ELECXROSPINNING, MEMBRANAS POLIMÉRICAS CONTENDO EXTRATOS DE Pterodon pubescens Benth E Arrabidaea chica. Verlot E SEUS USOS CAMPO DA IMVEMCÃO

[001] A presente invenção se insere no campo da engenharia e farmácia, e descreve um processo para obtenção de membranas poliméricas por electrospinning pela associação dos extratos de Pterodoji pubescens Benth e ArraJbidaea chica Verlot para aplicação em regeneração óssea e tecidual guiada.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Electrospinning é um método simples e conveniente para produzir fibra ultrafina com diâmetros na escala de micro ou nanômetro. Os scaffolds eletrofiados possuem estrutura reticular com elevada área superficial em relação ao volume, alta porosidade e poros com interconexões, que são semelhante à matriz extracelular naturais (MEC) , caracteristicas que podem aumentar a adesão, a proliferação e crescimento de células (Meng et al. 2010) .

[003] As membranas poliméricas {scaffolds) desenvolvidas pelo processo de electrospinning podem ser empregadas como barreiras físicas em Regeneração Tecidual Guiada (RTG) . Os princípios da RTG vêm sendo aplicados não somente na odontologia ou na ortopedia, como na sua forma mais tradicional, mas também em outras especializações da medicina. Compreender os mecanismos envolvidos é tão importante quanto a verificação dos tipos de barreiras físicas empregados na RTG, já que o material adotado está relacionado com os resultados obtidos. A aplicação dessas membranas tem como finalidade a regeneração do tecido ósseo, promovendo o reparo da região através da síntese fiel do tecido original, podendo ser espontânea ou induzida (associado com um ou mais extratos vegetais: Arrabiadaea chica e/ou Pterodon pubescens) . Atualmente-, ocorre a extrapolação desta técnica para vários tecidos, como tecido nervoso, cartilaginoso e conjuntivo (Iamaguti et al, 2008) .

[004] A ArraJbiadaea chica (Humb. & Bonpl.) Verlot (Bignoniaceae) , encontrada principalmente na Região Amazônica, popularmente conhecida como crajiru, carajiru, pariri e chica, é uma liana lenhosa, que possui folhas que fornecem pigmentos vermelhos, carajurina e carajurona, utilizados pelos Índios brasileiros como corante e agente cicatrizante. Ά medicina tradicional atribui à espécie um amplo espectro de propriedades, tais como anti- inflamatórias, adstringentes e terapêuticas, além de seu emprego no tratamento de enfermidades da pele (psoriase, feridas, úlceras, piodermites) , leucemia, câncer de boca e de útero, além de ser utilizada para a prevenção de cáries e como cosmético (Gentry, 1992; Kalil, 2000) .

[005] O género Pterodon compreende quatro espécies nativas do Brasil: Pterodon abruptus Benth. , Pterodon apparucuri Pedersoli, Pterodon pubescens Benth., [Pterodon Emarginatus Vogel) e Pterodon polygalaeflorus Benth. A espécie vegetal Pterodon pubescens Benth. (Sinonimia botânica: Pterodon emarginatus Vog.) é uma árvore da família das Leguminosae-Papillonoideae, encontrada no cerrado brasileiro, principalmente nos estados de...Minas Gerais, São Paulo, Goiás e Mato Grosso do Sul e conhecida popularmente como faveiro, sucupira-branca, fava-de-sucupira, sucupira ou sucupira-lisa ^' (Lorenzi, 1998). Alguns autores têm sugerido que o esqueleto vouacapânico de diterpernos furânicos esteja envolvido com as propriedades anti-inflamatórias, anti- edematogênica, analgésicas do óleo das sementes de Pterodon pubescens (Nunan et al., 1982; Carvalho et ai., 1999; Silva et al., 2004) .

[006] Assim, foram desenvolvidas três composições diferentes de membrana polimérica obtida pelo processo elecrospinninçr, contendo extratos vegetais Pterodon púbescens Benth (Sucupira) e/ou Arrabidaea chica Verlot para aplicações em regeneração tecidual guiada, pois estes extratos apresentam atividade anti-inflamatória e cicatrizante respectivamente. Ressalta-se que as barreiras físicas devem promover resposta celular (Arrabidaea chica Verlot: estimulação da cicatrização) e não produzir reação inflamatória (Pterodon pubescens Benth: ajuda no combate do processo anti-inflamatório e apresenta propriedades analgésicas, devido à presença dos vouacapanos) . Portanto, conseguiu-se desenvolver uma membrana com a capacidade de liberar princípios ativos vegetais, com as referidas atividades biológicas, sendo esses extratos utilizados pela primeira vez em associação.

ESTADO DA TÉCNICA

[007] O documento EP1558444B1 descreve um processo e composição para a produção de biomateriais de seda, por exemplo, fibras, películas, espumas. Neste processo, pelo menos, um polímero biocompatível, tal como (óxido de etileno) poli (PEO) e polietilenoglicol (PEG) foi misturado com a proteína de seda, em que a proteína é obtida a partir do Bombyx morl, antes de processar, por exemplo, electrospinning. Entretanto, tal documento limita-se na utilização de 2 possíveis polímeros para a .obtenção das membranas. A utilização de polímeros naturais, especifico neste caso a fibroina de seda, dificulta a reprodutividade dos mesmos, por ser um polímero que depende das condições climáticas regionais onde o casulo da seda é fabricado e coletado. Polímeros sintéticos utilizados no nosso trabalho, são polímeros já consagrados pela literatura e aprovados pelo FDA. A presente invenção, por outro lado, está associada a dois extratos vegetais que nunca foram apresentados em conjunto na literatura. Com a técnica de electrospinning utilizada, torna-se possível associar os extratos vegetais com outros polimeros, tais como, poli (ácido láctico-co- glicólico) (PLGA) , celulose, gelaina, polivinilpirrolidona (PVP) , poli ácido lático (PLLA) , etc, o que aumenta as possibilidades.de aplicações na área biomédica.

[008] O documento EP2254608B1 refere-se a scaffolds isentos de células biologicamente ativas compostos de compartimentos de extratos celulares e/ou extracelulares para utilização na regeneração tecidual. As células são semeadas sobre os scaffolds que são capazes de receber forças mecânicas e tem uma superfície padronizada. Essas células podem ser de animal, seres humanos ou plantas, com aplicação para reparação e regeneração de tecidos ou órgãos. Esses scaffolds foram associados com extratos extracelulares e/ou intracelulares a partir das referidas células ou tecidos. Scaffolds associados com células apresentam a dificuldade de armazenamento e estabilidade, e difícil controle de crescimento celular, obtendo, assim scaffolds com diferentes parâmetros e características. A presente invenção, de maneira diferente, desenvolveu uma membrana com a capacidade de liberar princípios ativos vegetais, com as referidas atividades biológicas, sendo esses extratos utilizados pela primeira vez em associação, e que apresentam propriedades analgésicas, anti-inflamatórias e cicatrizantes, que favorece a regeneração tecidual.

[009] 0 documento US7172765B3 descreve artigos e métodos biodegradáveis fibrosos e/ou bioabsorviveis para utilizar em aplicações médicas. Tais artigos que são formados por electrospinningr fibras de material biodegradável e/ou bioabsorvivel, compreendem um composto (ou composto assimétrico) de diferentes fibras biodegradáveis e/ou bioabsorviveis. Tais artigos que têm utilizações médicas especificas incluem uma barreira de redução de aderência e um sistema de liberação controlada. O referido documento apresenta uma visão geral do método do electrospinning, envolvendo os parâmetros para a obtenção de membranas para regeneração tecidual. Sugerem uma possível associação com princípios ativos tais como fármacos, mas não foram realizados testes com os mesmos, e sim somente a utilização de polímeros para a fabricação das membranas. Já a presente invenção mostra a associação de polímeros sintéticos aprovados Food and Drug Administration (FDA) associados com extratos vegetais que apresentam princípios biológicos que ajudam na regeneração tecidual, tornando essa membrana promissora para aplicações na área biomédica e odontológica. De acordo com os resultados in vitro, houve uma proliferação celular significativa.

[010] Assim, com o processo descrito na presente invenção, foi possível desenvolver uma membrana polimérica com a finalidade de regenerar o tecido ósseo, promovendo o reparo da região através da síntese fiel do tecido original. sendo induzida pela associação dos extratos vegetais: Arrabiadaea chica e/ou Pterodon pubescens. Ressalta-se que as barreiras fisicas devem promover resposta celular, visto que a Arrabidaea chica Verlot estimula a cicatrização) e não produzir reação inflamatória, pois a Pterodon pubescens Benth ajuda no combate do processo anti-inflamátório e apresenta propriedades analgésicas, devido à presença dos vouacapanos. Portanto, a membrana possui capacidade de liberar princípios ativos vegetais, com as referidas atividades biológicas, sendo esses extratos utilizados pela primeira vez em associação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[011] A presente invenção tem por objetivo propor um processo para obtenção de membranas poliméricas por electrospinninç pela associação dos extratos de Pterodon pubescens Benth e -Arrabidaea chica Verlot para aplicação em regeneração óssea e tecidual guiada.

[012] É um objeto adicional membranas poliméricas que compreendem a associação de 0,25 mg a 1,0 g de Pterodon pubescens e 0,10 a 1,0 g de Arrabidaea chica e pelo menos um polimero para regeneração tecidual guiada (RTG) .

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[013] A FIG. 1 apresenta micrografias das fibras, onde A representa PCL-S; B representa PCL-C e C representa PCL-S;

[014] A FIG. 2 apresenta gráficos absorbância x tempo mostrando a avaliação da citotoxicidade e crescimento celular das membranas poliméricas com os extratos vegetais em / c 3T3 de BALB. Os / c 3T3 de BALB foram tratadas com diferentes membranas durante 24 h, 3 e 7 dias. Os resultados representam as médias e desvios-padrão do experimento. Anova I teste. * P <0, 05.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[015] A presente invenção refere-se a um processo para a obtenção de membranas poliméricas por electrospinning compreendendo as seguintes etapas:

a} Coleta do material vegetal;

a.l) de Pterodon pubescens Benth;

a.2) de Arrabidaea chica Verlot;

b) Preparo do extrato vegetal de Pterodon pubescens

Benth;

b. l) triturar lkg dos frutos em gelo seco;

b.2) adicionar com agitação mecânica em um tanque de aço inox 3x o volume de diclorometano;

b.3) deixar em contato com o solvente extrator por 1,5 horas sob agitação;

b.4) repetir as etapas b.1), b.2) e b.3) por três vezes, totalizando 4,5 horas de extração;

b.5) coletar, filtrar e transferir o líquido extrator para um balão de fundo redondo e concentrado sob vácuo em evaporador rotativo a 40°C;

c) Secagem e moagem do material vegetal de Arrabidaea chica Verlot;

d) Preparo do extrato vegetal de Arrabidaea chica Verlot;

d.l)- transferir com agitação mecânica 3kg de folhas para um tanque de aço inox;

d.2) utilizar etanol 70%, acidificado com 0,3% de ácido cítrico P.A, na proporção de 1 (planta) :5 (solvente) P/v. d.3) repetir as etapas d.l) e d.2) por três vezes de 90 minutos cada;

d.4) filtrar a solução resultante sob vácuo protegido de luz;

d.5) concentrar o extrato bruto sob vácuo até redução de 80% do volume final;

d.6) neutralizar o extrato bruto com hidróxido de amónio até pH 6, 5-7, 00;

e) Preparo das soluções de electrospinning:

e. l) misturar 20% massa de polímero de massa molar de 80000 g/mol, 80% massa de acetona e os extratos vegetais obtidos em (b) e (c) por agitação por pelo menos 3 horas, a 23 e 28°C;

e.2) eletrofiar à temperatura variável entre 23 e 28°C, umidade variável entre 52 e 75%, com vazão variável entre 0,5 e 5 mL/h e tensões variáveis entre 10 e 30 kV e com distância variável da ponta da agulha à placa coletora entre 10 e 20 cm.

[016] É um.objeto adicional membranas poliméricas que compreendem a associação de 0,25 mg a 1,0 g de Pterodon pubescens e 0,10 a 1,0 g de Arrabidaea chica e pelo menos um polímero para regeneração tecidual guiada (RTG) .

[017] As membranas poliméricas compreendem opcionalmente:

- umectante ser selecionado do grupo que consiste em propilenoglicol e glicerina, preferencialmente glicerina;

- tensoativo não iônico ser selecionado do grupo que consiste em polissorbato 80 e triton X-100, preferencialmente triton X-100; - promotor de permeaçao ser selecionado do grupo que consiste em etoxidiglicol e l-metil-2-pirrolidona, preferencialmente l-metíl-2-pirrolidona; e

- mistura de solventes ser selecionada do grupo que consiste em diclorometano, DMF, álcool etílico, água acidificada com acético ou ácido fórmico, solução de cloreto de sódio, acetona e clorofórmio, preferencialmente acetona e clorofórmio.

Coleta do Material Vegetal

De Pterodon pubescens Benth. (Sucupira)

[018] Os frutos de Pterodon pubescens foram coletados e identificados pelo Prof Prof. Dr. Jorge Yoshio Tamashiro do departamento de Botânica do IB-UNICAMP. As exsicatas foram depositadas no Herbário do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas sob o voucher 179739. Assim, independentemente da região que o fruto é coletado ou a espécie do mesmo, é possível realizar a incorporação do extrato vegetal à membrana polimérica via o processo de electrospínning.

De Arrabidaea chica Verlot

[019] As folhas da trepadeira de A. chica foram coletadas e identificadas pela Dra . Glyn Mara Figueira. Uma exsicata foi depositada no Herbário do CPQBA/Unicamp sob n° 1865. Assim, independentemente da região que o fruto é coletado ou a espécie do mesmo, é possível realizar a incorporação do extrato vegetal à membrana polimérica via o processo de electrospínning.

Preparo dos Extratos Vegetais

De Pterodon pubescens Benth. (Sucupira) [020] Para obtenção do extrato de sucupira, os frutos (lkg) primeiramente foram triturados com gelo seco para aumentar a superficie de contato e consequentemente obter ura maior rendimento de extração. Em seguida, os frutos triturados foram transferidos para tanque de aço inox (5 litros de capacidade) com agitação mecânica e sob estes, adicionou-se 3 vezes o volume de diclorometano (3 litros) . Deixou-se o material vegetal em contato com o solvente extrator por 1,5 hora, sob agitação. Este procedimento foi repetido por 3 vezes, totalizando um período de 4,5 horas de extração. Após este período, o liquido extrator foi coletado, filtrado, transferido para balão de fundo redondo e concentrado sob vácuo em evaporador rotativo (Buchi® RE 120) a 40°C. No final do procedimento, obteve-se um total de 450g de extrato de sucupira, que foram acondicionados em frascos de vidro e armazenados à temperatura ambiente.

De Arrabidaea chica Verlot

[021] Antes da preparação do extrato vegetal de Arrabideae chica, é necessário primeiramente secar as folhas durante 48 horas em estufa à 40°C, com ventilação forçada e, posteriormente moer em moinho de martelo com peneira de 40 mesh. O material seco e moldo foi embalado em sacos laminados compostos por filme interno de polipropileno, revestido por uma camada externa de alumínio opaco com a finalidade de proteger o material vegetal da ação oxidativa, proveniente da luminosidade, oxigénio e umidade.

[022] - Após sécagem e moagem, pesou-se 3 kg de folhas e transferiu-se para um tanque de aço inox de capacidade de 50 litros com agitação mecânica. 0 extrato bruto foi obtido utilizando etanol 70% (grau técnico), acidificado com 0,3% de ácido cítrico P.A, na proporção de 1 (planta) :5 (solvente) p/v. 0 processo foi repetido por 3 vezes de 90 minutos cada. Filtrou-se a solução resultante sob vácuo protegido da luz. O extrato bruto foi concentrado sob vácuo até redução de 80% do volume final, esse extrato foi neutralizado com hidróxido de amónio até pH 6,5-7,00.

Preparo das soluções de electrospinning

[023] Todas, as soluções foram agitadas durante três horas, a 23 °C submetido ao processo de electrospinning no mesmo dia da preparação. A Tabela 1 demonstra a composição das membranas eletrofiadas (massa%).

Tabela 1:

S: Sucupira; C: Arrabidaea chica

Electrospinning

[024] O sistema de electrospinning utilizado na presente invenção consistiu de uma seringa de 10 mL e uma agulha com diâmetro 0,55 mm, uma bomba de infusão, uma fonte de alta tensão e uma placa de coletora aterrada.

[025] As soluções foram fiadas à temperatura ambiente a 25°C e umidade de 52%, com vazão de 2 mL/h e tensões de 12 a 13 kV, A distância da ponta da agulha à placa coletora foi de 12 cm.

Caracterização das membranas poliméricas obtidas

[026] A morfologia das membranas foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) . Para a observação pelo MEV, as amostras foram revestidas em ouro. Os diâmetros médios das fibras foram determinados por análise das imagens de MEV, utilizando o programa de análise de imagens, onde foram medidos os diâmetros de 50 fibras de cada amostra escolhidas aleatoriamente.

[001] As micrografias por MEV revelam, para as condições adotadas, a formação de uma rede densa de fibras com uma morfologia cilindrica, sem a presença de defeitos como estrutura de contas (beads) que são comumente observados em nanofibras obtidas por electrospinning. O diâmetro médio das fibras de PCL-S, PCL-C e PCL-SC foram 0,45 (±0,12) um, 1,25

(±0,53) um e 1,91 (±0,7) um respectivamente.

Cultura da Célular

[002] Utilizou-se linhagem estabelecida não cancerígenas BALB/c 3T3 (fibroblasto murinho) . As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de antibiótico (penicilina e estreptomicina) . As células foram plaqueadas em garrafas de 75 cm ² na densidade de 2 x 10* células/mL e incubadas a 37 ^e C sob atmosfera úmida com 5% de CO2.

Ensaios da Citotoxicidade

[003] Ensaio de Viabilidade Celular Através da Redução do MTT (3-Jarometo de (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5- difenil-tetrazólio) .

[004] Nesse ensaio, a viabilidade celular foi avaliada através da medida da capacidade das células de reduzir o MTT (3-brometo de (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5- difenil-tetrazólio) a formazan. O formazan é um pigmento insolúvel que é extraído das células e quantificado espectrofotornetricamente em λ=570 nm. A redução do MTT é catalisada principalmente pelas desidrogenases mitocondriais e também do citoplasma. Portanto, a alteração da função mitocondrial poderá ser detectada através da variação da capacidade de redução do MTT.

[005] As células foram plaqueadas na densidade de 6 x 10 ³⁴ células/mL em placas de 24 poços que já continham laminulas com ou sem biomaterial a ser estudado. Posteriormente, foram incubadas a 37°C, 5% de CO ₂ por 24h. Após 24h de incubação, o meio foi removido, os poços foram lavados com tampão salina tamponado com fosfato (PBS) e adicionado no meio sem soro contendo o corante MTT (0,5 mg/mL) . Após incubação por 3h a 37°C, o meio foi retirado cuidadosamente e adicionado 100 uL de etanol para solubilização do formazan. As placas foram agitadas por 5 minutos e a absorbância correspondente a cada poço foi lida no leitor de placas em λ=570 nm. Os valores foram expressos em porcentagens de redução de MTT em relação ao controle, onde as células não foram expostas aos agentes testes {Mosmann, 1983) .

[006] A FIG. 2 mostra os resultados de citotoxicidade e crescimento celular, que representa o crescimento progressivo das células 3T3 cultivadas sobre os scaffolds de PCL associados com os extratos vegetais ao longo do tempo de 24 horas, 3 dias e 7 dias. Pose se observar pelos resultados de viabilidade celular .que as membranas apresentam biocompatibilidade em todos os compostos quando expostos a linhagem 3T3 e houve diferença significativa na proliferação celular, avaliada pelo método MTT, entre os extratos analisados. [007] Foram analisadas todas as membranas em relação ao grupo controle e observou-se que o grupo controle vs. PCL-S apresentou diferença significativa apenas no intervalo de tempo de 7 dias (p< 0,01). Para o grupo PCL-C vs. grupo controle houve uma diferença significativa (p< 0,001), nos intervalos de tempo de 3 e 7 dias. O grupo PCL- SC apresentou melhores resultados em todos os intervalos de tempo analisados, (p< 0,01) para 24 horas e p< 0,001 para 3 e 7 dias.

[008] Estudos in vitro e in vivo demonstraram a capacidade cicatrizante do extrato bruto de Arrabidaea chica, com o aumento da produção de fibroblasto, ação tripanocida, antifúngica in vitro e atividade antimicrobiana (Barbosa et al., 2008; Jorge et al, 2010; Hofling et al., 2010) . Na presente invenção, foi observado um crescimento significativo dos fibroblastos nas membranas com extrato de Arrabidaea chica (FIG. 2) . A indução de crescimento de fibroblastos e, consequentemente, a ação cicatrizante dos extratos pode estar relacionada à presença das antocianinas (Taffarello et al., 2013), o que comprova que houve a liberação do extrato para o meio estimulando o crescimento de fibroblastos da linhagem 3T3. Observa-se que a associação dos dois extratos vegetais favoreceu a estimulação da proliferação de fibroblastos em 148% superior ao controle positivo FIG. 2.

[009] Estudos da literatura comprovam as atividades antinoceptiva e anti-inflamatória do extrato Pterodon pubescens, sendo estas atividades atribuídas à presença de geranilgeraniol e voaucapanos isolados (Spindola et al., 2010; Spindola et al., 2011). [010] No trabalho de Vieira et al, 2008 foi demonstrado que a atividades no ensaio de viabilidade celular com extrato alcoólico a partir das sementes de Pterodon pubescens à uma concentração de 30 mg/mL exerceu uma atividade antitumoral, podendo matar células. Nota-se que no presente estudo, a concentração do extrato de sucupira utilizada nas membranas poliméricas (Tabela 1) , não apresentou cltotoxicidade e estimulou o crescimento celular significativo no período de 7 dias (p< 0,01) (FIG. 2).

Teste estatístico

[011] Após a coleta dos dados e a categorização das variáveis, foi realizada a transferência dos valores para o Programa GraphPad Prism 5. As análises estatísticas dos resultados foram analisadas, aplicando-se os testes estatísticos Análise de Variância (Anova) + Comparação múltipla com o teste de Tukey. Considerou-se o nível de significância de 5%, ou seja, os dados foram estatisticamente significantes para p <0,05.

[012] Assim, de acordo com o processo descrito na presente invenção sob as condições adotadas no processo, obteve-se com sucesso membranas contendo extratos vegetais, não apresentando efeitos citotóxicos. Isto demonstrou que a referida membrana possui potencial aplicação para Regeneração Tecidual Guiada (RTG) , podendo ser uma nova alternativa no mercado com menor custo. A associação dos extratos está sendo aplicada pela primeira vez, onde reúne as atividades farmacológicas de ação cicatrizante e antimicrobiana com ação anti-inflamatória e analgésica, atribuida respectivamente à Arrabidaea chica e Pterodon pubescens.