SEU USO

Campo da invenção :

[1] A presente invenção se insere no campo de aplicação da ciência médica, mais especificamente, na área de fármacos para o tratamento de distúrbios do sistema urinário da bexiga, uma vez que se refere a um processo de obtenção de nanoparticulas biossintéticas de prata na forma de dispersão aquosa para incorporação em uma base farmacêutica ou veterinária para o tratamento de câncer de bexiga.

Fundamentos da invenção:

[2] A nanotecnologia tem se apresentado como uma área bastante inovadora no aprimoramento de produtos industrializados e principalmente no desenvolvimento de medicamentos mais eficazes e com menos efeitos tóxicos. Por se constituir como uma nova perspectiva na busca de alternativas terapêuticas para algumas doenças cuja cura ainda é desconhecida, a interação entre nanomateriais e sistemas biológicos desperta cada vez mais interesse da ciência .

[3] Por exemplo, o carcinoma urotelial invasivo de bexiga é uma doença potencialmente letal que requer tratamento agressivo e, se não tratados, menos de 15% dos pacientes sobrevivem dois anos. Além disso, poucas alternativas farmacológicas e terapêuticas são eficientes em seus estágios mais avançados.

[4] Nesta linha, a presente invenção propõe uma nanoparticulas biossintéticas de prata na forma de dispersão aquosa para instilação ou para incorporação em uma base farmacêutica ou veterinária para o tratamento de câncer de bexiga. As referidas nanoparticulas são obtidas através da redução da prata por enzimas e substratos presentes em solução obtidas após a filtração da biomassa do fungo Fusaríum oxysporum.

[5] No estado da técnica, alguns documentos, tais como TW200902722, PI 0605681-4 e US2009148484 , descrevem um processo de obtenção de nanoparticulas de prata biogênica por Fusaríum oxysporum.

[6] Todavia, os processos descritos diferem do processo proposto pela presente invenção, principalmente por não padronizarem os parâmetros para obtenção da biomassa e mecanismo de redução da prata, tais como quantificação de esporos, tempo, temperatura, agitação e concentração de AgN03 estabelecidos. Nesse sentido, é importante ressaltar que os parâmetros padronizados do processo proposto pela presente invenção são considerados essenciais para se atingir as características diferenciadas apresentadas pelas nanoparticulas biossintéticas de prata propostas.

[7] Portanto, nenhum documento do estado da técnica descreve nanoparticulas de prata biossintéticas com características únicas, com uma faixa estreita de diâmetro hidrodinâmico, já estabilizadas por proteínas do próprio microrganismo, não sendo necessário a adição de surfactantes , promissoras candidatas a fármaco para o tratamento do câncer de bexiga ín vivo, tal como proposto pela presente invenção.

Breve descrição da invenção:

[8] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de nanoparticulas biossintéticas de prata através da redução da prata por enzimas e substratos presentes em solução obtidas após a filtração da biomassa do fungo Fusaríum oxysporum. O processo proposto pela presente invenção consiste na adição de nitrato de prata à solução de extrato fúngico contendo redutases que irão reduzir os ions prata Ag ⁺ para prata Ag ⁰ , e compreende as etapas de; a) Produção de esporos em meio sólido; b) Padronização da solução de esporos para inoculação; c) Produção da biomassa em meio liquido d) Filtração e obtenção da biomassa; e) Extração de redutases e cofatores quinónicos; f) Redução da Ag ⁺ e formação das nanoparticulas ; e g) Lavagem das nanoparticulas de prata por centrifugação.

[9] Portanto, o processo proposto possibilita obter nanoparticulas de prata (AgNP) esféricas com faixa estreita de tamanho (baixa polidispersividade) , com odiâmetro médio de aproximadamente lOOnm, já estabilizadas por proteínas do próprio microrganismo, não sendo necessário a adição de surfactantes . Adicionalmente, a presente invenção refere-se as referidas nanoparticulas obtidas, assim como ao uso das mesmas para o preparo de um medicamento para tratar o câncer de bexiga, uma vez que através de ensaios preliminares, as AgNP biossintéticas promoveram considerável regressão do tumor de bexiga induzido pelo carcinógeno MNU, principalmente quando utilizado a concentração de 0,05mg/mL.

Breve descrição das figuras:

[10] Para obter completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.

[11] A Figura 1 A-B representa graficamente (A) a determinação do IC50 em carcinoma de bexiga 5637, e (B) a citotoxicidade das AgNP em função do tempo.

[12] A Figura 2 A-F são imagens que representam fotomicrografias das bexigas urinárias dos grupos Controle (A, B) e MNU (C, D, E, F) .

[13] A Figura 3 A-F são imagens que representam fotomicrografias das bexigas urinárias dos grupos MNU + AgNP 0,5 (A, B) , MNU + AgNP 0,2 (C, D) e MNU + AgNP 0,05 (E, F) .

Descrição detalhada da invenção:

[14] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de nanoparticulas biossintéticas de prata na forma de dispersão aquosa para instilação ou para incorporação em uma base farmacêutica ou veterinária para o tratamento de câncer de bexiga.

[15] O referido processo é considerado essencial para se atingir as características diferenciadas apresentadas pelas nanoparticulas obtidas. Assim, o referido processo compreende as etapas a seguir:

a) Produção de esporos em meio sólido;

b) Padronização da solução de esporos para

inoculação ;

c) Produção da biomassa em meio líquido;

d) Filtração e obtenção da biomassa;

e) Extração de redutases e cofatores quinónicos;

f) Redução da Ag ⁺ e formação das nanoparticulas; e g) Lavagem das nanoparticulas por centrifugação.

[16] Na etapa "a", para a produção de esporos, utilizou- se a espécie do fungo Fusaríum oxysporum,. preferencialmente a cepa ATCC 9848.

[17] Ainda, na etapa "a", para a produção dos esporos do fungo Fusaríum oxysporum (ATCC 9848) em meio sólido, prepara-se placas de Petri contendo de 3,9% de meio Agar Dextrose Batata - PDA (do inglês, potato dextrose agar) . Após solidificação do meio, realiza-se a inoculação do fungo a partir das amostras de F. oxysporum que encontravam-se preservadas em criotubos com glicerol em -80°C. Assim, as foram placas mantidas em estufas na temperatura de 33°C, sem luminosidade. As placas permaneceram nestas condições por mais 7 dias e foram avaliadas. Ao final de 14 dias o ensaio foi finalizado.

[18] Para a padronização da solução de esporos para inoculação, na etapa "b", após crescimento do F. oxysporum em meio sólido, conforme item (a) , os esporos obtidos das placas em meio PDA foram removidos com o auxilio de alça de Drigalski descartável em 50 mL de solução salina 0,9% e Tweem 20 a 1%. A suspensão obtida foi pipetada para frasco esterilizado, em seguida foram feitas leituras em espectrofotômetro no comprimento de onda de 530 nm. A concentração de esporos foi padronizada a partir da absorbância entre 0,15 a 0,17, que é equivalente a concentração de 10 ⁶ UFC/mL.

[19] Para a produção de biomassa por F. oxysporum em meio liquido, na etapa "c", utilizou-se 10% da suspensão de esporos padronizada para inocular em frascos Erlenmeyer, contendo 50 mL de meio com 0,5% extrato de levedura e 2% de extrato de malte. Em seguida, o inoculo é incubado em agitador orbital (Shaker) a 20-28°C e 100 rpm, por um período de 7 dias.

[20] Na etapa "d", após a crescimento da biomassa, de acordo com a etapa "c", o conteúdo é submetido a filtração à vácuo em funil de Buckner com papel de filtro (N.l), previamente seco em estufa a 80°C por 24 h e pesado. Todo material filtrado foi descartando, a biomassa do fungo retida no papel de filtro foi extraída e lavada três vezes com água por centrifugação, apresentando a coloração marron- avermelhada .

[21] Na etapa "e", a biomassa filtrada e lavada foi adicionada em água destilada e esterilizada, em relação de 20 gramas de biomassa para 100 mL água (1:5) . Em seguida, a solução foi incubada à 28°C, 120 rpm em agitador orbital (Shaker) , por 5 dias (onde a cinética de liberação da proteína se mostrou maior) para a extração das redutases e cofatores quinónicos.

[22] Na etapa "f", adicionou-se na solução obtida na etapa "e" quantidades de AgN03 para a obtenção de solução de concentração final de 1,0 x 10 ^~2 M. A formação das AgNP foi acompanhada através observação da alteração da coloração da solução para marrom-avermelhada e por leituras em espectrofotômetro com intervalo de 300-700 nm, por até 72h (tempo aproximado de estabilização do processo de redução) . A maior intensidade de banda plasmônica de ressonância aparece 440 nm, que representa a típica banda de prata metálica para tamanhos de 100 nm.

[23] Por fim, na etapa "f", as nanopartícuias foram lavadas por ultracentrifugação à 50.000 rpm por 30 min, por 3 vezes, com o objetivo de separar as proteínas ligadas as partículas daquelas presentes em solução. A cada ultracentrifugação, o sobrenadante foi descartado e 10,0 mL de água destilada foram adicionadas. Na última ultracentrifugação, realizou-se a quantificação de proteínas totais do sobrenadante da amostra pelo método de Bradford (1976) . Caso contenha concentrações proteicas detectáveis, mais etapas de lavagem deverão ser feitas.

[24] Portanto, o processo de biossintese proposto pela presente invenção, possibilita obter nanoparticulas de prata esféricas com características únicas, com uma faixa estreita de diâmetro hidrodinâmico, já estabilizadas por proteínas do próprio microrganismo, não sendo necessário a adição de surfactantes .

[25] Adicionalmente, a presente invenção refere-se às nanoparticulas biossintéticas de prata obtidas na forma de dispersão aquosa para instilação ou para incorporação em uma base farmacêutica ou veterinária para o tratamento de câncer de bexiga.

[26] As referidas nanoparticulas possuem a absorção máxima de banda plasmônica em 440 nm e concentração de prata metálica em 1,0 x 10 ^~2 M.

[27] Ainda, as nanoparticulas apresentaram o diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) de 104,1 nm ±2,1 e índice de polidispersividade de 0,317 ± 0,025. Além disso, as nanoparticulas apresentaram o Potencial Zeta de -28,8 mV ±1,7 mV, o qual sugere uma baixa tendência para agregação, pois em módulo, a presença de fortes cargas elétricas na superfície das partículas impede a aglomeração de partículas devido diferença eletroestática .

[28] Adicionalmente, a presente invenção refere-se ao uso das nanoparticulas obtidas para o preparo de um medicamento para tratar o câncer, preferencialmente o câncer de bexiga, mais preferencialmente câncer de bexiga urinária não-músculo invasivo (CBNMI), principalmente quando é utilizado a uma concentração de 0,05mg/mL. [29] Para avaliar o potencial das nanoparticulas da presente invenção, a seguir são apresentados os resultados dos testes realizados.

Testes Realizados:

[30] Foram realizados estudos de viabilidade celular em linhagem celular de carcinoma de bexiga 5637 pelo método de redução do MTT (MOSMANN, 1983) . Sendo assim, as células foram incubadas em crescentes concentrações de nanoparticulas de prata (AgNP) biossintéticas (1-25 uM) propostas pela presente invenção por 24h para a determinação da dose responsável pela redução em 50% da viabilidade celular (ICso) ·

[31] A regressão sigmoidal dos dados resultou no IC50 de 6,15 μΜ e coeficiente de determinação 0,9825 (Figura 1- A) . Em seguida, foi avaliado o perfil de citotoxicidade das AgNP biossintéticas em menores intervalos de tempo (Figura 1-B) . Os resultados mostraram que após 6h de tratamento o perfil de citotoxicidade é similar ao observado após 24h de tratamento, não obtendo diferenças estatísticas (24h vs 6h *p<0,05, ANOVA - Tukey) . Em tempos inferiores (lh e 3h) , não foram obtidos redução significativa da viabilidade quando comparados ao grupo 24h de tratamento (*p<0,05, ANOVA - Tukey) . Portanto, o ensaio de viabilidade demonstrou que a citotoxicidade das AgNP é dose e tempo dependentes nas condições testadas de incubação e de tipo celular.

[32] Com os resultados obtidos nos testes de viabilidade celular, foi avaliado a atividade antitumoral das AgNP(s) em modelo animal induzido quimicamente para o câncer de bexiga urinária não-músculo invasivo (CBNMI) .

[33] Para tal, foram utilizados 25 camundongos fêmeas da linhagem C57BL/ 6 obtidos no Centro de Bioterismo da Universidade Estadual de Campinas (CEMIB/UNICAMP) . Os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comité de Ética para Experimentação Animal (CEUA) / UNICAMP (protocolo número 4017-1) . Para a indução do CBNMI, 20 animais foram anestesiados com Cloridrato de Xilazina 2% (5mg/kg i.m.; Kõnig, São Paulo, Brasil) e Cloridrato de Cetamina 10%

(60mg/kg, i.m.; Fort Dodge, Iowa, EUA), mantidos nesse estado por 45 minutos para evitar micção espontânea e instilada uma dose de 1,5 mg/kg de N-metil-N-nitrosouréia (MNU - Sigma, St. Louis, MO, EUA) dissolvida em 0,1 mL de citrato de sódio

( 1M pH 6,0) a cada 15 dias (semanas 0, 2, 4), totalizando 3 doses (modificado de Garcia et al . , 2016) . Os outros 5 animais que não receberam MNU foram considerados como Grupo Controle .

[34] Posteriormente, os animais foram divididos em 4 grupos (5 animais por grupo) : Grupo MNU (Câncer) : recebeu uma dose intravesical de 0,1 mL de solução fisiológica 0,9% por 3 semanas consecutivas; Grupo MNU + AgNP 0,5 mg/mL: recebeu uma dose intravesical de 0,5 mg/mL de AgNP por 3 semanas consecutivas; Grupo MNU + AgNP 0,2 mg/mL: recebeu uma dose intravesical de 0,2 mg/mL de AgNP por 3 semanas consecutivas; e Grupo MNU + AgNP 0,05 mg/mL: recebeu uma dose intravesical de 0,05 mg/mL de AgNP por 3 semanas consecutivas .

[35] As doses intravesicais nos diferentes grupos experimentais foram instiladas via cateter flexível 20 gauge (Abocath, São Paulo, Brasil) . Os animais de todos os grupos experimentais receberam água e a mesma dieta sólida ad líbítum (Nuvilab, Colombo, PR, Brasil) . Após o período de tratamento, os animais foram eutanasiados e as bexigas urinárias coletadas e submetidas às análises histopatológicas .

[36] A mortalidade relativa ao procedimento de indução do CBNMI foi de 40% (n=2 animais) para os animais do grupo MNU, 60% (n=3 animais) para os grupos MNU + AgNP 0,5 mg/mLe MNU + AgNP 0,05 mg/mL, e 20% para o grupo MNU + AgNP 0,2 mg/mL .

[37] Para as análises histopatológicas foram utilizadas amostras da bexiga urinária de todos os grupos experimentais: Controle (n=5 animais), MNU (n=3 animais), MNU + AgNP 0,5 mg/mL (n=2 animais), MNU + AgNP 0,2 mg/mL (n=4) e MNU + AgNP 0,05 mg/mL (n=2) . As amostras foram coletadas, fixadas em solução de Bouin, inclusas em Paraplast Plus (Sigma, ST. Louis, MO, EUA) , seccionadas e coradas em Hematoxilina- Eosina. As lesões uroteliais foram classificadas conforme o estadiamento proposto pelo consenso da Organização Mundial da Saúde/Sociedade Internacional de Patologia Urológica

(EPSTEIN et al . , 1998) .

[38] O trato urinário dos animais do grupo Controle não apresentaram alterações microscópicas (Figuras 2a, 2b; Tabela 1) . O urotélio normal foi composto por 2 - 3 camadas, sendo: uma camada de células basais, uma camada celular intermediária, e uma camada superficial ou apical composta por células em guarda-chuva (Figuras 2a, 2b) .

[39] Em contraste, o trato urinário do grupo MNU

(Câncer) apresentou drásticas alterações histopatológicas, tais como: carcinoma urotelial com invasão da lâmina própria

(pTl) (Figuras 2c, 2d) e carcinoma urotelial papilifero (pTa)

(Figuras 2e, 2f) em 66,66% e 33,33% dos animais, respectivamente (Tabela 1) .

Tabela 1: Porcentagem de alterações histopatológicas na bexiga urinária de camundongos dos diferentes grupos experimentais .

[40] 0 carcinoma pTl foi caracterizado por células neoplásicas agrupadas em pequenos grupos ou cordões invadindo a lâmina própria, numerosas figuras de mitose e células pleomórficas com núcleos aumentados. O carcinoma urotelial papilifero (pTa) foi caracterizado por extensas lesões papiliferas, células uroteliais com arranjo desordenado e com perda da polaridade, intenso pleomorfismo celular e numerosas figuras de mitose.

[41] As lesões neoplásicas mais frequentes no Grupo MNU + AgNP 0,5 mg/mL foram o pTa (Figura 3a) e o pTis (Figura 3b) em 50% e 50% dos animais, respectivamente (Tabela 1), indicando que esse tratamento não foi eficaz em regredir as lesões neoplásicas. O carcinoma pTis foi caracterizado por uma desordenada proliferação das células uroteliais (hiperplasia) em um urotélio plano, com acentuadas atipias celulares caracterizadas por núcleos volumosos, redução do citoplasma e nucléolos múltiplos e proeminentes.

[42] As análises histopatológicas dos animais do Grupo MNU + AgNP 0,2 mg/mL demonstraram 50% de regressão tumoral, sendo que 50% dos animais apresentaram hiperplasia plana (Figura 3c; Tabela 1) . As lesões neoplásicas mais frequentes nesse grupo foram o pTis (Figura 3d) em 50% dos animais (Tabela 1) . A hiperplasia plana foi caracterizada por espessamento do urotélio e ausência de atipias citológicas.

[43] O tratamento com AgNP 0,05 mg/mL apresentou 100% de regressão tumoral (Tabela 1), sendo que 50% dos animais apresentaram urotélio normal (Figura 3e) e 50% apresentaram hiperplasia plana (Figura 3f ) , a qual é considerada uma lesão benigna .

[44] Deste modo, através destes ensaios preliminares, as AgNP biossintéticas da presente invenção promoveram considerável regressão do tumor de bexiga induzido pelo carcinógeno MNU, principalmente quando utilizamos as concentrações de 0,2 mg/mL a 0,05 mg/mL, demonstrando-se um promissor candidato à fármaco no tratamento de câncer de bexiga não músculo invasivo.