann. Die herkömmliche Zellkultivierung unter Verwendung von Alginaten als Micro-Carrier in einem Bioreaktor umfasst beispielsweise die folgenden Schritte. Zunächst werden Alginat-Kügelchen hergestellt, indem flüssiges Alginat durch Vernetzung in Kugelform ausgefällt wird (siehe z. B. [1]). Es wird eine Suspension von Alginat-Kügelchen gebildet, die, je nach Anwendung, eine Größenver teilung mit Durchmessern im Bereich von 200 pm bis 500 pm aufweisen. Die Breite der Größen verteilung, die in Abhängigkeit von Vertropfungsbedingungen einstellbar ist, kann sich auf die nachfolgende Zellkultivierung auswirken. Nach einem Waschen der vernetzten Alginat-Kügelchen erfolgt deren Modifizierung (Aktivierung und/oder Funktionalisierung), z. B. durch Ankopplung von Tyramin oder eine Einstellung der Elastizität der Kügelchen mittels vor der Herstellung der Alginat-Kügelchen gewählter Alginatmischungen. Die fertig modifizierten Alginat-Kügelchen wer den in einem Kultivierungsmedium suspendiert und in einen Bioreaktor gegeben. Die zu kultivie renden Zellen werden der Suspension im Bioreaktor zugesetzt, wo sie die Alginat-Kügelchen be siedeln und einem vorgegebenen Kultivierungsprotokoll unterzogen werden.

Das herkömmliche Verfahren hat die folgenden Nachteile und Beschränkungen. Die Herstellung der modifizierten Alginat-Kügelchen mit vorbestimmten Eigenschaften erfordert Spezialkennt nisse, was eine routinemäßige Bereitstellung der Alginat-Kügelchen in einem Labor zur Zellkulti vierung oder für eine industrielle Anwendung erschwert. Typischerweise werden die Alginat-Kü gelchen nach Vorgaben des Anwenders, z. B. mit einer bestimmten Größenverteilung, Durchmes ser) und/oder Modifizierung, hergestellt, zum Anwender in Suspension geliefert und beim Anwen der zunächst gelagert. Von Nachteil ist jedoch, dass der Transport und die Lagerung der Suspen sion beim Anwender die Alginat-Kügelchen in unerwünschter Weise verändern können.

Alginat-Kügelchen können aggregieren (verklumpen) oder zerfallen, was sich nachteilig auf eine genaue, reproduzierbare Dosierung durch den Anwender auswirkt. Bei der Lagerung kann die Ste rilität der Alginat-Kügelchen verloren gehen. Des Weiteren können Eigenschaften der fertigen Al ginat-Kügelchen vom Anwender nicht oder nur sehr beschränkt geprüft oder variiert werden. Bei spielsweise lässt sich die Größenverteilung von Alginat-Kügelchen in einer Suspension nachträg lich, wenn überhaupt, nur unter großem Aufwand verändern. Der Wasseranteil der Alginat-Kügel chen kann das Kultivierungsmedium im Bioreaktor verfälschen. Um dies zu vermeiden, kann die Zahl der Alginat-Kügelchen gering gehalten werden, was jedoch zu einem hohen Medienver brauch und einer kleinen Zahl kultivierbarer Zellen führt. Im Ergebnis zeichnen sich herkömmliche Verfahren zur Zellkultivierung durch eine geringe Effektivität, hohe Prozesskosten, keine Skalier- barkeit, eine beschränkte Erfolgsquote und eine geringe Reproduzierbarkeit aus. Es ist auch bekannt, Alginat-Kügelchen einer Trocknung zu unterziehen ([1]). Getrocknete Alginat- Kügelchen lassen sich besser lagern als in Suspension. Des Weiteren können getrocknete Alginat- Kügelchen mit dem Kultivierungsmedium im Bioreaktor rehydratisiert werden. Die Beschränkun gen der herkömmlichen Anwendungen von Alginat-Kügelchen konnten damit in der Praxis jedoch bisher nicht überwunden werden. Auch bei der Anwendung von herkömmlich getrockneten und rehydratisierten Alginat-Kügelchen hat sich gezeigt, dass die getrockneten Alginat-Kügelchen schwer handhabbar sind und die Zuverlässigkeit einer erfolgreichen Zellkultivierung und die Re produzierbarkeit des Kultivierungsergebnisses selbst bei Anwendung gleichbleibender Kultivie rungsprotokolle beschränkt sind.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biologischer Zellen, insbesondere ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von getrockneten Hydrogel-Partikeln, bereitzustellen, mit dem Nachteile herkömmlicher Techni ken überwunden werden. Die Aufgabe der Erfindung ist es des Weiteren, verbesserte Trägerparti kel für eine Kultivierung biologischer Zellen bereitzustellen, mit denen Nachteile herkömmlicher Trägerpartikel überwunden werden. Die Erfindung soll insbesondere Trägerpartikel bereitstellen, die reproduzierbare Eigenschaften haben, eine verbesserte Lagerungsfähigkeit aufweisen, ge nauer dosierbar sind, einfacher modifizierbar sind und/oder für eine routinemäßige Anwendung in Bioreaktoren verschiedener Bauformen und Aufgaben geeignet sind. Erfindungsgemäß herge stellte Trägerpartikel sollen insbesondere eine Zellkultivierung mit erhöhter Effizienz, Erfolgsquote und/oder Reproduzierbarkeit erlauben.

Diese Aufgaben werden jeweils durch ein Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biologischer Zellen und durch Trägerpartikel gelöst, welche die Merkmale der unab hängigen Ansprüche aufweisen. Bevorzugte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Gemäß einem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biologischer Zellen gelöst, das die folgenden Schritte umfasst. Es wird eine wässrige Suspension von sphärischen Hydrogel-Kügel chen bereitgestellt. Vorzugsweise werden die Hydrogel-Kügelchen durch Vernetzung eines Vor läuferpolymers mit einem ionischen Fällungsmittel frisch hergestellt. Die Herstellung der Hydro gel-Kügelchen kann mit an sich bekannten Verfahren erfolgen. Die Suspensionsflüssigkeit der wässrigen Suspension von Hydrogel-Kügelchen umfasst eine wässrige Lösung mit dem Fällungs mittel, in der die Herstellung der Hydrogel-Kügelchen erfolgt, und/oder eine Wasch- und/ oder Pufferlösung, mit der die Hydrogel-Kügelchen nach der Fällung optional gewaschen werden. An schließend erfolgt eine Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen, so dass getrocknete Hydrogel- Partikel gebildet werden. Die Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen umfasst eine Beaufschla gung der Hydrogel-Kügelchen mit einer reduzierten Temperatur (Temperatur unterhalb der Raumtemperatur, vorzugsweise unter 0°C) und mit einem Unterdrück (Druck geringer als Atmo sphärendruck). Die Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen erfolgt vorzugsweise im suspendier ten Zustand mit der Suspensionsflüssigkeit, wobei zunächst die Suspensionsflüssigkeit entfernt und dann die Hydrogel-Kügelchen getrocknet werden. Alternativ können die Hydrogel-Kügelchen vor der Gefriertrocknung aus der Suspensionsflüssigkeit der wässrigen Suspension entnommen werden, d. h. die Suspensionsflüssigkeit wird vor der Gefriertrocknung von den Hydrogel-Kügel chen getrennt.

Gemäß der Erfindung wird der Suspensionsflüssigkeit mindestens eine Lyoprotektant-Substanz zugesetzt, wobei die Hydrogel-Kügelchen in der Suspension vor der Gefriertrocknung mit der Lyoprotektant-Substanz beladen werden. Die Lyoprotektant-Substanz (oder: Lyoprotektivum) ist eine Substanz, die eine Beschädigung der Hydrogel-Kügelchen, insbesondere der Makromoleküle, aus denen die Hydrogel-Kügelchen aufgebaut sind, durch Eisbildung bei der Gefriertrocknung mi nimiert oder die Beschädigung verhindert. Des Weiteren wird eine Lyoprotektant-Substanz ver wendet, die bewirkt, dass die Hydrogel-Kügelchen nach der Gefriertrocknung, d. h. die getrockne ten Hydrogel-Partikel, unter der Wirkung der Lyoprotektant-Substanz eine Form aufweisen, wel che an eine sphärische Partikelform angenähert ist.

Die Hydrogel-Kügelchen umfassen vorzugsweise Alginat-Kügelchen (Alginat-Hydrogele). Die Um setzung der Erfindung in der Praxis ist jedoch nicht auf Alginat-Kügelchen beschränkt, sondern entsprechend auch mit Kollagen-, Gellan- oder Pektin-Hydrogelen. Alginat hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, da es einen Formspeicher-Effekt (Memory-Effekt) aufweist und nach dem Gefriertrocknen und der Rehydratisierung wieder sphärische Alginat-Kügelchen bildet.

Der Begriff "annähernd sphärische Partikelform" schließt eine Gestalt eines getrockneten Hydro- gel-Partikels ein, die einen Sphäroiden (insbesondere Kugel oder Ellipsoid) repräsentiert und eine glatte oder strukturierte Oberflächentopologie mit charakteristischen Strukturdimensionen wie z. B. Stufen, Vorsprüngen oder Vertiefungen, aufweist, die kleiner als eine Querschnittsdimension, vorzugsweise kleiner als 1/10 der Querschnittsdimension, des getrockneten Hydrogel-Partikels ist. Gemäß einem zweiten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch Trägerpartikel für eine Kultivierung biologischer Zellen, die getrocknete Hydrogel-Partikel umfas sen, die eine Lyoprotektant-Substanz enthalten und eine Form aufweisen, die an eine sphärische Form angenähert ist. Die Trägerpartikel sind vorzugsweise mit dem genannten Verfahren gemäß dem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung oder einer seiner Ausführungsformen her gestellt. Vorzugsweise haben die Trägerpartikel eine charakteristische Querschnittsdimension, wie z. B. einen Durchmesser, im Bereich von 50 pm bis 2 mm.

Gemäß einem dritten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch An wendungen der Trägerpartikel gemäß dem zweiten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung oder ihren Ausführungsformen als Zell-Carrier für die Kultivierung biologischer Zellen gelöst. Ge mäß bevorzugten Varianten kann die Anwendung der Trägerpartikel in einem Suspensions-Biore- aktor, insbesondere einem Kultivierungsgefäß, einer Mikrotiterplatte, hängenden Tropfen, einem Zellkulturbeutel, einem (Suspensions-)bioreaktor und/oder einer Schale, wie zum Beispiel einer Petrischale, vorgesehen sein. Vorzugsweise umfasst die Anwendung der Trägerpartikel die Phasen Herstellung der getrockneten Partikel, Rehydratisierung und Waschung, Zellinokulation, Zellver mehrung und Zellpassage/Ernte.

Die Erfinder haben festgestellt, dass durch die erfindungsgemäße Beladung der Hydrogel-Kügel chen mit der Lyoprotektant-Substanz, welche die annähernd sphärische Partikelform der Getrock neten Hydrogel-Partikel bewirkt, die Nachteile herkömmlicher suspendierter oder getrockneter Alginat-Kügelchen in Bezug auf die Lagerfähigkeit, Dosierbarkeit und Handhabbarkeit vermieden werden. Es wird eine schonende Gefriertrocknung mit einem Struktur- und Funktionserhalt der sphärische Hydrogel-Kügelchen bewirkt.

Die Lagerfähigkeit ist verbessert, da ein Verkleben oder Aggregieren vermieden wird, im trocke nen Zustand die Sterilität besser aufrechterhalten werden kann und somit ein Verkeimen der prä parierten Carrier-Beads vermieden werden kann. Diese Vorteile gelten insbesondere auch gegen über den herkömmlichen Ansätzen einer Gefriertrocknung von Alginat-Kügelchen, z. B. gemäß [1] So haben die Erfinder festgestellt, dass die herkömmlichen Alginat-Kügelchen im getrockneten Zu stand keine sphärische, sondern eine irregulär deformierte, z. B. gefaltete und/oder durch Risse oder Ausstülpungen versehene Gestalt haben, welche die Beschaffenheit der getrockneten Algi nat-Kügelchen, z. B. durch Dichteschwankungen im Schüttmaterial und irreguläre Klumpenbil dung, beeinträchtigt. Erfindungsgemäß hergestellte getrocknete Hydrogel-Partikel begünstigen eine sterile Lyophilisation und Rehydratisierung. Die Dosierbarkeit ist verbessert, da die getrockneten Hydrogel-Partikel ein homogenes Material bilden, das vollständig rieselfähig ist oder einen schnittfähigen Kuchen (Lyo-Kuchen, auch als ge trocknete Produktmatrix bezeichnet) bildet. Die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Konzent rationseinstellung der Carrier-Beads im Bioreaktor wird verbessert. Die getrockneten Hydrogel- Partikel können z. B. durch eine Volumenmessung, eine Massemessung und/oder eine optische Messung quantifiziert werden. Da die Getrockneten Hydrogel-Partikel opak sind, kann mit der op tischen Messung die Rehydratisierung im Bioreaktor geprüft werden.

Die getrockneten Hydrogel-Partikel können vereinfacht verarbeitet werden. Die Verarbeitung er folgt vorzugsweise in einer Sterilbank, wobei jedoch zur Dosierung kein Pipettieren erforderlich ist. Die getrockneten Hydrogel-Partikel können vereinfacht vorportioniert werden. Im Prozess der Herstellung und Anwendung der getrockneten Hydrogel-Partikel wird ein verbessertes Qualitäts management ermöglicht.

Die getrockneten Hydrogel-Partikel können als rieselfähiges Schüttgut oder in Tablettenform an gewendet und insbesondere direkt in einen Bioreaktor (Gefäß, in dem die Zellkultivierung erfolgt und das eine Einstellung von biochemischen und physikalischen Kultivierungsbedingungen ermög licht) eingebracht werden. Vorteilhafterweise verfälschen die getrockneten Hydrogel-Partikel nicht das Gesamtvolumen des Kultivierungsmediums im Bioreaktor.

Die Anwendung der rehydratisierten Hydrogel-Kügelchen erfolgt vorzugsweise, indem die ge trockneten Hydrogel-Partikel direkt in das Kultivierungsmedium im Bioreaktor gegeben werden. Die zu kultivierenden Zellen können bei Zufuhr der getrockneten Hydrogel-Partikel im Kultivie rungsmedium bereits suspendiert sein oder nach der Rehydratisierung der getrockneten Hydro gel-Partikel in den Bioreaktor zugeführt werden. Der Rehydratisierungsgrad der getrockneten Hydrogel-Partikel wird vorzugsweise mit einer optischen Transmissionsmessung- oder Streulicht messung am Kultivierungsmedium ermittelt. Besonders bevorzugt erfolgt die Zufuhr der Zellen in das Kultivierungsmedium, nachdem die getrockneten Hydrogel-Partikel vollständig hydratisiert sind.

Die Rehydratisierung der getrockneten Hydrogel-Partikel, z. B. in Wasser, kann optional als weite rer Teilschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens betrachtet werden. Vorteilhafterweise weisen die bei der Rehydratisierung gebildeten Hydrogel-Kügelchen (rehydratisierte Hydrogel-Kügelchen) auch nach der Rehydratisierung eine sphärische Partikelform auf. Vorzugsweise zeichnen sich die rehydratisierten Hydrogel-Kügelchen durch die Kugelform aus, wie sie vor der Gefriertrocknung gegeben ist. Damit wird in einer Inokulationsphase die Kultivierung von Zellen auf den Hydrogel- Kügelchen begünstigt. Des Weiteren zeichnen sich kugelförmige, rehydratisierte Hydrogel-Kügel chen vorteilhafterweise durch ein günstiges Schwebe-Verhalten in der Suspension und eine im Vergleich zu deformierten Hydrogel-Kügelchen verminderte Neigung zu unerwünschten Aggrega tionen aus.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Hydrogel-Kügelchen mit einer Proteinschicht beladen. Diese Modifizierung erfolgt vorzugsweise nach Herstellung der Hyd rogel-Kügelchen und vor der Gefriertrocknung. Die Proteinschicht kann z. B. Proteine der extrazel lulären Matrix umfassen, so dass vorteilhafterweise eine Adhäsion der Zellen auf rehydratisierten Hydrogel-Kügelchen begünstigt wird. Die Proteinschicht kann eine sub-Monolage, eine Monolage oder eine Multilage von Proteinmolekülen auf den Hydrogel-Kügelchen umfassen. Beispielsweise wird nach der Herstellung der Hydrogel-Kügelchen in einer Suspension der Suspensionsflüssigkeit das mindestens eine, zu koppelnde Protein zugesetzt und mit dem Hydrogel-Kügelchen inkubiert. Vorteilhafterweise erlaubt die Inkubation eine kovalente Kopplung von mindestens einem Protein oder einem Vermittlermolekül mit der gesamten Oberfläche, einschließlich eventueller Poren, der Hydrogel-Kügelchen.

Die Beladung mit der Proteinschicht erfolgt vorzugsweise vor der Gefriertrocknung. Bei ausge wählten Anwendungen der Erfindung kann die Beladung mit der Proteinschicht nach der Gefrier trocknung, insbesondere nach der Rehydratisierung, z. B. im Bioreaktor, erfolgen. Beispielsweise kann mindestens ein Protein aus dem Kultivierungsmedium im Bioreaktor oder von bereits im Bio reaktor vorhandenen Zellen geliefert werden.

Vorzugsweise werden die Hydrogel-Kügelchen mit mindestens einem Vermittlermolekül (z.B. Ty ramin) und/oder mindestens einem der Proteine beladen, die Laminin (rekombinant und gewebe spezifisch), Vitronektin, (rekombinant und kompatibel mit pluripotenten Stammzellen), Kollagen (gewebespezifisch, kompatibel mit multipotenten Stammzellen), Proteine aus dezellularisiertem Gewebe (sehr gewebespezifisch) und komplexe Proteinmischungen aus der Basalmatrix (z.B. Gel trex, Matrigel, denovoMatrix) umfassen.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden nach der Gefrier trocknung Rückstände der Lyoprotektant-Substanz entfernt. Wenn Rückstände der Lyoprotektant- Substanz von den getrockneten Hydrogel-Partikeln getrennt werden, ergeben sich Vorteile für die spätere Rehydratisierung und die nachfolgende Zellkultivierung. Vorteilhafterweise werden Ein flüsse der Lyoprotektant-Substanz auf die Zellen vermieden oder minimiert. Die Entfernung von Rückständen der Lyoprotektant-Substanz umfasst eine vollständige Beseitigung der Lyoprotek tant-Substanz aus den getrockneten Hydrogel-Partikeln oder eine Beseitigung der Lyoprotektant- Substanz von den Oberflächen der getrockneten Hydrogel-Partikel. Besonders bevorzugt sind die Oberflächen der getrockneten Hydrogel-Partikel frei von Rückständen der Lyoprotektant-Sub stanz.

Besonders bevorzugt werden die Rückstände der Lyoprotektant-Substanz, wie z. B. der „Lyo- Kuchen", durch eine mechanische Bearbeitung des getrockneten Materials, umfassend dessen Zerkleinerung und ein Sieben, entfernt. Vorteilhafterweise werden dabei gleichzeitig mit der Tren nung der Lyoprotektant-Substanz vom getrockneten Hydrogel die getrockneten Hydrogel-Partikel voneinander getrennt.

Alternativ oder zusätzlich können gemäß einer weiteren Variante der Erfindung Rückstände der getrockneten Lyoprotektant-Substanz nach der Rehydratisierung der getrockneten Hydrogel-Par tikel und vor der Anwendung der Partikel in einer Waschlösung, insbesondere aus Natriumchlorid, entfernt werden. Vorteilhafterweise wird durch das Waschen der rehydratisierten Hydrogel-Kü gelchen ein Einfluss der Lyoprotektant-Substanz auf die nachfolgende Zellkultivierung weiter un terdrückt.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass verschiedene Lyoprotektant-Substanzen für die erfindungsgemäße Modifizierung der Hydrogel-Kügelchen verfügbar sind. Die Lyoprotektant- Substanz kann insbesondere Trehalose, Dimethylsulfoxid (DMSO), Sucrose und/oder ein Poloxa- mer umfassen. Diese Lyoprotektiva, die einzeln oder in Kombination verwendbar sind, haben den Vorteil, dass ihre Wirkung auf biologische Zellen gut untersucht ist. Unerwünschte Auswirkungen auf die Zellkultur können damit vermieden oder minimiert werden. Trehalose und/oder Sucrose werden besonders bevorzugt als Lyoprotektant-Substanz verwendet, da bei deren Anwendung Trägerpartikel gewonnen werden, die sich nach der Rehydratisierung durch einen besonders weit gehenden Form- und Funktionserhalt und in der Zellkultur durch eine besonders gute Zellenadhä sion auszeichnen.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Konzentration der Lyoprotektant-Substanz in der Suspensionsflüssigkeit mit den ursprünglich hergestellten Hydro gel-Kügelchen im Bereich von 1 mg/ml bis 500 mg/ml gewählt. Dieser Konzentrationsbereich wird bevorzugt, da unterhalb der Konzentration von 1 mg/ml eine Annäherung an die sphärische Parti kelform nur unzureichend erzielte wird und oberhalb von 500 mg/ml eine übermäßige Belastung des Kultivierungsmediums im Bioreaktor durch die Lyoprotektant-Substanz auftreten kann.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann eine Funktionalisierung der erfindungsgemäß hergestellten Zell-Carrier für die Kultivierung biologischer Zellen vorgesehen sein. Vorzugsweise erfolgt eine Funktionalisierung der Hydrogel-Kügelchen vor oder während de ren Herstellung (Einkapselung von Wirkstoffen, magnetischen Partikeln, etc.), z. B. vor oder wäh rend einer Vertropfung zur Herstellung der Hydrogel-Kügelchen durch Ausfällen, damit die Sub stanzen in der Hydrogelmatrix eingeschlossen sind, oder nach deren Bereitstellung und vor der Gefriertrocknung (z. B. Funktionalisierung der Oberfläche mit Tyramin und/oder Proteinen). Die Funktionalisierung umfasst den Zusatz von Partikeln und/oder Substanzen, welche den Hydrogel- Kügelchen weitere, über die Trägerfunktion hinausgehende Eigenschaften verleihen. Gemäß be vorzugten Varianten der Erfindung werden die Hydrogel-Kügelchen mit magnetischen Partikeln und/oder biologisch wirksamen Substanzen (Wirkstoffen) beladen. Besonders bevorzugt erfolgt die Zufuhr der magnetischen Partikel und/oder der Wirkstoffe vor der Gefriertrocknung. Die Erfin der haben festgestellt, dass auch die funktionalisierten Hydrogel-Kügelchen im getrockneten Zu stand Partikel mit einer annähernd sphärischen Form und rehydratisierten Zustand kugelförmige Zell-Carrier bilden.

Hydrogel-Kügelchen, die jeweils einen oder mehrere magnetische Partikel enthalten, bieten vor teilhafterweise die Möglichkeit einer Manipulation der Zell-Carrier im Bioreaktor mittels magneti schen Feldern. Die magnetischen Partikel können aus an sich bekannten Permanent-Magnet-Ma- terialien bestehen.

Als biologisch wirksame Substanzen zur Modifizierung von Hydrogel-Kügelchen werden vorzugs weise Differenzierungsfaktoren, d. h. biologisch wirksame Substanzen, die eine Zelldifferenzierung auslösen und/oder eine Richtung der Zelldifferenzierung zu einem bestimmten Zeitpunkt beein flussen, verwendet.

Wenn gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Dispersion der ur sprünglich bereitgestellten Hydrogel-Kügelchen eine kohäsionsmindernde Substanz enthält, wird ein gegenseitiges Anhaften der getrockneten Hydrogel-Partikel unterdrückt. Vorteilhafterweise wird damit eine Schüttfähigkeit der getrockneten Hydrogel-Partikel begünstigt. Besonders bevor zugt umfasst die kohäsionsmindernde Substanz Polyethylenglykol, dessen Wirkung auf biologi sche Zellen vorteilhafterweise gut untersucht ist.

Für die Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen kann ein an sich bekanntes Gefriertrocknungs- Verfahren gewählt werden. Bevorzugt wird zur Gefriertrocknung, insbesondere von Alginat-Kügel chen, ein Protokoll mit den folgenden Phasen angewendet. Zunächst erfolgt eine Einfrierphase, in der die in Suspension bereitgestellten Hydrogel-Kügelchen gemäß einer vorbestimmten Zeit-Tem- peratur-Funktion mit einem Einfrierintervall von mindestens 120 min und einer End-Temperatur unterhalb von - 20°C und oberhalb von - 80°C eingefroren. Vorzugsweise werden Einfrierraten im Bereich von 50°C/min (schnelles Einfrieren), über 1 bis l,5°C/min (moderates Einfrieren) bis 0,1 bis rc/min (langsames Einfrieren) eingestellt. Die Einstellung in der Zeit-Temperatur-Funktion er laubt vorteilhafterweise ein schonendes Einfrieren der Hydrogel-Kügelchen. Anschließend ist eine Stabilisierungsphase vorgesehen, in der die Hydrogel-Kügelchen für die Dauer eines Stabilisie rungsintervalls von mindestens 90 min bei der End-Temperatur gelagert werden. Danach werden die gefrorenen Hydrogel-Kügelchen in einer ersten Trocknungsphase zur Bildung der getrockneten Hydrogel-Partikel, bei der End-Temperatur mit einem ersten Unterdrück beaufschlagt, der im Be reich von 30 pbar bis 60 pbar gewählt ist. Es folgt eine zweite Trocknungsphase, in der die trocke nen Hydrogel-Partikel bei einer Temperatur gleich oder größer als die End-Temperatur mit einem zweiten Unterdrück beaufschlagt werden, der geringer als der erste Unterdrück ist. Schließlich er folgt eine Belüftungsphase, in der die getrockneten Hydrogel-Partikel gemäß einer Zeit-Druck- Funktion mit einem Druckanstiegsintervall von mindestens 0.5 min bis 1 min (1 bar/min) in einen Normaldruck langsam überführt werden. Die Belüftungsphase erfolgt in einem Gefäß unter Be aufschlagung mit einem inerten Schutzgas oder Luft.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beige fügten Zeichnungen beschrieben. Die Zeichnungen zeigen in:

Figur 1: ein Flussdiagramm, das Merkmale bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsge mäßen Verfahrens zur Herstellung von Trägerpartikeln zeigt;

Figur 2: ein Flussdiagramm, das Merkmale bevorzugter Ausführungsformen der Anwendung er findungsgemäß hergestellter Trägerpartikel zeigt; Figur 3: photographische Bilder von rehydratisierten Trägerpartikeln im Vergleich zu herkömmli chen Trägerpartikeln; und

Figur 4: eine schematische Verfahrensdarstellung einer Beispiel-Anwendung erfindungsgemäß hergestellter Trägerpartikel.

Die Erfindung wird im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf Alginat-basierte Zell-Carrier (Trä gerpartikel) beschrieben. Alginat-Kügelchen, welche erfindungsgemäß mit der Lyoprotektant-Sub- stanz beladen und der Gefriertrocknung unterzogen werden, können beispielsweise aus kommer ziell verfügbaren Alginat hergestellt werden, das typischerweise eine geringe Viskosität durch re lativ geringe Kettenlängen der Polymer-Makromoleküle aufweist. Alternativ kann Alginat mit ei ner im Vergleich zum kommerziell verfügbaren Alginat höheren Viskosität aufgrund längerer Mo lekülketten verwendet werden. Die Auswahl eines konkret zu verwendenden Alginat erfolgt bei spielsweise in Abhängigkeit von der gewünschten Elastizität der Zell-Carrier bei der Zellkultivie rung. Die Erfindung ist nicht auf die Verwendung von Alginat beschränkt, sondern entsprechend auch mit anderen Flydrogelen, wie zum Beispiel Kollagen-, Gellan- oder Pektin realisierbar.

Ausführungsformen der Erfindung werden im Folgenden insbesondere unter Bezug auf Beispiele für die Beladung von Alginat mit Lyoprotektant-Substanzen, die Modifizierung von Alginat-Kügel chen, getrockneten Alginat-Partikeln und/oder rehydratisierten Alginat-Kügelchen und die Proto kolle der Gefriertrocknung beschrieben. Einzelheiten der Anwendung der rehydratisierten Alginat- Kügelchen bei der Kultivierung biologischer Zellen können realisiert werden, wie es an sich von der herkömmlichen Zellkultivierung bekannt ist.

Figur 1 zeigt schematisch die Flauptschritte der erfindungsgemäßen Fierstellung von getrockneten Alginat-Partikeln. Bei Schritt PI werden Alginat-Kügelchen in einer wässrigen Suspension in einem Behälter hergestellt. Die Fierstellung der Alginat-Kügelchen erfolgt beispielsweise durch Erzeu gung von Na-Alginat-Tröpfchen mit einer Düse und Vernetzung der Alginat-Tröpfchen in einer wässrigen Suspensionsflüssigkeit mit einem ionischen Fällungsmittel, beispielsweise wie in [1] be schrieben ist. Als Fällungsmittel wird beispielsweise eine BaCh-Lösung verwendet. Die Größe und Größenverteilung der Alginat-Kügelchen kann durch die Dimension der Düse und Betriebsparame ter der Düse eingestellt werden. Die vernetzten Alginat-Tröpfchen bilden formstabile Alginat-Kü gelchen, die in der Suspensionsflüssigkeit suspendiert sind. Vorzugsweise werden die Alginat-Kügelchen nach der Ausfällung durch Beschichtung mit Tyramin und/oder einem Protein, wie z. B. Matrigel, funktionalisiert. Die Beschichtung erfolgt durch Nie derschlag aus der Suspensionsflüssigkeit oder direkter kovalenter Ankopplung. Die Matrigelbe- schichtung bietet Vorteile für die Adhäsion von Zellen bei einer nachfolgenden Zellkultivierung.

Bereits während des Eintropfens der Alginat-Tröpfchen in die Suspensionsflüssigkeit oder alterna tiv nach der Vernetzung und Bildung der Alginat-Kügelchen wird der Suspensionsflüssigkeit eine Lyoprotektant-Substanz zugesetzt. Bei Tests der Erfinder wurde als Lyoprotektant-Substanz bei spielsweise Trehalose (100 mg/ml), Poloxamer (Handelsname Pluronic F 68, 1 mg/ml), und/oder Sucrose (100 mg/ml) in einer wässrigen NaCI-Lösung (0,9%) verwendet. Die Beladung der suspen dierten Alginat-Kügelchen mit der Lyoprotektant-Substanz erfolgt z. B. durch Lagerung der Algi nat-Kügelchen in einer wässrigen Lösung, welche die Lyoprotektant-Substanz, z. B. für mindestens einen Tag.

Optional werden bei Schritt P2 die mit der Lyoprotektant-Substanz beladenen Alginat-Kügelchen aus der Suspension entnommen. Beispielsweise wird die Suspensionsflüssigkeit abgegossen, so dass im Behälter die Alginat-Kügelchen, umgeben von Restflüssigkeit, Zurückbleiben. Alternativ wird zur Entnahme ein Sieb verwendet.

Wenn Schritt P2 nicht vorgesehen ist, erfolgt unmittelbar nach der Beladung der Alginat-Kügel chen mit der Lyoprotektant-Substanz bei Schritt P3 die Gefriertrocknung der Alginat-Kügelchen. Dabei sind die folgenden Phasen vorgesehen.

Zunächst werden die Alginat-Kügelchen in einer Einfrierphase über 150 min von Raumtemperatur auf eine End-Temperatur von z. B. - 45 °C abgekühlt (ca. 0,4°C/min). Während der Einfrierphase wird beispielsweise eine lineare Zeit-Temperatur-Funktion realisiert.

Anschließend folgt eine Stabilisierungsphase, in der die Alginat-Kügelchen für die Dauer eines Sta bilisierungsintervalls von 120 min bei der End-Temperatur gelagert werden. Die Stabilisierungs phase hat den Vorteil, dass die Probe mit den eingefrorenen Alginat-Kügelchen komplett durchge froren wird, bevor die Trocknungsphasen ausgeführt werden.

Eine nachfolgende erste Trocknungsphase hat die Funktion einer Antrocknungsphase, in der die Suspensionsflüssigkeit mittels Sublimation entfernt wird. Die erste Trocknungsphase wird bei spielsweise in einem Lyophilisator mit einer Kühleinheit und einem Kondensator durchgeführt. Während der ersten Trocknungsphase wird die End-Temperatur, zum Beispiel - 45 °C, aufrecht erhalten, während der Druck einer linearen Zeit-Druck-Funktion folgend über eine Dauer von 10 min vom Atmosphärendruck auf einen ersten Unterdrück von 50 pbar abgesenkt wird. Anschlie ßend wird in der ersten Trocknungsphase die gefrorene Probe für eine Stabilisierungsdauer von zum Beispiel 80 Stunden bei der End-Temperatur und dem ersten Unterdrück gehalten.

In einer nachfolgenden zweiten Trocknungsphase werden die getrockneten Alginat-Partikel mit einem zweiten Unterdrück beaufschlagt, der geringer als der erste Unterdrück ist und zum Bei spiel 100 pbar beträgt. Die Absenkung auf den zweiten Unterdrück erfolgt mit einer linearen Zeit- Druck-Funktion über eine Dauer von zum Beispiel 300 min. Während der zweiten Trocknungs phase ist die Temperatur der getrockneten Alginat-Partikel gleich der End-Temperatur oder eine erhöhte Temperatur, wie zum Beispiel Raumtemperatur (20 °C). Nach der Absenkung auf den zweiten Unterdrück wird die getrocknete Probe während der zweiten Trocknungsphase für eine Stabilisierungsdauer von zum Beispiel 20 Stunden bei dem zweiten Unterdrück gehalten.

Anschließend ist eine Belüftungsphase vorgesehen, in der die getrockneten Alginat-Partikel ge mäß einer linearen Zeit-Druck-Funktion mit einem Druckanstiegsintervall von mindestens 1 min in einen Normaldruck überführt werden. Die Belüftungsphase kann mit Luft oder einem Inertgas vorgesehen sein. Durch die Anwendung eines relativ langen Druckanstiegsintervalls wird vorteil hafterweise eine Beschädigung der getrockneten Alginat-Partikel vermieden. Bei Belüftung mit Luft erfolgt vorher das Verschließen des Lagerungsgefäßes in der Kammer, während bei Nutzung eines Inertgases das Verschließen nach der Belüftung erfolgt.

Als Inertgas wird vorzugsweise trockener Stickstoff oder Argon verwendet. Besonders bevorzugt werden die getrockneten Alginat-Partikel in dem Inertgas oder im Vakuum gelagert. Praktische Tests haben eine Lagerungsfähigkeit der erfindungsgemäß hergestellten getrockneten Alginat- Partikel z. B. bei 4 °C ohne Funktionalitätsverlust über mehrere Monate ergeben.

Das beispielhaft beschriebene Verfahren der Gefriertrocknung P3 kann in Bezug auf die eingestell ten Temperaturen und Drucke und die Form der Zeit-Druck-und Zeit-Temperatur-Funktionen in Abhängigkeit von den konkreten Anwendungsbedingungen modifiziert werden. Beispielsweise kann durch Vorbereitungstests ermittelt werden, welche Zeit-und Druck-Parameter für eine kon krete Hydrogel-, insbesondere Alginat-Probe, optimale Trocknungsergebnisse liefert. Im Ergebnis der Gefriertrocknung P3 liegen die getrockneten Alginat-Partikel als fertige Zell-Car- rier vor. Aufgrund des erfindungsgemäßen Zusatzes der Lyoprotektant-Substanz haben die ge trockneten Alginat-Partikel eine sphärische Form (siehe zum Beispiel photographische Abbildung in Figur 4), die vorteilhafterweise auch nach der Rehydratisierung erhalten bleibt. Die getrockne ten Partikel können als Kuchen Zusammenhängen oder ein rieselfähiges Schüttgut aus einzelnen Teilchen bilden. Die Bildung des rieselfähigen Schüttguts wird begünstigt, wenn der Suspension der Alginat-Kügelchen zusätzlich zu der Lyoprotektant-Substanz eine kohäsionsmindernde Sub stanz, wie zum Beispiel Polyethylenglykol, zugeführt wird. Es wird beispielsweise Polyethylengly kol mit dem Flandelsnamen PEG 600 mit einer Konzentration von 50 mg/ml verwendet, um ein Zusammenhaften der getrockneten Alginat-Partikel zu minimieren.

In Abhängigkeit von der Konzentration der verwendeten Lyoprotektant-Substanz kann diese nach der Gefriertrocknung P3 Reste auf der Oberfläche der getrockneten Alginat-Partikel bilden. Ent sprechend kann, wie in Figur 1 gezeigt ist, optional ein Schritt P4 zur Entfernung der Lyoprotek tant-Substanz insbesondere von der Oberfläche der getrockneten Alginat-Partikel vorgesehen sein, z. B. durch Sieben oder Mahlen vorgesehen sein.

Eine Anwendung der getrockneten Alginat-Partikel als Zell-Carrier bei der Kultivierung biologi scher Zellen ist schematisch in Figur 2 gezeigt. Zunächst erfolgt bei Schritt Kl die Vorbereitung ei nes wässrigen Kultivierungsmediums in einem Bioreaktor. Die Zusammensetzung des Kultivie rungsmediums wird in an sich bekannter Weise in Abhängigkeit von der konkreten Anwendung der Zellkultivierung gewählt. Dem Kultivierungsmedium werden die erfindungsgemäß hergestell ten Alginat-Partikel zugesetzt. Die Dosierung der getrockneten Alginat-Partikel erfolgt beispiels weise mittels Wägung. Tests mit erfindungsgemäß hergestellten, getrockneten Alginat-Partikeln ergaben, dass Partikel ohne eine Polyethylenglykol-Beladung zunächst auf der Oberfläche des Kul tivierungsmedium lagen und erst nach einem Zentrifugieren in das Kultivierungsmedium einsan ken, während bei mit Polyethylenglykol modifizierten Partikeln kein Aufschwimmen auf dem Kul tivierungsmedium beobachtet wurde.

Im wässrigen Kultivierungsmedium erfolgt bei Schritt K2 die Rehydratisierung der Alginat-Partikel. Die getrockneten Alginat-Partikel werden durch Aufnahme von Wasser aus dem Kultivierungsme dium in Alginat-Kügelchen umgewandelt, wie beispielhaft in Figur 3 gezeigt ist. Schließlich erfolgt bei Schritt K3 die Zellkultivierung, Zellinkubation und/oder Zelllagerung von biologischen Zellen im Kultivierungsmedium mit den Alginat-Kügelchen. Figur 3 zeigt photographische, lichtmikroskopische Bilder von Alginat-Kügelchen, die gemäß be vorzugten Varianten der Erfindung mit Trehalose (A) oder Sucrose (B) beladen, gefriergetrocknet und rehydratisiert wurden, im Vergleich mit Alginat-Kügelchen, die ohne Lyoprotektant-Substanz (C) gefriergetrocknet und rehydratisiert wurden, und frisch hergestellten Alginat-Kügelchen (D) in Suspension (Durchmesser rd. 400 pm. Die erfindungsgemäß hergestellten und rehydratisierten Partikel (A, B) zeigen vorteilhafterweise deutlich die gleiche Kugelform wie die suspendierten, un behandelten Alginat-Kügelchen (D). Die unbehandelt gefriergetrockneten und rehydratisierten Partikel (C) (z. B. gemäß [1]) weisen hingegen anders als die unbehandelten Alginat-Kügelchen eine zerklüftete, unregelmäßige Oberfläche auf.

Eine weitere Anwendung der getrockneten Alginat-Partikel als Zell-Carrier bei der Zellexpansion von hiPS-Zellen (humane induzierte pluripotente Stammzellen) ist schematisch in Figur 4 gezeigt. Für eine erste Expansionsphase werden getrocknete Alginat-Partikel 1 in ein erstes Kultivierungs gefäß 2, z. B. einen Suspensionsbioreaktor mit einem Volumen von wenigen ml (z.B. 10 ml) bis mehrere Liter (z. B. 31), gegeben. Durch Rehydratisierung werden aus den Alginat-Partikeln 1 Algi nat-Kügelchen 3 (beispielhaft gezeigt) gebildet. Des Weiteren werden aus einem Gefäß 4 hiPSC- Zellen in das Kultivierungsgefäß 2 gegeben. Es erfolgt dann die Zellkultivierung unter vorgegebe nen Kultivierungsbedingungen, in der die Zellen zunächst auf den Micro-Carriern anhaften und adhärieren und sich dann über mehrere Tage (z. B. 7 Tage) um ein Vielfaches vermehren (z.B. um das Siebenfache). In einem letzten Schritt des Prozesses werden die Alginat-Kügelchen mit adhä- rierten Zellen 5 gewonnen, d.h. es liegen nach dieser Gewinnung (z.B. durch eine enzymatische Behandlung) die verbrauchten Micro-Carrier 6 und die vervielfachten hiPS-Zellen 7 vor. Anschlie ßend können diese in einer Zellbank 10 gelagert, weiter untersucht und/oder prozessiert 9 (z.B. Differenzierung in Kardiomyozyten), und/oder zu einer direkten Anwendung 8 überführt (z.B. Bioprinting) werden.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merk male der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination oder Unterkombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.