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Title:
PROCESS FOR PRODUCING TICK EMBRYONIC STEM-LIKE CELLS, TICK EMBRYONIC STEM-LIKE CELLS, METHOD FOR REPLICATING MICROORGANISMS, METHOD FOR EXPRESSING MICROORGANISM PROTEINS, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, IMMUNOLOGICAL COMPOSITION, METHOD OF DIAGNOSIS AND USE OF SAID CELLS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2018/184084
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a process for producing tick embryonic stem-like cells and the tick embryonic stem-like cells produced by said process. Furthermore, the present invention relates to methods for replicating microorganisms and expressing microorganism proteins, a pharmaceutical composition, an immunological composition and a method of diagnosis in vitro, all comprising the cells according to the present invention, or produced according to the process of the present invention. Furthermore, the present invention relates to uses of the cells according to the present invention, or produced according to the process of the present invention.

Inventors:
BATTESTI DARCI MORAES BARROS (BR)
CHUDZINSKI-TAVASSI ANA MARISA (BR)
MORAES ANGELINA CIRELI (BR)
MARIA DURVANEI AUGUSTO (BR)
KERKIS IRINA (BR)
IWAI LEO KEI (BR)
PORTO RAFAEL MARQUES (BR)
MENDONÇA RONALDO ZUCATELLI (BR)
Application Number:
PCT/BR2018/050090
Publication Date:
October 11, 2018
Filing Date:
April 05, 2018
Export Citation:
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Assignee:
BIOTICK PESQUISA E DESENVOLVIMENTO TECNOLOGICO LTDA (BR)
FUND BUTANTAN (BR)
International Classes:
C12N5/0735; A61K35/646; A61K39/00; A61K39/002; A61K39/02; C12N1/10; C12N1/20; G01N33/569; C12R1/91
Domestic Patent References:
WO2017024372A12017-02-16
Other References:
MORAES, A. C. ET AL.: "Estabelecimento e caracterização de celulas embrionarias de Amblyomma sculptum Berlese (Acari: Ixodidae", DOUTORADO EM BIOTECNOLOGIA, 14 March 2018 (2018-03-14), Universidade de Sao Paulo, pages 1 - 29 e 89-108, XP055364521, Retrieved from the Internet [retrieved on 20180611]
FRANZE, D. A.: "Cultura de celulas embrionarias-simile de Rhipicephalus sanguineus (Latreille) (Acari: Ixodidae) para isolamento e cultivo de patogenos", DISSERTAÇÃO ( MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA, 4 September 2015 (2015-09-04), Universidade de Sao Paulo, XP055364530, Retrieved from the Internet [retrieved on 20180611]
REZENDE, J. ET AL.: "Primary embryonic cells of Rhipicephalus microplus and Amblyomma cajennense ticks as a substrate for the development of Borrelia burgdorferi (strain G39/40", BRAZ J BIOL., vol. 72, no. 3, 2012, pages 577 - 582, XP055364525, ISSN: 1519-6984
COSSIO-BAYUGAR, R. ET AL.: "Heterologous gene expression in a cattle tick Rhipicephalus microplus embryonic cell culture", JOURNAL OF ANIMAL AND VETERINARY ADVANCES, vol. 6, no. 10, 2007, pages 1214 - 1218., XP055539710, Retrieved from the Internet
KESSLER R. H. ET AL.: "Estabelecimento de cultura in vitro de celulas embrionarias do carrapato Boophilus microplus", EMBRAPA GADO DE CORTE, MATO GROSSO DO SUL, vol. 54, 1999, pages 1 - 4, XP055539713, ISSN: 1516-733X
PASSOS, L. M. F.: "In vitro cultivation of Anaplasma marginale and A. phagocytophilum in tick cell lines: a review", REV. BRAS. PARASITOL. VET., vol. 21, no. 2, 2012, pages 81 - 86, XP055539718, ISSN: 1984-2961
Attorney, Agent or Firm:
NAKATA, Carolina et al. (BR)
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Claims:
REIVINDICAÇÕES

1 . PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE CÉLULAS TRONCO EMBRIONÁRIAS SÍMILE DE CARRAPATOS, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

(a) quebra das massas de ovos do carrapato em meio L-15B completo suplementado com soro fetal bovino obtendo uma suspensão celular;

(b) centrifugação da suspensão;

(c) descarte do sobrenadante e ressuspenção do botão celular no meio L-15B completo suplementado com soro fetal bovino;

(d) colocação em recipientes de cultura, os quais são incubados à temperatura de 28 - 34 QC, preferencialmente 30 QC;

(e) realização de subcultivos de acordo com o crescimento celular, preferencialmente com 80% - 100% de confluência;

(f) criopreservação de alíquotas das células;

(g) recuperação das células após a criopreservação.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por ser para a produção de células tronco embrionárias símile de carrapatos Rhipicephalus sp., preferencialmente R. microplus.

3. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo meio L-15B completo suplementado com soro fetal bovino compreender L-15 com açúcares e aminoácidos, L-Glutamina; Caldo de triptose fosfato; Lipoproteína; Solução Stock D; Solução de vitaminas e Soro fetal bovino.

4. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo soro fetal bovino estar na concentração final de 5% a 25%, preferencialmente 20% no meio.

5. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por na etapa de criopreservação (f), as células serem ressuspedidas em meio de cultura L-15B completo suplementado com 25% de soro fetal bovino e 10% de dimetil sulfóxido (DMSO), sendo então distribuídas em recipientes de criopreservação e armazenadas em nitrogénio líquido.

6. PROCESSO, de acordo a reivindicação 5, caracterizado por antes do armazenamento em nitrogénio líquido, as células serem mantidas por 30 minutos a 1 ,5 hora, preferencialmente 45 minutos, em gelo seco.

7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por na etapa de recuperação (g), os recipientes de criopreservação serem rapidamente descongelados, preferencialmente em banho- maria a 37 QC, e os conteúdos transferidos para recipientes contendo meio de cultura L-15B completo suplementado com 5% a 25%, preferencialmente com 20% de soro fetal bovino, os quais são centrifugados, o sobrenadante descartado, o botão celular ressuspendido em meio L-15B completo suplementado com 5% a 25%, preferencialmente com 20% de soro fetal bovino e as células incubadas a 28 - 34 QC, preferencialmente 30 QC.

8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por na etapa de quebra das massas de ovos (a), a idade dos ovos ser entre 12 e 14 dias após o início da oviposição.

9. CÉLULAS TRONCO EMBRIONÁRIAS SÍMILE DE CARRAPATOS, caracterizadas pelo fato de que são produzidas pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

10. CÉLULAS, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadas por expressarem marcadores de células tronco.

1 1 . CÉLULAS, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas pelos marcadores de células tronco serem um ou mais dentre OCT3/4, Nanog,

STRO1 , CD1 17, CD4-like, CD133 e VEGF-R1 .

12. CÉLULAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a

1 1 , caracterizadas pelo fato de que são substancialmente equivalentes à linhagem

IBU/RBM-12 (número de acesso CNCM 1-5170).

13. MÉTODO DE REPLICAÇÃO DE MICRORGANISMOS, caracterizado por compreender infectar as células, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9 a 12, ou obtidas pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, com um microrganismo e incubar as células infectadas.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo microrganismo ser selecionado dentre bactérias e protozoários.

15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a

14, caracterizado por, após a infecção das células, proceder-se com a criopreservação das células infectadas.

16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a

15, caracterizado por, após a criopreservação das células infectadas, proceder-se com o descongelamento e incubação das células infectadas.

17. MÉTODO DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE MICRORGANISMOS pelas células, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9 a 12, ou obtidas pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por compreender a incubação das células infectadas, opcionalmente manutenção das células infectadas em propagações, e identificação das proteínas de interesse a partir de extratos dos microrganismos obtidos das células infectadas.

18. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreende as células, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9 a

12, ou obtidas pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou extratos das mesmas, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

19. COMPOSIÇÃO IMUNOLÓGICA, caracterizada por compreender as células, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9 a 12, ou obtidas pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou extratos das mesmas, e um adjuvante.

20. MÉTODO DE DIAGNÓSTICO in vitro, caracterizado por compreender contatar as células, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9 a 12, ou obtidas pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou extratos das mesmas, com uma amostra de fluido de um animal ou indivíduo.

21 . USO DAS CÉLULAS, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9 a 12, ou obtidas pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou extratos das mesmas, caracterizado por ser como substrato para isolamento ou cultivo de microrganismos.

22. USO DAS CÉLULAS, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9 a 12, ou obtidas pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou extratos das mesmas, caracterizado por ser para expressão e/ou obtenção de proteínas de microrganismos.

23. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 22, caracterizado pelos microrganismos serem selecionados dentre bactérias e protozoários.

24. USO DAS CÉLULAS, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9 a 12, ou obtidas pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou extratos das mesmas, caracterizado por ser para obter clones e subclones de células com biomarcadores.

25. USO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por ser como marcadores de células tronco, proliferação celular, reguladores da progressão do ciclo celular e apoptose.

26. USO DAS CÉLULAS, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9 a 12, ou obtidas pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou extratos das mesmas, caracterizado por ser para a produção de vacinas e/ou proteínas recombinantes.

27. USO DAS CÉLULAS, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9 a 12, ou obtidas pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou extratos das mesmas, caracterizado por ser para produção de kits diagnósticos para a detecção de antígenos e/ou anticorpos para uso animal e/ou humano.

28. USO DAS CÉLULAS, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9 a 1 2, ou obtidas pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou extratos das mesmas, caracterizado por ser para produção de um medicamento para tratar doenças transmitidas por carrapato.

29. USO DAS CÉLULAS, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 9 a 12, ou obtidas pelo processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou extratos das mesmas, caracterizado por ser para prevenir ou tratar doenças transmitidas por carrapato.

Description:
PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE CÉLULAS TRONCO EMBRIONÁRIAS SÍMILE DE CARRAPATOS, CÉLULAS TRONCO EMBRIONÁRIAS SÍMILE DE CARRAPATOS, MÉTODO DE REPLICAÇÃO DE MICRORGANISMOS, MÉTODO DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE MICRORGANISMOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMPOSIÇÃO IMUNOLÓGICA, MÉTODO DE DIAGNÓSTICO

E USOS DAS CÉLULAS CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um processo para a produção de células tronco embrionárias símile de carrapatos e às células tronco embrionárias símile de carrapatos obtidas por tal processo. Ainda, se refere a um método de replicação de microrganismos, a um método de expressão de proteínas de microrganismos, a uma composição farmacêutica, a uma composição imunológica e a um método de diagnóstico in vitro, todos os quais compreendo as células de acordo com a presente invenção, ou produzidas de acordo com o processo da presente invenção. Além disso, se refere a usos das células de acordo com a presente invenção, ou produzidas de acordo com o processo da presente invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O estudo de agentes patogênicos em cultivos primários de células e/ou de tecidos de carrapatos é realizado há mais de 50 anos (Bell-Sakyi, 2004). Há aproximadamente 880 espécies de carrapatos mundialmente conhecidas (Guglielmone et al., 2010), e pouco mais de 50 linhagens celulares estabelecidas. Weyer (1952) foi um dos pioneiros na obtenção de cultivos primários de células do carrapato Rhipicephalus bursa (Canestrini & Fanzago). Porém as culturas não sobreviviam por mais de uma semana (Pudney et al., 1973). A primeira cultura contínua de células de carrapatos foi estabelecida por Varma et al. (1975). No entanto, o que fez a grande diferença foi a introdução do meio para cultivo L-15 (Leibovitz) e L-15 modificado (L-15B) (Kurtti, et al., 1988).

Consequentemente, o número de linhagens celulares estabelecidas aumentou significativamente a partir da década de 90 (Passos, 2012), quando foi possível criopreservar as culturas em diferentes passagens (Munderloh et al., 1994). Desde então, várias espécies de carrapatos têm sido cultivadas e mantidas nos bancos de células.

Muitas linhagens anteriormente estabelecidas estão depositadas em Pirbright, Surrey (Reino Unido), no banco de células denominado "Biobank" (https://www.pirbright.ac.uk/tickcells). A maioria dos bancos de células comercializam as linhagens. Assim os cultivos são mantidos em constante crescimento e uma parte apenas é criopreservada. Em geral, nestes bancos de células comercializáveis, os preços de cada linhagem podem ser consideráveis. Apesar de funcionar há mais de uma década, ainda não há amostras de linhagens de carrapatos sulamericanos depositadas no banco celular de Pirbright.

Diversos carrapatos são importantes na transmissão de agentes patogênicos, comprometendo principalmente a saúde animal, como os do género Rhipicephalus, representadas no país por Rhipicephalus sanguineus s.l. (Latreille) e Rhipicephalus {Boophilus) microplus (Canestrini). A primeira é parasita de cães e responsável pela babesiose e ehrlichiose canina, além de outras doenças, enquanto que a segunda parasita os bovinos e transmite os agentes da babesiose e anaplasmose bovina. Ainda, Amblyomma sculptum Berlese, que até recentemente era citada como Amblyomma cajennense (carrapato estrela), é um carrapato com alto grau de antropofilia, e transmite a bactéria Rickettsia rickettsii, causadora da febre maculosa na América Latina.

Muitos bioagentes transmitidos por carrapatos são autóctones e não crescem em meios sintéticos ou não se adaptam a outros substratos, sendo mantidos em sangue, como é o caso da bactéria Anaplasma marginale {Rickettsiales: Anaplasmataceae), causadora da anaplasmose bovina recém mencionada. Cultivos de patógenos em células podem auxiliar o diagnóstico e isolamento desses hemoparasitos. Entretanto, para a obtenção de culturas primárias de células embrionárias de carrapatos é fundamental a utilização de muitos animais de laboratório. Uma vez a linhagem celular estabelecida, certamente pode significar baixo custo, rapidez de resultados e diminuição no uso de animais de laboratório, o que está em acordo às normas estabelecidas pelo Conselho de Ética em Experimentação Animal.

Linhagens contínuas de células de carrapatos, a maioria estabelecida a partir de tecidos embrionários, possibilitam inúmeras aplicações por funcionarem como um simplificado sistema de vetor in vitro, que pode ser particularmente útil para estudos de patógenos intracelulares, epicelulares e relação hospedeiro-vetor; serve também como modelo animal e como substrato para o crescimento e isolamento desses patógenos; permite a produção de antígenos in vitro para uso em testes diagnósticos, produção de vacinas, anticorpos e proteínas recombinantes; bem como permite o uso dessas células para diversos estudos moleculares, imunológicos e de silenciamento gênico.

O estabelecimento de linhagens de células de carrapato, apesar dos avanços científicos nesta direção, ainda é uma atividade trabalhosa, que necessita de intensa experimentação e frequentemente suscetível ao fracasso. Isto porque dificilmente as condições estabelecidas para o desenvolvimento de uma linhagem derivada de células de carrapato de uma espécie, podem ser utilizadas para o desenvolvimento de outra, ainda que igual ou semelhante. De maneira geral, as células de carrapatos são bastante frágeis e exigentes, o que pode explicar o baixo número de linhagens estabelecidas de membros da classe Arachnida, particularmente da subclasse Acari (ácaros e carrapatos). Além disso, adicionando- se mais um grau de complexidade ao processo, Bell-Sakyi et al. (2007) relataram que células de algumas espécies de carrapato podem ser muito difíceis de serem reanimadas após criopreservação, etapa fundamental para a manutenção dessas linhagens contínuas.

Ainda que para o desenvolvimento de novas linhagens contínuas se tomasse, a partir da literatura existente, as condições já relatadas como ponto de partida, observa-se que as variáveis envolvidas no processo são inúmeras, as informações existentes são muitas vezes contraditórias e não há sugestão sobre quais variáveis devem ser consideradas em cada caso, de forma levar, com expectativa razoável de sucesso, a uma linhagem com as características desejáveis para os fins de interesse.

Na prática, o que se observa é que cada espécie pode ter particularidades com relação às condições de cultura (por exemplo, meio de cultura, suplementos, período de iniciação da cultura primária, temperatura da cultura, entre outras), sendo que tais particularidades podem influenciar de modo determinante no sucesso do estabelecimento da linhagem.

Adicionalmente, há que se considerar que ainda que possa existir uma pletora de linhagens celulares de uma mesma espécie de interesse, as particularidades da linhagem e/ou a condição da cultura podem não ser favoráveis para uma determinada finalidade. Por exemplo, a depender do patógeno ou doença de interesse a ser estudada, linhagem celular vetora adequada, em condição de cultura apropriada, deve ser preferencialmente utilizada, visto que propagação de alguns microrganismos não ocorre satisfatoriamente com linhagem ou condição diversa. E mesmo em se tratando da infecção pelo patógeno da linhagem celular adequada (patógeno-vetor conforme ocorre preferencialmente na natureza), nem sempre a linhagem celular estabelecida, ou sua condição de cultura, se mostram ótimos para determinada finalidade de interesse. Assim, é desejável que existam diversas opções disponíveis de linhagens contínuas de carrapato para atender a vários propósitos e, preferencialmente, a mais de uma finalidade.

Alguns estudos se propuseram ao estabelecimento culturas celulares a partir de tecidos embrionários de carrapatos. No entanto, desvantagens podem ser observadas em diversos processos, bem como a linhagem estabelecida nem sempre se mostrou adequada sob determinados aspectos, como por exemplo, para a propagação de patógeno particular de interesse, ou expressão e/ou obtenção de proteínas de membrana de tal patógeno.

Esta última finalidade tem particular importância no campo de estudo e produção de vacinas contra patógenos infectantes de interesse. As pesquisas mais atuais, relatadas na literatura sobre a obtenção de vacinas mais eficientes, têm abordado o estudo das proteínas externas de membrana do estágio eritrocítico de A. marginale, as MSPs (MSP1 , MSP2, MSP3, MSP4 e MSP5). As MSPs expostas na superfície estariam prontamente acessíveis ao sistema imune e, provavelmente, são essenciais para a sobrevivência do parasita no hospedeiro. As MSPs poderiam funcionar no transporte de nutrientes e/ou na adesão e invasão dos eritrócitos do hospedeiro (McGAREY et al., 1994).

Utilizam-se com frequência as linhagens derivadas de tecidos embrionários de Ixodes scapularis, em que a linhagem antiga IDE8 (Munderloh et al., 1994) é a mais conhecida. No entanto, até o momento, só existem algumas propagações feitas em IDE8 (Bell-Sakyi et al. 2007), que é originada de uma espécie de carrapato da América do Norte. Esta espécie não é vetora de Anaplasma na natureza, o que possivelmente tem limitado os avanços na pesquisa básica e aplicada que possui como objeto patógenos não naturais de tal vetor, como A. marginale.

De maneira geral, as tentativas de infecção de células de linhagem de

R. microplus fracassaram. Uma linhagem de R. microplus, que existe no banco celular da Universidade de Minnesota, em Minneapolis/St. Paul, USA (BME-26) (Kurtti et al., 1988), pôde ser infectada e propagada até a 10 â passagem (Esteves et al., 2009), mas não há indicação de ter havido criopreservação das células infectadas ou se o patógeno continuou nas células. Ainda, vale ressaltar que a linhagem BME-26 foi derivada a partir de um processo longo de obtenção, necessitando de 26 passagens antes do sucesso da criopreservação. Ainda, a caracterização celular e molecular da linhagem BME-26, reportada por Esteves et al. (2008), indicou as células BME-26 de R. microplus como potencialmente microbicidas e autofágicas.

Seria, pois, um objeto de interesse, a obtenção culturas de células embrionárias símile de carrapato, as quais fossem adequadas para propagação in vitro de bactérias, principalmente bactérias de relevância económica, como por exemplo A. marginale, causadora da anaplasmose bovina. Ainda, seria, pois, um objeto de interesse, a obtenção culturas de células embrionárias símile de carrapato, as quais expressassem proteínas importantes com propriedades vacinais, que permitiriam determinar, por exemplo, quais MSPs e outras proteínas de membrana de A. marginale, presentes no carrapato, teriam potencial relevância para a produção de vacinas de interesse.

Neste sentido, considerando-se a importância que advém da utilização de linhagem contínua de carrapatos, o estabelecimento de um processo otimizado e padronizado para obtenção de tal linhagem derivada de células embrionárias símile de carrapatos, como, por exemplo, o R. microplus, principal vetor de anaplasmose, se fez necessário. Para tanto, revelou-se o processo da presente invenção, que culminou na revelação da linhagem IBU/RBM-12 (número de acesso CNCM 1-5170).

Cabe ressaltar que o desenvolvimento da linhagem IBU/RBM-12, conforme revelada pela presente invenção, é em si inesperado, considerando a intensa necessidade de experimentação, a incerteza quanto ao sucesso e as particularidades necessárias para o estabelecimento de uma linhagem embrionária de dada espécie de carrapato que sirva aos fins de interesse. Portanto, a revelação da presente invenção, conforme reivindicada, representa real avanço em relação ao estado da técnica.

Tomados em conjunto, conclui-se que as culturas de células embrionárias símile, conforme reveladas pela presente invenção, são excelentes substratos para manutenção e cultivo in vitro de microrganismos, por exemplo, bactérias do género Anaplasma, como Anaplasma marginale. Além disso, quando infectadas, essas células expressam proteínas importantes com propriedades vacinais. Em particular, quando infectadas, permitem o isolamento de proteínas externas de membranas dessa bactéria, tais como: Mspl A, Msp2, Msp3, OMP7, P44.

Ainda, as células desenvolvidas e cultivadas de acordo com a presente invenção, demonstraram que a criopreservação foi bem-sucedida na passagem 12. Além disso, as células infectadas podem ser criopreservadas e, quando descongeladas, permitem a propagação do microrganismo e nova criopreservação.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 se refere ao oligonucleotídeo direto 5'-3' do gene que codifica a MSP1 b de Anaplasma marginale utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

SEQ ID NO: 2 se refere ao oligonucleotídeo inverso 5'-3' de MSP1 b de Anaplasma marginale utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

SEQ ID NO: 3 se refere ao oligonucleotídeo 5'-3' da sonda de hidrólise utilizado no experimento de PCR em tempo Real Quantitativa.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 ilustra fotomicrografias do cultivo de células embrionárias de R. microplus, por microscopia óptica de luz invertida. As Figuras 1 A e 1 B ilustram células na passagem 6, com aumentos de 200x e 400x, respectivamente, e as Figuras 1 C e 1 D ilustram células na passagem 7, com aumentos de 200x e 400x, respectivamente.

A Figura 2 ilustra fotomicrografia de células de R. microplus infectadas com A. marginale (setas) em aumento de 3000x por Microscopia Eletronica de Transmissão.

A Figura 3 ilustra fotomicrografia de células de R. microplus infectadas com A. marginale em aumento de 7000x por Microscopia Eletronica de Transmissão.

A Figura 4 ilustra fotomicrografia de uma célula de R. microplus totalmente destruída, evidenciando as bactérias A. marginale em aumento de 20.000x por Microscopia Eletronica de Transmissão.

A Figura 5 (A-C) ilustra fotomicrografias de culturas de R. microplus infectadas com A. marginale, coradas com Panótico rápido, obtidas por meio de microscópio óptico em aumento de 1000x. As barras indicam 10 pm.

A Figura 6, representando o diagrama de Venn, ilustra a distribuição do número de proteínas reconhecido pelos soros de animais vacinados, de animais infectados não protegidos e de animais não infectados, aquelas em comum a todos, e aquelas em comum a cada par de soros.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um processo para a produção de células tronco embrionárias símile de carrapatos e às células tronco embrionárias símile de carrapatos obtidas por tal processo. Ainda, se refere a um método de replicação de microrganismos, a um método de expressão de proteínas de microrganismos, a uma composição farmacêutica, a uma composição imunológica e a um método de diagnóstico in vitro, todos os quais compreendendo as células de acordo com a presente invenção, ou produzidas de acordo com o processo da presente invenção. Além disso, se refere a usos das células de acordo com a presente invenção, ou produzidas de acordo com o processo da presente invenção.

Assim, um primeiro objeto da presente invenção é um processo para a produção de células tronco embrionárias símile de carrapatos, compreendendo as seguintes etapas:

(a) quebra das massas de ovos do carrapato em meio L-15B completo suplementado com soro fetal bovino obtendo uma suspensão celular;

(b) centrifugação da suspensão;

(c) descarte do sobrenadante e ressuspenção do botão celular no meio L-15B completo suplementado com soro fetal bovino;

(d) colocação em recipientes de cultura, os quais são incubados à temperatura de 28 - 34 Q C, preferencialmente 30 Q C;

(e) realização de subcultivos de acordo com o crescimento celular, preferencialmente com 80% - 100% de confluência;

(f) criopreservação de alíquotas das células quando atingem um número expressivo de subcultivos;

(g) recuperação das células após a criopreservação.

Uma realização preferencial da presente invenção é um processo para a produção de células tronco embrionárias símile de carrapatos Rhipicephalus sp., preferencialmente R. microplus.

Em uma realização preferencial da presente invenção, o dito meio L-

15B completo suplementado com soro fetal bovino compreende L-15 com açúcares e aminoácidos, L-Glutamina; Caldo de triptose fosfato; Lipoproteína; Solução Stock D; Solução de vitaminas e Soro fetal bovino.

Em uma realização preferencial da presente invenção, o dito soro fetal bovino está na concentração final de 5% a 25%, preferencialmente de 20% no meio.

Em uma realização preferencial da presente invenção, na dita etapa de criopreservação (f), as células são ressuspedidas em meio de cultura L-15B completo suplementado com 25% de soro fetal bovino e 10% de dimetil sulfóxido (DMSO), sendo então distribuídas em recipientes de criopreservação e armazenadas em nitrogénio líquido.

Em uma realização preferencial da presente invenção, antes do dito armazenamento em nitrogénio líquido, as células são mantidas por 30 minutos a 1 ,5 hora, preferencialmente 45 minutos, em gelo seco.

Em uma realização preferencial da presente invenção, na dita etapa de recuperação (g), os recipientes de criopreservação são rapidamente descongelados, preferencialmente em banho-maria a 37 Q C, e os conteúdos transferidos para recipientes contendo meio de cultura L-15B completo suplementado com 5% a 25%, preferencialmente com 20% de soro fetal bovino, os quais são centrifugados, o sobrenadante descartado, o botão celular ressuspendido em meio L-15B completo suplementado com 5% a 25%, preferencialmente com 20% de soro fetal bovino e as células incubadas a 28 - 34 Q C, preferencialmente 30 Q C.

Em uma realização preferencial da presente invenção, na dita etapa de quebra das massas de ovos (a), a idade dos ovos é entre 12 e 14 dias após o início da oviposição.

Um segundo objeto da presente invenção são as células tronco embrionárias símile de carrapatos, produzidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção.

Em uma realização preferencial da presente invenção, as ditas células expressam marcadores de células tronco, em que preferencialmente, os ditos marcadores de células tronco são um ou mais dentre OCT3/4, Nanog, STRO1 , CD1 17, CD4-like, CD133 e VEGF-R1 .

Em uma realização preferencial da presente invenção, as ditas células são substancialmente equivalentes à linhagem IBU/RBM-12 (número de acesso CNCM 1-5170).

Um terceiro objeto da presente invenção é um método de replicação de microrganismos, que compreende infectar as células, conforme definidas pela presente invenção, ou obtidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção, com um microrganismo e incubar as células infectadas. Em uma realização preferencial, o microrganismo é selecionado dentre bactérias e protozoários.

Preferencialmente, após a infecção das células, procede-se com a criopreservação das células infectadas. Ainda, preferencialmente, após a criopreservação das células infectadas, procede-se com o descongelamento e incubação das células infectadas.

Um quarto objeto da presente invenção é um método de expressão de proteínas de microrganismos pelas células, conforme definidas pela presente invenção, ou obtidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção, compreendendo a infecção das células com o microrganismo, a incubação das células infectadas, opcionalmente manutenção das células infectadas em propagações, e identificação das proteínas de interesse a partir de extratos dos microrganismos obtidos das células infectadas.

Um quinto objeto da presente invenção é um método de expressão de proteínas de microrganismos pelas células, conforme definidas pela presente invenção, ou obtidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção, compreendendo a incubação das células infectadas, opcionalmente manutenção das células infectadas em propagações, e identificação das proteínas de interesse a partir de extratos dos microrganismos obtidos das células infectadas.

Um sexto objeto da presente invenção é uma composição farmacêutica compreendendo as células, conforme definidas pela presente invenção, ou obtidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção, ou extratos das mesmas, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Um sétimo objeto da presente invenção é uma composição imunológica, caracterizada por compreender as células, conforme definidas pela presente invenção, ou obtidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção, ou extratos das mesmas, e um adjuvante.

Um oitavo objeto da presente invenção é um método de diagnóstico in vitro, compreendendo contatar as células, conforme definidas pela presente invenção, ou obtidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção, ou extratos das mesmas, com uma amostra de fluido de um animal ou indivíduo.

Um nono objeto da presente invenção é o uso das células, conforme definidas pela presente invenção, ou obtidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção, ou extratos das mesmas, como substrato para isolamento ou cultivo de microrganismos. Preferencialmente, os microrganismos são selecionados dentre bactérias e protozoários.

Um décimo objeto da presente invenção é o uso das células, conforme definidas pela presente invenção, ou obtidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção, ou extratos das mesmas, para expressão e/ou obtenção de proteínas de microrganismos. Preferencialmente, os microrganismos são selecionados dentre bactérias e protozoários.

Um décimo primeiro objeto da presente invenção é o uso das células, conforme definidas pela presente invenção, ou obtidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção, ou extratos das mesmas, para obter clones e subclones de células com biomarcadores. Preferencialmente, o uso é como marcadores de células tronco, proliferação celular, reguladores da progressão do ciclo celular e apoptose

Um décimo segundo objeto da presente invenção é o uso das células, conforme definidas pela presente invenção, ou obtidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção, ou extratos das mesmas, para a produção de vacinas e/ou proteínas recombinantes.

Um décimo terceiro objeto da presente invenção é o uso das células, conforme definidas pela presente invenção, ou obtidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção, ou extratos das mesmas, para produção de kits diagnósticos para a detecção de antígenos e/ou anticorpos para uso animal e/ou humano.

Um décimo quarto objeto da presente invenção é o uso das células, conforme definidas pela presente invenção, ou obtidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção, ou extratos das mesmas, para produção de um medicamento para tratar doenças transmitidas por carrapatos.

Um décimo quinto objeto da presente invenção é o uso das células, conforme definidas pela presente invenção, ou obtidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção, ou extratos das mesmas, para prevenir ou tratar doenças transmitidas por carrapato.

Qualquer um dentre os objetos ou suas realizações preferenciais acima descritos podem servir de base para compor os outros objetos e suas realizações preferenciais, ainda que tal (tais) relação(ões) não tenha(m) sido explicitamente descrita(s). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

DEFINIÇÕES

Salvo se definido de outro modo, todos os termos da técnica, anotações e outras terminologias científicas aqui utilizadas destinam-se a ter os significados normalmente compreendidos pelos técnicos no assunto do campo da presente invenção. Em alguns casos, os termos com significados comumente entendidos são definidos no presente documento com a finalidade de trazer clareza e/ou para pronta referência, e a inclusão de tais definições no presente documento não deve ser interpretada, necessariamente, como representando uma diferença substancial em relação ao que é geralmente entendido no estado da técnica.

As técnicas e os procedimentos descritos ou referidos pelo presente documento são geralmente bem compreendidos e empregados usando a metodologia convencional pelos técnicos no assunto. Conforme apropriado, os processos que envolvem o uso de kits e reagentes disponíveis comercialmente são geralmente realizados de acordo com protocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante, salvo quando indicado de outra forma.

Vale ressaltar que a presente invenção, onde for apropriado, não se limita à metodologia, protocolos, linhagem de células, géneros ou espécies de animais, construções e reagentes específicos descritos, os quais, de forma óbvia, podem variar. Neste sentido, termos comuns do campo da presente invenção, tais como "incubação", "infecção", etc, quando não explicitamente indicado no presente pedido, que devem ser realizados de acordo com uma metodologia específica, devem ser interpretados como podendo ser realizados por qualquer metodologia conhecida por um técnico no assunto. Além disso, a terminologia utilizada no presente documento é apenas para o propósito de descrever exemplos de realizações específicas, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção.

Ao longo do presente documento, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a", ou formas singulares de qualquer termo ou expressão, incluem as referências ao plural, a menos que o contexto dite claramente de outra forma.

Ao longo do presente documento, a palavra "compreende", e quaisquer variações como "compreendem" ou "compreendendo", devem ser interpretadas como "termos abertos", podendo implicar na inclusão de elementos ou grupos de elementos adicionais, os quais não foram explicitamente descritos, não possuindo caráter limitativo. Ao longo do presente documento, a palavra "consiste", e quaisquer variações como "consistem" ou "consistindo", devem ser interpretadas "termos fechados", não podendo implicar na inclusão de elementos ou grupos de elementos adicionais, os quais não foram explicitamente descritos, possuindo caráter limitativo.

Ao longo do presente documento, os valores exatos ou faixas de valores exatos fornecidos com relação a um fator, quantidade, concentração ou preferência particular devem ser interpretados como também fornecendo valores ou faixas de valores aproximados correspondentes, tal como por meio da expressão "cerca de".

Ao longo do presente documento, palavras e expressões como

"preferencialmente", "particularmente", "por exemplo", "como", "tal como", "mais particularmente" e similares, e suas variações, devem ser interpretadas como características inteiramente opcionais, realizações preferenciais ou exemplificações possíveis não exaustivas, sem conferir caráter limitativo de escopo.

Ao longo do presente documento, todos os títulos e subtítulos são utilizados apenas por conveniência e não deverão ser interpretados como limitações da presente invenção.

Ao longo do presente documento, as expressões "células tronco", "células tronco embrionárias", "células tronco embrionárias símile" ou variações destas, devem ser interpretadas como células que possuem uma ou mais das características conhecidas na literatura como normalmente presentes em células denominadas desta maneira. Por exemplo, tais células, de acordo com a presente invenção, são as células que possuem características de células indiferenciadas. Por exemplo, tais células, de acordo com a presente invenção, são as células que possuem a capacidade de diferenciação. Por exemplo, tais células, de acordo com a presente invenção, são as células que são auto-renováveis (linhagem contínua). Por exemplo, tais células, de acordo com a presente invenção, são as células que possuem um ou mais marcadores de células tronco, conforme relatados na literatura. São exemplos de marcadores de células tronco os seguintes: OCT3/4, Nanog, STRO1 , CD1 17, CD4-like, CD133 e VEGF-R1 .

Ainda, ao longo do presente documento, a expressão "substancialmente equivalente" tal como na expressão "células substancialmente equivalentes à linhagem IBU/RBM-12 (número de acesso CNCM 1-5170)" deve ser interpretada como referindo-se às células que foram obtidas pelo processo, conforme definido pela presente invenção, ou por processo substancialmente semelhante ao definido pela presente invenção, em que a expressão "processo substancialmente semelhante ao definido pela presente invenção" deve ser interpretada como o processo que altera em uma ou poucas etapas ou em uma ou poucas características precisamente definidas dentro de cada etapa, em relação ao processo conforme definido pela presente invenção.

Ao longo do presente documento, a expressão "veículo farmaceuticamente aceitável" deve ser interpretada como qualquer excipiente, ou substância que não seja um ingrediente farmaceuticamente ativo. Assim, deve ser entendido, de acordo com a presente invenção, que qualquer veículo farmaceuticamente aceitável convencional, em qualquer forma, usualmente empregado para atuar como veículo, está dentro do escopo da presente invenção. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são devidamente conhecidos por um técnico no assunto, bem como podem ser escolhidos a partir de Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Remington, 22- edição ou Handbook of pharmaceutical excipients, Rowe, 8- edição, incorporados no presente documento como referência. O excipiente farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a: tampão ou solução salina, estabilizante, tensoativo, solubilizante, emulsificante e conservante.

Ao longo do presente documento, a palavra "adjuvante" deve ser interpretada como qualquer substância que module ou aumente a imunogenicidade dos peptídeos híbridos da presente invenção. Assim, deve ser entendido, de acordo com a presente invenção, que qualquer adjuvante convencional, em qualquer forma, usualmente empregada em composições com este fim, está dentro do escopo da presente invenção. O adjuvante inclui, mas não está limitado a: adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, hidróxido de alumínio, sílica e saponina.

A presente invenção também é ilustrada pelos exemplos a seguir que, todavia, não devem ser interpretados como limitações do escopo de proteção da invenção. As características descritas no relatório descritivo acima e nos exemplos a seguir podem, separadamente e em qualquer combinação, servir de base para a realização da presente invenção em suas diversas formas de concretização e realização possíveis.

EXEMPLOS

Fêmeas de R. microplus ingurgitadas foram utilizadas nos ensaios que seguem.

DESINFECÇÃO DAS FÊMEAS DE R. MICROPLUS

Em uma capela de fluxo laminar horizontal, as fêmeas ingurgitadas de R. microplus foram lavadas em álcool 70% e mergulhadas em solução de cloreto de benzalcônio 2% por 15 minutos. A seguir, os espécimes foram lavados em água destilada esterilizada contendo antibióticos por 5 minutos, adaptando-se a técnica utilizada por Kessler et al. (1999). Depois de secas em gazes esterilizadas, as fêmeas foram colocadas individualmente em placas de Petri estéreis, e mantidas em uma estufa biológica com demanda de oxigénio (B.O.D), à 26 Q C ± 1 e umidade de 90% ± 5, para realização das posturas.

Assim que as fêmeas iniciaram a oviposição, os ovos foram separados dia-a-dia (até o final da postura), em placa de Petri estéril, sendo mantidos em estufa BOD nas mesmas condições acima, até a data exata do início dos experimentos. A cada dia de oviposição, os ovos foram colhidos e acondicionados em tudo cónico etiquetado, conforme o dia da postura a contar do primeiro dia. O período de incubação dos ovos de R. microplus varia de 22-26 dias. Foram testados ovos com idades de 10, 12 e 14. Ovos com idades de 12 e 14 dias resultaram em melhor adesão celular, e consequentemente na obtenção da linhagem, conforme reivindicada. Ovos com idades de 10 dias não permitiram a obtenção de células viáveis em número suficiente para permitir expansão e multiplicação.

As massas de ovos foram pesadas e transferidas para tubos cónicos de 50 mL, e para lavagem seguiu-se os protocolos propostos por Munderloh et al. (1994) e Bell-Sakyi (1991 ) com pequenas modificações, conforme abaixo.

PROTOCOLO DE LAVAGEM DOS OVOS

Os ovos foram lavados conforme protocolo abaixo:

- 10 minutos em cloreto de benzalcônio 2%;

- lavagem com água ultrapura autoclavada;

- lavagem com álcool 70% filtrado por 10 minutos;

- lavagem com água ultrapura autoclavada;

- 30 minutos em solução de água ultrapura autoclavada com antibióticos e antifúngico (Anfotericina B);

- 5 minutos em hipoclorito de sódio 2%;

- lavagem com água ultrapura autoclavada por 3 vezes.

PREPARO DOS CULTIVOS PRIMÁRIOS Os ovos foram quebrados com auxílio de pistilo plástico estéril em microtubo de 2ml_, em meio L-15 sem suplementação (sem a Solução Stock de vitaminas e sem soro fetal bovino). A suspensão celular foi centrifugada a 100 x g por 8 minutos. Após o descarte do sobrenadante, o botão celular foi ressuspendido em 4 mL do meio L-15B completo (Solução Stock + triptose fosfato 10%) com 20% SFB e adicionado de antibióticos (4 μΙ_ penicilina/estreptomicina) e antifúngico Anfotericina B (0,8 μΙ_). O botão celular ressuspendido foi colocado em garrafa de 25 cm 2 , e mantido em estufa a 30 Q C. As culturas foram observadas diariamente em microscópio de luz invertida da marca Nikon, modelo Elipse. O meio foi trocado semanalmente.

COMPOSIÇÃO DO MEIO LEIBOVITZ (L-15B) (MUNDERLOH & KURTTI, 1989)

O meio L-15B completo suplementado com soro fetal bovino (SBF) tem sua composição como segue:

- L-15 com açúcares e aminoácidos (antibióticos e antimicóticos a depender do estágio da cultura)

- L-Glutamina

- Caldo de triptose fosfato

- Lipoproteína

- * Solução Stock D

- Solução de vitaminas

- Soro fetal bovino

* A solução Stock D (Stock A + Stock B + Stock C + Stock D) foi detalhada por Munderloh & Kurtti (1989). Em resumo, compreende: A - C0CI+6H2O, CuSO4+5H 2 O, MnSO4+H 2 O, ZnSO4+7H 2 O; B - NaMoO4+2H 2 O; C - Na2+SeO3; D - glutationa reduzida + Stock A + Stock B + Stock C.

Foi selecionado o Meio de Leibovitz L-15 suplementado com 10% de caldo de Triptose Fosfato, 20% de soro fetal bovino, 0,1 % fração V da albumina bovina e antibióticos. O pH do meio de cultura foi ajustado inicialmente para 6,7 e o meio esterilizado em filtro de nitrocelulose com 22 μιη de poro.

CULTIVOS SECUNDÁRIOS

Os subcultivos foram realizados de acordo com o crescimento celular, e a partir da segunda passagem, os antibióticos foram suprimidos. Quando a confluência alcançou 80%-100%, preferencialmente 90%-100%, as células foram retiradas da garrafa por meio de raspagem mecânica com auxílio de instrumento próprio para raspagem de células {cell scraper).

Após centrifugação em tubo cónico com 6 mL de meio completo (por 8 minutos a 100 x g) o sobrenadante foi descartado, o botão celular foi ressuspenso em 8 mL de meio e dividido em 2 garrafas. A partir da primeira passagem, as culturas com cerca de 8 x 10 5 células/mL foram criopreservadas conforme descrito mais abaixo.

CRIOPRESERVACÃO E RECUPERAÇÃO DAS CULTURAS

Uma alíquota da suspensão celular (corada com Azul de Tripan) foi utilizada para a contagem celular em câmara de Neubauer para o cálculo da concentração de células/mL a ser utilizada no processo de criopreservação.

Após a contagem celular, a suspensão (oriunda da raspagem contendo células + 8 mL de meio L-15B) foi centrifugada a 100 x g por 8 minutos, o sobrenadante foi descartado e o botão celular ressuspendido em 1 mL de meio de cultura L-15B contendo SFB na concentração de 25% acrescido de dimetil sulfóxido (DMSO) na concentração de 10%.

Os criotubos foram mantidos por 45 minutos em gelo seco e, em seguida, transferidos para nitrogénio líquido. Para recuperação das células criopreservadas, cada criotubo foi rapidamente descongelado em banho-maria a 37 Q C. O conteúdo foi transferido para tubo cónico de 15 mL contendo 5 mL meio de cultura L-15B com de soro fetal bovino a 20%. Após a centrifugação (100 x g por 8 minutos), o sobrenadante foi descartado e o botão celular ressuspendido em 4 mL de meio, sendo a seguir incubado em garrafa de 25 cm 2 .

INFECÇÃO DAS CULTURAS PRIMÁRIAS E SECUNDÁRIAS DE CÉLULAS EMBRIONÁRIAS DE R.

MICROPLUS COM ANAPLASMA MARGINALE

Cepa de bactéria altamente patogênica de A. marginale foi isolada de bezerro parasitado, oriundo de Jaboticabal-SP. A cepa é mantida por passagens em bezerros esplenectomizados, e criopreservada em dimetil sulfóxido (DMSO) a 10%, em nitrogénio líquido, a -196 Q C. Essa amostra foi utilizada para a infecção de células de R. microplus. As culturas primárias de células foram infectadas e a infecção foi mantida em propagações em meio L-15B suplementado com soro fetal bovino Hyclone (Bovine Calf Serum - BCS Hyclone ® ) de 2% a 5%, preferencialmente na concentração de 2%, nas culturas propagadas com A. marginale. Nesta concentração, o crescimento celular desacelerou compensando o aumento do patógeno e invasão de novas células. As células infectadas também foram criopreservadas. O DNA foi extraído a partir de células infectadas e não- infectadas utilizando kit comercial "Dneasy Tissue" (Qiagen, Chatsworth, CA) e analisado por PCR em tempo real. Figuras contendo tais células, obtidas por microscopia óptica e eletrônica de transmissão, foram preparadas.

PROTOCOLO PARA EXTRACÃO DE A. MARGINALE DAS CÉLULAS DE R. MICROPLUS

As células infectadas foram raspadas e centifugadas a 3000 rpm por 15 minutos. Em seguida, o botão celular recuperado foi lavado em meio L-15B ou PBS estéril por 3 vezes, com centrifugações intercaladas. Na última lavagem, as células foram ressuspendidas no meio de homogeneização.

MEIO DE HOMOGENEIZAÇÃO PARA VOLUME FINAL DE 1 L

O meio de homogeneização utilizado foi conforme protocolo abaixo:

- EDTA - 0,38 g;

- Trietanolamina com HCI (5 mM) - 0,93;

- Fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMCF) (1 mM) - 0,20 g;

- Completar com água ultrapura até 1 L e acertar o pH para 7,5.

PROTOCOLO DE CONGELAMENTO DAS CÉLULAS DE R. MICROPLUS INFECTADAS COM A.

MARGINALE

O protocolo de congelamento das células de R. microplus infectadas A. marginale foi o seguinte: as células foram mecanicamente raspadas da garrafa, o conteúdo transferido para um tubo cónico de 15 mL, e o tudo centrifugado a 1800 rpm por 8 minutos. O sobrenadante foi pipetado para outro tubo cónico de 15 mL e este então centrifugado a 4800 rpm por 15 minutos. O botão celular foi então ressuspendido em 1 mL de meio de cultura L-15B suplementado com 25% de SFB e 10% de dimetil sulfóxido (DMSO). O conteúdo foi então transferido para criotubos de 1 ,8 mL e mantidos por 45 minutos em gelo seco. Após, os criotubos foram transferidos para nitrogénio líquido.

PROTOCOLO DE DESCONGELAMENTO DAS CÉLULAS DE R. MICROPLUS INFECTADAS COM A.

MARGINALE

Os criotubos contendo células infectadas foram retirados do nitrogénio líquido e descongelados entre os dedos. O conteúdo foi transferido para um tubo cónico de 15 mL contendo 5 mL de SFB. Após centrifugação a 1000 rpm por 4 minutos, o sobrenadante foi descartado e 2,0 mL de meio L-15B suplementado com Hyclone (2%) foi adicionado, seguindo-se a homogeneização do conteúdo. O conteúdo foi transferido para nova garrafa para o cultivo de células. MICROSCOPIA ELETRÕNICA DE TRANSMISSÃO

As amostras das células de R. microplus não infectadas (controle) e infectadas com A. marginale foram fixadas em solução de Karnovsky em 0,1 M de tampão de cacodilato de pH 7,2 durante 2 horas. Foram então pós-fixadas numa solução de Tetróxido de Ósmio a 1 % no mesmo tampão durante 1 hora. Após a lavagem, foram imersas em solução de Acetato de Uranila a 0,5% com 13,3% de sacarose e mantidas a 4 Q C durante 24 horas. A desidratação foi realizada em série de etanol. Após a passagem em Óxido de Propileno, as amostras foram infiltradas com 1 :1 mistura de Óxido de Propileno com resina Epon durante 2-3 horas. As suspensões de células foram transferidas para BEEM cápsula com resina pura e centrifugou-se a 900 x g durante 5 minutos. Após a substituição da resina e nova centrifugação para sedimentar as células, as cápsulas foram secas a 60 Q C para a polimerização durante 2 a 3 dias.

Secções ultrafinas (60-70 nm) foram colocadas em grelhas de cobre, em contraste com uma solução aquosa de Acetato de Uranila a 2% durante 10 minutos, Citrato de Chumbo, durante 3 a 5 minutos (Reynolds, 1963) e, em seguida, examinadas sob um microscópio TEM LEO 906E (Zeiss, Alemanha). As imagens foram capturadas pela câmera CCD MegaView III por meio do item de programa - Universal TEM imagem Platform (Olympus macio Imaging Solutions GmbH, Alemanha).

PROTOCOLO DE ANÁLISE DE DNA DE A. MARGINALE

EXTRACÃO DE DNA A PARTIR DE CÉLULAS INFECTADAS

Para as amostras de cultura, realizou-se a extração de DNA utilizando- se o DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Como controle positivo da reação, foram utilizadas amostras de sangue de bovinos sabidamente positivos para Anaplasma marginale. Como controle negativo, células de cultura de R. microplus sem infecção com A. marginale. Após a extração e dosagem da concentração, o DNA foi armazenado a -20 Q C para realização da qPCR.

AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA PELA PCR EM TEMPO REAL QUANTITATIVA

PARA o GENE MSP1B DE A. MARGINALE

A qPCR foi realizada pelo método descrito por Carelli et al. (2007), com modificações para o gene msplfi. A reação foi realizada com volume final de mistura de 10 μΙ_, contendo 1 μΙ_ de DNA genômico, 5,0 μΙ_ de GoTaq Probe qPCR Master Mix (Promega), 0,9 μΜ de cada oligonucleotídeo iniciador (direto: 5'- TTGGCAAGGCAGCAGCTT-3' (SEQ ID NO: 1 ) e inverso: 5- 'TTCCGCGAGCATGTGCAT-3' (SEQ ID NO: 2)) e 0,2 μΜ da sonda de hidrólise (6FAM-5'-TCGGTCTAACATCTCCAGGCTTTCAT-3'-BHQ1 (SEQ ID NO: 3)). Os ciclos foram realizados sob as seguintes condições: 2 minutos a 50 Q C, 10 minutos a 95 Q C e 40 ciclos de 15 segundos a 95 Q C e 1 minuto a 60 Q C. As reações de amplificação foram conduzidas em aparelho termociclador CFX96 Thermal Cycler (BioRad, Hercules, CA, Estados Unidos). Todas as amostras foram testadas em duplicatas. A quantificação do número de cópias de DNA-alvo/ L foi realizada com a utilização do plasmídeo pSMART (Integrated DNA Technologies, Coralville, lowa, EUA) contendo a sequência alvo de 95 bp para amplificação do DNA do A. marginale (gene msplfi). A eficiência da reação foi calculada por meio de uma curva padrão obtido a partir de diluições seriadas do DNA plasmidial contendo a sequência-alvo. Para isso, diluições seriadas foram feitas a fim de construir uma curva padrão com diferentes concentrações de DNA plasmidial contendo a sequência-alvo (2,0 x 10 7 cópias/ μΙ_ a 2,0 x 10° cópias/ μΙ_). O número de cópias de plasmídeos foi determinado de acordo com a fórmula (Xg/pL DNA/[tamanho do plasmídeo (pb) x 660]) x 6,022 x 10 23 x cópias do plasmídeo/pL. Água ultrapura estéril (Qiagen, Madison, Estados Unidos) foi utilizada como controle negativo da reação.

PROTOCOLO DE ANÁLISE DE PROTEÍNAS DE SUPERFÍCIE DE MICRORGANISMO A PARTIR DE

CÉLULAS INFECTADAS

Partiu-se de extratos celulares de A. marginale obtidos de cultura de células do carrapato Rhipicephalus microplus, por metodologia descrita acima. Soro de bovinos imunizados e resistentes à infecção por A. marginale foi usado para imunoprecipitar as proteínas imunogênicas, que foram então encaminhadas para análise proteômica.

EXTRATO DE A. MARGINALE DE CULTURA DE CÉLULAS DE CARRAPATO

Realizou-se a extração e solubilização das proteínas presentes nos extratos celulares de A. marginale obtidos de cultura de células do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. A 1 mL de solução de células infectadas com A. marginale foram adicionados 2% de NP40, 1 mM PMSF e 5 mM de EDTA. Em seguida, a solução foi sonicada em 6 pulsos de 1 minuto de duração e 1 minuto de intervalo, à intensidade de 70% da potência máxima em sonicador de 450 W de potência, em gelo. A solução foi centrifugada a 10000 x g a 4 °C por 10 min para separação do sobrenadante contendo as proteínas solúveis dos restos celulares. Este sobrenadante foi utilizado nos experimentos seguintes.

IMUNOPRECIPITAÇÃO

A imunoprecipitação separa especificamente as proteínas do lisado que são reconhecidas pelos anticorpos do soro do animal infectado. Esta metodologia fornece informações mais precisas a respeito daquelas proteínas que de fato induzem uma resposta imune no animal infectado.

Anticorpos do soro de bovinos vacinados (V+), de animais infectados não protegidos (B+) e de animais não infectados (B-) são ligados a uma resina através de proteína A/G. Em seguida, um lisado de membrana de Anaplasma marginale, obtida de hemácias de bovinos infectados, é incubado com a resina ligada aos anticorpos. A resina é lavada e, em seguida, as proteínas que se ligaram aos anticorpos são removidas. Estas proteínas foram especificamente reconhecidas pelos anticorpos, e provavelmente são as mesmas que induziram sua produção nos animais dos quais foi coletado o soro. Através de análise proteômica por espectrometria de massas identificamos as proteínas com potencial de induzir a expressão de anticorpos protetores. Estas proteínas foram usadas como base para o desenho dos peptídeos apresentados nesta invenção.

Os anticorpos de soros de bovinos vacinados (V+), de animais infectados não protegidos (B+) e de animais não infectados (B-) foram acoplados à resina ligada com proteína A/G e a imunoprecipitação de proteínas de A. marginale reconhecidas por soros de bovinos infectados não protegidos e imunizados e protegidos foi realizada utilizando o kit Pierce Crosslink IP kit da Thermo Scientific, seguindo instruções do fabricante. Os soros utilizados eram constituídos de "pools" de soros de diversos animais na mesma condição. As soluções contendo as proteínas imunoprecipitadas foram submetidas à análise proteômica para identificação das proteínas reconhecidas pelos anticorpos.

ANÁLISE PROTEÔMICA

A análise proteômica do tipo shotgun consiste em identificar o conjunto de proteínas de uma determinada amostra. Nesta etapa as amostras em solução obtidas por imunoprecipitação são analisadas por espectrometria de massas. Para tal, as proteínas das amostras passam por um processo de: (1 ) redução onde se quebra as pontes dissulfeto, (2) alquilação onde os grupos -SH são alquiladas para evitar a formação das pontes de dissulfeto, (3) Digestão com enzima tripsina e (4) Dessalinização. As amostras são então analisadas no espectrômetro de massas. A identificação das proteínas é feita analisando-se os dados no software Mascot que faz uma busca dos peptídeos identificados contra um banco de dados das sequências protéicas do Anaplasma.

DIGESTÃO TRIPSÍNICA EM SOLUÇÃO

Às amostras lisadas foram adicionadas 5 μΙ_ de ditiotreitol (DTT) 1 M para redução das pontes dissulfeto, incubados por 1 ,5 hora em temperatura ambiente. Após a incubação com DTT, foi adicionado 20 μΙ_ de iodoacetamida para a alquilação das cisteínas por 1 hora no escuro em temperatura ambiente. Para consumir a iodoacetamida que não reagiu, foram adicionados 20 μΙ_ de DTT e incubado por mais 1 hora. Após a incubação, foram adicionados 775 μΙ_ de água ultrapura e 2 μΙ_ de trispsina (Sigma) quantidade suficiente para se obter uma razão protéica de 1 :50 e então incubado a 37 Q C overnight. No dia seguinte, a reação foi interrompida adicionando-se 2 μΙ_ de ácido acético 100%.

DESSALINIZAÇÃO DAS AMOSTRAS

As amostras foram dessalinizadas utilizando colunas de extração em fase sólida Sep-Pak Light tC18 (Waters Corporation, Estados Unidos). Inicialmente, as colunas foram condicionadas com 2 mL de metanol, seguido de 2 mL de ácido trifluoroacético (TFA) 0,1 % e acetonitrila (ACN) 50% e 1 mL de TFA 0,1 %, após o condicionamento, a amostra foi carregada com 1 mL de TFA 0,1 % duas vezes, lavada com TFA 0,1 %, e eluída da coluna com 2 mL de TFA 0,1 % e ACN 50% transferindo lentamente para um eppendorf novo de 2 mL, em seguida o Sep-Pak foi lavado com 2 mL de ACN 100%.

As amostras foram secas e concentradas em Speed-Vac (RVC 2-18,

CHRIST, Analítica). Após a secagem completa, as amostras foram ressuspendidas em 20 μΐ de ácido fórmico 0,1 % e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos para análise no espectrômetro de massas.

ANÁLISE POR ESPECTRÔMETRO DE MASSAS

As amostras foram analisadas no espectrômetro de massas LTQ

Orbitrap Velos (Thermo Scientific, Estados Unidos) acoplado ao cromatógrafo líquido de nano-fluxo EASY-nLC (Thermo Scientific, Estados Unidos). Os peptídeos foram separados por um programa de gradiente de 120 minutos, da seguinte forma: 5-40% do solvente B (90% acetonitrila em 0,1 % de ácido fórmico) por 90 minutos, seguido por 40-90% do solvente B por 20 minutos no fluxo de 200 nL/minuto usando uma pré-coluna empacotada com 5 cm de beads de C18 de 10 μιη (Júpiter, Phenomenex) em um capilar de dimensões ID 100 μιη x OD 360 μιη e uma coluna analítica de ponta com frit empacotada com 15 cm de beads C18 de 5 μιη (Aqua, Phenomenex) em um capilar de dimensões ID 75 μιη x OD 360 μιη.

O espectrômetro de massas foi operado em modo de aquisição dependente de dados (DDA, do inglês Data Dependent Acquisition), onde os 10 íons mais intensos de cada amostra foram selecionados para a fragmentação no ion trap linear utilizando a dissociação por fragmentação por colisão induzida por dissociação (CID) em MS/MS. A aquisição dos dados foi controlada pelo programa de computador Xcalibur 1 .4 (Thermo Scientific). De modo geral, as condições de análise foram: voltagem no capilar do nano-electrospray de 2,3 kV, temperatura da fonte a 250 Q C, tempo de injeção no ion-trap ajustado a 100 ms e no FT-MS em 1000 ms com uma resolução de 60.000 em m/z 300-1800. O tempo de exclusão dinâmica foi ajustada para 70 segundos. Os arquivos de dados do massa (.raw) foram convertidos para .mgf usando o software MS Convert (v.3.0.4445, ProteoWizard, SourceForge) e analisados no Mascot (v.2.4, Matrix Science Ltd, Boston, MA, USA). As proteínas foram identificadas através da pesquisa de dados MS e MS/MS em banco de dados de Anaplasma sp. baixados do Uniprot. A tripsina foi definida para a especificidade das enzimas com no máximo duas miss cleavages, a tolerância da massa dos íons precursores foi ajustado para 0,17. Na busca dos espectros MS/MS foram determinadas como modificação fixa a carbamidometilação de resíduos de cistéina, enquanto que a oxidação de metionina e acetilação de proteína N-terminal foram definidas como modificações variáveis.

RESULTADOS

CULTURA DE CÉLULAS, INFECÇÃO E PROPAGAÇÃO DO PATÓGENO

As culturas primárias de células embrionárias símile foram mantidas em constante crescimento na estufa à 30 Q C, sendo algumas criopreservadas.

O primeiro repique (raspagem e propagação celular em novas garrafas) foi possível após 12 meses do início do cultivo primário. O cultivo secundário (P1 ) por sua vez, pôde ser propagado após 6 meses, resultando em sucesso para a passagem 2 (P2). A partir desta fase, as células começaram a crescer rapidamente, triplicando a cada 15 dias nas primeiras passagens, mas dobrando a cada 3 dias após a passagem 8. Culturas na passagem 7 podem ser observadas (Figura 1 ). À medida que as células entraram em crescimento rápido (em P3), passou-se a fazer criopreservação, e a recuperação das células após 3 meses de congelamento foi bem-sucedida na passagem 12.

As infecções com A. marginale foram realizadas desde o início dos cultivos. A cada infecção e propagação, o patógeno foi extraído das células por centrifugação e o produto foi enviado para análise proteômica.

No total, foram infectadas com A. marginale mais de dez garrafas de cultura de células de R. microplus, que posteriormente foram propagadas para novas garrafas e também foram criopreservadas. Células infectadas na 4- propagação foram analisadas pela PCR em tempo Real. As curvas obtidas demonstraram que o material infectante foi transmitido para novas células, mesmo após congelamento. As imagens em microscópio eletrônico de transmissão evidenciam a presença de A. marginale nas células propagadas (Figuras 2-5). Assim, pode-se dizer que as culturas de células de R. microplus, conforme desenvolvidas pela presente invenção, são de fato excelentes para a manutenção e propagação de Anaplasma marginale, conforme indica a grande quantidade nas células em necrose (Figura 4).

EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE INTERESSE PELAS CÉLULAS E DETERMINAÇÃO DE ANTÍGENOS DE ANAPLASMA MARGINALE INDUTORES DE ANTICORPOS EM BOVINOS

Os soros dos animais vacinados (V+), de animais infectados não protegidos (B+) e de animais não infectados (B-) foram usados para imunoprecipitar proteínas de A. marginale com potencial para gerar proteção. O soro de animais não infectados, negativos para A. marginale, não apresenta anticorpos contra a bactéria, e foi usado como controle, ou seja, para descontar-se dos resultados obtidos com os soros positivos as proteínas reconhecidas por eventual reação cruzada inespecífica. O diagrama de Venn, apresentado na Figura 6, indica que as proteínas de maior interesse são aquelas reconhecidas pelo soro de animais vacinados, de animais infectados e aquelas em comum aos dois. As proteínas reconhecidas estão listadas na Tabelas 1 A-C e representadas no diagrama de Venn da Figura 6.

TABELA 1 - PROTEÍNAS IDENTIFICADAS ATRAVÉS DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS DE

AMOSTRAS IMUNOPRECIPITADAS COM OS SOROS DE ANIMAIS TABELA 1 A - ANIMAIS NÃO INFECTADOS (NEGATIVOS)

# Acesso Proteína

I0CKT9|I0CKT9_9RICK 60 kDa chaperonin (Fragment) OS=Anaplasma sp.

Alpha-ketoglutarate decarboxylase OS=Anaplasma D1 ASG3|D1 ASG3_ANACI

centrale (strain Israel)

Q5P9U5|Q5P9U5_ANAMM Ana29 OS=Anaplasma marginale (strain St. Maries)

Dihydrolipoyl dehydrogenase OS=Anaplasma centrale D1 ASU7|D1 ASU7_ANACI

(strain Israel)

Dihydrolipoyl dehydrogenase OS=Anaplasma

Q2GKV3|Q2GKV3_ANAPZ

phagocytophilum (strain HZ)

DNA polymerase III, epsilon subunit OS=Anaplasma

Q2GJZ1 |Q2GJZ1_ANAPZ

phagocytophilum (strain HZ)

Putative DNA recombination protein RmuC

Q2GKS0|Q2GKS0_ANAPZ

OS=Anaplasma phagocytophilum (strain HZ)

Putative glutamate synthase OS=Anaplasma centrale

D1 ASB6|D1 ASB6_ANACI

(strain Israel)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma

Q5PB93|Q5PB93_ANAMM

marginale (strain St. Maries)

Release factor glutamine methyltransferase

D1 ATR9ID1 ATR9 ANACI

OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

TABELA 1 B - ANIMAIS INFECTADOS

# Acesso Proteína

Dihydrolipoyl dehydrogenase OS=Anaplasma

D1 ASU7ID1 ASU7 ANACI

centrale (strain Israel)

DNA polymerase III, epsilon subunit OS=Anaplasma

Q2GJZ1 |Q2GJZ1_ANAPZ

phagocytophilum (strain HZ)

C5MQH1 |C5MQH1_ANAM Major surface protein 2 variant 9H1 (Fragment) A OS=Anaplasma marginale

Major surface protein 3 OS=Anaplasma centrale

D1 AUH6ID1 AUH6 ANACI

(strain Israel)

Major surface protein MSP1 a (Fragment)

G9JM05|G9JM05_ANAMA

OS=Anaplasma marginale

Outer membrane protein 7 OS=Anaplasma centrale

D1 ATI4|D1 ATI4_ANACI

(strain Israel)

Putative outer membrane protein OmpA

D1 AU79|D1 AU79_ANACI

OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Transketolase OS=Anaplasma phagocytophilum

Q2GL03|Q2GL03_ANAPZ

(strain HZ)

S5PA40IS5PA40 ANAPH Esterase OS=Anaplasma phagocytophilum str. TABELA 1 C - ANIMAIS VACINADOS E PROTEGIDOS

# Acesso Proteína

2,3-bisphosphoglycerate-independent

Q2GKV7|GPMI_ANAPZ phosphoglycerate mutase OS=Anaplasma

phagocytophilum (strain HZ)

2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate

D1 AT50|D1 AT50_ANACI cytidyltransferase OS=Anaplasma centrale (strain

Israel)

Alpha-ketoglutarate decarboxylase OS=Anaplasma

D1 ASG3|D1 ASG3_ANACI

centrale (strain Israel)

DNA polymerase III, epsilon subunit OS=Anaplasma

Q2GJZ1 |Q2GJZ1_ANAPZ

phagocytophilum (strain HZ)

D1 ASM5|D1 ASM5_ANACI Lon protease OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Major surface protein 3 (Fragment) OS=Anaplasma Q84H71 |Q84H71_ANAMA

marginale

Outer membrane protein 7 OS=Anaplasma centrale

D1 ATI4|D1 ATI4_ANACI

(strain Israel)

P44 major outer membrane protein (Fragment)

C6G2Q4|C6G2Q4_ANAPH

OS=Anaplasma phagocytophilum

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma

Q5PAX1 |Q5PAX1_ANAMM

marginale (strain St. Maries)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma

Q5PB93|Q5PB93_ANAMM

marginale (strain St. Maries)

Putative uncharacterized protein OS=Anaplasma

Q5PB95|Q5PB95_ANAMM

marginale (strain St. Maries)

Release factor glutamine methyltransferase

D1 ATR9|D1 ATR9_ANACI

OS=Anaplasma centrale (strain Israel)

Transketolase OS=Anaplasma phagocytophilum

Q2GL03|Q2GL03_ANAPZ

(strain HZ)

Uncharacterized protein OS=Anaplasma

Q2GJN6|Q2GJN6_ANAPZ

phagocytophilum (strain HZ)

Na Tabela 2 estão listadas as proteínas selecionadas em função dos resultados das análises proteômicas das proteínas imunoprecipitadas e que poderão servir de base para o desenho de uma vacina. São todas proteínas externas de membrana, altamente acessíveis ao sistema imune do animal infectado, ao contrário de proteínas internas da célula bacteriana que somente são expostas após processamento das bactérias por células fagocitárias apresentadoras de antígenos. Por outro lado, as proteínas externas, ou de superfície, são reconhecidas pela defesa do animal assim que a bactéria penetra seu organismo, permitindo uma rápida resposta imune. TABELA 2 - PROTEÍNAS IMUNOPRECIPITADAS COM SORO DE ANIMAIS VACINADOS

Proteína Sigla

Major surface protein 1 a MSP1 a

Major surface protein 2 MSP2

Major surface protein 3 MSP3

Outer membrane protein 7 OMP7

P44 major outer membrane protein P44

O soro de animais imunizados e protegidos, ou seja, vacinados, possui anticorpos protetores, já que impedem a infecção contra proteínas de superfície de A. marginale. As proteínas reconhecidas por estes anticorpos protetores e imunoprecipitadas são as que induzem a produção destes mesmos anticorpos pelo animal imunizado. A comparação destas proteínas com aquelas detectadas em A. marginale obtida de extrato de eritrócitos de boi infectados permitiu determinar as proteínas imunogênicas de A. marginale presentes na forma da bactéria encontrada no carrapato. Isto é importante visto que o primeiro contato que o bovino tem com a bactéria é com a forma vinda do carrapato transmissor. Em função deste resultado, é possível desenhar peptídeos, ou seja, partes das proteínas mais imunogênicas, a serem usadas, por exemplo, em abordagens vacinais contra a anaplasmose.

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