Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedi¬ miento para producir la actividad enzimática D-aminoácido oxidasa de Rhodotorula gracilis en Escherichia coli . Más particularmente, describe un método para aislar el gen que codifica para una enzima con actividad D-aminoácido oxidasa mediante el uso de técnicas de ADN recombinante, la clonación de dicho gen en un microorganismo del género Escherichia, la hiperproducción de dicha enzima por fermentación en dicho microorganismo y la extracción de la enzima. Esta enzima puede ser utilizada para la preparación del ácido 7β-(4-car- boxibutanamido) cefalosporánico. Este ácido es un intermedio para la preparación del ácido 7-amino cefalosporánico, que a su vez es un conocido intermedio para la preparación de una gran variedad de agentes antibacterianos de la familia de las cefalosporinas.

Estado de la Técnica

Para la producción del ácido 7β- (4-carboxibutana- mido) cefalosporánico, también denominado glutaril-7-aminoce- falosporánico (en lo sucesivo referido como GL-7ACA) a partir de la cefalosporina C, es conocido el uso de la enzima D- aminoácido oxidasa (en lo sucesivo referida como DAO) proce- dente de distintos microorganismos como Trigonopsis variabi - lis (Biochem. Biophys. Res. Commun. (1993) 31:709) , Rhodoto- rula gracilis (J. Biol. Chem. (1994) 269:17809) y Fusarium solani (J. Biochem. (1990) 108:1063) . La producción de la DAO mediante el empleo de estos microorganismos presenta muchos inconvenientes. Por un lado, el nivel de actividad de la DAO es muy bajo, y por otro, junto a la actividad DAO se producen otras enzimas como esterasas y catalasas. Las pri-

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meras degradan el ácido GL-7ACA disminuyendo asi el rendi¬ miento del proceso. Las segundas destruyen el peróxido de hidrógeno necesario en la catálisis y obligan a la adición de este compuesto, lo que produce una pérdida de actividad de la enzima acortando sus posibilidades de reutilización. Para evitar dicha contaminación enzimática es necesario purificar la DAO, lo cual complica mucho el procedimiento enzimático de obtención de GL-7ACA a partir de la cefalosporina C.

Recientemente se ha descrito un procedimiento para aislar el gen que codifica para la DAO de T. varlabilís y expresarlo en Escherichia colí y en T. var±ab±l±s (Solici¬ tud de Patente japonesa publicada N271180/1988; Solicitud de Patente Europea Nδ 93202219.7, publicada con el NQ 0583817- A2) . Por otra parte , también se ha clonado y expresado en Escherichia colí y Achremon±um chrysogenum el gen que codi¬ fica para la DAO de F. solani (Solicitud de Patente japonesa publicada NQ 2000181/1990; J. Biochem. (1990) 108:1063; Bio/- Technology (1991) 9:188).

Por otra parte, era conocido que la levadura Eho- dotorula gτacilis (Biotechnol. Appl. Biochem. (1992) 16:252). Las ventajas que presenta la DAO de Rhodotorula gracilis es que posee una alta eficiencia catalítica (J. Biol. Chem.

(1993) 268:13850) y una baja constante de disociación del FAD que usa como cofactor (Eur. J. Biochem. (1991) 197:513). También se sabia la secuencia de aminoácidos de los extremos amino-terminales de dos péptidos de esta DAO (J. Biol. Chem.

(1994) 269:17809) uno de ellos conteniendo un residuo de arginina implicado en la catálisis. Más recientemente, se ha publicado su secuencia completa de aminoácidos (Biotech. Letters (1965) 17:193). Sin embargo los niveles de produc¬ ción de DAO por la cepa salvaje Rhodotorula gracilis son muy bajos como para que se pueda desarrollar un proceso indus¬ trial. En el estado de la técnica no se ha encontrado ningún procedimiento para aislar el gen que codifica para la DAO de Rhodotorula gracilís y tratar de expresarlo ya sea en Esche- richia coli u otro microorganismo.

Descripción detallada de la invención

Para la descripción de esta invención se parte de la levadura Rhodotorula gracilis ATCC 26217 como donador de los ácidos desoxirribonucleico (en lo sucesivo referido como ADN) y ribonucleico (en lo sucesivo referido como RNA) . Una vez obtenido el ADN genómico de la levadura (el cual contiene el gen con la información genética relativa a la producción de la DAO, también denominado en lo sucesivo gen dao) se utilizó como molde para un proceso de amplificación conocido como reacción de la polimerasa en cadena (en lo sucesivo referido como PCR), en el que se emplearon como cebadores dos oligonucleótidos sintéticos que habían sido diseñados en función de dos cortas secuencias de aminoácidos conocidas de la DAO de Rhodotorula gracilis. El fragmento de ADN obtenido como producto de la amplificación del proceso de PCR se aisló y se introdujo en un vector plasmidico obtenido de una cepa de Escheríchia coli. El vector recombinante se utilizó para obtener la secuencia del fragmento de ADN que contenía parte del gen dao de Rhodotorxzla gracilis.

A continuación se digirió parcialmente el ADN genómico de Rhodotorula gracílis con la endonucleasa de restricción Sau3A y con los fragmentos de ADN resultantes se construyó una genoteca utilizando un vector fágico lambda- GEMÍ2 de Escherichia coli. El fragmento de ADN anteriormente clonado por PCR se utilizó como sonda para rastrear la geno- teca con la finalidad de aislar los fagos recombinantes que contenían el gen dao. Utilizando los fagos aislados que con¬ tenían el gen dao se procedió a la subclonación de dicho gen en vectores plasmídicos de Escherichia coli . Los vectores recombinantes así obtenidos se utilizaron para determinar la secuencia completa del gen dao, que resultó estar constituida por múltiples exones e intrones.

Como el fragmento de ADN anteriormente obtenido que contiene la secuencia genómica del gen dao de Rhodotorula gracilis posee muchos intrones, no puede ser utilizado para

su expresión directa en Escherichia. coli . Por ello se aisló RNA total de Rhodotorula gracilis y se utilizó como molde pa¬ ra obtener ADN complementario (en lo sucesivo referido como cADN) empleando una transcriptasa en reverso y como cebador un oligonucleótido sintético diseñado en función de la se¬ cuencia de nucleótidos del extremo 3' del último exon del gen dao . Una vez obtenida la hebra de ADN complementaria al RNA correspondiente al gen dao, ésta se utilizó como molde para su amplificación mediante PCT utilizando dos oligonucleótidos sintéticos diseñados en función de las secuencias de nucleó¬ tidos de los extremos 5' y 3' correspondientes al primer y al último exón del gen dao, respectivamente. En estos oligonu- cleótidos sintéticos se incluyeron las secuencias de unión al ribosoma de Eεcheπchia coli (en lo sucesivo referido co¬ mo RBS) un codon de iniciación de la traducción y un codon de terminación de la traducción, así como distintos sitios de restricción útiles para la clonación de fragmentos de ADN. Se obtuvo así un nuevo fragmento de ADN que una vez aislado fue clonado en un vector plasmídico de Escherichia coli . El vec¬ tor reccmbmante se utilizó para determinar la secuencia del fragmento de ADN que representa al RNA mensajero del gen dao de Rhodotorula gracilis .

Utilizando las dianas de restricción creadas me¬ diante la clonación, el fragmento de ADN que contenía el cADN completo del gen DAO de Rhodotorula gracilis fue posterior¬ mente clonado en un vector plasmídico de Escherichia coli que posee un promotor que permite la expresión de genes en esta Dacteria huésped. De esta manera se obtuvo un clon recombi- nante αe Escherichia colx que producía una DAO activa, que se depositó en la Colección Española αe Cultivos Tipo (CECT) , Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológi¬ cas, Universidad de Valencia, 46100 Bur^asot (Valencia) con el n^ 4636.

Para la producción de la DAO utilizando el clon recombmante αe Escherichia coli previamente seleccionado se le hace crecer en un medio que contenga una fuente de carbo¬ no, una fuente de nitrógeno y sales minerales. La temperatu¬ ra para esta producción está entre 18 y 30°C, y el pH debe

mantenerse entre 5 y 9. Para la fermentación en matraz pue¬ den utilizarse matraces de distintos volúmenes desde 50 mi hasta 1000 mi con una cantidad de medio entre el 10 y el 50% del volumen del matraz. Una fermentación se extiende en un período entre 12 y 90 horas.

El cultivo de los microorganismos recombmantes puede mejorarse si se eligen condiciones adecuadas para man¬ tener la estabilidad de los vectores recombinantes, lo que se consigue mediante la adición de antibióticos al medio de cultivo, tales como cloranfenicol, kanamicma o tetraciclma, para los cuales el vector recombinante que contiene el gen dao presente un marcador de resistencia. Esto, además de estabilidad la producción, evita la contaminación del medio de cultivo con otros microorganismos indeseables y elimina también las cepas que por haber perdido el vector recombman- te han dejado de producir DAO.

La DAO producida por los clones recombmantes se puede extraer mediante separación de las células del medio de cultivo por centrifugación y posterior rotura o permeabiliza- ción de las mismas con procedimientos químicos, enzimáticos o mecánicos. Si se necesita un extracto enzimático de mayor pureza, la DAO puede purificarse por técnicas convencionales de precipitación, de filtración, cromatográficas, etc.

Utilizando la DAO obtenida a partir de los clones recombmantes de Escherichia coli que expresaban el gen dao de Rhodotorula gracilis se puede producir GL-7ACA a partir de cefalosponna C. Los extractos enzimáticos concentrados pueden también inmovilizarse haciéndolos reaccionar con so¬ portes sólidos inertes adecuados y así la DAO inmovilizada puede emplearse cíclicamente.

La novedad de esta invención radica en el hecho de ser la primera vez que la enzima DAO de la levadura .Rhodo¬ torula gracilis puede ser expresada en un microorganismo procariota como Escherichia coli . Con ello se puede obtener un aumento de la producción lo que facilitaría el empleo a escala industrial de esta enzima. La posibilidad de producir la enzima en distintas cepas de Escherichia coli que carezcan

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de enzimas indeseables como catalasa o esterasas, así como la posibilidad de mejorar su estabilidad y facilitar su purifi¬ cación mediante su modificación por técnicas de ingeniería de proteínas son otros aspectos que aumentan el concepto de novedad de esta patente.

La presente invención será ilustrada con más de¬ talle en los Ejemplos que siguen.

EJEMPLO 1

1. Ensayo de la actividad DAO

El ensayo de la DAO se realizó según el procedi¬ miento previamente descrito (J. Biol . Chem. (1967) 242:3957), utilizando D-fenilglicma (25 mM) como sustrato. La mcuba- ción se lleva a cabo en tampón fosfato 50 mM pH 8,0 conte¬ niendo FAD 5 μM durante 15 a 30 minutos. La reacción se detiene con 1/10 de volumen ácido acético puro. La variación de la D.O. a 252 nm determina la actividad de la enzima, teniendo en cuenta que 89,2 nmol del ácido benzoil fórmico que se origina en la reacción presentan una D.O.-, ₅₂ de 1,0. Una unidad (U) equivale a 1 nmol de sustrato transformado por minuto.

2. Preparación de los ADN vectores y de las células de Esche- richia coli competentes para la transformación

El vector plasmídico pBCKS/+ (Cm ^r ) (Stratagene) , que contiene un marcador de resistencia para el cloranfenicol fue preparado como sigue: Las cepas de Escherichia coli poseyendo individualmente el plásmido antes indicado se incu- barón durante 16 horas con agitación en un agitador orbital a 250 rpm y a 37°C en 0, 5 litros de medio LB conteniendo 10 g/1 de extracto de levadura y 5 g/1 de NaCl . Transcurrido el tiempo indicado las células se sedimentaron, se lavaron, se lisaron y los plásmidos se aislaron siguiendo el método alca- lino (Sambrook et al. (1989) Molecular Clonmg: A laboratory Manual, Cold Spnng Harbor Laboratory, Cold Spnng Harbor, New York, USA) . El ADN plasmídico obtenido por este método

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se purificó por centrifugación en gradiente de CsCl.

Las células competentes de Escherichla coli fue¬ ron obtenidas por el procedimiento del RbCl (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Fun¬ damentalmente se utilizaron las cepas de Escheríchla coli DH5α (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (USA) y Escherich±a colí DH10B (Life Technologies, Gaithersburg, MD) para la clonación y análisis de fragmentos.

3. Preparación del ADN donante que posee la información gené¬ tica relativa a la producción de DAO

La cepa de Rhodotorula gracilis ATCC 26217 se cultivó en un medio YMPG que contiene: extracto de malta (0,3%), extracto de levadura (0,3%), peptona (0,5%) y glucosa (1%). La incubación se prolongó durante 36 horas hasta alcanzar una D.0. _66O de 5,0 con agitación en un agitador orbital a 250 rpm y a una temperatura de 30QC. Las células fueron seguidamente sedimentadas, lavadas y usadas con zymolyasa y el ADN se extrajo siguiendo un procedimiento descrito previamente (Sherman et al. (1986) Laboratory Course for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Para conse- guir una mayor pureza el ADN se trató con ARNsa, luego se extrajo varias veces con fenol y cloroformo-alcohol isoamíli- co y en la fase acuosa se precipitó el ADN con isopropanol. El ADN precipitado se lavó con etanol al 100% y etanol al 70% y se disolvió en un tampón Tris-HCl 10 mM pH 7,5 conteniendo EDTA 1 mM (tampón TE) .

4. Obtención mediante PCR de un fragmento de ADN que contiene el gen dao de Rhodotorula gracilis

Una muestra de 0,15 μg del ADN de Rhodotorula gracilis se mezcló con 0,01 μl (25 μM) de cada uno de los oligonucleótidos degenerados RG1

(5'-GACT(C/G)CC(C/G) GAGGACGT(C/T/G) (T/A) (C/G) (T/A) (C/G) (G/C)CAGAC-3') y

RG2 (5'-GC(aG)GG(G/CÍT)Cβ(AJC/G)AGi(Q/NC)CC(GJA/C)ACGTτGTG-3 ^• ) que codifican para las secuencias de aminoácidos DLPEDVSSQT y HNVGLRPA respectivamente. A esta mezcla se adicionaron 2,5 unidades de Taq polimerasa (Perkin-Elmer) junto con el tampón adecuado recomendado por los suministradores y el preparado se sometió a un proceso de amplificación en un aparato de PCR (Gene-ATAQ, Pharmacia) empleando 30 ciclos, siendo cada ciclo de : 98QC (1 minuto), 55QC (2 minutos) y 72QC (2,5 minutos). El resultado de la amplificación se visualizó mediante tin¬ ción con bromuro de etidio después de una electroforesis en gel de agarosa al 1%.

El fragmento de ADN obtenido por PCR, de un tama- ño de aproximadamente 1 kb, se purificó mediante extracción del gel de agarosa utilizando β-agarasa (Biolabs) siguiendo las recomendaciones de los distribuidores.

5. Clonación y secuenciación del fragmento obtenido por PCR que contiene el gen dao

Una muestra de 0,1 μg de ADN del plásmido pBCKS/+ se digirió con la endonucleasa de restricción EcoRV (Pharma¬ cia) a 37SC, en un tampón recomendado por los suministrado¬ res, durante 1 hora y se calentó durante 10 minutos a 652C para detener la reacción. El plásmido digerido se mezcló con una muestra del fragmento de ADN resultante del PCR purifica¬ do anteriormente (0,2 μg) y ambos ADNs se ligaron mediante la enzima T4 ADN ligasa (Amersham) en presencia de ATP usando un tampón recomendado por los suministradores. La mezcla de ligación resultante se utilizó para transformar células competentes de Escherichía coli DH5α. Los transformantes se aislaron en un medio de cultivo sóli¬ do con agar (2%) que contenía medio LB, cloranfenicol (34 μg/ml ) , X-gal (40 μg/ml ) e IPTG 0,2 mM. Mediante este proce- dimiento se obtuvieron varios clones que presentaban un feno¬ tipo blanco en el medio de selección. Uno de estos clones contenía el plásmido recombinante pPCR20 que posee el frag-

mentó de ADN de 1 kb resultante de la amplificación por PCR insertado en el sitio BcoRV del plásmido pBCKS/+.

La secuencia de nucleótidos del fragmento conte¬ nido en el plásmido pPCR20 se determinó sobre el mismo plás- mido mediante un método previamente descrito (Sanger et al. (1977) Proc. Nati. Acá. Sci. USA 74:5463-5464) utilizando el T7 ADN polymerase Kit (Pharmacia), [ ³⁵ S]dCTP como marcador radioactivo y oligonucleótidos comerciales o sintéticos como cebadores. La secuencia de nucleótidos reveló que el frag- mentó clonado poseía 0,995 kb. Los análisis de la secuencia y su comparación con otras secuencias conocidas en los bancos de datos internacionales (GeneBank/EMBL) indicaron que el fragmento clonado codificaba para una parte del gen dao de .Rhodotorula gracilis .

EJEMPLO 2

1. - Construcción de una genoteca de Rhodotorula gracilis

La obtención del ADN total de la cepa de Rhodoto- rula gracilis ATCC 2617 se realizó tal y como se describe en el apartado 3 del ejemplo 1. Un total de 300 μg de dicho ADN total se digirieron parcialmente con 20 unidades de Sau3Al en un volumen de reacción de 600 μl a 37°C y se recogieron 3 alícuotas de 200 μl a los 45 segundos, 1 minuto y 2 minutos respectivamente, deteniéndose la digestión con EDTA 20 mM frío. Tras comprobar las digestiones en un gel del 0,7% de agarosa, se mezclaron, se calentaron a 68°C durante 10 minu¬ tos, se dejaron enfriar lentamente hasta temperatura ambiente y se colocaron sobre un gradiente de sacarosa (10-40%) de 38 mi. Dicho gradiente se centrifugó a 26.000 rpm durante 24 horas a 15°C, recogiéndose alícuotas de 0.5 mi, lOμl de las cuales se analizaron en un gel del 0, .4% de agarosa. Las alícuotas cuyo ADN poseía un tamaño entre 18 y 22 kb se mez¬ claron y se diluyeron con agua destilada hasta aproximadamen- te el 10% de sacarosa. Seguidamente se precipitó el ADN con etanol, se resuspendió en 50 μl de un tampón TE y 3 μl de esta última solución se analizaron en un gel del 0.4% de

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agarosa. En dicho gel se comprobó que el tamaño de los frag¬ mentos de ADN era correcto y que su concentración era de aproximadamente 50 ng/μl .

Paralelamente se preparó el ADN del bacteriófago lambda-GEM12 (Promega) esencialmente como se ha descrito previamente (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) . Para ello, la cepa Escherichia coli LE392 (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) se creció durante 10 horas en NZCYM-0.2% mal¬ tosa (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) y se midió su D.O. a 600 nm. El volumen de cultivo correspondiente a 3xl0 ⁹ células se centrifugó a 4.000 rpm durante 10 minutos a 4°C en una centrífuga de mesa y se resuspendió en 1.2 mi de tampón Tris-HCl 50 mM pH 7.5 conte¬ niendo 0.1 M NaCl, 2 g/1 MgS0 ₄ .7 y 0.01% gelatina (tampón SM) . A estas células se añadieron 3xl0 ⁷ unidades formadoras de placa (ufp) del fago lambda-GEM12 y la mezcla se incubó durante 30 minutos a 37°C sin agitación. Con 200 μl de las células infectadas se inoculó cada uno de los matraces (de 500 mi con 100 mi de medio NZCYM-0.2% maltosa) precalentados a 37°C Dichos matraces se incubaron a 37°C hasta que el cultivo apareció lisado (5-6 horas) . Los lisados se trataron con ADNsa (1 μg/ml) y ARNsa (2 μg/ml) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente se adicionaron 5,8 gramos de NaCl por cada 100 mi de lisado y la mezcla se mantuvo durante 60 minutos en hielo. Transcurrido este tiempo se filtró para eliminar los restos celulares. Tras añadir 20 mi de PEG-6.000 al 50% por cada 100 mi de lisado, la mezcla se mantuvo 60 minutos en hielo y se centrifugó a lO.OOOxg duran¬ te 20 minutos a 4°C. El precipitado se resuspendió en 1 mi de TM y se extrajo dos veces con una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico (24/1 (CÍA) para eliminar los restos de PEG-6000 sin romper el fago. Posteriormente se extrajo dos veces con fenol neutro, una con fenol-CÍA y una con CÍA. La

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fase acuosa se llevó a 0.5 M NaCl (con NaCl 4 M) y el ADN se precipitó con dos volúmenes de etanol a -20°C. Una vez cen¬ trifugado durante 20 minutos a 4°C en una minicentrífuga, el ADN precipitado se lavó con etanol al 70%, se secó y se re- suspendió en 50 μl de TE.

50 μg de ADN del bacteriófago se digirieron con las endonucleasas BamHI y Xbal a 37°C durante 2 horas. La doble digestión se extrajo con fenol-CIA y CÍA, se precipitó con etanol y se resuspendió en 50 μl de TE. Tras recoger una alícuota de 2 μl, al resto se le añadió MgCl ₂ hasta 10 mM y se incubó a 42°C durante 1 hora para favorecer el reanilla- miento de los brazos del vector por sus extremos cohesivos. Nuevamente se recogió una fracción de 2 μl que se analizó junto con la anterior en un gel del 0.5% de agarosa. Una vez comprobado el correcto reanillamiento por los extremos cohe¬ sivos, la mezcla se dispuso sobre un gradiente (10-40%) de sacarosa de 38 mi. En este caso se evitó el calentamiento del ADN a 68°C antes de ser colocado en el gradiente, ya que esto conduciría a la separación de los extremos cohesivos del fago. El gradiente se centrifugó a 26.000 rpm durante 24 horas a 15°C, recogiéndose seguidamente en alícuotas de 0.5 mi . Tras analizar 15 μl de cada una de ellas en un gel del 0.5% de agarosa, se mezclaron aquellos que carecían del frag¬ mento central dispensable o "stuffer" y se diluyeron con agua destilada hasta alrededor del 10% de sacarosa. El ADN se precipitó con etanol, se resuspendió en 50 μl de TE y 2 μl de esta última solución se visualizaron en un gel de agarosa (0.5%) para confirmar la ausencia del fragmento central y estimar que su concentración aproximada era de 100 ng/μl . Posteriormente se realizaron una serie de liga¬ ciones utilizando 0,25 μg de inserto y cantidades de vector comprendidas entre 0,25 y 0,75 μg, variando la relación in¬ serto/vector. Las reacciones se incubaron a 12-14°C durante 16 horas. Tras comprobar en un gel del 0,4% de agarosa la aparición de fragmentos de ADN (originados por ligación) de tamaño superior al del vector o inserto, se mezclaron todas las reacciones de ligación, se precipitaron con etanol y se

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resuspendieron en 4 μl de tampón de ligación.

La encapsidación del ADN fágico recombinante ori¬ ginado tras la ligación se realizó con los extractos de empa¬ quetamiento "ín vitro" Packagene (Promega) . Con el resultado de la reacción de encapsidación resuspendido en 500 μl de SM se realizaron infecciones de Escherichia coli LE392 para titular el número de fagos presentes y de Escherichia coli NM539 (Promega) con la finalidad de determinar el porcentaje de fagos recombinantes. Escherichia coli NM539 es una cepa lisógena del fago P2 y sólo origina placas de lisis cuando el fago que la infecta carece de la región central dispensable. El título fágico resultó ser de 132 ufp/μl (66.000 ufp tota¬ les) en Escherichia coli LE392 y de 113 ufp/μl en Escherichia coli NM539. Esto significaba que alrededor del 85% de los fagos eran portadores de un fragmento de ADN exógeno. Para calcular el número de fagos recombinantes necesarios para constituir una librería genética completa se aplicó la ecua¬ ción de Clarke y Carbón, N=In/l-p) /ln/l-f) ; donde "p" es la probabilidad deseada, "f" la proporción del genoma del orga- nismo elegido contenida en un recombinante y "N" el número necesario de recombmantes. Asumiendo que el tamaño del geno¬ ma de Rhodotorula gracilis está contenido en alrededor de 15.000 kb y que el promedio de los insertos encapsidados fuera de 18 kb (a pesar de que se habían seleccionado tamaños entre 18 y 22 kb) , con el número de fagos recombmantes obte¬ nidos se había conseguido una genoteca de Rhodotorula graci ¬ lis con un 99,99% de probabilidad.

Una vez realizadas esta serie de comprobaciones teóricas, se infectó Escherichia coli NM539 y la librería genética completa se extendió sobre 5 placas Petri de 150 mm de diámetro (alrededor de 11.300 ufp/placa Petπ) , recogién¬ dose seguidamente en 50 mi de SM. De estos 50 mi se tomaron 40 mi y se les añadió 2,5 mi de cloroformo antes de almace¬ narlos a 4°C. A los 10 mi restantes se les añadió DMSO al 7% se almacenaron a -80°C. De esta forma se disponía de una solución que contenía un número de fagos recombmantes de aproximadamente 5.300 ufp/μl preparados para su análisis.

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2. Identificación de los clones que contienen el gen dao

Aproximadamente 60.000 ufp se extendieron sobre 2 placas Petri de 150 mm de diámetro (alrededor de 30.000 ufp/- placa Petri) y se transfirieron a filtro de nitrocelulosa. Suponiendo un inserto medio de 18 kb por cada ufp y 15.000 kb para el genoma de Rhodotorula gracilis, dicho genoma estaría representado alrededor de 72 veces. En este caso la bacteria elegida para la infección fue Escherichia coli LE392, ya que el número de falsos recombinantes era despreciable y el tamaño de las placas de lisis mayor y más uniforme que el obtenido con Escherichia coli NM539.

El proceso de selección de fagos positivos se llevó a cabo de acuerdo con un procedimiento de hibridación previamente descrito (Sambrook et al. (1989) Molecular Clo- ning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) . El proceso se inició con la prehibridación de los filtros de nitrocelulosa. Para ello, los filtros se incubaron a 42°C durante 3 horas en tampón de hibridación (Sambrook et al. (1989) Molecular Clo- ning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA. La hibridación se realizó retirando el tampón utilizado en la prehibridación e introdu¬ ciendo nuevo tampón de hibridación junto con 200 ng del frag¬ mento de ADN marcado con ³² p previamente desnaturalizado. El ADN que se utilizó como sonda para la identificación de los clones portadores del gen dao consistió en un fragmen- to de 900 pb obtenido mediante digestión EcoRI-HindIII de pPCR20. Los filtros se incubaron a 42 ^C C durante 16 horas y se lavaron dos veces durante 20 minutos a temperatura ambiente en 2XSSC- 0.1% SDS, seguidos de otros dos lavados del mismo tiempo a la temperatura de hibridación en tampón 0.1XSSC-0.1% SDS (Sam¬ brook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) . Por último, los filtros de nitrocelulosa se expusieron en Hyperfilm-MP (Amersham) bajo pantallas amplificadoras a - 70°C durante 48 horas.

Una vez completado el proceso de prehibridación,

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hibridación, lavados y autorradiografla se seleccionaron un total de 16 clones positivos de los 54 obtenidos. Las pla¬ cas de lisis positivas se recogieron individualmente con la ayuda de una pipeta Pasteur y cada una de ellas se resuspen- dio en 1 mi de SM más 50 μl de cloroformo. Seguidamente se titularon los fagos presentes en dicha solución. Para ello fue necesario diluir 5.000 veces dicho fago para que al rea¬ lizar la infección con 20 μl del mismo, el número de placas de lisis por placa Petri oscilara entre 500 y 1.000. Una vez transferido el contenido de cada placa Petri a su correspon¬ diente filtro de nitrocelulosa, estos últimos se hibridaron nuevamente con la misma sonda. La autorradiografla mostró que entre el 20 y el 50% de los fagos de cada placa Petri generaban una señal positiva. Por lo tanto, se hizo necesa- rio purificar cada uno de los fagos positivos a través de un tercer ciclo de hibridación. Para ello, se recogieron con pipeta Pasteur aquellas placas de lisis positivas que se encontraban más aisladas del resto o las que estaban rodeadas de placas de lisis también positivas y se resuspendieron en 1 mi de SM más 50 μl de cloroformo. Tras diluir 100 veces dicha solución fágica e infectar con 15 μl de ella, se consi¬ guieron títulos de alrededor de 300 placas de lisis por placa Petri. Una vez procesadas en idénticas condiciones a los dos ciclos anteriores, se consiguió que el 100% de los fagos de cada placa Petri fueran positivos. De esta forma de purifi¬ caron 16 placas de lisis independientes. Cada placa de lisis se resuspendió en 100 μl de SM más 10 μl de cloroformo y con 2 μl de esta solución se consiguieron placas de lisis conflu- yentes con la finalidad de amplificar en medio sólido dichos fagos positivos. Tras recoger la capa superior de agarosa y resuspenderla en 5 mi de SM se obtuvieron soluciones con alrededor de 10 ^"7 ufp/μl para cada uno de los fagos positi¬ vos.

La sonda anteriormente mencionada de 900 pb Eco- RI-fíi_πdIII también se utilizó para determinar por el método de Southern (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor, New York, USA) aquellos fragmentos de ADN genómico que incluían el gen dao de Rhodotorula gracilis. Para ello se realizó en las condiciones que se describen seguidamente una hibridación con el ADN digerido con las endonucleasas (Phar- macia) de restricción BamHI, EcoRI, HindIII, Knpl, PstI, PvuII, Xbal y XHol y fraccionado en gel de agarosa. El gel de agarosa en el que se separaron fragmentos de ADN en base a su tamaño molecular se incubó secuencialmente a temperatura ambiente y con agitación suave durante 15 minutos en HC1 0.25 M, 1 hora en solución desnaturalizante y 1 hora en solución neutralizante. Seguidamente el gel se colocó sobre un taco de papeles de filtro Whatman 3 MM empapados en 10 x SSC y sobre él se dispuso un filtro de nitrocelulosa BA85 (0.45 μm)

(Schleicher and Schuell) de las dimensiones del gel y empapa- da en 2xSSC evitando la formación de burbujas. Sobre el filtro de nitrocelulosa se colocaron dos láminas de papel Whatman 3MM embebidas en 2xSSC, encima se emplazaron 8-10 centímetros de altura de papel de filtro seco de las mismas dimensiones y sobre todo ello un peso de alrededor de 500 gramos. La transferencia se mantuvo durante 16 horas. Una vez transferido el ADN, el filtro de nitrocelulosa se sumer¬ gió cuidadosamente en 6xSSC durante 5 minutos, se dejó secar a temperatura ambiente 1 hora y se incubó entre dos láminas de papel Whatman 3MM a 80°C con vacío 3 horas más. Seguida- mente se prehibridó e híbrido en las mismas condiciones des¬ critas anteriormente para el rastreo de la genoteca. El re¬ sultado de la autorradiografía mostró la aparición de bandas específicas de hibridación para cada una de las digestiones. Concretamente, el tamaño de dichas bandas fue de 8,4 kb para la digestión EcoRI y de 3,5 kb para la HindlII. Tras purifi¬ car el ADN de los fagos tal y como se indica en el apartado 1 del ejemplo 2 para el bacteriófago lambda-GEM12, se reali¬ zaron digestiones EcoRI y HindIII, identificándose las bandas de 8,4 kb EcóRI y de 3,5 H±πdlII anteriormente mencionadas. Mediante el método de Southern se confirmó que ambas bandas hibridaban específicamente con la sonda de 900pb EcoRI-Hiπ- dlll procedente de pPCR20.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Con la finalidad de subclonar los fragmentos de 8,4 kb EcoRI y de 3,5 kb H±πdlII anteriormente citados, se digirieron 5 μg del fago # 11 con EcoRI y otros 5 μg con HindIII, se purificaron los fragmentos deseados por el método de GENECLEAN II (BIO 101, Inc.) y se ligaron con el plásmido pBCKS/+ (Stratagene) digerido con EcoRI o HindIII utilizando T4 ADN ligasa, ATP y el tampón recomendado por los suminis¬ tradores de la enzima. La mezcla de ligación resultante se incubó durante 5 horas a 12°C y se utilizó para transformar células competentes de Escherichia coli DH5α. Los transfor¬ mantes se seleccionaron en medio LB sólido al que se habían adicionado cloranfenicol (34 μg/μl) , X-gal (40 μg/μl) e IPTG 0.2 mM. Entre los clones que presentaban el fenotipo blanco de selección se identificaron como pALR90 y pALR91 aquellos que portaban el fragmento HindIII de 3,5 kb (ambas orienta¬ ciones) y como pALR92 y pALR93 los que incluían el fragmento EcoRI de 8,4 kb (ambas orientaciones) .

3. Secuenciación del fragmento que contiene el gen dao El fragmento de ADN contenido en el plásmido pARL90 y que codifica para el gen dao de Rhodotorula gracilis se secuenció utilizando el mismo procedimiento descrito para secuenciar el inserto del plásmido pPCR20, utilizando en este caso oligonucleótidos sintéticos como cebadores diseñados en función de la secuencia determinada anteriormente con el plásmido pPCR20. Esta secuencia se muestra en la SEQ ID NO:l.

EJEMPLO 3

1. Extracción del ARN total de JLhodotorula gracilis

La cepa de Rhodotorula gracilis ATCC 26217 se cultivó en el medio YMPG antes descrito. La incubación se prolongó durante 15 horas (D.O. ₆₆₀ = 1,13) con agitación en un agitador orbital a 250 rpm y a una temperatura de 30°C. El ARN se extrajo según un procedimiento previa¬ mente descrito (Methods Enzymol . (1991) 194:398) utilizando

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

fenol caliente y perlas de vidrio.

2. Obtención del cADN correspondiente al gen dao

Una muestra de 7 μg de ARN total de Rhodotorula gracilis conteniendo ARNsina se anilló a 70°C durante 5 minu¬ tos con 2 μl del oligonucleótido

RTDA02 (5' -CCATCGATAAGCTTACAACTTCGACTCCCGCGCCGC-3' ) (10 μM) . El producto resultante se incubó a 42°C durante 90 minutos con la transcriptasa en reverso AMV (Promega) utilizando el tampón y las condiciones que indican los suministradores. A continuación la mezcla se calentó a 95°C durante 5 minutos y se diluyó 4 veces con agua destilada.

El producto resultante se utilizó como molde para una amplificación por PCR. A tal efecto se utilizaron los oligonucleótidos

RTDA01 (5' -GGAGGAATTCATATGCACTCTCAGAAGCGCGTCG-3' ) y RTDA02 antes descrito. El oligonucleótido RTDA01 aporta la secuen¬ cia de nucleótidos GGAGG que representa un sitio de unión al ribosoma de Escherichia coli que será necesario para la pro- ducción de la DAO en este microorganismo. El procedimiento de amplificación fue similar al que anteriormente se descri¬ bió pero en este caso utilizando 30 ciclos de: 95°C (1 minu¬ to) , 55°C (2 minutos) y 72°C (2 minutos) . El resultado de la amplificación se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio después de una electroforesis en gel de agarosa al 1%.

El fragmento de ADN obtenido por PCR, de un tama¬ ño de aproximadamente 1,1 kb, se purificó mediante extracción del gel de agarosa utilizando Geneclean (Bio 101, Inc.) si¬ guiendo las recomendaciones de los distribuidores.

3. Clonación y secuenciación del fragmento de ADN que corres¬ ponde al ARN mensajero del gen dao

Una muestra de 0,1 μg de ADN del plásmido pBCKΞ/+ se digirió con la endonucleasa de restricción EcoRV (Pharma- cia) a 37°C, en un tampón recomendado por los suministrado¬ res, durante 1 hora y se calentó durante 10 minutos a 65°C para detener la reacción. El plásmido digerido se mezcló con

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

una muestra del fragmento de ADN resultante del PCR y purifi¬ cado anteriormente (0,2 μg) y ambos ADNs se ligaron mediante la enzima T4 ADN ligasa (Amersham) en presencia de ATP usando un tampón recomendado por los suministradores. La mezcla de ligación resultante se utilizó para transformar células competentes de Escherichia coli DH5α. Los transformantes se aislaron en un medio de cultivo sóli¬ do con agar (2%) que contenía medio LB, cloranfenicol (34 μg/ml), X-gal (40 μg/ml) e IPTG 0,2 mM. Mediante este proce- dimiento se obtuvieron varios clones que presentaban un feno¬ tipo blanco en el medio de selección. Uno de estos clones contenía el plásmido recombinante pCDAAOlO que posee el frag¬ mento de ADN de 1,1 kb resultante de la amplificación por PCR insertado en el sitio EσoRV del plásmido pBCKS/+. Este clon se depositó en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el n° 4636.

La secuencia de nucleótidos del fragmento conteni¬ do en el plásmido pCDAA03 se determinó mediante el mismo método descrito anteriormente. La secuencia de nucleótidos y su comparación con otras' secuencias conocidas en los bancos de datos internacionales (GeneBank/EMBL) , así como con la secuencia de aminoácidos recientemente publicada de la DAO de Rhodotorula gracilis (Biotech. Letters (1995) 17:193) indica¬ ron que el fragmento clonado contenía la región del cADN que codifica para la DAO de Rhodotorula gracilis . En la SEQ ID NO :1 se indican los exones correspondientes al cADN que co¬ difican para la DAO de Rhodotorula gracilis . Este análisis también permitió conocer que el fragmento clonado en el plás¬ mido pCDAAOlO contiene el gen dao en la orientación adecuada para su expresión bajo el control del promotor lac del vec¬ tor, por lo que este plásmido permite producir la DAO bajo el control de este promotor.

EJEMPLO 4

1 . Producción de la DAO de Rhodotorula gracilis en Escheri ¬ chia coli

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

La cepa Escherichia coli CECT 4636 se fermentó en el medio LB durante 20 horas a 25°C y con agitación a 250 rpm. Seguidamente las células se recogieron por centrifuga¬ ción a 5.000 x g durante 10 minutos, se rompieron por sonica- ción y se ensayó su actividad DAO tal y como se describe en el apartado 1 del ejemplo 1. La actividad DAO obtenida por este procedimiento fue de 40 U/mg de proteína.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

LISTADO DE SECUENCIAS

SEO ID NO:l

Número de hélices: doble

Configuración de la secuencia: lineal

Tipo de moléculas: ADN

Secuencias hipotéticas: NO

Anti-sentido: NO

Tipo de fragmento:

Origen de la molécula: Rhodotorula gracilis

Fuente experimental inmediata de la molécula - cepa ATTC

26217.

Posición de la secuencia en el genoma: NO

Características de la secuencia: Longitud 1542 pb.

CDS: 72-100(113); 220-333; 398-469; 525-642; 663-911; 970- 1530

AACGAGGGGT GTCGCTCGAC TAACAGCTCT CTATCCTCTT GCTGCTAGCA 50 TTGTACTACT CGAACGACGC C ATG CAC TCT CAG AAG CGC GTC GTT 95

Met His Ser Gln Lys Arg Val Val 1 5

GTC CTC GGA TCA GGC GGT GCGTCTTTTC CCTCTCCTCC CCACACCCGA 143 Val Leu Gly Ser Gly

10 AGTCCTCGA CGAGGTGTAG GACGGCGAGC AAAGCTGCCG AGGGCGATCT 193 GGGCTGACTG AGCGCTCGAG TGTACAG TT ATC GGT CTG AGC AGC 237

Val He Gly Leu Ser Ser 15 GCC CTC ATC CTC GCT CGG AAG GGC TAC AGC GTG CAT ATT CTC 279 Ala Leu He Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His He Leu 20 25 30

GCG CGC GAC TTG CCG GAG GAC GTC TCG AGC CAG ACT TTC GCT 321 Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala

35 40 45

TCA CCA TGG GCT GTGCGTCGTC TCACTGTAGT TGGAGGATGT 363

Ser Pro Trp Ala

50 CAGCGAGAGC TGAGCAATCT CGTCATCCCC GCAG GGC GCG AAT TGG 410

Gly Ala Asn Trp 55 ACG CCT TTC ATG ACG CTT ACÁ GAC GGT CCT CGA CAÁ GCA 448 Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly Pro Arg Gln Ala

60 65

AAA TGG GAA GAA TCG ACT TTG TGCGTCTCCT TCTACCTCAT 489

Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe 70 75

TCTTGGCCTC GAGCTGACGA GTGTATGATA CACAGC AAG AAG TGG GTC 537

Lys Lys Trp Val

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

GAG TTG GTC CCG ACG GGC CAT GCC ATG TGG CTC AAG GGG ACG 579

Glu Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr

30 85 90

AGG CGG TTC GCG CAG AAC GAA GAC GGC TTG CTC GGG CAC TGG 621

Arg Arg Phe Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp

95 100 105

TAC AAG GAC ATC ACG CCA AAT GTGCGCCCAC ATTCACTCTT 662 Tyr Lys Asp He Thr Pro Asn

110 CCCTTCGCAT GTCTCCGTTT ACTGACCCGC CCTCTTTCGC CGTGCGCAG 712 TAC CGC CCC CTC CCA TCT TCC GAA TGT CCA CCT GGC GCT ATC 754 Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala He 115 120 125

GGC GTA ACC TAC GAC ACC CTC TCC GTC CAC GCA CCA AAG TAC 796 Gly val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr

130 135 140

TGC CAG TAC CTT GCA AGA GAG CTG CAG AAG CTC GGC GCG ACG 838 Cys Gln Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr

145 150 155

TTT GAG AGA CGG ACC GTT ACG TCG CTT GAG CAG GCG TTC GAC 880 Phe Glu Arg Arg Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp 160 165 170

GGT GCG GAT TTG GTG GTC AAC GCT ACG GGA CTT GGTATGTCCC 923 Gly Ala Asp Leu Val Val Asn Ala Thr Gly Leu

175 180

GAACTGCCCC TCTCTACCTG C^TTTTGCT GATTGATATG CTCGCAG GC 972

G ly GCC AAG TCG ATT GCG GGC ATC GAC GAC CAÁ GCC GCC GAG 1011 Ala Lys Ser He Ala Gly He Asp Asp Gln Ala Ala Glu

185 190 195

CCA ATC CGC GGC CAÁ ACC GTC CTC GTC AAG TCC CCA TGC AAG 1053 Pro He Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys Lys

200 205

CGA TGC ACG ATG GAC TCG TCC GAC CCC GCT TCT CCC GCC TAC 1095 Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr 210 215 220

ATC ATT CCC CGA CCA GGT GGG GAA GTC ATC TGC GGC GGG ACG 1137 He He Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val He Cys Gly Gly Thr

225 230 235

TAC GGG GTG GGA GAC TGG GAC TTG TCT GTC AAC CCA GAG ACG 1179 Tyr Gly Val Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr

240 245 250

GTC CAG CGG ATC CTC AAG CAC TGC TTG CGC CTC GAC CCG ACC 1221 Val Gln Arg He Leu Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr 255 260 265

ATC TCG AGC GAC GGA ACG ATC GAA GGC ATC GAG GTC CTC CGC 1263 He Ser Ser Asp Gly Thr He Glu Gly He Glu Val Leu Arg

270 275

CAC AAC GTC GGC TTG CGA CCT GCA CGA CGA GGC GGA CCC CGC 1305 His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg Arg Gly Gly Pro Arg 230 285 290

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

GTC GAG GCA GAA CGG ATC GTC CTG CCT CTC GAC CGG ACÁ AAG 1347 Val Glu Ala Glu Arg He Val Leu Pro Leu Asp Arg Thr Lys

295 300 305

TCG CCC CTC TCG CTC GGC AGG GGC AGC GCA CGA GCG GCG AAG 1390 Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala Lys

310 315 320

GAG AAG GAG GTC ACG CTT GTG CAT GCG TAT GGC TTC TCG AGT 1431 Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser 325 330 335

GCG GGA TAC CAG CAG AGT TGG GGC GCG GCG GAG GAT GTC GCG 1473 Ala Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala

340 345

CAG CTC GTC GAC GAG GCG TTC CAG CGG TAC CAC GGC GCG GCG 1515 Gln Leu Val Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala 350 355 360

CGG GAG TCG AAG TTG TAGGGCGGGT TT 1542

Arg Glu Ser Lys Leu

365

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

22.1 -

INDICACIÓN RELATIVA AL DEPOSITO DE UN MICROORGANISMO

(Regla 13 bis del PCT)

Las indicaciones se refieren al microorganismo mencionado en la descripción página 4 .línea 31

B. IDENTIFICACIÓN DEL DEPOSITO Otros depósitos están identificados en una hoja suplementaria D

Nombre de la institución de depósito

Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)

Dirección de la institución de depósito (comprendidos el distrito postal y el país)

Departamento de Microbiología Facultad de Ciencias Biológicas Universidad de Valencia 46100 BURJASOT (Valencia)

Fecha de depósito n° de orden

0 7- 02 - 1996 4636

C. INDICACIONES SUPLEMENTARIAS (en caso necesario) Se adjunta una hoja separada para la continuación de estos datos D

D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS QUE SE FACILITAN LAS INDICACIONES

(caso de que las indicaciones no se faciliten para todos los estados designados)

E. INDICACIONES SUMINISTRADAS POR SEPARADO (en caso necesario)

Las indicaciones numeradas a continuación serán presentadas posteπormente en la Oficina internacional (especificar la naturaleza general de las indicaciones por ejem "n° de orden del depósito")

que la Esta hoja se ha recibido en la Oficina internacional el

Formulario PCT/RO/134 (Julio 1992)