Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel¬ lung von hä okompatiblen Substraten durch Einarbeitung, Adhä¬ sion und/oder Modifizierung und Verankerung von nicht-throm- bogenem Endothelzelloberflächen-Polysaccharid (HS I) in seiner Peptid-gebundenen oder freien Form in und/oder auf syntheti¬ sche und Bio-Polymere (Substrate) mittels physikalischer Ver¬ teilung, Adhäsion an der Oberfläche und/oder chemischer Ver¬ ankerung, die als blutverträgliche Substrate in der Medizin eingesetzt werden können. Diese Polymere können in Form von Fasern, Hohlfasern, Membranen, Organersatzteilen, Kanülen, Spritzen, Schläuchen, Blutbehältern oder in anderer Form vor¬ liegen oder dazu verarbeitet werden.

Es ist bekannt, daß unphysiologische Polymere ohne zusätzli¬ che Hilfsmaßnahmen bei Blutkontakt mehr oder weniger rasch zur -Blutgerinnung führen. Weiterhin ist bekannt, daß die Strör mungsverhältnisse des Blutes, die u.a. durch die Gestalt, Oberflächenbeschaffenheit und elastischen Eigenschaften von Substraten, beeinflußt werden, den Gerinnungsprozeß des Blu¬ tes ebenfalls stark beeinflussen. Wenn jedoch geeignete Poly¬ mere, wie z.B. EP-Copolymere, Cellulose, fluoriertes Polyethy- len, Polyetherurethan, Polyethercarbonat, Hydrogele von z.B. Polyacrylamid ausgewählt werden, nimmt die Blutgerinnung nach Polymerkontakt deutlich ab.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Blutgerinnung durch Überziehen von hydrophoben Polymeren mit Albumin weiter herab¬ zusetzen. Eine weitere Möglichkeit zur Herabsetzung der Koagu¬ lation des Blutes ist der Einsatz von sulfonierten und sulfa- tierten Produkten, wie z.B. sulfatiertes Polystyrol oder vinyl- sulfonsäurehaltige Copolymere.

Die größten blutgerinnungshemmenden Effekte wurden durch Ein¬ bau oder Oberflächen-Modifizierung von Polymeren mit blutge-

rinnungshe menden Mitteln, wie Heparin oder Heparinoide, er¬ zielt. Schon der Einschluß von Heparin in mikroporöses Kunst- stoffmaterial, aus dem es leicht herausdiffundieren kann, führt zu einer antikoagulierenden Wirkung. Deutlichere Effekte wurden durch oberflächliche Modifizierung von z.B. Styrol mit an¬ schließender salzartiger Bindung von Heparin erzielt.

Durch die bisher produzierten Materialien ist es aber noch nicht gelungen, eine Blutverträglichkeit zu erreichen, wie sie z.B. die intakte Endothelzelloberflache auf der luminalen Seite des Blutgefäßes bewirkt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Her¬ stellung von hämoko patiblen, polymeren Substraten.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Einlagerung, Adsorption oder Bindung eines biologisch und speziell gerinnungsphysiologisch inerten Endothelzelloberflä- chen-Polysaccharids in seiner freien oder peptidgebundenen Form an oder in geeignete Polymere. Diese Einlagerung, Adsorp¬ tion oder Bindung kann über van der Waals-Wechselwirkungen, Salzbrücken, Chelatbindungen oder durch kovalente Bindung er¬ reicht werden. Die Blutverträglichkeit der so gewonnenen mo¬ difizierten Polymeren ist gegenüber allen bisher bekannten Polymeren deutlich verbessert.

Die so modifizierten Polymeren sollen Einsatz finden in Form von künstlichen Organen, Membranen, Hohlfasern, Oxigenatoren, Spritzen, Schläuchen, Behältern, faserhaltigen Gebilden, die dadurch gekennzeichnet sind, daß

(1) HSI eingearbeitet oder immobilisiert oder auf der Ober¬ fläche verankert wird in synthetische und Biopolymere nach den bekannten Methoden der Immobilisierung von Enzymen, Mem¬ branherstellung, der KunststoffVerarbeitung und den Methoden der Polymerchemie über van der Waals-Kräfte, hydrophobe Inter¬ aktionen _r Chelatbindungen und salzartige Bindungen,

(2) HSI kovalent verankert wird an synthetischen Polymeren und Biopolymeren nach den Methoden der Peptidchemie, Protein¬ chemie, Zuckerchemie oder Polymerchemie.

Unter dem Begriff HSI wird ein Endothelzelloberflächen-Proteo- Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von etwa 195 000 und einem Molekulargewicht des Polysaccharidteils von 35 000 bei 3 - 4 Polysaccharidketten/Molekül, und einem Peptidanteil von 55 000 verstanden. Der Polysaccharidanteil, eine Untereinheit des Moleküls, die über Proteolyse oder Alkaliabbau zugänglich ist, hat sich in allen biologischen Aggregations- und Funk¬ tionstesten als völlig inert erwiesen, z.B. in Bezug auf

- Wechselwirkung mit den Faktoren der Blutgerinnung, Wechselwirkung mit Antithrombin III,

- Wechselwirkung mit Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren, wie z.B. Platelet derived growth factor etc., Wechselwirkung mit Bindegewebsstrukturpolymeren, wie Kollagen I - VI, Laminin, Fibronectin, Nidogen und Entac- tin,

Wechselwirkung mit Thrombozyten.

Diese Substanz kann als Polysaccharidanteil mit oder ohne ver¬ bleibendem Peptidrest für die Bindung an Polymere zur Herstel¬ lung hämokompatibler Substrate eingesetzt werden. Die Lang¬ zeit-Blutverträglichkeit von Peptid-gebundenem HS I-Polysac- charid kann durch Bindung von Plasmaproteinen an den verblei¬ benden Peptidrest oder Immunisierung bei Verwendung von HS- I aus anderen Spezies eingeschränkt sein. In einem solchen Fall wird der Peptidrest durch weitere Proteolyse verkürzt .oder, falls erforderlich, durch Einwirkung von 0,5 M NaOH restlos entfernt.

HS I wird aus dem konditionierten Medium von massenkultivier¬ ten Endothelzellen oder aus den -Endothelzellen selbst nach Molgewicht, Hydrophobizität und Ladung gereinigt:

Bovine aortale Endothelzellen, oder Endothelzellen aus ande¬ ren Spezies und anderen Blutgefäßen, bzw. Endothelzellen aus anderen Geweben, wie z.B. Cornea, Liquorhöhlen etc., werden durch Behandlung mit Kollagenase, durch mechanische Ablösung, durch Behandlung mit anderen lytischen Reagenzien, wie z.B. Heparinase und/oder Heparitinase, durch Behandlung mit Tryp- sin oder anderen Proteasen, durch Einwirkung von EDTA, EGTA oder anderen Chelatbildnern aus dem Gewebe gelöst und in her¬ kömmlichen Gewebekulturflaschen, in Petrischalen _r in Hollow-

Fiber-Perfusionskulturen, auf Beads, in Roller laschen oder

9 in anderer Weise in großer Anzahl gezüchtet (2 x 10 Zellen/

Präparation) . Die Aufzüchtung erfolgt nach den herkömmlichen

Techniken der Gewebe- und Zellkultur.

Die Zellen werden, wie oben beschrieben, von der Unterlage gelöst, durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen, durch Ul¬ traschallbehandlung, durch Behandlung in einem Potter oder durch andere Weise homogenisiert, bei 10 000 x g abzentrifu- giert und der überstand mit Detergenzien, vorzugsweise 2 % * SDS, gelöst.

Als eine weitere Quelle für HS I kann das konditionierte Me¬ dium von Endothelzellen dienen. Hierzu wird das Medium zu¬ nächst mit Chondroitinase ABC inkubiert, in Gegenwart von Chelatbildnern, wie z.B. EDTA, im Rotationsverdampfer einge¬ engt und dann prinzipiell in der gleichen Weise, wie für das Material zellulären Ursprungs beschrieben, aufgearbeitet.

Die HS I-haltigen Materialien werden an Sepharose CL-6B oder Sepharose CL-4B chromatographiert. Als Säulendimensionen wer¬ den Durchmesser zu Höhen-Verhältnisse von 1 : 10 - 1 : 50 verwendet (z.B. 10 x 200 cm). Als Elutionsmittel kann 0,13 M Tris/HCl, 0,1 % SDS pH 7,4 oder ein anderes geeignetes Lauf- mittel Verwendung finden. Der Nachweis des HS I in dem Prä¬ parationsschritt kann durch Reaktion von Aliquots aus den Chromatographiefraktionen in Nachweisreaktionen für Zucker, wie z.B. die Orcinreaktion, in Nachweisreaktionen für Uron-

Ersatzbiatt

säuren, wie z.B. die Carbazolreaktion, durch Zugabe einer geringen Menge von radioaktiv markiertem HS I vor der Sepha- rose-Chromatographie, oder auf andere Weise erfolgen.

Die so identifizierten HS I-haltigen Chromatographiefraktio¬ nen werden im Rotationsverdampfer 1 : 10 eingeeng , durch Chromatographie an Sephadex G-25, oder durch Dialyse, durch Ultrafiltration an Ultrafiltrationsmembranen, durch Ausfällen in 80 % Ethanol oder auf andere Weise entsalzt und danach in 3 - 7 M Harnstoff, Detergenzien, wie z.B. 0,1 % Triton X-100 und Puf ersalzen, wie z.B. 0,1 M NaAc pH 6,5, aufgenommen. Die Lösung wird auf eine Anionenaustauschersäule, wie z.B. DEAE-Cellulose, in Gegenwart von 7 M Harnstoff, Detergenzien und Puffersalzen aufgetragen und mit einem Salz-Gradienten (z.B. 0 - 1 M NaCl) wieder von der Säule eluiert.

Als weitere Reinigungsschritte stehen die folgenden Techni¬ ken zur Verfügung:

Dichtegradienten-Ultrazentrifugation in einem CsCl-Gra- dienten bei einer mittleren Dichte von vorzugsweise 1,4 g/ ml; - weitere Zyklen von Gelchromatographie/Ionenaustauscher- chromatographie;

Chromatographie an lipophilen Gelen, wie z.B. Octylsepha- rose;

HPLC an Ionenaustauschersäulen, Silicagelsäulen, reversed- phase-Säulen und an Gelsäulen.

Die nachfolgenden Kriterien werden zur Prüfung der .Homogeni¬ tät einer HS I-Präparation herangezogen:

1. die Nicht-Nachweisbarkeit von Galaktosamin in der Baustein¬ analyse zeigt die Freiheit von kontaminierendem Chondroi- tinsulfat an; 2. ein Absorptionsmaximum bei 280 nm und ein Minimum bei 260 nm zeigt die Freiheit von kontaminierender RNS oder DNS an;

3. eine Bande in der NU-Sieve-Agarose Gelelektrophorese und eine Bande (bei 55 000) in der SDS-Gelelektrophorese zeigt die Abwesenheit von kontaminierenden Proteinen an;

4. nach Inkubation in 0,5 M NaOH für 12 h bei 4°C wird ein hochmolekulares Polysaccharid gefunden.

Als Modifikation der Präparation kann auch das HS I-Polysac- charid bzw. -Peptidopolysaccharid durch Alkalidegradation (z. B. Inkubation in 0,5 M NaOH während 12 h bei 4°C) oder pro- teolytischen Abbau (z.B. mit Papain oder mit Pronase) oder andere Verfahren in jeder Stufe der Präparation, auch aus den unbehandelten Zellen oder aus dem unbehandelten Medium, freigesetzt und über Gelchromatographie, enzymatischen Abbau von kontaminierenden Biopolymeren, Ionenaustauscherchroma¬ tographie, Dichtegradientenultrazentrifugation, HPLC an Gel- permeationssäulen, an Silicagelen und/oder an reversed-phase- Säulen gereinigt werden. Mit Ausnahme des vorstehend ange¬ führten Punktes 2 _ finden alle oben dargestellten Homogeni¬ tätskriterien für eine solche Präparation Verwendung.

Unter dem Begriff "synthetische Polymere und Biopolymere' ¹ sollen alle bekannten natürlichen Polymeren und bisher syn¬ thetisch hergestellten Polymeren, die als Homo- und verschie¬ dene Copolymere mit unterschiedlicher Taktizität, unterschied¬ lichem Molgewicht, unterschiedlicher Sequenzanordnung der Bausteine u.a. statistischer und/oder alternierender Reihen¬ folge; Blockcopolymere mit unterschiedlichen Sequenzlängen- verteilungen, Triblockcopolymere, Ionomere, Pfropfcopolymere, Polymere mit unterschiedlichem Vernetzungsgrad, sowie Polyme¬ re, die durch polymeranaloge Reaktionen modifiziert werden, verstanden werden. Die erfindungsgemäß im folgenden aufgeführ¬ ten Polymeren sind nur eine kleine Auswahl von Polymeren, die durch weitere CoPolymerisationen, Pfropfung oder polymerana- loge Reaktionen zusätzlich modifiziert werden können und da¬ mit die ^' erweiterte Auswahl von•geeigneten synthetischen und Biopolymeren ergeben. Beispiele der kleineren Auswahl von ge¬ eigneten synthetischen und Biopolymeren sind:

Polyolefine, Polyethylen (HDPE, LDPE, LLPE) , fluoriertes Ethy- len, Copolymere des Ethylens mit Buten- (1), Penten-(1), He¬ xen- (1), Copolymere des Ethylens und Propylens, EPR-Kautschuk, oder EPT-Kautschuk (dritte Komponente mit Dienstruktur u.a. Dicyclopentadien, Ξthylidennorbonen, Methylendomethylenhexa- hydro-naphthalin, eis,cis-Cyclooctadien-1 ,5, Hexadien-1 ,4) , Hexyn (1-Hexen-methylhexadien) ,

Eth len-Vinylacetat-Copolymere, Ethylen-Methacrylsäure-Copo- ly ere, Ethylen-N-Vinylcarbazol, Ethylen-Trifluorchlorethylen, Polypropylen, Polybuten-(1) , Poly-4- (methylpenten- (1 ) ) , Poly- isobutylen-Copolymere, Isobutylen-Styrol-Copolymere, Butyl- kautschuk, Polystyrol und modifiziertes Styrol, chlormethy- liertes Styrol, sulfoniertes Styrol, Poly- (4-aminostyrol) , Styrol-Acrylnitril-Copolymere, Styrol-Acrylnitril-Butadien- Copolymere, Acrylnitril-Styrol-Acrylester-Copoly ere, Styrol- Butadien-Copolymere, Styrol-Divinylbenzol-Copolymere, Poly- diene in der cis,trans-, in der 1,2- und in der 3,4-Konfigu- ration, Butadien, Isopren, gereinigter Naturkautschuk, Chlo- ropren, Styrol, Butadien-Copolymere (SBR) , Triblockpolymere (SBS) , NBR-Acrylnitril-Butadien-Copolymere, Poly- (2,3-dime- thylbutadien) , ein Triblock-Copolymeres aus Polybutadien, terminiert mit cycloaliphatischen sekundären Aminen oder Ben- zyl-L-glutamat oder Polypeptiden oder N-Carbobenzoxylysin, Poly- (alkenamere)-Polypentenamere, Poly- (1-hexen-methylhexa¬ dien) , Polyphenylen, Poly-(p-xylylen) , Polyvinylacetat, Vinyl- acetat-Vinylstearat-Copolymere, Vinylacetat-Vinylpivalat-Co- poly ere, Vinylacetat-Vinylchlorid-Copolymere, Polyvinylalko- hol, Polyvinylfor al, Polyvinylbutyral, Polyvinylether, Poly- (N-vinylcarbazol) , Poly-N-vinylpyrrolidon, Poly-(4-vinylpy- ridin) , Poly- (2-vinylpyridiniumoxid) , Poly- (2-methyl-5-vinyl- pyridin) , Butadien- (2-methyl-5-vinylpyridin)-Copolymere, Polytetrafluorethylen, Tetrafluore.thylen-Hexafluorpropylen- Copolymere, Tetrafluorethylen-Perfluorpropylvinylether-Copo- lymere, Tetrafluorethylen-Ethylen-Copolymere, Tetrafluorethy- len-Trifluornitrosomethan-Copolymere, Tetrafluorethylen-Per- fluormethylvinylether-Copolymere, Tetrafluorethylen-(Perfluor-

4-cyanobutyl inylether)-Copolymere, Poly-(trifluorchlorethy- len) , Trifluorchlorethylen-Ethylen-Copolyraere, Polyvinyliden- fluorid, Hexafluorisobutylen-Vinylidenfluorid-Copolymere, Po- lyvinylfluorid, Polyvinylchlorid, schlagfestes PVC durch Bei¬ mischen von ABS, MBS, NBR, chloriertem PE, EVAC oder Polyacry- laten, Weich-PVC, nachloriertes PVC, Vinylchlorid-Vinylacetat- Copolymere, Vinylchlorid-Propylen-Copolymere, Polyvinyliden- chlorid, Vinylchlorid-Vinylidenchlorid-Copolymere, Vinyliden- chlorid-Acrylnitril-Copoly ere, Polyacrylsäure, Acrylsäure- Itakonsäure-Copolymere , Acrylsäure-Methacrylsäure-Copolymere, Acrylsäureester-Acrylnitril-Copolymere, Acrylsäureester-2- Chlorethylvinylether-Copolymere, Poly- (1,1-dihydroperfluor- butylacrylat) , Poly-(3-perfluormethoxy-1 , -dihydroperfluorpro- pylacrylat) , Polysulfon, Polyacrolein, Polyacrylamid, Acryl- säure-Acrylamid-Copolymere, Acrylamid-Maleinsäure-Copolymere, Acrylamid-Hydroxymethylmethacrylat-Copolymere, Acrylamid-Me- thylmethacrylat-Copolymere, Acrylamid-Methylacrylat-Copoly- mere, Acrylamid-Maleinsäureanhydrid-Copolymere, Acrylamid- Methacrylsäureanhydrid-Copolymere, Acrylamid-Anilinoacryl- amid-Copolymere, Acrylamid-(N-acrylol-4-carboxymethyl-2,2'- dimethylthiazolin)-Copolymere, Polymethacryla id, Methacryl- säure-Methacrylnitril-Copolymere, Methacrylsäure-3-Fluorsty- rol-Copolymere, Methacrylsäure-4-Fluorstyrol-Copolymere, Meth- acrylsäure-3-Fluoranilid-Copolymere, nitrierte Copolymere von Methacrylsäure mit Methacrylsäure-3-fluoroanilid oder Fluoro- styrol, oder Copolymere von Methacrylsäure mit 3-4-Isothio- cyanatostyrol, oder N-Vinylpyrrolidon mit Maleinsäureanhy¬ drid, oder Polyvinylalkohol und Polyallylalkohol, Polyacry1- nitril, Acrylnitril-2-Vinylpyridin-Copolymere, Acrylnitril- Methallylsulfonat-Copolymer , Acrylnitril-N-Vinylpyrrolidon- Copolymere, hydroxylgruppenhaltiges PAN, Acrylnitril-Vinyl- acetat-Copolymere, Acrylnitril—Acrylester-Copolymere, Polyal- lylVerbindungen, Polydiallylphthalat, Polytrisallylcyanurat _r Poly-α-cyanoacrylat, Polydimethylaminoethylmethacrylat und Copolymere mit Acrylnitril, Methylmethacrylat-Laurylmethacry- lat-Copolymere, para-Acetaminophenylethoxymethacrylat-Methyl- methacrylat-Copolymer , Glykoldimethacrylat-Methacrylat-Co-

polymere, Poly-2-hydroxyethylmethacrylat, 2-Hydroxyethylmeth- acrylat-Methylmethacrylat-Copolymere, Glykolmethacrylat-Gly- koldimethylmethacrylat-Copolymere, HEMA-Styrol-Block- und Pfropfcopolymere, Poly-N,N'-p,ρ*-oxydiphenylenmellitimid, Po- lydiethylenglykolbisallylcarbonat, aliphatische Polyether, Polyoxymethylene, Polyoxyethylen, Polyfluoral, Polychloral, Polyethylenoxid, Polytetrahydrofuran, Polypropylenoxid, Ethy- lenoxid-Propylenoxid-Copolymere, Propylenoxid-Allylglyσidyl- ether-Copolymere, Polyepichlorhydrin, Ethylenoxid-Epichlorhy- drin-Copolymere, Poly-1 ,2-dichlormethyl-ethylenoxid, Poly-2,2- bis-chlormethyl-oxacyclobutan, Epoxid-Harze, Bisphenol-A-di- glycidylether, epoxidiertes Phenol-Formaldehyd, Kresol-Form- aldehyd-Harze, Vernetzung mit Carbonsäureanhydriden, Aminen wie Diethylentriamin, Isophorondiamid, 4,4'-Diaminodiphenyl- methan, aromatische Polyether, Polyphenylenoxide, Polyphenol, Phenoxyharze, aliphatische Polyester, Polylactid, Polygly- kolid, Poly-3-propionsäure, Poly-ß-D-hydroxybutyrat, Polypi- volacton, Poly-ε-caprolacton, Polyethylenglykoladipat, Poly- ethylenglykolsebacat, Ungesättigte Polyester aus Maleinsäure¬ anhydrid, Phthalsäureanhydrid, Isophthalsäure, Terephthalsäu- re oder HET-Säure mit Ethylenglykol, T ^" ,2-Propylenglykol, Neo- pentylglykol, oxyethylierte Bisphenole oder Cyclododecandiol, Vernetzung ungesättigter Polyesterharze oder Vinylesterharze durch Copolymerisation von ungesättigten Polyestern mit Sty¬ rol, Methacrylat, Vinylmonomeren, Vinylacetat, Methylmethacry- lat, Polycarbonat aus Bisphenol-A sowie dessen Derivaten und Polyether, Polyester, segmentierte Polyσarbonate aus Bisphe¬ nol-A sowie dessen Derivaten, und aliphatischen Polyethern so¬ wie aliphatischen Polyestern (siehe oben) , Polyethylenglykol- terephthalat (PET) oberflächenmodifiziert, mit Acrylsäure ge¬ pfropft oder durch partielle Hydrolyse, der Oberfläche von PET, Polybutylenglykolterephthalat, Polyethylenglykolterephthalat- adipat, Polyethylenglykolterephthalat segmentiert mit Poly- etherblöcken und aliphatischen Polyesterblöcken und Polytetra- hydrofuranblöcken, Poly-p-hydroxybenzoat, Hydroxybenzoesäure- Isophthalsäure-Copolymere, Hydroxybenzoesäure-Hydrochinon- Copolymere, Hydroxybenzoesäure-Terephthalsäure-Copolymere, Hy-

droxybenzoesäure-p,p*-Diphenylether-Copoly er , Polyvinylpyr- rolidon, Polyvinylpyrroliden-Maleinsäureanhydrid-Copolymere, Alkydharze aus Glycerin, Trimethylpropan, Pentaerythrit, Sor¬ bit mit Phthalsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Adipinsäure und Fettsäure aus Leinöl, Ricinusöl, Sojaöl, Ko¬ kosöl, aliphatische Polysulfide -(R-Sx-) x = Schwefelgrad, aromatische Polysulfide, Polythio-1 ,4-phenylen, aromatische Polysulfidether aus Phenol und Thiophen, Polyethersulfone, Polysulfo-1 ,4-phenylen, Poly-p-phenylensulfon, Polyimine, Po- lyethylenimin, verzweigte Polyethylenimine, Polyalkylenimine, Polyamide, Polyhexamethylenadipamid, Polyhexamethylensebac- amid, Polyhexamethylendodecandiamid, Polytridecanbrassylamid, Versamide aus pflanzlichen Ölen mit Diaminen und Triaminen, Polyamid aus ω-Aminocarbonsäuren mit ,ß,γ,<5-Aminocarbonsäu- ren oder Lactamen, Terephthalsäure-m-Aminobenzamid-Copolyme- re, Terephthalsäure-m-Phenylendiamin-Copolymere, Polyamidhy- drazide, z.B. aus Isophthalsäure und m-Aminobenzhydrazid, Po¬ lypiperazinamide, z.B. aus Fumarsäure und Dimethylpiperazin, Polybenzimidazole aus Terephthalsäure und Tetraaminobenzol (substituiert) , oder aus Diaminodiphenylether und Dichlordi- phenylsulfon (substituiert und cyclisiert) oder aus m-Pheny- lenisophthalamid und Terephthalamid, Polyimide, z.B. aus Py- romellitsäuredianhydrid, Methoxy-m-phenylendiamin, Pyrone, z.B. aus Pyromellitsäuredianhydrid und Diaminobenzidin, aro¬ matische Polyamide, Poly-m-phenylenisophthalamid, Poly-p-benz- amid, Poly-p-phenylenterephthalamid, m-Aminobenzoesäure-p- Phenylendiamin-Isophthalsäure-Copolymere, Poly-4,4'-diphenyl- sulfonterephthalamid aus Terephthalsäure und Hexamethylente- tramin, Terephthalsäure ^' und Gemischen aus 2,2,4-Trimethylhexa- methylendiamin und 2,4,4-Trimethylhexamethylendiamin, aus Te¬ rephthalsäure, Diaminomethylennorbonen und ε-Caprolactam, aus Isophthalsäure und Laurinlactam, aus Isophthalsäure und Di-4- (cyclohexylamino-3-methyl)-methan, aus 1 ,12-Decandisäure und 4,4 ^, -Diaminodicyclohexylmethan, aromatische Polyamide mit He- terocyclen, z.B. Dicarbonsäuredichlorid, Terephthalsäure und Isophthalsäure, dia inhaltige Heterocyclen, mit Oxidazol-, Triazol-, Bithiazol- und Benzimidazol-Strukturen, 3- (p-Ami-

nophenyl)-7-amino-2,4- (1H,3H)-chinazolindion + Isophthalsäu¬ re, Polyaminosäuren, Poly-methyl-L-glutamat, Poly-L-gluta- minsäure u.a., Copolypeptide, z.B. aus Glutaminsäure und Leu- cin, Glutaminsäure und Phenylalanin, Glutaminsäure und Valin, Glutaminsäure und Alanin, Lysin und Leucin, p-Nitro-D,L-phe- nylalanin und Leucin u.a. , Polyharnstoffe aus Diisocyanaten mit Diaminen und Harnstoffen, Polyurethan aus aliphatischen und aromatischen Diisocyanaten und bifunktionellen und tri- funktionellen hydroxylhaltigen aliphatischen Polyestern (sie¬ he oben) und aliphatischen Polyethern (siehe oben) , und gege¬ benenfalls Modifizierung mit bifunktionellen aminogruppenhal- tigen, hydroxylgruppenhaltigen und carboxylgruppenhaltigen Substanzen, z.B. Hexamethylendiisocyanat, Diphenylmethandi- isocyanat, Toluylendiisocyanat-2,4 und -2,6, Tolidindiisocy- anat, Xylylendiisocyanat, Glycerin, Ethylenglykol, Diethylen- glykol, Pentaerythrit, 3-Dimethylamino-1 ,2-propandiol, und Kohlehydrate, aliphatische und aromatische Dicarbonsäuren und deren Derivate, o,m,p-Phenylendiamin, Benzidiri, Methylen-bis- o-chloroanilin, p,p'-Diaminodiphenylmethan, 1 ,2-Diaminopro- pan, Ethylendiamin, Aminoharze aus Harnstoff und cyclischen Harnstoffen, Melamin, Thioharnstoff, Guanidin, Urethan, Cyan- amid, Säureamide und Formaldehyd sowie höhere Aldehyde und Ketone, Silicone, Polydialkylsiloxan, Diarylsiloxan und Alkyl- arylsiloxan, wie Dimethyl-, Diethyl-, Dipropyl-, Diphenyl-, Phenylmethyl-siloxan, Silicone mit funktioneilen Gruppen, z. B. Allylgruppen, γ-substituierte Fluorsilicone mit Aminogrup- pen und Vinylgruppen, z.B. A inopropyltriethoxysiloxan, 2- Carboxylpropylmethylsiloxan, Blockpolymere mit Dimethylsil- oxaneinheiten und Polystyrol- oder Polycarbonatblocken, Drei- blockcopolymere aus Styrol, Butylacrylat mit ,ω-Dihydroxy- polydimethylsiloxan, 3,3,3-Trifluorpropylmethylsiloxan, Avo- cane (90 % Polypropylenglykol und 10 % Siloxan) , Blockcopo- lymere aus Silicon und Polycarbonat, Cellulose und Cellulose- . derivate, z.B. Celluloseacetat, Perfluorbutyrylethylcellulo- se, Perfluoracetylcellulose, Perfluoracetylcellulose-, Gel- luloseni rat, Carboxymethylcellulose, regenerierte Cellulose, regenerierte Cellulose aus Viskose und ähnliche Cellulosede-

rivate, Agarose, Polysaccharide wie Carrageenan , Dextrane, Mannane, Fructosane, Chitin, Pectine, Glykosaminoglykane, Stärke, Glykogen, Alginsäuren, sowie alle Deoxypolysaccharide wie Halogen-deoxypolysaccharide, Amino-deoxypolysaccharide oder Sulfhydryl-deoxypolysaccharide und deren Derivate, Mure- in, Proteine, z.B. Albumin, Gelatine, Kollagen I - XII, Ke- ratin, Fibrin und Fibrinogen, Casein, Plasmaproteine, Milch¬ proteine, Strukturproteine aus tierischem und pflanzlichen Geweben, Sojaproteine, Proteine aus der Nahrungsmittelindu¬ strie.

Die erweiterte Auswahl von Polymeren ergibt sich dadurch, daß oben aufgeführte Polymere, die aus den verschiedenen Monomer¬ bausteinen synthetisiert werden, mit weiteren bisher bekann¬ ten Monomeren copolymerisiert werden (es werden darunter die Monomeren verstanden, die in dem Buch Funktional Monomers, Ed. R.H. Yocum u. E.B. Nyquist, Vol I und II, Marcel Dekker, New York 1974 aufgeführt sind). Des weiteren können die oben auf¬ geführten Polymeren durch Pfropfung, durch polymeranaloge Reaktionen und durch Herstellung von weiteren Blockcopolyme- ren und Pfropfcopolymeren partiell oder voll modifiziert wer¬ den. Außerdem können Polymermischungen, Legierungen, beschich¬ tete Polymere und Polymere in Form verschiedener Verbundwerk¬ stoffe hergestellt werden. Diese Polymere können durch ener¬ giereiche Strahlung, Belichtung, Oxidation, hydrolytischem Abbau, durch photochemische Reaktionen, durch Halogenierung, Sulfochlorierung, Chlor ethylierung, durch Umsetzung mit Ra¬ dikalbildnern, u.a. , Oberflächen-modifiziert werden.

Weiterhin können Polymerderivate mit bi- und polyfunktionei¬ len Verbrückungsreagenzien hergestellt werden, wie sie zur Herstellung von reaktionsfähigen Polymeren nach den Methoden der Peptid-, Protein-, Polysaccharid- und Polymerchemie be¬ kannt sind. Im folgenden ist eine Auswahl der zur Derivati- sierung von Polymeren verwendbaren funktionellen Gruppen oder Vernetzermolekülen gegeben:

E

Phosgen, Formaldehyd, Glyoxal, Acrolein, Glutardialdehyd, Azi- de, aktivierte Ester, Anhydride, Säurechloride, Ester, ge¬ mischte Anhydride, Bromcyan, Difluordinitrobenzol, Thioisocy- anat, Epoxid, Imid, Isocyanate, Urethiongruppen, Diisocyana- te, Triisocyanate, Maleinimid, Dicyclohexylcarbodiimid, N,N'- Bis (trimethylsilylschwefeldiimid) , Peroxide, Vinylketogrup- pen, aromatische Diazoverbindungen, Vinylsulfon, Trichlortri- azin, Monochlortriazin, Dichlortriazin, Bromacrylamid, Di- fluorchlorpyrimidin, Trichlorpyrimidin, Dichlorchinoxalin, Chloracetylaminogruppen, Chloracetylharnstoff, 3-Halogenpro- pionamid, α,3-Dihalogenpropionamid, 3-quaternäres Ammonium- propionamid, 3-Sulfatopropionamid, 3-Sulfonylpropionamid, sub¬ stituierte Alkan-dicarboxamide, substituierte Alkan-monocarb- oxylate, substituierte Cycloalkan-carboxamide, Alken-mono- carboxamide, Arylamide, Crotonamide, substituierte Acrylami- de, Mono-, Di- und Trihalogen-acrylamide, substituierte Cro¬ tonamide, Alken-dicarboxamide, cyclische Halogenmaleinimide, Alkin-carboxamide, substituierte aliphatische Ketone, Amide von substituierten aliphatischen Sulfonsäuren, substituierte Methansulfona ide, substituierte Ethansulfonamide, 3~Sulfato- ethylsulfonamide, 3-Thiosulfatoethylsulfonamide, quaternäres Ammoniumethansulfona id, Vinylsulfonamid, ß-Chlorvinylsulfon- amid, Ester von reaktiven aliphatischen Sulfonsäuren, ß-sub- stituierte Ethylsulfone, 3-Thiosulfatoethylsulfone, ß-Halogen- vinylsulfon, 3-substituierte Ethylaminderivate, 3-Sulfato- ethyla in, 3-Halogenethylpyrazolon, N-(3-Halogenethyl)-amide, N- (3-Sulfatoethyl)-amide, 3-substituierte Ethylammonium-Ver- bindungen, 3-substituierte Ethylamide von Sulfonsäuren, N,3- Halogenethylsulfonamide, ß,γ-Dihalogenpropionylamide von Sul¬ fonsäuren, 3-Sulfatoethylamide von Sulfonsäuren, Ethylenimin und Ethylenimin-Verbindungen, Allylgruppen, Propargylgruppen, Diallylphthalat, Triallylcyanurat, Benzylderivate, 2-substi¬ tuierte Thiazolcarbonsäuren, Chlorsulfonylpyridin, 4-Substi- tuiertes-3,5-dicyano-2,6-dichlorpyridin, 2,6-Bis (methylsul- fonyl)-pyridin-4-carbonylchlorid, Chlorpyridazin, Dichlorpy- ridazon, 1-Alkyl-4,5-dichlor-β-pyridazon, Chlor- und Brom-py- rimidin, 3-(2' ,4' ,5'-Trichlorpyrimidyl- (6')-amino)-anilin,

4,5,6-Trichlorpyrimidin-2-carbonylchlorid, Trifluorpyri idin, Trifluorchlorpyrimidin, 2-Chlortriazinyl-Derivate, 2-Chlor-4- alkyl-s-(triazinyl-6-aminocarbonsäure) , 2-Chlorobenzothiazol- carbonyl, 6-Amino-2-fluorbenzothiazol, 2-Methylsulfonyl-6- aminobenzothiazol, 2,3-Dichlorchinoxalin-6-carbonylchlorid, 1 ,4-Dichlorphthalazin-6-carbonylchlorid, 3-Chloro-1 ,2,4-benzo- triazin-1-N-oxid-7-carbonylchlorid, Fluor-2-nitro-4-azidoben- zol, Sulfonsäureester, N-Sulfonylharnstoffe, Thiosulfato-S- alkylester, N-Methylolharnstoff, N,N'-Dimethylol-glyoxal-mono- urein, Terephthaldialdehyd, Mesitylentrialdehyd, Isothiuroni- umgruppen, Triacylformal.

Die oben aufgeführten synthetischen Polymere und Biopolyme¬ re sowie die daraus hergestellten Polymerderivate mit den oben aufgeführten Vernetzern bzw. funktioneilen Gruppen von Vernetzern oder Verfahren zur Oberflächenmodifizierung von Polymeren könen erfindungsgemäß zur Verankerung von HS I ein¬ gesetzt werden. Analog kann HS I mit den oben aufgeführten Vernetzermolekülen bzw. den funktioneilen Gruppen von Vernet¬ zern und den Verfahren zur Oberflächenmodifizierung zur Modi¬ fizierung von HS I für die erfindungsgemäße Verankerung an Polymere eingesetzt werden. Die kovalente Verbrückung von HS I an polymere Substrate kann entweder mit der Querbrückenlänge "O" (Selbstquervernetzung oder Vernetzung nur unter Beteili¬ gung der funktionellen Gruppen des polymeren Substrates und des HS I) , oder mit der Querbrückenlänge größer als 0 unter Verwendung von hydrophilen oder hydrophoben, amphiphilen, ge¬ ladenen, ungeladenen, flexiblen oder sperrigen Spacern in ei¬ ner Größenordnung 0,2 - 5 nm erfolgen.

Die Verankerung von HS I an Polymere oder Polymerderivate kann weiterhin erfolgen über

1. salzartige Bindung an positiv-geladene Gruppen von Polyme¬ ren, z.B. quaternäre Ammoniumgruppen und Phosphoniumgrup- pen, - _ _

2. Chelatbindung nach den bekannten Methoden zur Herstellung von Chelatbindungen mit funktionellen Gruppen von Makromo-

Ersateblaff

lekülen und Metallen, 3. über hydrophobe Interaktionen durch Derivatisierung von HS I und/oder Polymeroberflächen mit gesättigten und/oder ungesättigten langkettigen Kohlenwasserstoffen mit einer Kettenlänge von 8 - 30 Methylengruppen, versehen mit den bekannten funktionellen Gruppen, oder mit cyclischen oder heterocyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlen¬ wasserstoffen mit einer Anzahl von 6 - 50 Kohlenstoffato- men.

Weiterhin kann die Verankerung von HS I über Adsorption, Ein¬ schluß in polymere Netzwerke, Einkapselung oder physikalische Vermischung nach den Methoden der Kunststoffverarbeitung er¬ folgen.

Für den erfindungsgemäßen Einsatz der hämokompatiblen Substra¬ te in Form von Fasern, Hohlfasern, Membranen, Organersatztei¬ len, Kanülen, Spritzen, Schläuchen, Blutbehältern oder in an¬ derer Form werden die verwendeten oder die hergestellten Po¬ lymeren nach ihren für den Verwendungszweck geeigneten physi¬ kalischen, mechanisch-technologischen und chemischen Eigen¬ schaften ausgewählt.

Beispiele

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorlie¬ genden Erfindung. Dabei wurde so vorgegangen, daß zunächst die Gewinnung von HS I zwecks erfindungsgemäßer Verankerung an polymere Substrate beschrieben wurde. Danach wurde an we¬ nigen ausgewählten Beispielen die kovalente Verankerung an po¬ lymere Substrate dargestellt, wobei zum besseren Verständnis überwiegend eine Polymerklasse beschrieben wurde.

Beispiel 1 : Gewinnung von HS I aus kultivierten bovinen Aorta- Endothelzellen zur Verankerung an polymere Sub¬ strate

Rinderaortae werden von frisch geschlachteten Tieren entnom¬ men. Die Aortae werden von Fettgewebe etc. befreit und die Aa. intercostales mit Klemmen ligiert. Die Aortae werden dann mit 3 x 50 ml sterilem PBS gespült und an einem Ende mit einer Klemme ligiert. Eine sterile Lösung von 0,1 % bovinem Pankre- as-Trypsin (Boehringer Mannheim) in 1 mM EDTA / PBS wird von oben in die Aortae gefüllt und das zweite Ende ligiert. Die Aortae werden dann 7,5 min bei 37°C in einem Wasserbad inku¬ biert.

Eine der Aortae-Endligaturen wird entfernt und die Flüssig¬ keit wird mit einer sterilen Pipette entnommen. Die in der Lösung suspendierten Zellen werden bei 800 x g und 37°C 10 min abzentrifugiert, in sterilem Dulbecco's modified esseπ- tial medium (DMEM) + 10 % fetalem Rinderserum in Gegenwart von 10 000 U Penicillin und 10 000 U Streptomycin (Endothel- zellmediu ) bei 37°C aufgenommen.

Eine sterile 75 cm ² Gewebekulturflasehe wird mit 20 ml Endo- thelzellmedium 1 h bei 37°C inkubiert. Zu dieser Flasche wer¬ den die abzentrifugierten Zellen, suspendiert in 1 ml Endo- thelzellmedium, gegeben. Die Flasche wird dann in einem Inku¬ bator bei 37°C in einer Atmosphäre von 5 % C0 ₂ und gesättig¬ tem Wasserdampf zur Aufzüchtung der Zellen aufbewahrt.

Die Zellen werden morphologisch und durch Färbung mit anti- bovinem Faktor Villa Antikörpern (Dianova, Hamburg) charakte¬ risiert.

Die Zellen werden zur Konfluenz gezüchtet, mit sterilem PBS gewaschen, von der Unterlage gelöst durch Inkubation mit 2 ml 0,1 % Trypsin in 1 mM EDTA / PBS für 3 min bei 37°C, mit 5 ml Endothelzellmedium versetzt, bei 800 x g abzentrifugiert, in 9 ml Endothelzellmedium resuspendiert und in jeweils 3 ml dieser Suspension in drei neue 75 cm ² Gewebekulturflaschen ausgesät, wie oben beschrieben.

Zur Massenkultur werden die Zellen in Rollerflaschen ausge¬ sät, in der gleichen Weise, wie für die Anzüchtung in den

9 75 cm ² Flaschen beschrieben. Etwa 10 Zellen werden für eine

HS I-Präparation eingesetzt. Zur Vorbereitung für die HS I- Präparation werden die Zellen mit 1 mM EDTA in PBS von der Unterlage gelöst, durch 3mal 30 s Ultraschallbehandlung bei 0°C mit jeweils 1 min Unterbrechung zwischen jedem Ultraschall homogenisiert, bei 10 000 x g abzentrifugiert und der über¬ stand auf 2 % SDS eingestellt. Diese Lösung (etwa 5 ml) wird auf eine Sepharose-CL-6B-Säule (5 x 100 cm) gegeben. Eluiert wird mit 0,1 % SDS, 0,1 M Tris/HCl, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA pH 7,5. Fraktionen von 20 ml werden aufgefangen bei einer Flu߬ geschwindigkeit von 100 ml/h.

Der Ausfluß der Säulenchromatographie (Fraktion 35 - 50) wird in 80 % Ethanol präzipitiert, bei 10 000 x g abzentrifugiert, im WasserStrahlvakuum getrocknet und in 50 ml 7 M Harnstoff, 0,1 % CHAPS (3- ( (3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio)-1-ρropan- sulfonat) , 0,1 M Tris/HCl, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA pH 7,3 gelöst (Lösungspuffer) und auf eine DEAE-Cellulose-Säule (2,5 x 5 cm) gegeben. Die Säule wird mit 100 ml des Lösungspuffers äquili- briert und dann mit einem linearen Gradienten von 0 - 1 M NaCl auf der Basis des Lösungspuffers eluiert (250 + 250 ml) . Die Fraktionen, die zwischen 0,45 - 0,6 M NaCl eluieren, werden gesammelt, in 80 % Ethanol präzipitiert, bei 10 000 x g abzen¬ trifugiert und im Vakuum getrocknet.

Die Substanz wird in 12,8 ml 0,1 M Tris/HCl, 4 M Guanidinium- hydrochlorid und Cäsiumchlorid der Dichte 1,4 g/ml gelöst und in einem SW 40 Rotor (Beckmann) bei ^■ 35 000 UpM 60 h zentrifu- giert. Das Zentrifugationsröhrchen wird am Boden punktiert und Fraktionen von 1 ml werden gesammelt. Die Fraktionen mit einer Dichte von größer als 1 ,4 g/ml werden gesammelt, in 80 % Etha¬ nol präzipitiert, bei 10 000 x g abzentrifugiert und im Vaku¬ um getrocknet.

Die Substanz wird in 2 ml 0,1 M Tris/HCl 1 mM PMSF, 1 mM EDTA

pH 7,5 gelöst und mit 1 U Chondroitinase ABC und 100 U RNAse (Boehringer Mannheim) 1 h bei 37°C inkubiert. Danach wird die

Substanz, wie oben beschrieben, an Sepharose-CL-6B rechromato-

9 graphiert. Die Ausbeute beträgt im Mittel etwa 14 mg/10 Endo¬ thelzellen.

Beispiel 2: Gewinnung von HS I-Polysaccharid aus konditionier- tem humanen Umbilical-Endothelzellmedium

Die Umbilicalvenen aus frischen humanen Nabelschnüren werden mit sterilem PBS gespült, und dann mit einer sterilen Lösung von 10 000 U Kollagenase (Boehringer Mannheim) in Cord-Puffer 5 min bei 37°C perfundiert. Die Zellen werden bei 37°C und 800 x g 5 min abzentrifugiert.

Menschliche Seren werden aus dem menschlichen Blut durch Koa¬ gulation und Zentrifugation bei 2000 x g gewonnen. Die Seren dürfen in einem SMA-12-Profil keine pathologischen Auffällig¬ keiten zeigen.

Boviner Wachstumsfaktor wird aus 10 Rinderhypothalami von frisch geschlachteten Tieren durch Homogenisierung und Extrak¬ tion mit Aceton/Chloroform 2 : 1 gereinigt. Der in dem Entfet¬ tungsmittel unlösliche Rückstand wird in Mengen von 15 - 50 mg/1 Kulturmedium eingesetzt.

Menschliches Fibronectin wird aus menschlichem Plasma gewon¬ nen. Dazu wird 10 g Gelatine (Sigma) in 50 ml 0,2 M NaAc bei 65°C gelöst. 200 ml Sepharose CL-2B wird mit 10 g Bro cyan bei einem pH von 10,5 10 min umgesetzt. Das Gel wird danach mit 10 1 0,2 M NaAc gewaschen und mit der Gelatine-Lösung zu¬ sammen bei 4°C 24 h geschüttelt. Anschließend wird nach Zuga¬ be von 5 ml Aminoethanol 7 h weitergeschüttelt. Das Gel wird mit 4 M Guanidiniumchlorid und anschließend mit PBS gewaschen (je 1 1) . 1 1 menschliches Plasma wird mit dem Gel zusammen 24 h bei 4°C geschüttelt. Das Gel wird anschließend mit 5 1 PBS auf der Fritte gewaschen und mit 200 ml 1 M NaCl eluiert.

Das Eluat wird gegen 3 x 5 1 PBS dialysiert und durch Filtra¬ tion über einen 0,2 μm-Filter sterilisiert.

Die humanen Endothelzellen werden in 20 ml DMEM + 10 % mensch¬ lichem Serum in Gegenwart von 10 000 U Penicillin, 10 000 U Streptomycin und Wachstumsfaktor suspendiert. Eine 75 cm ² Ge¬ webekulturflasche wird mit 2 ml der Fibronectin-Lösung bei Raumtemperatur 3 h inkubiert. Die Lösung wird entfernt, die Flasche mit PBS gewaschen und die Zellen hinzugegeben. Die Flasche wird in einen Inkubationsschrank zur Aufzüchtung der Zellen gegeben (siehe oben) .

Die Passagierung und die Massenkultivierung in Rollerflaschen erfolgt mit den gleichen Medien und Kulturgefäßpräparationen, sowie Zellkulturtechniken, wie beschrieben.

Die gesammelten konditionierten Medien (etwa 25 1) werden mit 10 M NaOH auf 0,5 M NaOH eingestellt und 12 h bei 4°C inku¬ biert. Das Medium wird anschließend mit 10 M HCl auf pH 1 ,5 - bei 4°C eingestellt und bei 10 000 x g abzentrifugiert. Der überstand wird mit 10 M NaOH neutralisiert und an Amicon PM 10 Membranen ultrafiltriert bis zu einem Volumen von 100 ml. Die Lösung wird auf 80 % Ethanol eingestellt, 12 h bei 4°C stehen¬ gelassen und bei 10 000 x g abzentrifugiert. Der Niederschlag wird in PBS aufgenommen, 1 h mit 10 U Chondroitinase ABC bei 56°C inkubiert und auf einer Dowex 1 2 Säule (20 ml Gel) ge¬ geben. Die Säule wird mit je 20 ml 1 M NaCl und 4 M NaCl ge¬ waschen. Das 4 M NaCl Eluat wird gegen 3 x 1 1 Wasser dialy¬ siert und lyophilisiert. Die Ausbeute beträgt etwa 1,2 mg.

Beispiel 3: Kupplung von HS I an Silicon

1 g Silicon mit freien OH-Gruppen wird mit 18 ml dest. Wasser und 2 ml γ-Aminopropyltriethoxysilan (10 % V/V) versetzt und der pH-Wert mit 6n-HCl zwischen pH 3 und pH 4 eingestellt. Nach der pH-Einstellung wird auf 75°C 2 h erhitzt, gewaschen und getrocknet. 1 g Aminogruppen-haltiges Silicon wird mit

2,5 % wässeriger Lösung von Glutardialdehyd in 0,05 M Natrium¬ phosphat-Puffer versetzt und auf pH 7,0 eingestellt, Reaktions¬ dauer 60 min. Das aktivierte Silicon wird mit einer 1 % Lösung von HS I unter Rühren 2 - 4 Stunden umgesetzt. Es wird mit 6 M Harnstoff-Lösung gewaschen.

Beispiel 4: Isothiocyanat- upplungsreaktion von HS I an Sili¬ con

1 g Aminogruppen-haltiges Silicon wird mit einer 10%igen Lö¬ sung von Thiophosgen in Chloroform (V/V) umgesetzt. Die Reak¬ tionsmischung wird mindestens 4 h am Rückfluß gehalten, bes¬ ser jedoch 12 - 15 h. Es wird mit trockenem Chloroform gewa¬ schen und vakuumgetrocknet. Zum Isothiocyanat-Silicon wird langsam eine wässerige 1 % HS I-Lösung (50-100 mg HS I/g Sili¬ con) gegeben. Der pH-Wert wird auf 8,5 eingestellt und es wird

2 h umgesetzt vor der Wäsche mit einer 6 M Harnstoff-Lösung.

Beispiel 5: Carbodiimid-Kupplung von HS I an Aminogruppen- haltiges Silicon

Zu 1 g Aminogruppen-haltigem Silicon werden 50 ml 0,03 M Phosphorsäure mit einem pH-Wert von 4,0 gegeben. Danach wer¬ den 100-200 mg wasserlösliches Carbodiimid und 50-100 mg HS I zur Mischung gegeben und 24 h reagieren gelassen. Es wird, wie oben beschrieben, gewaschen.

Beispiel 6J Triazin-Kupplung von HS I an Aminogruppen-halti¬ ges Silicon

Zu 1 g Aminogruppen-haltigem Silicon werden 10 ml Benzol ge¬ geben, das 0 _/ 2 ml Triethylamin und 0,3 g 1 ,3-Dichlor-5-meth- oxytriazin enthält. Die Reaktionsmischung wird 2 - 4 h bei 45 bis 55°C gehalten, abdekantiert, mit Benzol gewaschen und ge¬ trocknet. Die Kupplung mit HS I (50-100 mg) erfolgt in 0,05 M Phosphat-Puffer bei pH 8 bei 4°C über Nacht. Es wird, wie oben beschrieben, gewaschen.

Beispiel 7: Immobilisierung von HS I über Glutardialdehyd

0,1 - 10 ml verdünnte Glutardialdehyd-Lösungen (0,1 - 5 %) wer¬ den zu 1 g dispergierten oder imprägnierten Aminogruppen-hal¬ tigem Polymeren und 10 mg HS I gegeben und bei pH 7,4 0,5 - 2 min umgesetzt. Danach wird sofort mit kaltem Wasser gewaschen.

Beispiel 8: Thermische und photochemische Immobilisierung von HS I an Polymere

1 g Fluor-2-nitro-4-azidobenzol wird mit 10 g HS I im Dunkeln bei 50°C und maximal pH 10,5 in 0,05 M Natriumborat-Puffer 16 - 64 h umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wird abfiltriert und mit 95 % Ethanol gewaschen. Die PhotoImmobilisierung an Polymere erfolgt in einigen Stunden bei 200 - 300 Watt mit einer Quecksilberdampflampe. Danach wird, wie oben beschrie¬ ben, gewaschen.

Beispiel 9: Verankerung von HS I über Oxirangruppen an Hy- droxyl- und Aminogruppen-haltige Polymere

10 g gewaschenes 2%iges Agarose-Gel wird in 5 ml 2,5 M NaOH- Lösung suspendiert. 20 mg Natriumborhydrid wird zugefügt und danach werden tropfenweise 1 ,4-Butandioldiglycidylether unter heftigem Rühren zugegeben. Die Reaktion dauert 6 h bei Raum¬ temperatur. Dann werden 50 ml Aceton und schließlich Wasser zugesetzt. Das Oxiran-Gel wird in 25 ml 0,5 M Natriumbicarbo- nat suspendiert und 50 mg HS I zugefügt. Die Reaktion dauert 5 h. Das Produkt wird, wie oben beschrieben, gewaschen.

Beispiel 10: Azokupplung von HS I über Arylamingruppen an Polymere

1 g Aminogruppen-haltiges Silicon wird in 25 - 50 ml Chloro¬ form gelöst, das 5 % Triethylamin (V/V) und 1 g p-Nitroben- zoylchlorid enthält. Die Reaktionsmischung wird wenigstens 4 h unter Rückfluß gehalten. Es wird mit trockenem Chloroform ge-

waschen und unter Rückfluß in einer 5 % Natriumdithionit-Lö- sung gekocht. Die Azokupplung erfolgt mit 1 g Arylamin-Sili- con durch Zugabe von 20 ml 2n-HCl im Eisbad. Es werden 100 mg festes Natriumnitrit zugegeben und 30 min diazotiert. Danach wird mit Eiswasser gewaschen. 100 mg HS I werden bei pH 8,5 in 0,05 M Natriumphosphat gelöst und 1 g diazotiertes Polyme- res zugegeben. Es wird zwischen 2 - 18 h gekuppelt. Das Pro¬ dukt wird, wie oben beschrieben, gewaschen.

Beispiel :1 : Herstellung von Polymer-gebundenem HS I durch Copolymerisation mit Alkylierungs- und Acylie- rungsmonomeren

3,4-Epoxybuten, Acrylsäure-2,3-epoxypropylester, Acrylsäure- 2,3-thioglycidylester, 1-Allyloxy-3-(N-ethylenimin)-2-propa- nol, Acrylsäure-O-succinimidester oder Acrylsäurechlorid, Ma¬ leinsäureanhydrid, Chlormaleinsäureanhydrid, Maleinsäureazid oder 3-Bromopropen werden in äquimolaren Mengen mit HS I um¬ gesetzt und anschließend mit den üblichen Methoden polymeri' ¹ - siert oder copolymerisiert.

tt