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Title:
PROCESS FOR PRODUCING RECOMBINANT PROTEINS FROM BREAST MILK PROTEINS FOR USE IN SPECIALISED FOODS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2018/074913
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to the biotechnology industry and to the industry for manufacturing specialised foods. The present invention concerns a method for producing pure functional recombinant proteins from breast milk proteins in a transformed strain of the yeast Pichia pastoris X-33, which are subsequently used to produce safe specialised foods with a high aggregate value, and which overcome the disadvantages and side effects related to the consumption of specialised foods made from the principal components of cow's milk.

Inventors:
MURGUÍA CAVERO, Marco Antonio (Villa Navone No. 6, Colonia Lomas de las PalmasC.P. Huixquilucan, Estado de México, 52788, MX)
Application Number:
MX2017/000102
Publication Date:
April 26, 2018
Filing Date:
September 25, 2017
Export Citation:
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Assignee:
MURGUÍA CAVERO, Marco Antonio (Villa Navone No. 6, Colonia Lomas de las PalmasC.P. Huixquilucan, Estado de México, 52788, MX)
International Classes:
C12N15/81; C12P21/02; C12R1/84
Foreign References:
US6423509B12002-07-23
US6100054A2000-08-08
Other References:
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MANUAL DEL USUARIO EASYSELECTTM PICHIA EXPRESSION KIT. CAT., 18 June 2010 (2010-06-18), pages viii, 7, 26, 53, 56, 64, 65, Retrieved from the Internet [retrieved on 20171214]
INOUE, H. ET AL.: "High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids", GENE, vol. 96, no. 1, 1990, pages 23 - 28, XP023545713
SCHEICH, C. ET AL.: "An automated method for high-throughput protein purification applied to a comparison of His-tag'' and GST-tag affinity chromatography", BMC BIOTECHNOLOGY, vol. 3, 2003, pages 1 - 8, XP021005905
LONNERDAL, B.: "Recombinant Human Milk Proteins. En: Protein and Energy Requirements in Infancy and Childhood", NESTLE NUTR WORKSHOP SER PEDIATR PROGRAM, vol. 58, 2006, pages 207 - 217, XP055490059
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Claims:
REIVINDICACIONES

Habiendo descrito suficientemente la invención, se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo expresado y contenido en las siguientes cláusulas reivindicatorías.

1. Un método para la producción de las proteínas recombinantes de la LM en un sistema eucariote, caracterizado porque el método consiste en la transformación del sistema eucariote con un vector específico de ADN de doble cadena heterólogo que contiene una secuencia de nucieótidos optimizada que codifica a cada una de las proteínas de la LM recombinantes junto con un conjunto de genes "auxiliares" y de elementos de la regulación de la transcripción, para la expresión constitutiva y la secreción de las proteínas de ¡a leche materna recombinantes en un medio de cultivo liquido selectivo en condiciones de crecimiento estándares.

2. Eí método según la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema eucariote es la levadura Pichia pastoris X-33.

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado por la construcción de un vector de ADN heterólogo de doble cadena con la capacidad de regular la transcripción de una secuencia de ácidos nucleicos optimizada que codifica las proteínas mb nantes de la proteínas de la leche materna

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque el vector de ABN heterólogo de doble cadena es un plásmido pGZaLM que contiene un gen de resistencia a un antibiótico específico asi como un conjunto de secuencias de nucleótidos codificantes y de elementos de la regulación de la replicación y de la transcripción necesarios para su propagación en un huésped procariote y para la expresión de las proteínas recombinantes de las proteínas de la leche materna en el huésped eucariote.

5. Un método de acuerdo a la reivindicación 4, donde al vector de ADN heterólogo de doble cadena se le ha insertado una secuencia de nucleótidos específica y optimizada que codifica a las proteínas de la leche materna recombinantes (pGZaLM), las cuales incluyen la lactoferrína, las inmunoglobulinas de secreción IgA e IgG, la beta caseína, la kappa caseína, la alfa í a ctoa I b ú m i n a , la lisozima y la osteopontina.

6. El método según cuaiqu iera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porqu e el sistema de amplificación natural del plásmido pGZaLIVI es un huésped procariote.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque el huésped procariote es la bacteria Escherichia coli (E. coü) con el genotipo F- mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80ΐ3θΖΔΜ15 Δ lacX74 recA1 araD139 Δ (araleu) 7897 gaíU galK rpsL (StrR) endA1 nupG.

8 El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque la reacción de PCR de punto fina! para validar la clonación del plásmido pGZaL en E. coíi así como la transformación de la levadura Pichía pastoris X-33 requiere de los oügonucleótidos sentido -5'- GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3 '- y antisentido -5'- GCAAATGGCATTCTGACATCC-3 '-.

9. E! método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque la preparación de las células ultracompetentes de E. coli con ei genotipo F- mcrA Δ (mrr- hsdRMS-mcrBC) d>80lacZAM15 Δ íacX74 recAI araD139 Δ (araleu) 7697 gaiU galK rpsL (StrR) endA1 nupG requiere una solución de PIPES 0.5 M y de DMSO al 7.5%

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque la preparación de las células competentes de Pichia pastoris X-33 requiere una solución de cloruro litio (LiCI) 100 mM.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque el método incluye la generación de una cepa ultracompetente de la bacteria E. coü con el genotipo F- mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) d 80lacZA 15 Δ lacX74 recA1 araD139 Δ (araleu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG; !a cual tiene la capacidad de amplificar el plásmido especifico pGZaLM.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque la cepa de E. coli es compatible con el gen de resistencia al antibiótico del plásmido pGZaL .

13. E! método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque se genera una cepa de la levadura Pichia pastoris X-33 transformada con el plásmido pGZaLM, con la capacidad de expresar y de secretar al medio de cultivo las proteínas recombinantes de las proteínas de la L .

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque las levaduras de Pichia pastoris X-33 transformadas con el plásmido pGZaLFvl son cultivadas en condiciones de crecimiento estándares en un medio de cultivo líquido selectivo LB bajo en sales (<90 mM).

15. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque comprende la purificación específica de las proteínas recombinantes de las proteínas de la LM a partir del medio de cultivo liquido selectivo de las evaduras transformadas de Pichia pastoris X-33.

16. E! método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque la transformación de la levadura Pichia pastoris X-33 requiere la linealización del plásmido pGZaLM con enzimas de restricción.

17. El método según cualquiera de las reivin

presentes, caracterizado porque la linealización de

pGZaLM requiere de la enzima de restricción Bsp H1

18. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque la transformación de la levadura Pichia pastoris X-33 con el plásmido pGZaLM se lleva a cabo con una solución que contiene polietilengiicol (PEG) al 50%, cloruro de litio 1 M y ADN de cadena simple en concentración de 2 mg/mL.

19. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque a transformación de la levadura Pichia pastoris X-33 con el plásmido pGZaLM se realiza mediante electro oración.

20. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque e! medio de cultivo de E. coli transformada con el plásmido pGZaLM contiene triptona 10 g/L, extracto de levadura de 5 a 10 g/L, NaCi 5 g/L pH 7 y zeocina; en donde la concentración de zeocina es de 25 μ g / m L a 50 pg/mL, preferentemente 50 pg/mL.

21. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque el medio de cultivo de Pichia pastoris X-33 transformada con el plásmido pGZaLM contiene extracto de levadura 10 g/L, peptona 20 g/L, dextrosa 20 g/L y zeocina.

22. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque el medio de cultivo de Pichia pastoris X-33 transformada con el plásmido pGZaLM contiene zeocina en un rango de concentraciones de 90 pg/mL a 200 pg/mL, la cual se usa preferentemente a 150 pg/mL.

23. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque la composición del plásmido incluye una región codificante de un polipéptido de seis residuos de histidina.

24. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque las proteínas recombinantes producidas incluyen a la lactoferrina, las inmunogiobulinas de secreción IgA e IgG, la beta caseína, la kappa caseína, la alfa lactoalbúmina, la iisozima y la osteopontina humanas.

25. Ei método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque las proteínas recombinantes producidas se emplean en la fabricación de alimentos especializados con un aito valor agregado.

26. E! método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque la purificación de la proteína recornbinante se realiza mediante una cromatografía en columna por afinidad utilizando preferentemente el medio de cultivo de la levadura Pichia pastoris X-33 transformada con el plásmido pGZaL .

27, El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque la purificación de la proteína recornbinante se realiza mediante una cromatografía en columna por afinidad y el grupo funciona! de la matriz de i tercambio es Níquel.

28. El método según cualquiera de las reivindicaciones presentes, caracterizado porque la purificación de la proteína recornbinante mediante una cromatografía en columna por afinidad utiliza una solución de ímidazo! 250 mM, aH2P04 50 mM y NaCI 500 mM a pH 8.

Description:
PROCESO DE PRODUCCIÓN DE LAS PROTEINAS RECO B ES DE LAS PROTEÍ S DE LA LECH MATERNA PARA SU APLICACIÓN EN ALIMENTOS ESPECIAL! DOS

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención está relacionada con la industria biotecnológica y con la industria de la manufactura de alimentos especializados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCI

La leche mate na "Azúcares: Este término solo puede usarse para los monosacá idos (aldosas y cetosas) y los olígosacáridos inferiores (disacáridos (LM) representa la principal fuente de nutrimentos para los infantes y está constituida, entre otras cosas, por un conjunto de proteínas biológicamente activas que proporcionan una variedad de ventajas fisiológicas claves para los infantes. Las proteínas de la LM no sólo proporcionan energía y aminoácidos, sino que tienen un pape! fundamental en el desarrollo normal y la maduración de órganos específicos como la mucosa intestinal, facilitan la digestión y la incorporación de nutrimentos, modulan la función del sistema inmune y protegen a! infante contra la infección de microorganismos patógenos.

Por esta razón, la LM es considerada el estándar de oro de ía nutrición infantil temprana. Sin embargo, se ha reportado que una gran proporción de la población infantil mundial de 0 a 2 años de edad recibe una alimentación con algún tipo de fórmula infantil (Fl; O S, 2013). Es por ello que la OMS y la Asociación Americana de Pediatría reconocen que las Fl son un alimento alternativo adecuado cuando ¡as madres no pueden, tienen contraindicado o deciden no amamantar a sus

La LM madura proporciona de 7 a 8 g/L de proteína total (Lonnerdaí, 2003), presenta una relación de proteínas séricas:caseinas 80:40 (Koletzko y cois., 2005), su fracción de las caseínas está constituida por la b-caseína y la k-caseína (Lonnerdaí, 2010) y su fracción de las proteínas séricas es rica en proteínas como la lactoferrina (LF), las inmunoglobulinas de secreción IgA e ! g G , la lisozima C (LZC) y la α-lactoalbúmina (a-LA).

La lactoferrina o lactotransferrina es una glicoproteína de 892 aminoácidos (REFSEQ: AAN63998.1) y de a roximadamente 78 KDa, la cual está codificada por el gen LTF (REFSEQ: AY165048.1) en el humano.

Lónnerdal y colaboradores (2014) demostraron que la LF humana es una proteína globular resistente a las enzimas proteolíticas del tracto gastrointestinal que presenta una marcada actividad antimicrobiana y antivira! relacionada con su fuerte afinidad por el hierro, que está involucrada en la función del sistema inmunitario así como en la incorporación de! hierro por ¡as células del intestino y que además, regula directamente la expresión de citocinas como la IL-1 y de factores de crecimiento como el TGF-β (Lonnerda!, 2014). Por otro lado, las inmunoglobulinas de secreción igA e I g G son proteínas heterólogas que forman muftímeros con una masa molecular de aproximadamente 70 KDa, las cuales están presentes en concentraciones importantes en la LM. La inmunidad de la madre puede tran.síerirse al infante a través de las inmunoglobulinas de secreción antígeno-específ icas, lo cual previene la adherencia y la penetración de bacterias y de antígenos derivados de la dieta capaces de provocar una infiamación en ¡a mucosa intestinal (Lonnerdal, 2010),

La LZC (EC 3, 2, 1, 17) es una enzima con actividad peptidoglicano N-acetilmuramoil-hidrolasa que está codificada en el gen LYZ (REFSEQ: HM 000239.2) en el humano y que presenta una cadena de 130 aminoácidos (REFSEQ: NP_00G23G,1) con una masa molecular de aproximadamente 14,7 KDa. Se ha descrito que la LM tiene una concentración relativamente afta de LZC, la cual se conoce por su capacidad para degradar la pared celular externa de las bacterias Gram- negativas. Además, la LZC en conjunto con la LF es capaz de matar las bacterias Gram-positivas (Lonnerda!, 2010),

Por otra parte, la a~LA es una de las glicoproteínas más abundantes de la LM. En el humano, la a-LA está codificada en el gen LALBA (REFSEQ: NM m 002289,2) y su proteína madura consta de 123 aminoácidos (REFSEQ: NP__002280.1 ) con una masa molecular aproximada de 14 KDa. La estructura primaria de la a-LA presenta una composición de aminoácidos bien balanceada, tiene una alta proporción de aminoácidos esenciales (triptófano, Usina y cisteina) y es asimilada totalmente durante su paso a través del tracto gastrointestinal ya que no se ha detectado en las heces de los infantes alimentados al seno materno (Donovan y Lónnerdal, 1989). Por otro lado, se ha descrito que la digestión de la a-LA resulta en la producción de un conjunto de péptidos con una notable actividad antimicrobiana mediada por la estimulación de la actividad fagocítica de los macróíagos del peritoneo (Migliore- Samour y cois., 1992). Otros péptidos derivados de la a~LA presentan una actividad prebiótica debido a ia inducción del crecimiento de las bifidobacterias (Kee y cois., 1998). Además, la a-LA es una proteína de unión a calcio y también tiene la capacidad de unir hierro y zinc. Esta propiedad de la a-LA podría facilitar ia absorción del hierro y del zinc mejorando el estado nutricional del infante. En conjunto, estas evidencias demuestran claramente que las proteínas de ía LM poseen actividades biológicas que contribuyen a los beneficios a corto y a largo plazo de la lactancia exclusiva.

Por otro lado, la b-CSN es una proteína globular de 211 aminoácidos (REFSEQ: NP_001882.1) con una masa molecular de aproximadamente 23.85 KDa, ia cual está codificada en el gen CSN2 (REFSEQ: NM_001891.3) en el humano. La b-CSN es la caseína predominante de la LM y su molécula está altamente fosforilada (Uníprot KB). Los residuos fosforilados de serina y de treonina están localizados en ia región N- terminal de la proteína y son capaces de unir iones de calcio, de hierro y de zinc. Durante la digestión de la b~CSN, se liberan fosfopéptidos que mantienen soluble a los iones de calcio, de hierro y de zinc, lo que facilita su absorción (Lónnerdal, 2010). Por lo tanto, es probable que los fosfopéptidos de ia b-CSN contribuyan a ia alta b i od is pon ib i I id ad de estos iones metálicos a partir de la LM.

La k-CSN es una protelna altamente glícosilada de 162 aminoácidos (REFSEQ: NP_005203.2) con una masa molecular aproximada de 18.16 KDa, ia cual está codificada en el gen CSN3 (REFSEQ: NM_005212.2) en el humano. La k-CSN es la subunidad con la menor concentración en la fracción de las caseínas de la LM y se caracteriza porque su estructura primaria presenta una cantidad relativamente importante de residuos de ácido siálico cargado. Se ha demostrado que la fuertemente glicosiiada k-CSN inhibe la unión de Helicobacter pylori a la mucosa gástrica in vitro (Stromquist y cois., 1995), lo que podría explicar que la alimentación ai seno materno proporciona cierta protección contra H pylori. Asimismo, se ha descrito que la k~CSN previene la fijación de las bacterias a la mucosa epitelial actuando como un análogo de receptor. Durante la digestión de la k-CSN, se genera un péptido altamente glicosilado denominado glicomacropéptido (Lónnerdal, 2010). Probablemente, este gücomacropéptido actúe también como un análogo de receptor. Asimismo, se ha demostrado que este gllcomacropéptido potencia la absorción de zinc en monos rhesus infantes, debido tal vez a los residuos e Ϊ ác ido siálico con carga negativa que quelan el zinc (Lonne rdaL , 2010).

Por otro la do, las Fl estándí ares están hechas a base de los componente !S p p rincipales de i la leche de vaca y se ha demostrado que existen d iferencias significativas en la composición y I a concentrad ón de las proteínas totales entre la leche óí 5 va ca y la LM. La leche de vaca presenta una relación de p ro teínas séricas 5: caseínas de 20:80, su fracción de las prote íínas > séricas tiene una elevada concentración de la beta lactog lobu lina ( b - L G ) y una escasa concentración de la

LF, de las i nmunoglobulinas d le secreción, de la LZC y de la a-

LA (Farrell y c< ais., 2004). L ¡ a fracción de las caseínas de la leche de va ica € ístá compuest a de la a-caseína (a-CSN), de la b-caseína ( b-CS >N) y de ¡a k-c aseína (k-CSN). La a-CSN y la b-

L G son las prot eínas más abundantes de la leche de vaca, las cuales no s se p roducen en la L (Farrell y cois., 2004). Por otro lado, el g irado de simi litud entre la secuencia de ¡os aminoácido! s de las proteínas totales de la LM y de la leche de vaca, determinado mediante la herramienta de alineamiento BLAST (http://bsast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), es del 70% máximo. Las diferencias en la secuencia de los aminoácidos de las proteínas totaies de la leche de vaca con respecto a la LM disminuyen significativamente su bioactividad y alteran las respuestas medidas en ¡os estudios clínicos de los infantes alimentados con una F! en comparación con los infantes amamantados (King y cois., 2007; Manzoni y cois., 2009).

Por otro lado, el uso de la leche de vaca corno ¡a principal fuente de proteínas para la elaboración de las Fl estándares ha resultado en la necesidad de ajustar el contenido de la fracción de las proteínas séricas de las Fl mediante la adición de concentrados de suero de leche de vaca para obtener una relación proteínas séricas:caseínas similar al de la LM de aproximadamente 80:40 (Koletzko y cois., 2005). No obstante, la composición y la concentración de la fracción de las proteínas totales de las F! todavía presentan diferencias considerables en comparación con la LM. Las F! estándares tienen una mayor concentración de proteina total (de 14 a 15 g/L) debido a la escasa concentración de proteínas como la LF y la α-LA, las cuales presentan una composición de aminoácidos bien balanceada y proporcionan una cantidad adecuada de los aminoácidos esenciales triptófano, Usina y cisteína. Sin embargo, e! enriquecimiento de las Fl con concentrados de suero de leche de vaca y su elevada concentración de la proteína total resulta en una mayor concentración de la a-CSN y de la b-LG de bovino, las cuales están identificadas como los principales factores de riesgo en el desarrollo de reacciones alérgicas en ios infantes (Heine y cois., 1991). Además, el mayor consumo de proteína total en los infantes alimentados con una H estándar se manifiesta por una concentración significativamente mayor de aminoácidos en plasma y de nitrógeno ureico en sangre en comparación con los infantes alimentados con LM (Koletzko y cois., 2009). Este hecho ha sido considerado como una fuente de estrés metabólico sobre ios tejidos como el hígado y los riñones de ios infantes en pleno desarrollo (Lonnerdal, 2014). Tal vez, es más preocupante el aumento significativo de la concentración de la insulina del suero sanguíneo en los infantes alimentados con una F 1 estándar comparados con ios infantes amamantados, causado probablemente por la alta concentración de los aminoácidos insuünogénicos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina (Davis y cois., 2008).

Más aún, se ha reportado que la b-CSN contenida en la leche de vaca existe como una serie de variantes genéticas que presentan diferencias puntuales en su secuencia de aminoácidos (Formaggioni y cois., 1999). Las variantes más frecuentes en la leche de vaca de la mayoría del ganado bovino lechero en todo el mundo son la b-CSN A1 y A 2, ! a cuales difieren por una sustitución del aminoácido histidina en la posición 67 de la b-CSN A1 por una proüna en la misma posición de la b-CSN A2. Esta sustitución provoca que la digestión de la b-CSN A1 , y no de la b~CSN humana ni de la b- CSN A2 de bovino, resulte en la producción de un conjunto de péptidos con una marcada actividad opiácea. E! péptido opioide que comúnmente se forma durante la digestión de la b- CSN A1 es la beta casomorfina 7, el cual ha sido identificado como un factor de riesgo en eí desarrollo de enfermedades relacionadas con el síndrome metabólico como la obesidad, la diabetes rnelütus tipo I y algunas enfermedades cardiovasculares (Kaminski y cois,, 2007). Las deficiencias de las F! estándares descritas arriba tienen un fuerte impacto en ia salud y representan una clara desventaja nutricionai en los infantes alimentados con una Fi.

En estudios clínicos recientes, se ha demostrado que ios infantes amamantados tienen una menor incidencia de infecciones bacterianas y virales, principalmente gastrointestinales y respiratorias, mantienen un mejor nivel de hierro en el suero sanguíneo y presentan un mayor crecimiento con un mejor estado nutricionai en comparación con ios infantes alimentados con una Fi estándar. Actualmente, las evidencias sugieren consistentemente que los beneficios de la LM están relacionados con el excelente balance de sus componentes y con las propiedades biológicas de sus proteínas séricas (Lonnerdaí, 2014; Vandenplas y cois., 2014). Por otro lado, en varios estudios clínicos, se ha reportado que los infantes alimentados con una FI enriquecida con la LF bovina o con la α-LA bovina tienden a ganar mayor peso manteniendo un nivel nutricionai balanceado, tienen una menor incidencia de infecciones respiratorias y presentan un mayor nivei de ferritina plasmática y de hematocrito (nivel de hierro en suero) en comparación con los infantes alimentados con una F! estándar (Davis y cois., 2008: Egashira y cois., 2007; Klng y cois., 2007; Koíetzko y cois., 2009; Trabulsi y cois., 2011). Sin embargo, los parámetros medidos en estos estudios clínicos siguen siendo diferentes de los que se observan en el grupo control de ios infantes alimentados al seno materno (Trabulsi y cois., 2011). Además, también se ha descrito que la adición de la LF bovina en las Fl estándares mejora la flora intestinal de los infantes, protegiéndolos contra los cuadros severos de la diarrea infecciosa.

Aunque estas evidencias sustentan el enriquecimiento de las Fl estándares con fracciones puras de las proteínas séricas de la leche de vaca, actualmente no ha sido posible reproducir la concentración de las proteínas séricas de la L con sus homologas de la leche de vaca en las Fl estándares. La principal fuente de las proteínas séricas de bovino para la elaboración de las Fl es el suero de la leche de vaca, el cual es un producto derivado de la manufactura de los quesos (Agropur !nc, 2015). Existen diferentes técnicas para separar la fracción de las proteínas séricas de interés a partir de los concentrados de proteína del suero, de los aislados de proteína del suero, de ios hidrolizados del suero, del suero líquido o incluso de la leche entera (Kamau y cois., 2010).

Hoy en día, las técnicas disponibles para purificar las proteínas séricas de la leche de vaca incluyen la cromatografía en gel, de intercambio iónico, por hidrofobicidad y de adsorción, ia filtración en membrana, la hidrólisis enzimática y la precipitación o agregación (Heine y cois., 1991). Las técnicas de separación mediante cromatografía son eficientes cuando se necesita obtener una fracción de las proteínas séricas de la leche de vaca considerablemente pura. Sin embargo, estas fracciones se utilizan solamente para los ensayos y ¡os procesos a nivel de laboratorio por la baja cantidad de materia! que se produce mediante la cromatog rafia .

En contraste, ia producción industrial de Fi requiere grandes cantidades de concentrados de suero de ieche de vaca (Lónnerdal, 2014), e! cual estará inevitablemente contaminado con otras proteínas que necesitarán un tratamiento adícionai. Por ejemplo, la precipitación de las proteínas del suero de la leche seguida de una filtración en membrana, permiten la producción de un gran volumen de a-LA junto con la b-LG como contaminante. Luego, mediante un tratamiento térmico, una digestión enzimática con tripsina o con pepsina porcina y una filtración en membrana, es posible retirar la b-LG contaminante. Así es como se obtiene una fracción relativamente pura de la a-LA bovina para las aplicaciones en la industria alimentaria y farmacéutica (Kamau y cois., 2010). Por otro lado, la metodología para la purificación de la LF de bovino, a partir de ¡a leche descremada o de! suero de la leche de vaca, consiste en la microfiltración, la cromatografía de intercambio catiónico y la ultrafiitración. Luego de un tratamiento térmico a baja temperatura, la LF de bovino es liofilizada para hacer un polvo. A causa de ía escasa concentración de la LF en la leche de vaca y de algunas desventajas del proceso para su purificación, esta proteína es una materia prima excesivamente cara con una baja b i o d i s p o n i b i l¡ d a d (Tomita y cois., 2008). Con todo esto, las fracciones puras de las proteínas séricas de la leche de vaca, como la a-LA de bovino, están contaminadas con una concentración importante de b-LG (Agropur Inc, 2015). Además, el tratamiento térmico durante el proceso de extracción de las fracciones puras de las proteínas séricas de la leche de vaca y en la elaboración de las Fl afecta la digestibíiidad de las proteínas séricas de la leche de vaca, lo cual disminuye considerablemente la bioactividad de las proteínas séricas de bovino (Lónnerdal, 2014). Si las proteínas séricas de la leche de vaca son altamente susceptibles a la proteólisis enzimática del tracto gastrointestinal superior, estómago y duodeno, no podrán ejercer sus efectos fisiológicos en ía parte dístal del intestino delgado, yeyuno e íleo (Lónnerdal, 2014).

Debido a las desventajas y a los efectos adversos que actualmente ocurren con el uso de las Fl estándares para la alimentación infantil, a la baja actividad biológica que presentan las proteínas de la leche de vaca inherente a su secuencia de aminoácidos y a las limitaciones para obtener fracciones puras de las proteínas séricas de la leche de vaca, desde hace 10 años, varios grupos de investigación alrededor del mundo están trabajando en eí desarrollo de diferentes sistemas de expresión que les permita obtener las variantes recombinantes de las proteínas de la LM (Lonnerdal, 2006); por ejemplo, en la leche de vacas transgén icas , en microorganismos como bacterias y levaduras así como en los granos de algunas plantas, como el arroz. Sin embargo, debido a la complejidad y a los problemas relacionados con ios sistemas de expresión en el estado del arte, como (i) la alergia a las proteínas de la leche de vaca, (ii) e! costo elevado de la producción de las proteínas recombinantes y (iii) los asuntos de seguridad e inocuidad alimentaria, el uso de estas proteínas recombinantes se ha limitado a las a licaciones a nivel laboratorio (Sigma Aldrich),

I. ESTADO DEL ARTE

En todo ei mundo, existe el consenso de que la alimentación exclusiva al seno materno proporciona una serie de beneficios fisiológicos inigualables para los infantes. Los infantes alimentados con LM presentan una menor ocurrencia de infecciones por patógenos y cuando se enferman, su recuperación es más rápida en comparación con los infantes alimentados con una Fl (Revisado en Lonnerdal, 2014). La menor prevalencia de las infecciones por patógenos en ios infantes alimentados con LM probablemente esté relacionada con varios componentes de la LM pero muchos de éstos son las proteínas de la leche que poseen propiedades a ntim icrob ia ñas (Lónnerdal y Lyer, 1995), Los infantes alimentados con LM también presentan un patrón de desarrollo diferente y un mejor estado nutricional (Davis y cois., 2008) así como una composición diferente de la microfíora intestinal (Lónnerdal, 2014) en comparación con ios infantes alimentados con una Fl. Asimismo, se ha descrito que la alta biodisponibilidad de los nutrimentos de !a LM se debe, en parte, a sus proteínas, las cuales facilitan la incorporación de ios nutrimentos (Sato y cois., 1986). A pesar de que se han incorporado diferentes modificaciones en la composición de las F! estándares para asemejarla a ia de la LM, por ejemplo, adicionando aceites vegetales, ácidos grasos de cadena larga, concentrados de suero de leche de vaca, oíigosacáridos, minerales y vitaminas, el desempeño de . los infantes alimentados con una Fl es significativamente diferente en comparación con los infantes alimentados con L (Lónnerdal, 2006). En años recientes, se ha reportado que las proteínas de la LM presentan una serie de actividades biológicas que están relacionadas con los beneficios de la lactancia materna exclusiva y aún no ha sido posible rnímetizar la composición de la fracción de las proteínas de la LM en las Fl estándares ya que estas proteínas son específicas de nuestra especie (Lónnerdal, 2006). Entre las proteínas de la LM que han demostrado consistentemente una marcada actividad biológica están la LF, la !gA e IgG, la LZC, la a- LA, la b-CSN y la k- CSN. Aunque ios concentrados de las proteínas del suero de ía leche de vaca están disponibles comercia ímente y han sido incorporados en las Fl, no hay evidencias clínicas que demuestren la correlación de alguna actividad biológica de estas proteínas de bovino, probablemente porque presentan diferencias estructurales significativas en comparación con las proteínas de la LM. Esto es importante ya que algunas proteínas de la LM, como la LF, tienen receptores específicos en el intestino delgado que sólo reconocen ía proteína específica de nuestra especie (Liao y cois., 2012).

Por medio de la biotecnología, las proteínas de la LM pueden producirse en microorganismos, en plantas y en la leche de ganado bovino transgénsco (Krimpenfort, 1993). De esta forma, las proteínas recombinantes de las proteínas de la LM pueden producirse en cantidades suficientes para utilizarlas en la elaboración de alimentos especializados. Sin embargo, para lograr esto, es necesario evaluar la bioactividad de las proteínas recombinantes, demostrar su seguridad para el consumo humano y considerar la opinión del consumidor sobre los productos recombinantes. a. Sistemas de expresión de las proteínas recombinantes de las proteínas de la leche materna.

Producción de ¡as proteínas de ¡a leche matera recombinantes en microorganismos En las últimas dos décadas, se han utilizado las levaduras Saccharomyces cerevisae y Aspergiilus niger como sistemas de expresión para la producción de las proteínas de la leche materna recombinantes. La LF y la a-LA humanas recombinantes se ha expresado en Saccharomyces cerevisae pero no están disponibles comercialmente debido a los bajos niveles de expresión en la levadura (Revisado en Lonnerdal, 2008), Por otro lado, Aspergiilus niger ha sido utilizada exitosamente para la producción de la LF humana recombinante, la cual está disponible comercialmente para aplicaciones a nivel laboratorio (Revisado en Lonnerdal, 2006). Esta levadura presenta un elevado nivel de producción de la LF humana recombinante, lo que la convierte en un sistema de expresión atractivo. Además, la caracterización de la LF humana recombinante producida en Aspergiilus ha permitido establecer que su secuencia de aminoácidos y sus modificaciones postrad uccionales son similares a las de la proteína nativa.

Asimismo, se ha demostrado que la LF humana recombinante producida en Aspergiilus se une con la misma afinidad ai receptor para lactoferrina expresado en las células epiteliales del intestino delgado en comparación con la protefna nativa (Revisado en Lonnerdal, 2006) Sin embargo, hoy en día se continúa trabajando en el desarrollo de ios métodos de extracción y de purificación de la protefna recombinante para 37

lograr un beneficio económico que permita utilizaría como materia prima en la industria alimentaria.

Por otro Sado, la aplicación US Patent no. 6,423,508 B1 describe un método para producir una cepa de la levadura Pichia pastoris resistente a la actividad antimicrobiana de la lactoferrina de cualquier mamífero así como para producir ¡a proteína recombinante de la lactoferrina de cualquier mamífero en dicha cepa de la levadura Pichia pastoris. En esta aplicación, los inventores reclaman e! uso del método para producir la lactoferrina recombinante de cualquier mamífero en la cepa de la levadura Pichia pastoris resistente a la lactoferrina, denominada KCTC0500BP. Sin embargo, los autores no presentan evidencia de que Sa levadura Pichia pastoris KCTC0500BP transformada con el vector que contiene el gen LTF de humano tenga la capacidad de producir la proteína recombinante de la lactoferrina humana. Tampoco presentan evidencias de la forma en la que la proteína recombinante de ia lactoferrina se produce en la levadura Pichia pastoris KCTC05Q0BP, es decir, sí es intracelular o se secreta al medio de cultivo de la levadura. Además, en dicha invención, no se describen las condiciones de crecimiento óptimas de la levadura Pichia pastoris KCTC0500BP transformada para obtener el mejor rendimiento de la producción de la lactoferrina humana recombinante. Por otro lado, la invención con el número US Paíent 5,942,274 describe un método para la producción de las proteínas recombinantes de la a-LA y de la b~CSN de humano en la bacteria Escherichia coli y en la levadura Saccharomyces cerevisiae así como un proceso para la elaboración de una fórmula infantil que contiene una mezcla selecta de micro y macronutrimeníos junto con las proteínas recombinantes mencionadas arriba. Sin embargo, en el Ejemplo 2 de dicha invención se menciona que: "el plásmido utilizado para ía transformación de S. cerevisiae contiene una región que permite su replicación extracromosoma! autónoma ... así como una región de origen bacteriano que dirige la expresión de las proteínas recombinantes". Esto indica claramente que la transformación de la levadura S. cerevisiae con el plásmido que contiene los genes nativos de la a~LA y de la b-CSN humanos es transitoria y que el mecanismo de regulación de la expresión de ¡as proteínas recombinantes mencionadas en dicha invención son diferentes de los mecanismos nativos de la levadura. Esto conlleva el riesgo de que la levadura pierda e! genotipo en las siguientes generaciones.

Producción de las proteínas de la leche materna recombinantes en la ¡eche de ganado lechero transgénico

Algunas de las primeras aplicaciones comerciales de ias proteínas recombinantes se lograron después de su producción en la leche de ciertos animales. Los biofarmacéuticos, como Sos factores de coagulación VIH y IX, fueron expresados en la leche de ovejas y de cabras en un principio. La LF y la a-LA humanas recombinantes, las dos principales proteínas de la LM, se producen en la leche de vacas transgénicas (van Berkel y cois., 2002; Wang y cois., 2008) y están disponibles comerciaimente. Sin embargo, ninguna de las dos ha podido utilizarse como aditivo en la elaboración de alimentos especializados ni de las Fl. Una posible aplicación es utilizar la leche de las vacas transgénicas que contiene la LF y la a- LA humanas recombinantes pero aún no ha sido posible debido en parte a la logística, el transporte y el almacenamiento, así como ai costo del mantenimiento de los animales transgénicos. Otro factor importante que ha limitado el uso de la leche de las vacas transgénicas es la fuerte regulación legal para los organismos genéticamente modificados. Por otro lado, la Sisozima humana recombinante se ha producido en la leche de ratones (Revisado en Lónnerdal, 2006) y recientemente, en la leche de vaca (Maga y cois., comunicado persona!). Sin embargo, aún no se tienen aplicaciones comerciales para esta proteína.

Producción de ¡as proteínas de la leche materna recombinantes en plantas.

Los científicos botánicos han logrado expresar exitosamente varías proteínas recombinantes en diferentes cultivos agrícolas. Utilizando promotores constitutivos, es posible lograr un alto nivel de expresión de las proteínas recombinantes en las plantas. Asimismo, es posible dirigir ía expresión de las proteínas recombinantes de tai manera que se pueden utilizar partes específicas de la planta. Las frutas (plátanos), las semillas (arroz y cebada), las hojas (tabaco) y ios tubérculos (papas) se utilizan para ía producción de las proteínas recombinantes.

La LF humana recombinante ha sido producida en la planta de tabaco (Salmón y cois., 1998). Sin embargo, los niveles de expresión son bajos y la proteína recombinante requiere un proceso exhaustivo de extracción y de purificación antes de considerar la posibilidad de utilizarla en la industria alimentaria o farmacéutica. No se han reportado evidencias de su actividad biológica y no está disponible comercia Imente. La LF humana recombinante también se ha producido en papas (Chong y Langrídge, 2000) aunque ios niveles de expresión son bajos. Este sistema es atractivo ya que las papas forman parte de la dieta normal de las personas.

El arroz se ha utilizado consistentemente para ía producción de ía ferritina de soya para incrementar su contenido endógeno de hierro (Goto y cois., 1999) y actualmente, se utiliza para la expresión de varias proteínas de la LM como la LF, la LZC y la a1 - antitripsina (Huang y cois., 2002: Suzuki y cois., 2003). Esta semilla presenta un elevado nivel de expresión de las proteínas recombinantes de las proteínas de la LM; por ejemplo, se han obtenido 5 g de LF humana recombinante/Kg de arroz en pruebas de campo a gran escala durante varias generaciones (Lónnerdal, 2008). El arroz presenta varias ventajas como sistema de expresión, por ejemplo, el arroz no contiene compuestos tóxicos (las papas producen la sotaní na), el arroz es uno de los primeros alimentos no lácteos introducido en la dieta de los infantes debido a su baja alergenicidad y la expresión de las proteínas recombinantes es dirigida para que se produzca como una proteína de almacenamiento y se mantenga en la semilla (Lónnerdal, 2008). Por otro lado, ía caracterización de la LF humana recombinante producida en arroz ha permitido establecer que su secuencia de aminoácidos y sus modificaciones postraduccionales son similares a las de la proteína nativa. Asimismo, se ha demostrado que la LF humana recombinante producida en arroz se une con la misma afinidad al receptor para iactoferrina expresado en las células epiteliales del intestino delgado en comparación con la proteína nativa (Suzuki y cois., 2003).

Los detalles dei estado del arte que se menciona arriba, se describen en la aplicación número US Patent 20031007400A1. En dicha invención, los autores reclaman el uso de un método para la producción de las proteínas recombinantes de la LF y de la LZC humanas en los granos de una planta transgénica de arroz. Los inventores reclaman también la aplicación de este método para la producción de cualquiera de las proteínas recombinanles de las proteínas de ¡a LM. Asimismo, dicha invención contempla e! uso de los granos de arroz transgénico, que contienen las proteínas recombinantes de la LF o de la LZC humanas, para la preparación de composiciones nutrimentales, particularmente para la preparación de fórmulas infantiles. Sin embargo, esta invención presenta una seria desventaja porque para cada protefna recombinante se requiere la generación de plántulas transgénicas independientes que deberán ser sembradas en parcelas con condiciones de cultivo controladas para evitar la contaminación de los cultivos silvestres adyacentes. Por otro lado, la composición de dicha Invención, el grano de arroz, se espera que sea adicionado como ingrediente funcional en las fórmulas infantiles, lo cual representa un riesgo para ios infantes con alergia a la composición del arroz.

Por esta razón, \a presente invención proporciona un método de alto rendimiento para producir las proteínas recombinantes de las proteínas de la LM de mayor interés nuíricionai en una escala industrial, las cuales incluyen pero no están limitadas a la iactoferrina, las inmunoglobulinas de secreción IgA e IgG, la beta caseína, la kappa caseína, la alfa lactoaibúmina y la iisozima C.

La presente invención involucra el uso de la levadura Pichia pastoris como un sistema de expresión eucariote de las proteínas recombinantes de interés. Pichia pastoris es un microorganismo que tiene la ventaja de realizar el correcto ensamblaje y plegamiento de las proteínas así como sus modificaciones postraduccionales. Más aún, Pichia pastoris ha sido utilizada comúnmente para !a expresión y la caracterización de una gran variedad de proteínas funcionales del proteoma humano y está catalogada como GRAS ante la FDA (GRAS: generalmente reconocida como segura, por sus siglas en inglés; Ahmad y cois., 2014). La presente invención incluye: (i) la clonación de una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica las proteínas recornbinantes de interés en un vector de ADN heterólogo, el cual contiene los genes "auxiliares" y los elementos de la regulación de la transcripción suficientes para seleccionar las cepas de la levadura Pichia pastoris transformada, para facilitar la transformación estable de la levadura Pichia pastoris y para permitir la expresión constitutiva y la secreción de las proteínas recornbinantes de interés, (ii) la transformación de ia levadura Pichia pastoris con el vector de ADN heterólogo descrito arriba, (iii) el cultivo de la levadura Pichia pastoris transformada en un medio líquido selectivo que favorezca la producción eficiente de las proteínas recornbinantes y (iv) la purificación específica de las proteínas recornbinantes de interés a partir del medio de cultivo de la levadura Pichia pastoris transformada.

La presente invención se diferencia de las composiciones en e! estado del arte porque utiliza un vector de ADN heterólogo que contiene un conjunto de elementos de transcripción que facilita la reproducción selectiva del sistema de expresión eucariote descrito en este documento y permite la secreción de la proteina recombinante al medio de cultivo de dicho sistema de expresión. Esta característica representa una ventaja importante con respecto a ¡as composiciones en el estado del arte ya que la secreción de las proteínas recombinantes a! medio de cultivo de! sistema de expresión disminuirá significativamente los costos de producción reíacionados con la extracción y la purificación de las proteínas recombinantes. Otro elemento de diferenciación de la presente invención es la optimización de ia composición de la secuencia de nucleótidos que codifica a cada una de las proteínas recombinantes de las proteínas de la LM, la cual está diseñada para mejorar su nivel de expresión en el sistema de expresión eucariote descrito en este documento y resulta en la producción de la proteína recombinante con las mismas características fisicoquímicas y funcionales en comparación con la proteina nativa correspondiente de la LM.

La práctica de la presente invención permitirá producir las proteínas recombinantes de las proteínas de la LM a nivel industrial, las cuales serán utilizadas en la elaboración de alimentos especializados para mejorar sustancialmente su composición nutrimental. Esta tecnología contribuirá al desarrollo de alimentos especializados con un perfil proteínico con alto valor agregado, que se verá reflejado en un mejor estado nutriciona! y metabólico así como en una mayor toierabilidad por parte de! consumidor.

OBJETIVO DE LA !NVE

En base a ¡os antecedentes, la presente invención tiene como objetivo proporcionar un método para la producción en masa de las proteínas recombinantes de las proteínas de la leche materna, las cuales conserven sus ca acterísticas nativas y puedan utilizarse en la manufactura de alimentos especializados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Construcción del plásmido pGZaLM. El plásmido contiene todos los elementos necesarios para su propagación en ¡a bacteria E. coli con el genotipo F- mcrA Δ (mrr-hsd RMS- mcrBC) SOiacZAM 15 Δ íacX74 recA1 araD139 Δ (araleu) 7897 galU gal rpsL (StrR) endA1 nupG y la producción de las proteínas recombinantes de las proteínas de la LM en la levadura Pichia pastoris X-33.

Figura 2. Análisis del plásmido pGZaL en un gel de agarosa a! 1% extraído a partir de la bacteria E. coli transformada y ¡inealizado con la enzima de restricción Bsp H1.

Figura 3. Ilustración de las colonias de E, coli transformadas con e! plásmido pGZaLM!. A. Cultivo de E coli transformada en agar LB bajo en sales adicionado con zeocina 5Gpg/mL para seleccionar las bacterias transformadas con el plásmido pGZaLM, el cual confiere la resistencia a la zeocina. B y C. Pruebas típicas para confirmar ia identidad de la bacteria E coli, utilizando los medios E B y MacConkey respectivamente. Figura 4. Representación ilustrativa de la levadura Pichia pastoris X-33 transformada con el plásmido pGZaLM. A. Medio de cultivo YPD con zeocina 100 pg/rnL para eí crecimiento selectivo de la levadura Pichia Pastoris X-33 transformada con el plásmido pGZaLM.

Figura 5. Análisis de la a-LA humana recombinante en un gel de poliacrilamida al 12% en condiciones desnaturalizantes y red u ct o ra s .

EVE DESCRIPCIÓN DEL I N VE NT ¡

La presente invención trata de un método de alto rendimiento para ¡a producción de las proteínas recombinantes de las proteínas de la LM en la levadura Pichia pastoris X~33, las cuales mantienen sus características fisicoquímicas y funcionales nativas y se obtienen en fracciones esencialmente puras. Las proteínas recombinantes producidas por ¡a práctica de la presente invención incluyen a la lactoferrina , las inmunogíobulinas de secreción IgA e IgG, la beta caseína, la kappa caseína, la alfa lactoaíbumina y la íisozima, las cuales pueden aplicarse en la fabricación de alimentos especializados con un alto valor agregado.

El método objeto de la presente invención consiste en la transformación de la levadura Pichia pastoris X-33 con un vector específico de ADN de doble cadena heterólogo que contiene una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica a cada una de las proteínas de la LM recombinantes junto con un conjunto de genes "auxiliares" y de elementos de la regulación de la transcripción, los cuales permiten que la levadura produzca de manera constitutiva y secrete las proteínas de la LM recombinantes en condiciones de crecimiento estándares en un medio de cultivo líquido selectivo.

La presente invención está relacionada también con la construcción de un vector de ADN heterólogo de doble cadena con la capacidad de regular la transcripción de una secuencia de ácidos nucleicos optimizada que codifica las proteínas recomb nantes de las proteínas de la leche materna. En su modalidad preferida, el vector de ADN heterólogo de doble cadena es un plásmido pGZaLM que contiene un gen de resistencia a un antibiótico especifico así como un conjunto de secuencias de nucleótidos codificantes y de elementos de la regulación de la replicación y de la transcripción necesarios para su propagación en un huésped procariote así como para la expresión de las proteínas recombinantes en el huésped eucariote. En su modalidad preferida, e! huésped procariote es ¡a bacteria Escherichia coli (E. coli) con el genotipo F- mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) |>S0iacZAM15 Δ lacX74 recA1 araD139 Δ (araleu) 7897 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG y el huésped eucariote es la levadura Pichia pastoris.

En otro aspecto, el método de la presente invención incluye Sa generación de una cepa u !tracom pétente de la bacteria E. coli con el genotipo F- mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80 iacZAM 15 Δ lacX74 recA1 araD139 Δ (araleu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG, la cual tiene la capacidad de amplificar el plásmido específico pGZaLM, La cepa de E. coli utilizada en la presente invención es particularmente compatible con el gen de resistencia al antibiótico del plásmido pGZaLM, lo cual es fundamental para seleccionar específicamente a las células transformadas con dicho plásmido.

La presente invención incluye asimismo la generación de una cepa de la levadura Pichia pastoris X-33 transformada con el plásmido pGZaLM, con ía capacidad de expresar y de secretar ai medio de cultivo las proteínas reco m b i na ntes de las proteínas de la LM. Es de relevancia para la presente invención que el plásmido pGZaLM contiene una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica a cada una de las proteínas de la LM recombinantes, lo cual resulta en un uso eficiente de ios codones de dicha secuencia codificante y promueve un mayor nivel de expresión de las proteínas recombinantes de interés en la levadura Pichia pastoris X-33. Las características de las secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican a cada una de las proteínas recombinantes de las proteínas de la LM se describen en la siguiente sección.

En otro aspecto, la presente invención está relacionada con el método para el cultivo de la levadura Pichia pastoris X-33 transformada con e! plásmido pGZaLM y para la producción eficiente de las proteínas de ia LM recombinantes. En la práctica de la presente invención, las levaduras de Pichia pastoris X~33 transformadas con el plásmido pGZaLM son cultivadas en condiciones de crecimiento estándares en un medio líquido selectivo LB bajo en sales, lo cual permite ia reproducción exclusiva de las células transformadas con el plásmido pGZaLM sin la necesidad de condiciones ambientales ni de agregar nutrimentos especiales para ia producción de las proteínas recombinantes.

Asimismo, la presente invención involucra un método para ia purificación específica de las proteínas recombinantes de las proteínas de la LM expresadas por las levaduras transformadas de Pichia pastoris X-33 y secretadas ai medio de cultivo. La composición del plásmido utilizado en la presente invención incluye una región codificante de un poíipéptido de seis residuos de histidina, lo cual resulta en la expresión de las proteínas de la LM como proteínas de fusión acopladas a una "cola" de polihistídinas. Este polipéptido de histidinas facilita la purificación de las proteínas de ia LM recombinantes mediante una cromatografía por afinidad. Por lo tanto, la presente invención proporciona las proteínas recombinantes de las proteínas de la LM en una forma sustanciaimente pura. Para mejorar la comprensión del invento, se realizará una descripción detallada de alguna de ¡as modalidades del mismo, la cual se muestra en los ejemplos que con fines ilustrativos más no limitativos se anexan a la presente descripción.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA IN ENCIÓN

La presente invención involucra el uso de la levadura Pichia pastoris corno un sistema de expresión eucariote de las proteínas recornbinantes de interés. Pichia pastoris es un microorganismo que tiene la ventaja de realizar el correcto ensamblaje y plegamiento de las proteínas asi como sus modificaciones postrad uccionales. Esto representa una ventaja con respecto a las composiciones en e! estado del arte ya que Pichia pastoris ha sido utilizada comúnmente para la expresión y la caracterización de una gran variedad de proteínas funcionales del proteoma humano y está catalogada como GRAS ante la FDA (GRAS: generalmente reconocida como segura, por sus siglas en inglés; Ahmad y cois,, 2014). Además, las proteínas recornbinantes producidas en este sistema no requieren de ningún tratamiento para inducir su correcto plegamiento y sus modificaciones postraduccionales son comparables con las de las proteínas nativas.

Asimismo, la presente invención se diferencia de las composiciones en el estado del arte porque utiliza el plásmido pGZaL que contiene un conjunto de elementos de transcripción que facilita la reproducción selectiva de la levadura Pichia pastoris X-33 descrita en este documento y que permite la secreción de la proteína recombinante al medio de cultivo de dicho sistema de expresión. Esta característica representa una ventaja importante con respecto a las composiciones en el estado del arte ya que la secreción de las proteínas recombinantes al medio de cultivo del sistema de expresión disminuirá significativamente los costos de producción relacionados con la extracción y a purificación de las proteínas recombinantes. Otro elemento de diferenciación de la presente invención es la optimización de la composición de ia secuencia de nucieótidos que codifica a cada una de las proteínas recombinantes de las proteínas de la LM, la cual está diseñada para mejorar su nivel de expresión en la levadura Pichia pastoris X-33 descrita en este documento y resulta en la producción de la proteína recombinante con las mismas características fisicoquímicas y funcionales en comparación con la proteina nativa correspondiente de la LM.

Además, la presente invención proporciona un método de purificación de las proteínas de la LM recombinantes altamente eficiente y económicamente viable, lo cua! representa otra ventaja con respecto de las composiciones descritas en e! estado del arte porque se facilita la obtención de una fracción sustancialmente pura de las proteínas recombinantes. Esta característica es muy significativa ya que es posible superar las deficiencias y los efectos adversos relacionados con las proteínas contaminantes de las fracciones de las proteínas de la leche de vaca que actualmente se utilizan en. la elaboración de los alimentos especializados. I. PROCESO DE PRODUCCIÓN DE LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE LAS PROTEÍNAS DE LA LECHE MATERNA EN UN SISTEMA DE EXPRESIÓN EUCARIOTE

La presente invención en su modalidad más amplia consiste en un método de alto rendimiento para la producción de las proteínas recom b i n a ntes de las proteínas de la LM en la levadura Pichia pastoris X-33. Esto se realiza mediante ia transformación de la levadura Pichia pastoris X-33 con un plásmido que contiene ia secuencia de nucleótidos optimizada que codifica a cada una de las proteínas de la LM, las cuales incluyen a la LF, a la IgA y a la IgG de secreción, a la fo-CSN, a la k-CSN, a la a-LA y a la LZC. Dicho plásmido contiene también los elementos de regulación de la transcri ción suficientes para que la levadura produzca las proteínas recombinantes de interés en condiciones estándares de crecimiento en un medio de cultivo líquido selectivo. Las proteínas de la LM recombinantes se extraen y se purifican de manera específica a partir del medio de cultivo de la levadura mediante una cromatografía en columna por afinidad.

Para ia expresión de las proteínas de la LM recombinantes, se construyó el plásmido pGZaLM que contiene una secuencia de nucleótidos específica y optimizada que codifica a cada una de las proteínas de la LM. Es de relevancia mencionar que la optimización de la secuencia de nucleótidos que codifica a cada una de las proteínas de la LM recombinantes se refiere a una mejora en la composición de la secuencia de ios nucleótidos que permite el uso eficiente de los codones en la levadura Pichia pastoris, lo que resulta en un nivel de expresión elevado y estable de las proteínas recombinantes de interés.

La denominada "preferencia principal por codones" se basa en e! hecho de que existen codones de "preferencia" a través de los genes en un genoma determinado y éstos están correlacionados con los aminoacií-ARNs de transferencia (ARNt) presentes en la célula. Debido a que los codones individuales se transcriben en proporciones diferentes y que el factor limitante en la transcripción es aparentemente el tiempo de espera por el am inoacii-ARNt apropiado, entonces es necesario que la secuencia de nucleótidos codificante utilice los codones que correspondan a los aminoacíl-ARNt más comunes en la célula para maxirnízar la velocidad de la traducción de una proteína. Para ejemplificar este aspecto, se describirán las características de la secuencia de nucleótidos optimizada del gen LTF, la cual codifica a la LF humana. La secuencia del ARN mensajero (ARNm) nativo del gen LTF de humano que abarca de los nucleótidos 70 a 2145 del REFSEQ: AY165046.1 presenta un contenido promedio de GC del 53%, lo que resulta en un índice de adaptación de codones (IAC) de 0.42. Aquellos genes altamente adaptados con un uso de codones idéntico al preferido por el organismo utilizado como sistema de expresión presentan en un IAC de 1 mientras que !os genes con un uso de codones diferente al preferido por e! organismo en cuestión resultarán en un valor cercano a cero. Por esta razón, la síntesis de la secuencia de nucleotidos que codifica a la LF humana recombinante está basada en ía secuencia del ARNm mencionada arriba pero se le aplicaron una serie de mod ficaciones para eliminar en la medida de lo posible algunos sitios cis-actuantes, como los sitios de splicing, y el contenido de GC promedio fue ajustado a un 41% para prolongar la vida media del ARNm. Asimismo, el uso de los codones fue adaptado para ¡as condiciones de la levadura Pichia pastoris, el cual resulto en un IAC de 0.96. La secuencia de nucleotidos optimizada debe permitir un nivel de expresión elevado y estable de la LF humana recombinante, la cual presenta las mismas características fisicoquímicas y funcionales con respecto de la proteína nativa. Este proceso se realizó con cada una de las secuencias de nucleotidos codificantes de las proteínas de la LM recombinantes.

El piásmído pGZaLIVI está compuesto de la secuencia de nucleotidos codificante optimizada que se menciona arriba fusionada "en marco" a una región promotora GAP del plásmido, la cual permite la expresión constitutiva y estable de ¡as proteínas recombinantes en la levadura Pichia pastoris X- 33. Asimismo, la secuencia de nucleotidos codificante optimizada que se menciona arriba está flanqueada "en marco" por una región codificante del factor de secreción a, el cual permite secretar la proteína ai medio de cultivo de la levadura. Además, el plásmido contiene una región que codifica un motivo de polihistidinas que permite la purificación específica de la proteína recombinante. Asimismo, esle plásmido contiene una región de terminación de ia transcripción (AOX1) que incrementa ia estabilidad de la proteína recombinante. Por otro lado, el plásmido utilizado en el presente método contiene un gen de resistencia a zeocina con sus regiones reguiadoras específicas para el huésped procariote y el huésped eucariote. Este gen permite seleccionar sólo las células que han sido transformadas con el plásmido. Finalmente, el plásmido contiene una región de origen de replicación , la cual le permite autorepl carse en e! huésped procariote.

Luego de la construcción de! plásmido pGZaL , se seleccionó la cepa de la bacteria Escherichia coli que se utilizó como huésped para la amplificación natural de! plásmido así como la cepa de la levadura Pichia pastoris que se usó como sistema de producción de las proteínas recombinantes de las proteínas de ia LM.

En la presente invención, se utilizó la bacteria E. coli con ei genotipo F~ mcrA Δ (mrr-hsdR S-mcrBC) OSOiacZAM 15 Δ lacX74 recA1 araD139 Δ (araleu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG como huésped para la amplificación de! ector pGZaLM porque se ha reportado que presenta una elevada eficiencia de crecimiento, un mayor rendimiento y una mejor calidad de producción del vector asi como una mayor estabilidad para la clonación. Su genotipo presenta ías siguientes características:

1. hsdR que permite la transformación eficiente con ADN de doble cadena desmetilado que resulta de una amplificación por PCR

2. mcrA que permite la transformación eficiente con ADN de doble cadena metilado que se obtiene de la extracción de ADN genómico

3. lacZAM15 para ¡a selección de las clonas recombinantes por medio de! color azul/blanco

4. endA1 para preparaciones íntegras y puras del ADN piasmídico así como para obtener mejores resultados en las aplicaciones siguientes a ¡a purificación del plásmido debido a que la cepa de E. coü no presenta la actividad inespecífica de la EndonucSeasa I

5. recA1 para reducir la ocurrencia de las recombinanciones inespecíficas en el ADN clonado

Asimismo, se usó la levadura Pichia pastoris X-33 como sistema de producción de las proteínas de la L recombinante porque presenta una alta eficiencia de producción de proteínas recombinantes y un mejor nivel de recuperación de la proteína de interés.

A continuación, se preparan las células ultracompetentes de E. coli mencionadas arriba utilizando una solución con PIPES 0.5M en una solución salina con MnCI2, CaCí2 y KCI así como con DMSO ai 7.5%. Este paso facilita la transfección del plásmido ya que el cloruro de calcio desestabiliza la pared celular y la membrana plasmática de la bacteria, aumentando la permeabilidad de la membrana celular. Después, e! vector pGZaL se clona en Sa bacteria Escherichía coli utilizando un choque térmico para reproducir una gran cantidad del pGZaLM, el cual será utilizado para transformar a la levadura Pichia pastoris X-33.

Luego, el vector pGZaLM se extrae y se purifica a partir de las células transformadas de Escherichía coli y se linealiza mediante una reacción de restricción con la enzima Bsp H1. En seguida, se preparan las células competentes de la levadura Pichia pastoris X-33 con una solución 100 m de cloruro de litio (LiCI), Entonces, el plásmido pGZaLM linealizado del paso anterior se inserta en la levadura mediante el método de LiC! o mediante la electroporación , En su modalidad preferida, la transformación de Pichia pastoris se realiza mediante la electroporación.

Luego, la levadura se reproduce en un medio YPD líquido adicionado con zeocina 150 pg/mL para que exprese y secrete las proteínas de la LM recombinantes. Este medio de cultivo permite asegurar el crecimiento selectivo de las levaduras transformadas con el plásmido pGZaLM, el cual le confiere a la levadura la resistencia a la zeocina.

Finalmente, la proteína recombinante se extrae y se purifica a partir del medio de cultivo de ¡a levadura mediante una cromatografía en columna por afinidad, la cual consta de una matriz acoplada a Níquel que interactúa selectiva y fuertemente con los residuos de poiihistidina de la proteína recombinaníe.

El invento ha sido descrito suficientemente corno para que una persona con conocimientos medios en la materia pueda reproducir y obtener los resultados que se mencionan en el presente documento. Sin embargo, cualquier persona hábil en el campo de la técnica que compete e! presente invento puede ser capaz de hacer modificaciones no descritas aquí. No obstante, si para la aplicación de estas modificaciones, en una estructura determinada o en e\ proceso de manufactura del mismo, se requiere de la materia reclamada en las siguientes reivindicaciones, dichas estructuras deberán ser comprendidas dentro del alcance de la esta invención.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1. Construcción del plásmid© recombínante para la expresión y la secreción de las proteínas de la LñH recombinantes en la levadura Pichia pastons.

E! plásmido utilizado en la práctica de la presente invención contiene una secuencia de nucleótidos específica y optimizada que codifica a cada una de las proteínas de la LM, La optimización de la secuencia de nucleótidos que codifica a cada una de las proteínas de la LM recombinantes se refiere a una mejora en la composición de la secuencia de ¡os nucleótidos que permite el uso eficiente de ios codones en la levadura Pichia pastoris, lo que resulta en un nivel de expresión elevado y estable de las proteínas recombinantes de i nterés .

Las secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican a cada una de las proteínas de la LM recombinantes se sintetizaron in vitro utilizando como referencia las secuencias del ARNm de las proteínas de la LM que están publicadas en el GenBank. A continuación, se describen las referencias:

LACTOFERRINA | Gen LTF, REFSEQ: AY165046.1. Abarca de los nucleótidos 70 al 2145

LISOZI A C l Gen LYZ, REFSEQ: NM_000239.2. Abarca de los nucleótidos 55 al 444.

ALFA LACTOALBÚMINA j Gen LALBA, REFSEQ: NM__002289.2 Abarca de los nucleótidos 58 al 428. BETA CASEÍNA | GEN CSN2 , REFSEQ: N _001891.3 Abarca de ¡os nucleóíidos 48 al 678

KAPPA CASEÍNA j GEN CSN3, REFSEQ: NM__005212.2 Abarca de ¡os nucleóíidos 61 a I 546.

Algunas de las modificaciones in vitro de ¡as secuencias mencionadas arriba incluyen ¡a re-edición de la secuencia de nucleóíidos codificante para eliminar en la medida de ¡o posible algunos sitios cis~actuantes, como ios sitios de spiicing, así como eí ajuste del contenido de GC promedio de ¡a secuencia para prolongar la vida media del ARNm. Asimismo, el uso de ios codones fue adaptado para las condiciones de la levadura Pichia pasforis, lo cual permite un nivel de expresión elevado y estable de las proteínas recombinantes y éstas presentan las mismas características fisicoquímicas y funcionales con respecto de la proteína nativa. Este proceso se realizó con cada una de ¡as secuencias de nucleóíidos codificantes de las proteínas de ¡a LM recombinantes.

E! píásmido pGZaLM está compuesto de ¡a secuencia de nucleóíidos codificante optimizada que se menciona arriba fusionada "en marco" a una región promoíora GAP del píásmido, la cual permite ¡a expresión constitutiva y estable de las proteínas recombinantes en ¡a levadura Pichia pastorís X- 33. Asimismo, la secuencia de nucleótidos codificante optimizada que se menciona arriba está flanqueada "en marco" por una región codificante del factor de secreción a, el cual permite secretar la proteína ai medio de cuitivo de la levadura. Además, el plásmido contiene una región que codifica un motivo de polihistídinas que permite ia purificación específica de la proteína recombinante. Asimismo, este plásmido contiene una región de terminación de ía transcripción (AOX1) que incrementa la estabilidad de la proteína recombinante. Por otro lado, el plásmido utilizado en el presente método contiene un gen de resistencia a zeocina con sus regiones reguladoras específicas para el huésped procariote y el huésped eucariote. Este gen permite seleccionar sólo las células que han sido transformadas con ei plásmido. Finalmente, el plásmido contiene una región de origen de repiicación, la cual le permite autoreplicarse en el huésped procariote.

EJEMPLO 2. Generación de las células ultracompetentes de t r a n s f o rrn a c s o n y la ampilmcacso&i de! psasmsd© pGZaLfw, PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Para iniciar se prepararon los reactivos necesarios. Se preparó PIPES 0.5 M disolviendo 15.1 gramos de PIPES en 80 mL de agua desionizada, se ajustó el pH a 6.7 con KOH 5M y se agregó agua hasta obtener un volumen final de 100 mL. Después, esta solución se esterilizó por medio de filtración y se alicuotó para almacenarla a -20 oC. Ya teniendo listo la solución PIPES 0.5M, se preparó el buffer de transformación disolviendo 10.88 gramos de ¡v1nGI2 « 4H2G, 2.20 gramos de CaC12 » 2H20, 18.65 g de KCl en 800 mL de agua des ionizada y después, se agregó 20 mL de PIPES (0.5M, pH 6.7) y se aforó con agua hasta 1 litro. Al terminar, se esterilizó e! buffer de transformación por filtración usando un filtro de 0.45 μηι y se alicuotó para almacenarlo a -20 oC.

PREPARACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES

Teniendo listos los reactivos, se picó una colonia de la bacteria Escherichsa coli con el genotipo F- mcrA Δ (mrr- hsdRMS-mcrBC) 4>80lacZAM15 Δ lacX74 recAi araD139 Δ (araleu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endAi nupG previamente cultivada en agar LB durante 20 horas a 37 °C y se transfirió en 26 mL de caldo LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 5 g/L de NaCI) en un matraz de 250 mL. Después, el caído inoculado se incubó 8 horas a 37 "C con agitación a 150 r p m .

Luego, se usó el cultivo de inicio para inocular 3 matraces Erlenrneyer con 250 mL de medio SOB (20 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 2.4 g/L de gS04, 0.5 g/L de NaCI y 0.186 g/L de KCI). El primer matraz recibió 10 mL del cultivo inicial, el segundo recibió 4 mL del cultivo inicial y el tercero recibió 2 mL del cultivo inicial. Después, se incubaron todos los matraces toda la noche a 22 °C con agitación a 150 rpm .

Al día siguiente, se leyó la densitometrfa óptica de los 3 cultivos a 600 nrn y se continuó monitoreando la densitometría cada 45 minutos. Cuando la densitometría de uno de los cultivos alcanzó 0.55, se transfirió el matraz de ese cultivo en un baño de agua fría por 10 minutos y los otros dos cultivos se desecharon.

Las células se concentraron por medio de centrifugación a 2500 g (3900 rpm) por 10 minutos a 4°C. Se retiró e! sobrenadante quitando la máxima cantidad de medio. Después, se resuspend ieron las células gentilmente con 80 mL de buffer de transformación frío. De nuevo, se concentraron las células por medio de centrifugación a 2500 g (3900 rpm) por 10 minutos a 4 ° C, se quitó el sobrenadante y se congelaron las células competentes a - O^C durante toda ía noche. Luego, se resuspendieron las células gentilmente en 20 mL de buffer de transformación frió y se agregó 1.5 mL de DMSO (d imetilsulfóxido) , se mezcló la suspensión de bacterias y se incubó en hielo por 10 minutos. A continuación, se alicuotó la suspensión en tubos de microcentríf uga estériles e inmediatamente se congelaron las células ultracompetentes mediante la inmersión de ios tubos bien cerrados en un baño de nitrógeno liquido y se almacenaron a -70°C.

EJEMPLO 3. Transformación de las células ultracompetentes de la bacteria Escherichia col i con el plásmido pGZaL!WI.

La presente invención contempla la clonación del plásmido pGZaLM en la bacteria Escherichia coíi para amplificarlo de manera natural. Esta bacteria presenta una elevada eficiencia de crecimiento, un mayor rendimiento y una mejor calidad de producción del plásmido así como una mayor estabilidad para la clonación .

Para cada transformación, se descongeló en hielo un vial de la cepa de E. coli ultracompetente con el genotipo F- mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) OSGlacZA 15 Δ lacX74 recA1 araD139 Δ (araleu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG. Después, a cada vial se ie agregaron 2 μ L de ADN plasmídíco 5 pg/mL y se mezcló con cuidado, A continuación, los viales se incubaron en hielo por 30 minutos y pasando este tiempo, se metieron en un baño de agua a 42X por 30 segundos sin agitar. Luego, se retiraron los víales del baño de agua e inmediatamente se colocaron en hielo por 2 minutos.

Pasando ¡os 2 minutos de incubación en hielo, se agregó a cada vial 250 pL de medio S.O.C acondicionado previamente a 25 °C (2% de triptona, 0.5% de extracto de levadura, 10 mM NaCI, 2.5 mM KCi, 10 mM MgC¡2, 10 mM MgS04, 20 m glucosa) y se taparon ¡os viales para así agitarlos horizontaimente a 150 rpm por 1 hora en una incubadora con agitación a 37 ° C.

Luego de la incubación, se agregaron y extendieron 200 pL del medio de cultivo de ¡as células de E. coli transformadas sobre ¡as placas con agar LB bajo en sales con 50 pg/rnL de zeocína y se incubaron a 37 ° C toda la noche. Luego, se seleccionaron algunas colonias y se analizaron por medio de PCR.

Para calcular la eficiencia de la transformación de las cé¡uSas u itracompetentes en cfu/pg de ADN plasmídico, se utilizó ¡a siguiente fórmula recordando que el volumen total de la mezcla transformada fue de 300 μί: numero e colamos p§ 300 ul volumen total

S.xp 6— X ··;—— X factor de dilución íQ pg de pUC19 DNA ug Xul iaca

EJEMPLO 4. Extracción del plásmsd© pGZaLIVl a partir de las células transí* ! y la vermcaes inserción de la ucleótidos optimizad; codifican a la una ínas de i recomhsnantes Para verificar la amplificación de los plásmidos pGZaLM que contienen las secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican a cada una de las proteínas de la L recombinantes, se picó una colonia de E. coSi transformada previamente cultivada en agar LB bajo en sales con zeocina 50 pg/mL durante toda la noche a 37°C y se transfirió en 15 mL de medio LB bajo en sales con zeocina 50 pg/ml. El cultivo de las células transformadas de E. coli se incubó toda la noche a 37'C agitándose a 150 rpm aproximadamente. Después, e! medio de cultivo se diluyó 1:500 en 3 mL de medio fresco LB bajo en sales con zeocina 50 pg/mi y nuevamente, se dejó incubando toda la noche a 37 °C con agitación a 150 rpm. Luego de la incubación, las células bacterianas se recuperaron por medio de una centrifugación a 6000 g por 15 minutos a 4°C.

La pastilla de células bacterianas se resuspendió con 0.3 mi de Buffer P1 (Tris-HCI 50 mM pH 8.0, EDTA 10 mM, RNasa A 100 pg/mi) y se agregó 0.3 mi de Buffer P2 (NaOH 200 mM, SDS 1%) mezclando muy bien invirt sendo el tubo sellado de 4 a 6 veces hasta que se obtuvo una suspensión homogénea. Después, se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y a continuación, se agregó 0.3 mi de Buffer P3 (Acetato de potasio 3.0 M, pH 5.5) previamente refrigerado y se mezcló invirtiendo el tubo de 4 a 8 veces. Luego, se incubó en hielo por 5 minutos y se centrifugó a máxima velocidad (14 OOOg aproximadamente) en una m icrocentrffuga por 10 minutos. Se obtuvo un sobrenadante claro donde se encontraba ei ADN plasmidico y se removió.

A continuación, se equilibró una columna QiAGEN-tip 20 adicionando 1 mi de Buffer QBT (NaCI 750 mM, MOPS 50 m pH7.0, Isopropanol 15%, Tritón X-100 0.15%) y se esperó a que se vaciara por flujo de gravedad. Después, ei sobrenadante obtenido se aplicó a ia columna QIAGEN-tip 20 dejando que se introdujera a la resina mediante flujo de gra edad.

Se lavó la columna con Buffer QC (NaCI 1.0 M, MOPS 50 Mm pH 7.0, Isopropanol 15%) y se eluyó el ADN con 0.8 m! de Buffer QF (NaCI 1.25 M, Tris-HCi 50 mM pH 8.5, Isopropanol 15%). El ADN se precipitó mediante la adición de 0.7 volúmenes de isopropanol a temperatura ambiente, se mezcló y se centrifugó inmediatamente a 15 000 g por 30 minutos en una microcentrífuga.

Después de la centrifugación, se decantó con cuidado ei sobrenadante y la pastilla de ADN que se obtuvo se lavó con 1 mí de etanoi al 70%, se centrifugó a 15 000 g por 10 minutos y se decantó de nuevo ei sobrenadante sin dañar ia pastilla. Esta última pastilla se dejó secando al aire durante 5 minutos y se redisolvió en 40 pL de Buffer Tris-EDTA.

Luego, el ADN plasmídico se utilizó como templado para verificar la presencia de las secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican a cada una de las proteínas de la LM recombinantes mediante la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) siguiendo el orden y el volumen especificado en el Cuadro 1 y utilizando los oligonucleótidos pGAP Forward 5 ' - GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3 ' y AOX1 reverse 5 ' - GCAAATGGCATTCTGACATCC-3 ' .

Cuadro 1. Com onentes de ia mezcla de reacción de PCR de punto final para la amplificación de una región específica

Asimismo, la PCR se corrió acorde a los parámetros que se presentan en el Cuadro 2:

Cuadro 2: Programación del termociclador para la reacción en cadena de ia polimerasa (PCR) para verificar la transfecclón de E, coli DH5a con el piásmid© GZaLf^ ,

Desnaturalización inicial 95 3 min 1

Desnaturalización 95 30 seg 30

Alineación de los

53 30 seg 30 oligonucleótidos

Extensión 72 30 seg 30

Extensión fina! 72 10 m i n 1

EJEMPLO 5. Transformacf órt de la levadura Pichia pastoris

La enzima de restricción BspHM (Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc) fue utilizada para realizar un corte cercano a la región del promotor del plásmsdo pGZaLM para idealizarlo. Este corte de restricción genera un sitio "pegajoso" complementario a una región recombinante del promotor GAP en el genoma de la levadura, lo que permite la transformación estable de este microorganismo.

La levadura Pichia pastoris X-33 fue reactivada en medio líquido YPD (Yeast Extract Pepone Dextrose) (Sigma Aldrich) durante 48 h a 30°C a 130 rpm. A partir de este cultivo, se estrió una caja petri con agar YPD (Sigma Aldrich) en tres planos y se incubó a 30°C por 48 h. Una colonia aislada fue tomada del cultivo sólido de la levadura para inocular nuevamente caldo YPD que fue incubado durante 40 h a 30°C y 200 rpm.

Para la preparación de células competentes de Pichia pastoris se tomaron 20 mL de cultivo de esta levadura en medio líquido YPD y se centrifugaron durante 5 minutos a 1500 x g. El sobrenadante resultante se desechó y ^ a pastilla fue lavada con agua estéril a 4°C. Se realizó una segunda centrifugación de la muestra por 10 minutos a 1500 x g. La pastilla obtenida se resuspendió en 1 mL de solución 100 mM de cloruro de litio (LiCI). La mezcla anterior fue centrifugada a 12500 x g durante 15 segundos. Posteriormente, se removió el cloruro de litio usando una micropipeta para después resuspender las células en 400 pL de una solución 100 mM de cloruro de litio. La mezcla fue homogenizada suavemente y después fue transferida a diversos tubos Eppendorf, colocando 50 pL de mezcla en cada

Luego, la mezcla de células con la solución 100 mM de cloruro de litio fue centr fugada a 3000 x g por 1 m i n . La pastilla de células competentes fue resuspendida en la "solución de transformación" agregando: 240 pL de solución de polietiienglscol (PEG) al 50%, 36 pL de solución 1 M de cloruro de litio, 25 iL de ADN de cadena simple en concentración de 2 mg/mL y 50 μί del piásmido iineanzado; en el orden mencionado. Los tubos fueron mezclados en vortex por 1 minuto y después incubados a 30°C por 30 min. Luego, las muestras fueron centrifugadas a 3000 x g durante 5 minutos y el sobrenadante fue desechado. La pastilla resultante fue resuspendida en 1 mL de medio de cultivo líquido YPD, para luego ser incubada a 30 °C sin agitación. La mitad de las muestras fueron removidas y almacenadas a 4°C después de 1 h de incubación, mientras que la otra mitad permaneció en ¡as condiciones de incubación mencionadas durante 4 h.

El siguiente paso ¡levado a cabo fue el de tomar 50 μί. de cada muestra e inocular cajas Petri con medio sólido YPD adicionado con 150 pg/mL de zeocina (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific ¡nc), realizando un estriado en tres planos. Los cultivos fueron incubados a 30°C durante 38 h . Transcurrido el tiempo de incubación, se tomaron colonias aisladas de cada muestra y con ellas se inocularon nuevas cajas Petri conteniendo agar YPD adicionado con 150 pg/mL de zeocina (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc), para nuevamente ser incubadas a 30°C durante 36 horas con una velocidad de agitación de 200 rpm. Una vez alcanzado el crecimiento deseado, se tomaron colonias aisladas para inocular caldo YPD con 150 pg/mL de zeocina (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc) y se incubó a 30 ° C por 36 h con agitación a 200 rpm.

Entonces, se prosiguió a realizar la verificación de la inserción de las secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican a cada una de las proteínas de la LM recombinantes de acuerdo al Ejemplo 4,

EJEMPLO 6. Purificación de las proteínas de la LM recombinantes a partir dei medio de cultivo de la levadura transformada de Pichüa pastoris X~33, Las proteínas recombinantes de las proteínas de la LM se producen como una protefna de fusión, la cual contiene un poiipéptido de seis residuos de histidina en su extremo carboxilo terminal, el cual permite la purificación selectiva de la proteína recombinante mediante la cromatografía en columna por afinidad utilizando una resina ligada al ácido iminodiacético acoplado a níquel. Los residuos de histidina tienen una potente afinidad por los iones metálicos di y trivalentes como el níquel.

Una vez que se obtuvieron células de Pichia pastoris transformadas con el plásmido pGZaLM, se procedió a realizar la purificación de la proteína que se expresó y que fue secretada al medio por la levadura. Para realizar este proceso se utilizó el kit ProBond Purification System (Life Technologies). Para la preparación de las columnas de purificación, se resuspendió la resina y se mezcló por inversión. Luego, se tomaron 2 mí de la resina y se transfirieron a la columna de purificación. Se dejó reposar la columna durante 2 minutos y después se centrifugó por 1 minuto a 800 g. Después, con ayuda de una micropipeta el sobrenadante se removió y se desechó.

A continuación, se adicionó a la columna 8 mi de agua destilada estéril para resuspender la resina. Se dejó reposar la columna durante 2 minutos y nuevamente se centrifugó por 1 minuto a 800 g, para después remover y desechar con ayuda de una micropipeta el sobrenadante.

Después, se agregó 8 mi de solución amortiguadora de unión nativa () y se mezcló por inversión. La columna se dejó reposando durante 2 minutos y se centrifugó por 1 minuto a 800 g, para después con una micropipeta remover y desechar el sobrenadante. Por último se volvió a agregar 8 mí de solución amortiguadora de unión nativa y se repitió el procedimiento.

Cuando la resina quedó preparada, se prosiguió con la purificación de ¡a proteína. Para este proceso se tomaron 10 mi del medio líquido YPD de la levadura Pichia pastoris transformada y se añadieron a ¡a columna de purificación previamente preparada. La columna se agitó suavemente durante 50 minutos aproximadamente a temperatura ambiente. Después, se dejó reposar ía resina durante 2 minutos y luego se centrifugó por 1 minuto a 800 g. El sobrenadante resultante se removió con ayuda de una micropipeta y se almacenó a 4°C para que este fuera analizado por SDS-PAGE.

A continuación, se lavó la columna con 8 mi de solución amortiguadora de lavado nativo y se dejó reposar durante 2 minutos a temperatura ambiente. Luego, se centrifugó durante 1 minuto a 800 g. Nuevamente, con ayuda de una micropipeta se retiró y desechó el sobrenadante resultante para ser aimacenado a 4 ° C para analizarlo por SDS-PAGE, El lavado de ¡a columna se repitió 3 veces.

Para la purificación de la protelna, se colocó la columna en una posición vertical y se removió el tapón inferior de la columna. Se eluyó la proteína con 10 mi de solución amortiguadora de elución nativa y se almacenaron alícuotas de esta de 1 mi para analizarlas después mediante SDS-PAGE.

EJEMPLO 7, Análisis de la masa molecular de las proteínas re c o m b i n a n tes de las proteínas de la L. SVi mediante SDS- P A G E .

Se tomó una alícuota de las proteínas purificadas de acuerdo al método descrito en el Ejemplo 8 y mezcló 1 :1 con un buffer de carga de muestra compuesto de Tris-HC! 65,8 mM pH 6.8, SDS 2.1 %, glicerol 26.3% (w/v), azul de bromofenol 0.01% y β- mercaptoetanol. Después, las muestras de carga fueron calentadas a 95 ° C por 5 minutos y sus proteínas totales fueron separadas en función de su masa molecular en un gel de poliacrilamida con un gradiente de 4% a 20% en condiciones desnaturalizantes y reductoras. La electroforesis se llevó a cabo en una cámara ini PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad Laboratories) utilizando una solución amortiguadora de corrida compuesta de Tris 25 mM, glicina 192 mM y SDS 0.1%, pH 8 3. La electroforesis se corrió a 70 V durante 15 minutos y luego a 100 V durante 80 minutos. Finalmente, el gel se tiñó con azul de Coomassie G-250 y se fotodocumentó con el GelDoc EZ (Bio-Rad Laboratories). La imagen del gel se analizó con el ImageLab 4.1 software (Bio-Rad Laboratories). Para determinar la identidad de las bandas que corresponden a la hLF y a la hA-LA recombinantes, utilizamos una muestra de la fracción de las proteínas totales de la leche materna madura previamente caracterizada en nuestro laboratorio. Asimismo, eí cálculo de la masa molecular de la hLF y de la bA~LA nativas se realizó en función del marcador de masa molecular Precisión Plus Protein Dual Xtra Standard (Bio-Rad Laboratories) de 250-2 KDa con e! método de punto a punto de! IrnageLab 4.1 software.

EJEMPLO 8. Determinación del punto isoeléctrico fpl) de las proteínas recombinantes de ¡as proteínas ele la LW1 mediante ta electroforesis en dos dimensiones.

En este Ejemplo, se utilizarán ios resultados obtenidos con ¡a LF y la a-LA humanas recombinantes.

Utilizando la lactoferrina humana (Sigma Aldrich) y la alfa iactoalbúm ina bovina (Sigma Aldrich) nativas como estándares, se determinó el punto isoeléctrico de Sas proteínas recombinantes de la hLF y de la hA-LA mediante una electroforesis 2D. La electroforesis 2D es una combinación secuencial de dos técnicas de separación donde se utiliza un enfoque isoeléctrico seguido de una electroforesis convencional SDS-PAGE. Esta técnica es capaz de separar una mezcla compleja de proteínas en función de su punto isoeléctrico y de su masa molecular.

Para realizar la electroforesis 2D, las proteínas recombinantes de la hLF y de la hA-LA purificadas fueron diluidas en un buffer de reh id ratación compuesto de Urea 8 M, 3-[(3- colamidopropi!)dimetilamonio]~1 -propanosulfonato al 2%, DTT 50 mM, anfolito BioLyte 3-11 al 0.2%, azul de bromofenol 0.001% (Bio-Rad Laboratories) y aplicadas a una tira de poliacrilamida tipo IPG de 11-cm con un gradiente de pH 3-11. El isoelecíroenfoque (IEF) se llevó a cabo en una cámara Protean 112 (Bio-Rad Laboratories).

La separación de las proteínas mediante !EF se llevó a cabo con las siguientes condiciones:

1. SI aumento linear de voltaje de 0 a 500 V durante 20 minutos.

2. S2 aumento linear de voltaje de 500 a 1000 V durante 1 hora.

3. S3 aumento linear de voltaje de 1000 V a 2000 V durante 2 horas.

4. S4 aumento linear de voltaje de 2000 V a 4000 V durante 4 ho ras .

5. S5 aumento linear de voltaje de 4000 V a 8000 V durante 12 horas.

Después, las tiras ¡PG se equilibraron con un buffer que contiene urea 8 ¡VI, SDS a! 2%, Tris-HCI 0.05 M, giiceroi al 20% y DTT al 2% a pH 8.8 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, las tiras IPG fueron tratadas con un buffer de alquilación que contiene Urea 6 M, SDS al 2%, Tris HC! 0.375 M pH 8.8, giiceroi a! 20% y iodoacetamida al 2.5% (Bio- Rad Laboratories) a temperatura ambiente durante 30 minutos y así se acoplaron sobre un ge! de poliacrilamida con un gradiente de 4% a 20% para separar las proteínas recombinantes en función de su masa molecular mediante SDS-PAGE,

La segunda dimensión de la electroforesis se Nevó a cabo en una cámara Mini PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad Laboratories) utilizando una solución amortiguadora de corrida compuesta de Tris base 25 mM, glicina 192 mM y SDS 0.1%, pH 8.3, La electroforesis vertical se corrió a 75 V durante 15 minutos y Suego a 110 V durante 80 minutos.

En seguida, las proteínas recombinantes se electrotransfirieron del g e I de poliacriSamida a una membrana de PVDF en una cámara de condiciones semisecas Mini Trans Blot Turbo (Bio-Rad Laboratories). La electrotransferencia de las proteínas recombi antes se llevó a cabo utilizando un buffer de transferencia compuesto de Tris base 25 mM, glicina 192 mM y metanol 20% a pH 8.3 con las siguientes condiciones: 25 V/1 ,300 mA durante 7 minutos. Después de la electrotransferencia, ía membrana fue incubada con un buffer de Tris-HCI 20 mM y NaCI 500 mM a pH 7.5 (TBS) con leche descremada en polvo al 5% para bloquear los epltopos inespecíficos. Luego, la membrana se incubó con un buffer de Tris-HCI 20 mM, NaCI 500 mM, T een 20 al 0.05% (TTBS) y leche descremada en polvo ai 5% pH 7.5 junto con ios anticuerpos primarios anti-hLF y anti-hA-LA monoclonales producidos en ratón (Santa Cruz Biofechnology) a 4 °C durante toda la noche. Después de la incubación con el anticuerpo primario, la membrana se lavó con el buffer de TTBS y luego, se incubó con un buffer de citrato 20 mM, NaCI 500 mM, Tween 20 0.05% (TCBS) a pH 5.5 con el anticuerpo secundario antiratón acoplado a la peroxidasa de rábano (G-HRP, Bio-Rad Laboratories) y se probó ¡a reacción enzimática con peróxido de hidrógeno al 3% y con diaminobenzidina como sustrato para visualizar las proteínas inmunoreactivas. Finalmente, el inmunoblot se f otodocu me ntó con e! GelDoc EZ (Bio-Rad Laboratories) y la imagen se analizó con el software ImageLab 4.1.

EJEMPLO 9. Secoenciación de tos aminoácidos de las proteínas de la LM recombinantes mediante la cromatografía de líquidos de afta resolución acoplada a un

Luego de la separación de las proteínas recombínantes de la hLF y de la hA-LA mediante SDS-PAGE, sus bandas fueron escindidas y las proteínas se digirieron "¡n gel" con Termolisina (Sigma Aldrich). Los péptidos generados durante la digestión enz mática fueron aplicados en un sistema LC-MS con bomba de nanoflujo EASY-nLC I! (Thermo-Ficher Co. San José, CA) acoplado a un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap Velos (Thermo-Ficher Co., San José, CA) con un sistema de ionización tipo nanoelectroatom ización (ESI). El espectrómetro fue calibrado con una solución Calmix (N-butilamina , cafeína, et-Arg-Phe-Ala (MRFA) y Ultramark 1821) utilizando el modo de ionización positiva ESI. La N-butilamina se incluye para ampliar el espectro a un menor rango de calibración de masas, lo cual permite obtener determinaciones con exactitudes menores a 5 ppm (partes/millón). En el sistema de cromatografía de líquidos se aplicó un gradiente de 10-80% de solvente B (ag ua/aceton itrilo con 0.1% de ácido fórmico) en un periodo de 120 minutos, utilizando una columna capilar hecha en casa (ID 0.75 μιτι y 10cm largo RP-C18). El flujo de! sistema LC fue de 300 nanoiitros/minuto. Para la fragmentación de ios péptidos, se utilizaron los métodos de CID (Disociación inducida por colisión) y HCD (Disociación por colisiones de alta energía) donde solamente ios iones con carga 1+ y 2+ fueron seleccionados para los eventos de fragmentación. Los iones con cargas 3 + ,4 + , >5+ y de cargas indefinidas fueron desconsiderados.

Todos los espectros se adquirieron en modo de detección positivo. La ejecución y la captura de los datos de fragmentación se realizaron como una función del escaneo total de iones según las cargas predeterminadas, con un ancho de aislamiento de 3.0 (m/z), una energía de colisión normalizada de 35 unidades arbitrarias, una activación Q de 0.250, un tiempo de activación de 10 milisegundos y un tiempo máximo de inyección de 10 milisegundos por microescaneo. Durante la captura automática de los datos, se utilizó Sa exclusión dinámica de iones: (i) lista de exclusión de 400 iones, (ii) tiempo de pre exclusión de 30 segundos y (i i i) tiempo de exclusión de 300 segundos.