Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Nucleosid-3 ' ,5 '-cyclophosphaten und -cyclothiophosphaten, welche Enzym-Antagonisten bzw. Enzym-Agonisten sind..

₅ Agonisten und Antagonisten des "second messenger"-Stoff- wechsels (Hormonstoffwechsels) sind geeignet, in Stoff- wechselprozesse, die sich in gewissen Krankheiten mani¬ festieren, regulierend einzugreifen. Bei zu niedriger "second messenger"-Konzentration können Agonisten die not-

₁₀ wendige intracelluläre Konzentration ergänzen. Bei zu hoher Konzentration an "second messenger" können Antago¬ nisten die Wirkung des Überschusses auf Normalniveau bringen. Damit haben sowohl die Agonisten als auch die Antagonisten des "second messenger" pharmakologische und

-. ₅ potentiell therapeutische Wirksamkeit.

Besonders die Cyclothiophosphate haben auch als Bio¬ chemikalien . für die Forschung praktische Bedeutung.

_2Q Nach den bisher vorliegenden Kenntnissen handelt es sich bei den Agonisten um Vertreter mehrerer Substanzklassen, nämlich

(A) Nucleosid-3* ,5'-cyclophosphate (vgl. J.P. Miller in "Cyclic 3' ,5'-Nucleotides - Mechanisms of Action" (H.

₂₅ Cramer und I. Schulz, Ed., S. 70-105, Wiley, London);

(B) Nucleosid-3' ,5'-cyclothiophosphate mit S _p -Konfiguration (vgl. J.D. Rothermel, B. Jastorff, L.H. Parker Botelho, J. Biol. Chem. .25_9, (13) 8151-8155 (1984));

(C) D-myo-Inosit-phosphate (vgl. M.J. Berridge, Spektrum ^ ₀ der Wissenschaft 1985, S. - 136-146; H. Streb, R.F.

Irvine, M .J. Berridge, I. Schulz, Nature 306, 67-68 (1983)).

Zur Zeit ist lediglich ein Antagonist des s.m.-Stoff- ^wechseis bekannt, nämlich Adenosin-3' ,-5 '-cyclothiophosphat mit R _p -Konfiguration (vgl. J.D. Rothermel et al., J. Biol. Chem. 258, 12125-12128 (1983)).

Die bekannten Verfahren zur Darstellung der Nucleo- sid-3 ' ,5'-cyclophosphate gehen aus von Nucleosid-3' ,5'-cy- clophosphaten (Verfahren 1), Nucleosid-5'-monophosphaten (Verfahren 2 ) oder Nucleosiden (Verfahren 3). 5 Verfahren 1 wird eingesetzt, um natürliche Nucleo- sid- ^1" ,5"-cyclophosphate (wie cyclisches Adenosin-, Guano- sü- und Cytidinmonophosphat (cAMP, cGMP und cCMP)) durch Substitutionsreaktionen an der heterocyclischen Base zu

-|o verändern (siehe z.B. G. Michael, K. Mühlegger, M. Nel- b-αreck, C. Thiessen und G. Weimann, Pharmacological Research Communications, 6_, 203-251 (1974)). Es bedingt den Einsatz der kostbaren, natürlichen Nucleosid-3 ' ,5'-cy¬ clophosphate, die alternativ über die Verfahren 2 und 3

₁₅ darstellbar sind.

Verfahren 2 wird eingesetzt, um natürlich vorkommende Nucleosid-3' ,5'-monophosphate zu synthetisieren oder um modifizierte Nucleosid-3 ',5 ' -monophosphate aus Nucleo-

2 ₀ sid-5 ' -phosphat-Analogen darzustellen. Cyclisiert wird mittels phosphataktivierender Kondensationsreagentien

(L_.-N. Simon, D.A. Shuman und R.K. Robins, Advances Cyclic

Nu-eleotide Research 3_' 225-353, (1973)). Die Methode

Bedingt zunächst die Synthese der Nucleosid-5'-monophospha- 5 te. Einfachstes Verfahren dabei ist die Phosphorylierung nach Yoshikawa mit P0C1 ₃ und die anschließende alkalische Hydrolyse (M. Yoshikawa, T. Kato and T. Takenishi, Tetra¬ hedron Letters ^0_, 5065 (1967)). Andere Verfahrensvarian¬ ten, die alle noch aufwendiger sind, stehen zur Verfügung.

₃₀ Verfahren 2 bedingt immer mindestens eine Zweistufensyn¬ these mit vorhergehender Isolierung des Monophosphats.

Verfahren 3 wird angewendet zur Darstellung von natürlich vorkommenden Cyclophosphaten und deren Analogen. Hierbei ■ - wird ausgehend vom natürlichen, eventuell geschützten Nucleosid (Adenosin, Guanosin, Cytidin) bzw. einem Nucleo- sid-Analogen zunächst ein aktivierter Phosphorsäureester

dargestellt, der dann durch basenkatalysierte Reaktion zum Nucleosid-3' ,5 '-cyclophosphat cyclisiert wird (siehe K.F. Borden und M. Smith, J. Org. Chemistry \_, 3241 (1966)). Verfahren 3 gleicht Verfahren 2, nur daß andere Phos- 5 phorylierungsmittel für die Darstellung der aktivierten Phosphorsäureester eingesetzt werden. Auch hier wird diese Zwischenstufe isoliert und dann in eine zweite Stufe eingesetzt.

10 Die natürlichen Nucleosid-3 ' ,5'-cyclophosphate (cAMP und cGMP) werden zur Zeit allerdings nach keinem dieser Verfahren im industriellen Maßstab hergestellt, da die Verfahren 2 und 3 zu umständlich und damit zu teuer sind. Die Gewinnung erfolgt vielmehr auf mikrobiologischem Wege.

~ 5

Das bislang bekannte Verfahren zur Darstellung der Nucleo- sid-3 ',5'-cyclothiophosphate mit S _p -Konfiguration bzw. R _p -Konfiguration geht aus von Nucleosid 3 ' ,5*-cyclophospha- ten. Das Verfahren bedarf einer Abfolge von mindestens ₀ sechs Syntheseschritten (Einführung von Schutzgruppen, Darstellung diastereo erer Anilidate, chromatographische Trennung der Diastereomeren, stereospezifische Einführung des Schwefels, Abspaltung der Schutzgruppen, Aufreinigung der Cyclothiophosphate) (J. Baraniak et al. J.C.S. Chem. _δ Comm. 1979, 940-41; J. Baraniak und W.J. Stec, J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1987, 1645-1656). Die Synthese über alle Schritte verläuft mit sehr niedriger Gesamtausbeute und ist sehr teuer, arbeitsintensiv und zeitaufwendig. Die Anwendungsbreite dieses Verfahrens ist obendrein sehr ₀ beschränkt.

Agonisten vom Typ der Cyclothiophosphate sind auch zugäng¬ lich durch Phosphorylierung von Nucleosiden mit bis-p-Ni- trophenylthiophosphorsäurechlorid und anschließende basen- .-*. katalysierte Cyclisierung. Auch dieses Verfahren umfaßt

- q -

die Abfolge von mindestens* acht Reaktionsschritten (Dar¬ stellung geschützter Nucleoside in zwei Stufen, Phosphory¬ lierung, chromatographische Isolierung des bis-p-Nitrophe- nylthiophosphorsäureesters, Cyclisierung, Ionenaustausch ._; und chromatographische Trennung). Nach diesem Verfahren entsteht mit Adenin als Base das R -Diastereomere in ganz untergeordneten Anteilen (vgl. F. Eckstein u. ü. Kutzke, Tetrahedron Letters 21, 1657-1660 (1986)).

_-.„ Den Verfahren des Standes der Technik haften gravierende Mängel an: Sie lassen sich nur mit sehr hohem Zeitaufwand durchführen und liefern eine unbefriedigende Ausbeute. Ihre Anwendbarkeit erscheint wegen der teilweise drasti¬ schen Reaktionsschritte von vornherein begrenzt. So ist

--_z.B. an eine Übertragung auf modifizierte Nucleobasen gar nicht zu denken.

Es bestand daher die Aufgabe, ein verbessertes Herstellungs¬ verfahren für Nucleosid-3' ,5'-cyclophosphate und -cyclo-

_,_. thiophosphate (nachfolgend kurz "Cyclo(thio)phosphate") zu finden, und dabei die diastereomeren Cyclothiophosphate mittels eines einzigen Syntheseverfahrens in etwa gleicher Ausbeute zu erhalten. Anzustreben war ferner, die Zahl der Synthesestufen zu reduzieren. Weiter sollte versucht wer-

,-_den, ein Verfahren zu finden, das gegenüber der Nucleobase invariant ist, d.h. alle denkbaren Nucleobasen mit ein¬ schließt. Als besonders vorteilhaft mußte ein Verfahren gelten, bei dem von ungeschützten Nucleosiden ausgegangen werden kann und das mit wohlfeilen Phosphorylierungsrea- gentien auskommt.

Es wurde nun gefunden, daß die vorstehend genannte Aufgabe in besonders vorteilhafter Weise mittels des erfindungs¬ gemäßen Verfahrens gelöst werden kann. Bei dem erfindungs- .gemäßen Verfahren zur Herstellung von Nucelosid-3' ,5'-cy- clo(thio)phosphaten aus Nucleosiden wird in einem

Reaktions edium das ungeschützte Nucleosid mit Phosphor¬ oder Thiophosphorsäuretrichlorid in der 5 '-Position des Nucleosids phosphoryliert und das in der 5 '-Position selektiv phosphorylierte Produkt in einem mit Wasser mischbaren, aprotischen organischen Lösungsmittel mit.- ei¬ nem Siedepunkt (bei Normalbedingungen) unterhalb 250 C gegebenenfalls in Gegenwart von Wasser mittels einer Base cyclisiert, die in 1M wässriger Lösung einen pH-Wert von mindestens 12,5 besitzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren verläuft nach den folgenden Reaktionsgleichungen:

Agonist

(Cyclophosphat)

Agonist Antagonist

(Sp-Cyclothiophosphat) (R_-Cyclothiophbspha )

Die (Thio)phosphorylierung wird mit (Thio)phosphorylchlorid in einem Reaktionsmedium RM vorgenommen, vorzugsweise in Ansätzen von 1 bis 10 Mol (Thio)phosphorylchlorid je 1 Mol Nucleosid.

Als Reaktionsmedium RM hat sich ein Phosphorsäureester 0=P(OR) ₃ , worin R für Methyl- oder Ethyl- steht, als besonders günstig erwiesen (vgl. M. Yoshikawa, T. Kato und T. Takenishi, Tetrahedron Letters 5_0_, 5065 (1967)). Im

_IQ allgemeinen wird das Nucleosid in Mengen von 0,01 bis 1 mMol je 1 ml Reaktionsmedium RM eingesetzt. Zweckmäßig wird die (Thio)phosphorylierung im Temperaturbereich zwischen -20 und +100 C durchgeführt. Die Dauer der Reaktion ist auf die Vollständigkeit des Phosphorylierungs-

_..- Schrittes abgestimmt; sie liegt im allgemeinen im Bereich von 0,2 bis 2 Stunden. Der Reaktionsverlauf kann durch HPLC überprüft werden. Ein wesentlicher Vorteil des er¬ findungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß es sich als Ein-Topf-Reaktion durchführen läßt, d.h. die Isolierung

--. und Reinigung des Phosphorylierungsprodukts unterbleiben.

Zur Cyclisierung wird zweckmäßig das Reaktionsgemisch des Phosphorylierungsschrittes in das Lösungsmittel LM über¬ führt. Das mit Wasser mischbare, aprotische Lösungsmittel

»_~____--•_ LM wird vorzugsweise aus der Gruppe der Nitrile, Ether,

Amide, Phosphorsäureester, Sulfoxide, N-Alkylimidazolidone und tertiären Amine bzw. Gemischen derselben ausgewählt. Als Vertreter der Nitrile seien Acetonitril und Malodi- nitril, als Vertreter der Ether cyclische Ether wie Tetra-

* „.__/ _r *—< hydrofuran, Dioxan, lineare E-ther wie Dimethoxyethan,

Diethylenglykoldimethylether und Triethylenglykoldimethyl- ether, als Vertreter der Amide Dimethylformamid, Dimethyl- acetamid und Methylformamid, als Vertreter der Phosphor¬ säureester die Trialkylphosphate wie Trimethylphosphat und Triethylphosphat, als Vertreter der Sulfoxide Dimethylsulfoxid, sowie als Vertreter der N-Alkyl-Heterocyclen 1 ,3-Dimethyl-2-imi- dazolidon und 1 ,3-Dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2(-1H)pyrimidon

- fl- genannt. Als Vertreter der tertiären Amine sind Pyridin, N-Methylpiperidin und N-Methylmorpholin geeignet.

Vorzugsweise wird zur Cyclisierung ein Gemisch des Lösungs- mittels LM mit Wasser angewendet. Zweckmäßig enthält das zur Cyclisierung verwendete Losungsmittelgemisch 0 bis 80, vorzugsweise 0 bis 60, beispielsweise 20 bis 60 Vol.% Wasser. Der Cyclisierungsschritt wird im allgemeinen so durchgeführt, daß für 1 mMol phosphoryliertes Nucleosid 10 bis, 500 ml Losungsmittelgemisch eingesetzt werden. Wesent¬ lich für die Cyclisierung ist die Bedingung, daß die Cyclisierung bei einem pH-Wert von 12,5 bis 14, vorzugs¬ weise 12,5 bis 13, durchgeführt wird. Die Einhaltung dieser Bedingung wird sichergestellt durch die Anwesenheit der Base B im Reaktionsgemisch. Im allgemeinen wird die Base B zusammen mit dem Lösungsmittel LM eingesetzt. Die Base wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkali¬ hydroxiden, Erdalkalihydroxiden, Tetraalkylammoniumhydroxiden, den metallorganischen Alkalialkylverbindungen, den Alkali- alkoxiden und den Alkaliamiden bzw. Gemischen derselben.

Genannt seien insbesondere das Kaliumhydroxid, das Barium¬ hydroxid, das Tetramethylammoniumhydroxid, das Butyllithium, das Kalium-tert.-butoxid und das Lithiumdiisopropylamid. Bπr. allgemeinen findet die Cyclisierung im Temperaturbe¬ reich zwischen -20 C und dem Siedepunkt des verwendeten Lösungsmittels statt. Für die Herstellung der Cyclophos¬ phate sind Temperaturen von 0 bis 20°C besonders günstig, die Cyclothiophosphate werden vorzugsweise bei Rückflußtem- peratur erzeugt. Die Reaktionszeiten sind verhältnismäßig kurz, sie liegen beispielsweise im Bereich von ca. 15 see. bis zu 1 Minute. Bei der Durchführung sämtlicher Reaktions¬ schritte kann auf die Anwendung von Druck verzichtet werden.

Als ein besonderes Kennzeichen des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens kann gelten, daß es in der Regel ohne Isolierung von Zwischenprodukten, beispielsweise nach der Phos¬ phorylierung, durchgeführt werden kann.

5

Zur Aufarbeitung wird das Reaktionsgemisch in üblicher Weise, beispielsweise durch Anlegen von Vakuum, vom Lö¬ sungsmittel LM und Reaktionsmedium RM befreit. Zweckmäßig wird das vom Lösungsmittel befreite Reaktionsprodukt chro-

₀ matographisch aufgetrennt. In Ablehnung an an sich be¬ kannte Trennverfahren kann die chromatographische Auftrennung auf Reversed-Phase-Material vorgenommen werden. Als besonders günstig hat sich die Aufreinigung auf einem Ionenaustauschmaterial erwiesen. Genannt seien ^■ -. schwachbasische Ionenaustauschermaterialien, beispielsweise vom Typ DEAE-SEPHADE '. Weiter ist von Vorteil die An¬ wendung von neuartigen, druckstabilen Polyacrylamiden (Typ FRACTOGEIr^) .

₂₀ Insbesondere die antagonistisch wirksamen R -Isomeren der Cyclothiophosphate müssen äußerst rein sein, da ihre biologische Aktivität durch Anwesenheit von Spuren der Agonisten (Cyclophosphat oder S _p -Cyclothiophosphat) ver¬ schleiert bzw. ganz unterdrückt werden kann. Erfindungs-

~ - gemäß beträgt deshalb bei dem antagonistisch wirksamen Nucleosid-3' ,5'-Cyclothiophosphaten mit R -Konfiguration der Gehalt an Nucleosid-3',5'-Cyclophosphat und Nucleo- sid-3' ,5'-Thiophosphat mit S _p -Konfiguration weniger als 0,01 Gew.%.

3 ^* 0 ^*

Die agonistisch wirksamen Nucleosid-3 ' , 5 ' -Cyclothiophospha ^¬ te mit S _p -Konfiguration werden soweit gereinigt, daß sie im wesentlichen frei von Nucleosid-3 ' , 5 ' -Cyclothiophosphat mit R -Konfiguration (Antagonist) sind. Die Anwesenheit

.r, von Spuren des gleichwirkenden Nucleosid-3 ' , 5 ' -Cyclophos- phats, welches als Nebenprodukt durch Oxidation des Cyclo- thiophosphats entstehen kann, stört dagegen weniger,

-ιo- sollte jedoch möglichst auch vermieden werden.

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Synthesever¬ fahren kommen sowohl die natürlich vorkommenden Nucleoside 5 als auch synthetisch zugänglich gemachte Nucleoside (vgl. Ulimanns Encyclopädie der Techn. Chemie, 4. Auflage, Bd. IT, S. 419-423) in Frage.

In; erster Linie seien die N-Glycoside der Pyrimidine - _!£ • Cytosin, Uracil und Thymin und der Purine Adenin und Guanin mit Pentosen, vor allem der D-Ribose oder der D-2'-Desoxyribose, d.h. die Nucleoside Cytidin, Uridin, Thymidin, Adenosin und Guanosin genannt. Das Verfahren ist aber nicht auf das Vorliegen der genannten Basen be- - ₁ 5 schränkt, sondern es kann auch auf die sogenannten sel¬ tenen Nucleoside (vgl. Lüpke u. Seela, Chemie in uns. Zeit 12, 189-198 (1978)) angewendet werden.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ₀ st darin zu erblicken, daß von den ungeschützten Nucleo¬ siden ausgegangen werden kann. Vorzugsweise werden sie vor Anwendung in an sich bekannter Weise getrocknet.

Als Basen im Sinne des obigen Reaktionsschemas sind, wie ~ - bereits erwähnt Adenin und Guanin sowie Cytosin, Uracil und Thymin geeignet; ferner kommen Inosin, Purin, Benz- imidazol, Indol und Derivate der heterocyclischen Basen in Betracht.

₃₀ Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

1. Trennverfahre :

1.1 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ... Zur HPLC wurden folgende Geräte verwendet:

^" I.¬

Pumpe: Pye Unicam LC 3-XP und Altex 100 A. UV-Detektor: UV III Monitor von LDC Milton-Roy mit feststehender Wellenlänge bei 254 nm.

Quantitative Auswertungen erfolgten über den Recording 5 Data Processor Model 604 von United Technologies Packard.

Bei Anwendung der Gradiententechnik benutzte man zwei Pumpen des Typs LDC Consta metric Model III, einen Mischer, Gradient master, und UV-Monitor von LDC.

10

Die Trennungen wurden in einer nach dem "balanced density"

Verfahren bei 500 bar selbstgepackten Stahlsäule (4,6 mm Innendurchmesser, 25 cm Länge) der Fa. Merck durchgeführt. Für die micro-präparativen Trennungen benutzte man eine -:»- ^• Säule mit 7,8 mm Innendurchmesser und 25 cm Länge. Trennmaterial: LiChrosorb RP-18, Korngröße 10 /Um (Merck AG). Die Fließgeschwindigkeit betrug bei allen Trennungen 1 ,5 ml pro Minute.

2 1-2 Flash-Chromatographie

Säule: Glassäule mit 3 x 25 cm Füllhöhe. ^" Die Feins wurden durch einen Acetatfilter sowie eine 1,5 cm starke Kiesel¬ gelschicht 60 H zurückgehalten. Trennmaterial: 60 g LiChroprep RP-18, Korngröße 25-40 ,um 5 (Merck) ;

Kieselgel 60 H, Korngröße 0,063-0,1 ,um (Merck).

Optimale Trennbedingungen lieferten folgende Parameter:

- Durchmesser/Höhe der Säulenfüllung 1:7

- Probenmenge/Trennmaterial 1:30 ₀ Sinkgeschw. des Laufmittels in der Säule 2-3 cm/Min. Die Flash-Chromatographie wurde mit einem Druck von 2 bis 4 bar durchgeführt. Die Trennungen verfolgte man über einen Serva Chromatocord 254 Detektor mit Durchflußküvette und Recorder.

1.3 Ionenaustausch-Chromatographie

Eine mit DEAE-Sephadex-A-25, schwach basischer Anionenaus- tauscher (Pharmacia), durchgeführte Säulenchromatographie benötigte folgende Zusatzausstattung:

₅ - Schlauchpumpe: LKB, 10200 Perpex peristaltic pump,

UV-Detektor: Hitachi 101 (einstellbare Wellenlänge),

- Monitor: ISCO, Absorbance Monitor Model UA-5 und Multiplexer-Expander Model 1133,

- Fraktionssamler: Gilson TDC 220. 0-

Trennungen mit Fractogel-TSK-DEAE-650, schwach basischer Anionenaustauscher (Merck), wurden unter flashchromatogra- phischen Bedingungen (1,3 - 1,5 bar) durchgeführt. TBK-Puffer: Der Triethylammoniumbicarbonat-Puffer wurde

₁₅ aus über Aluminiumoxid gereinigtem Triethylamin, 1 M in Wasser, hergestellt durch Einleiten von C0 ₂ bei 0°C, bis pH = 7,5 erreicht war.

2. Spektroskopische Methoden ₀ 2.1 UV

Spektralphotometer 554 der Fa. Perkin-Elmer. Die Proben wurden in Wasser oder Methanol gegen das Lösungsmittel gemessen: ε hat die Einheit 1/Mol x cm.

*-) e

2.2 NMR

WH-360, 360 MHz Spektrometer der Fa. Bruker

Meßfrequenzen ¹ H (360 MHz), ³¹ P (145,72 MHz), ¹³ C (90,54 ₃₀ MHz) .

Als Referenzsubstanzen dienten für die Kerne:

¹ H: TMS (extern), ³¹ P: H ₃ P0 ₄ (85 %ig) , ¹³ C: TMS (extern).

2.3 MS:

. - Die Massenspektren wurden an einem Spektrometer des Typs CH 7 A und Finnigan MAT, Modell 8222 der Fa. Varian MAT aufgenommen.

Die Messungen wurden mit der FAB-Technik durchgeführt (Fast Atom Bombardment) . Als Aufnahmebedingung konnte sowohl positiv mode als auch negativ mode gewählt werden. Ionisierungsgas: Xenon (7k eV) ; 0,2 ,umol Probe in 1 ,ul Glycerin-Matrix.

3. Allgemeine Synthesevorschrift

Das Nucleosid wird über Phosphorpentoxid wenigstens 24 Std. lang bei RT getrocknet. Anschließend löst man je 1 mMol Nucleosid unter Erwärmen, (ca. 1 Min. bei 150 C) in 5 ml Triethylphosphat (TEP). Nach dem Abkühlen auf 0°C wird die Lösung mit 2,0 Äquivalenten (Thio)phosphorylchlorid versetzt und anschließend bei RT gerührt. Die Reaktionsge¬ schwindigkeiten variieren mit dem Typ der Nucleobase.

Den Reaktionsverlauf kontrolliert man durch regelmäßige HPLC-Messungen. Dabei werden 0,01 ml der zu analysierenden Probe mit 0,2 ml Wasser hydrolysiert und mindestens 15 Min. lang stehengelassen.

Nach Beendigung der Phosphorylierungsreaktion wird der

Ansatz in einen Tropftrichter überführt. Die Reaktions¬ mischung tropft man binnen kurzer Zeit (20 - 60 sek. ) in eine Lösung von 0,1 M KOH, die 60%ig an Acetonitril ist (120 ml pro 1 mMol Nucleosid). Zur Herstellung von Cyclophosphaten wird dabei auf ca. 0 C gekühlt; die Cyclisierung zu Cyclothiophosphaten erfolgt bei Rückflu߬ temperatur. Die Lösung wird nach Beendigung der Zugabe ca. 30 sek. lang gerührt, danach erforderlichenfalls schnell im Eisbad abgekühlt und gleichzeitig mit 6 N Salzsäure mittels pH-Meter auf pH 5,5 - 6,5 eingestellt. Die Lösung wird im Rotationsverdampfer bei 30°C eingeengt und der ölige Rückstand mit 300 ml trockenem Ether im Ultraschall¬ bad behandelt, um Triethylphosphat zu entfernen. Der Niederschlag wird erneut mit 300 ml Ether gewaschen und anschließend in 100 ml trockenem Methanol suspendiert. Die ausgefallenen Salze werden abfiltriert und das Filtrat

— .4

wird für die chromatographische Aufreinigung am Rotations¬ verdampfer bei 30°C zur Trockne eingedampft. Das Roh¬ produkt trennt man dann mit Flash-Chromatographie auf RP-18 Material gegebenenfalls in Kombination mit Ionenaus- 5 tausch-Chromatographie auf schwach basischem Material (Sephadex oder Fractogel).

Beispiel 1

Adenosin-3 ' ,5'-cyclophosphat (cAMP) 10267 mg (ImMol) Adenosin wurden 24 h über P-C im Vakuum getrocknet und in 5 ml frisch destilliertem Triethylphos¬ phat unter Erwärmen gelöst.

Im Eisbad wurden 186 ,ul (2 mMol) frisch destilliertes 15 Phosphoroxychlorid zugegeben, wobei bei 0 C weiter gerührt wurde. Nachdem in der HPLC (RP-18, 15 % CH ₃ 0H, 100 mMol TEAF-Puffer) kein Nucleosid mehr nachzuweisen war (1 h), wurde der Ansatz in 120 ml einer eiskalten, 0,08 M KOH-Lösung mit 60% Acetonitril-Anteil zügig eingetropft 2 ₀ und sofort danach mit 6 N HC1 neutralisiert.

Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer bei 30 C eingeengt und der ölige Rückstand mit 300 ml trockenem Ether im ültraschallbad behandelt, um Triethylphosphat zu entfernen. 25 Der Niederschlag wurde erneut mit 300 ml Ether gewaschen und anschließend mit 100 ml trockenem Methanol suspendiert. Die ausgefallenen Salze wurden abfiltriert und das Filtrat wurde zur chromatographischen Aufreinigung bei 30 C zur Trockne eingedampft.

30

Zur Isolierung des Produkts wurde eine Flash-Chromatographie durchgeführt (RP-8, 12% CH ₃ OH, 100 mM TEAF-Puffer) und die

Produktfraktion lyophilisiert.

Ausbeute: 5850 OD (optical density) (39%) :.- MG: 329,3

- 1-3-

Der molare Extinktionskoeffizient ε hat bei 258 mm den Wert 15000.

5 Das Produkt wurde durch das H- (Ribose H-1 ' Proton) und

31 P-NMR-Spektrum sowie das Massenspektrum identifiziert.

Beispiel 2

Guanosin-3' ,5'-cyclophosphat (cGMP) , }. ιo 283 mg (1 mMol) Guanosin wurden 24 h lang über P Δ0_ _c _> im

Vakuum getrocknet und in 5 ml frisch destilliertem Triethylphosphat unter Erwärmen gelöst.

Im Eisbad wurden 186 μl (2 mMol) frisch destilliertes i Phosphoroxychlorid zugegeben und es wurde bei 0°C gerührt.

Nachdem in der HPLC (RP-18, 8% CH ₃ 0H, 100 mMol TEAF-Puffer) kein Nucleosid mehr nachzuweisen war (1h), wurde der Ansatz in 120 ml einer eiskalten, 0,08 M ₂ 0 KOH-Lösung mit 60% Acetonitril-Anteil zügig eingetropft und sofort danach mit 6 N HCl neutralisiert.

Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer bei 30 C eingeengt und der ölige Rückstand mit 300 ml trockenem Ether im 25 Ultraschallbad behandelt, um Triethylphosphat zu entfernen. Der Niederschlag wurde erneut mit 300 ml Ether gewaschen und anschließend in 100 ml trockenem Methanol suspendiert.

Die ausgefallenen Salze wurden abfiltriert und das Filtrat

₃₀ wwuurrddee ffüürr ddiiee cchhrroommaa-tographische Aufreinigung bei 30 C zur Trockne eingedampft.

Zur Isolierung des Produkts wurde eine Flash-Chromatographie durchgeführt (RP-8, 4% MeOH, 100 mMol TEAF-Puffer) und die Produktfraktion wurde lyophilisiert.

- Ib-

Ausbeute: 5440 OD (40%)

UV: λmax = 249 n , sh = 270 im ε = 13.600

HPLC: (8% MeOH/100 mMol TEAF) (R _p ): Rt = 6*15 Min.

_ Das Produkt wurde durch das H- (Ribose H-1 ' Proton) und

° 31 P-NMR-Spektrum und das Massenspektrum identifiziert.

Beispiel 3

Benzimidazol-1-ß-D-ribofuranosid-3' ,5'-cyclophosphat

_ _Λ 250 mg (1 mMol) Benzimidazol-1-ß-D-ribofuranosid wurden 24 10 h lang über P ₂ °5 ^ ^{m Va} *^ ^uum getrocknet und in 5 ml frisch destilliertem Triethylphosphat gelöst.

Im Eisbad wurden 186 μl (2 mMol) frisch destilliertes

Phosphoroxychlorid zugegeben und es wurde bei 0 C gerührt. _ιc Nachdem in der HPLC (RP-18, 20% CH ₃ 0H, 100 mMol

TEAF-Puffer) kein Ribosid mehr nachzuweisen war (1h), wurde der Ansatz in 120 ml einer eiskalten, 0,08 M KOH-Lösung mit 60% Acetonitril-Anteil zügig ^' eingetropft und sofort danach mit 6 N HCl neutralisiert. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer bei 30 C eingeengt und der ölige Rückstand mit 300 ml trockenem Ether im Ultraschallbad behandelt, um Triethylphosphat zu entfer¬ nen. Der Niederschlag wurde erneut mit 300 ml Ether gewaschen und anschließend in 100 ml trockenem Methanol suspendiert. Die ausgefallenen Salze wurden abfiltriert und das Filtrat wurde zur ehromatographisehen Aufreinigung bei 30°C zur Trockne eingeengt.

30

- π--

Zur Isolierung des Produkts wurde eine Flash-Chromatographie

(RP-8, 15% CH ₃ 0H, 100 mMol TEAF-Puffer) durchgeführt und die Produktfraktion lyophilisiert.

Ausbeute: 3060 OD (45%)

Der molare Extinktionskoeffizient hat bei 245 nm den Wert

6800

HPLC: 20% MeOH, 100 mMol TEAF; Rt = 4'42 Min.

Das Produkt wurde durch das H- (Ribose H-1 ' Proton) und I G 3 -i

P-NMR-Spektrum und das Massenspektrum identifiziert.

In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse für verschiedene erfindungsgemäß hergestellte Cyclophosphate zusammengefaßt

5

0

- ig -

Beispiel 4

R /S _r -Adenosin-3 ' ,5 '-cyclothiophosphat (CAMPS) 2,67 g (10 mMol) Adenosin wurden nach der allgemeinen Synthesevorschrift mit 2 ml (20 mMol) Thiophosphorylchlo- 5 rid phosphoryliert (Reaktionszeit 90 Min) und anschließend der Cyclisierungsreaktion unterworfen. HPLC-Reaktionskontrolle erfolgte im System RP-18, 18% MeOH, 100 mMol Triethyl- ammoniumformiat-Puffer (TEAF). Zur Aufarbeitung wurde eine Vorreinigung über Fractogel

10 TSK-DEAE-650 mit einem TBK-Puffergradienten von 0 - 0,07 M vorgenommen. Die Hochreinigung erfolgte über RP-18 Flash-Chromatographie mit 1% Methanol. Die Produktfraktionen wurden anschließend lyophilisiert. Ausbeute: R _p /S _p : 47450 OD (32%) (Rohprodukt).

₁ 5 Isomerentrennung und Hochreinigung der Produkte erfolgte über Anionenaustausch-Chromatographie isokratisch mit TBK-Puffer an DEAE-Sephadex-A 25 Material (HCOs-Form 2,5 x 50 cm). 1560 OD wurden auf die Säule gegeben und mit Wasser wurden ungeladene- Verbindungen abgetrennt. ₀ Anschließend konnte mit 0,25 M TBK ein Nebenprodukt eluiert werden. Mit 0,35 M TBK eluierten dann R -cAMPS und danach das S _p -Isomere in reiner Form. Die Produkte wurden aus Wasser lyophilisiert.

2.5 Ausbeute:

R _p : 473 OD (30%) S _p : 319 OD (20%)

Nebenprodukt; 230 OD (15%)

MG: 345,3

UV: λ max = 258 nm

._ru r, Der molare Extinktionskoeffizient ε hat bei 258 nm den

Wert 15000.

HPLC: 18% MeOH, 100 mMol TEAF, R _p : Rt = 3'05 Min.

S„: Rt = 3'44 Min. Das Produkt wurde durch das 1H- und 31P-NMR-Spektrum und

-.; das Massenspektrum identifiziert.

^" SO-

Beispiel 5

R /S _p -Inosin-3' ,5'-cyclothiophosphat

335 mg (1,25 mMol) Inosin ließ man, wie unter 3. an¬ gegeben, mit 0,25 ml (2,5 mMol) Thiophosphorylchlorid 5 reagieren. Der Verlauf der Phosphorylierung wurde durch regelmäßige HPLC-Messungen im System 15% MeOH, 100 mMol TEAF verfolgt. Nach 10 Std. Reaktionszeit wurde cyclisiert und aufgearbeitet. Der Rückstand wurde in 4 ml MeOH/Wasser 1:10 gelöst und flashchromatographisch im Fließmittel

1012,5% MeOH, 100 mMol TEAF aufgetrennt. Den Verlauf der Trennung kontrollierte man über eine UV-Durchflußküvette. Das diastereomere Produkt eluierte mit dem ersten Signal (Reinheit ca. 50%). Ausbeute: R _p /S _p 12470 OD (1,04 mMol; 83% d.Th. ) Roh-

₁ produkt.

Isomerentrennung und Hochreinigung der Produkte erfolgte über Anionenaustausch-Chroma-tographie isokratisch mit TBK-Puffer -an Fractogel-TSK-DEAE 659 Material (HC0 ₃ -Form 2,3 x 20,5 cm = 80 ml). 5360 OD des Rohproduktes wurden in

2 ₀ f0 ml Wasser gelöst und in zwei Portionen von je 5 ml aufgetrennt. Nach der Probenaufgabe eluierte man zunächst mit reinem Wasser ungeladene Verbindungen. Durch stufen¬ weise Erhöhung des Puffers in 0,05 molaren Schritten konnten erst ein Nebenprodukt mit 0,05 M TBK, und danach

₂ 5 die Produkte (R ) mit 0,2 M und (S ) mit 0,25 M TBP-Puffer eluiert werden. Um den Puffer zu entfernen, wurde lyo¬ philisiert.

Ausbeute: R : 886 OD (17%) S _p : 537 OD (10%)

₃₀ MG: 346,3

UV: λ ax = 249 nm

Der molare Extinktionskoeffizient ε hat bei 249 nm den Wert 12000.

HPLC: 10% MeOH, 100 mMol TEAF; R _p : Rt = 7,53 Min. _ ₅ S _p :Rt = 10,13 Min.

" 2 | -

Das Produkt wurde durch das 1„ H- und, 31_P-.N-.M,,_R.-Spek,t.rum und, das Massenspektrum identifiziert.

Beispiel 6 ° R _p /S _r -2-Chlor-adenosin-3' ,5'-cyclothiophosphat

2T1 ^" mg (0,7 mMol) 2-Chloradenosin und 0,14 ml (1,4 mMol) PSCI3 wurden, wie unter 3. beschrieben, zur Reaktion gebracht und 47 Std. lang bei RT gerührt. HPLC-Reaktions- kontrolle führte man im System 20% MeOH, 100 mMol TEAF ' durch. Danach wurde der Ansatz cyclisiert und wie beschrie¬ ben aufgearbeitet. Das Rohprodukt wurde in 3 ml Wasser gelöst und flashchromatographisch im Fließmittel 20% MeOH, 100 mMol TEAF aufgetrennt. Den Verlauf der Chromatographie kontrollierte man über eine UV-Durchflußküvette. Die diastereomeren Produkte eluierten dabei mit dem 5ten (R _p , Reinheit ca. 90%) und 6ten (S _p , Reinheit ca. 90%) Signal. Die flüchtigen Bestandteile der Produktfraktionen wurden im Vakuum bei RT abdestilliert und die Isomeren anschließend lyophilisiert. Der wiedergewonnene Edukt-An- ⁰ teil beträgt 2560 OD = 26%.

Ausbeute (bezogen auf die umgesetzte Eduktmenge):

R : 1858 OD (16%), Rohprodukt

R : 1195 OD (17%), Rohprodukt

Hochreinigung des R _p -Isomeren erfolgte über Anionenaustausch-

~ ^~ Chromatographie isokratisch mit TBK-Puffer an DEAE-Sephadex-A Material (HCOa-Form 1,6 x 20 cm). 250 OD des Rohproduktes gab man auf die Säule und eluierte mit Wasser das Ribosid, danach mit 0,1 M TBK zwei Nebenprodukte. Die das R _p -Iso- mere enthaltenden Fraktionen wurden eingefroren und lyo-

³⁰ philisiert.

Ausbeute: 101 OD (41%)

MG: 379,8

UV: λ ax = 264 nm

Der molare Extinktionskoeffizient ε hat bei 263 nm den ^: - Wert 14000.

HPLC: 30% MeOH, 100 mMol TEAF; R : Rt = 3'40 Min.

S _p : Rt = 3*50 Min. Das Produkt wurde durch das 1H- und 31P-NMR-Spektrum und das Massenspektum identifiziert.

^~

Beispiel 7

R _r /S-,-Guanosin-3' ,5'-cyclothiophosphat

0,028 g (0,1 mMol) getrocknetes Guanosin wurden in 1 ml

Triethylphosphat gelöst, mit 0,02 ml (0,2 mMol) PSC1 ₃ 0 versetzt und 24 Std. lang bei Raumtemperatur gerührt. Den Reaktionsverlauf kontrollierte man durch HPLC-Messungen (RP-18, 10% MeOH/100 mMol TEAF), für die 10 μl Reaktions¬ lösung mit 200 μl H ₂ 0 versetzt und 30 Min. lang bei 50°C im Wasserbad stehen gelassen wurden. Nach Beendigung der 5 Reaktion tropfte man den Reaktionsansatz in die Cyclisierungslösung nach 3. Anschließend wurden die leicht flüchtigen Bestandteile im Vakuum abgezogen, der Rückstand wurde zweimal mit 30 ml Ether ausgeschüttelt, in 10 ml Methanol aufgenomen, die Salze abfiltriert und das Filtrat 0 eingeengt. Die Reinigung erfolgte flashchromatographisch auf RP-8-Material mit 4% Methanol/100 mMol TEAF. Das (R )-Isomere eluierte mit Fraktion 6, das (S _p )-Isomere mit Fraktion 7. Beide Diasteromeren wurden mittels micropräparativer HPLC 5 an RP-18 Material mit 5% MeOH/100 mMol TEAF hochgereinigt.

MG: 361,26

Ausbeute: (R _p ) : 7,2 mg (0,02 mMol, 20,0% d.Th.)(S _p ) : 3,8 mg (0,01 mMol, 20,8% d.Th. )

UV: λ max = 249 nm,' sh = 270 nm ₀ ε = 13.600

HPLC: (10% MeOH/100 mMol TEAF) (R _p ) : Rt = 6 ^r 15 Min.

(S _p ) : Rt = 9'30 Min. Das Produkt wurde durch das 1H- und 31P-NMR-Spektrum und

_;5 das MassenSpektrum identifiziert.

In der nachfolgenden Tabelle 2 sind die Ergebnisse für verschiedene erfindungsgemäß hergestellte Cyclothiophosphate zusammengefaßt.

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Tabelle 2 Nucelosid-3'.5' ^* -c c|ot ip f ⁾ ** l ^: P