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Patent Searching and Data


Title:
PROCESS FOR PRODUCTION OF ANTIOXIDANT ACTIVE SUBSTANCE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2009/151057
Kind Code:
A1
Abstract:
Disclosed is a process for producing carnosic acid (the major antioxidant active substance contained in a rosemary plant) with high efficiency by carrying out the ortho-position oxidation of a phenol with an oxidizing agent (e.g., 2-iodoxybenzoic acid) and the subsequent ester removal reaction by using, as a starting material, pisiferic acid (the main component of Chamaecyparis pisifera which is a plant which has been planted in great numbers as wood resources). Specifically disclosed is a process for producing an antioxidant active substance contained in a rosemary plant and represented by general formula (5).  The process is characterized by comprising: a first step of oxidizing a pisiferic acid derivative represented by general formula (1) with an oxidizing agent represented by general formula (2) or (4); and a second step of reducing or hydrolyzing a pisiferic acid derivative intermediate produced in the first step.

Inventors:
TADA  MASAHIRO (3-8-1 Harumi-cho,Fuchu-sh, Tokyo 38, 〒1838538, JP)
Application Number:
JP2009/060547
Publication Date:
December 17, 2009
Filing Date:
June 09, 2009
Export Citation:
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Assignee:
National University Corporation Tokyo University of Agriculture and Technology (3-8-1, Harumi-choFuchu-sh, Tokyo 88, 〒1838588, JP)
国立大学法人東京農工大学 (〒88 東京都府中市晴見町3-8-1 Tokyo, 〒1838588, JP)
International Classes:
C07C51/367; A61K31/192; A61K31/366; A61P3/10; A61P17/10; A61P25/28; C07C62/32; C09K15/08
Foreign References:
JP2006199666A2006-08-03
JP2007508320A2007-04-05
Other References:
MINOMIYA K. ET AL.: 'Carnosic acid, a new class of lipid absorption inhibitor from sage' BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS vol. 14, 2004, pages 1943 - 1946
WALTER L. MEYER ET AL.: 'Diterpenoid Total Synthesis, an A?B?C Approach. VIII. Introduction of Oxygen at Carbon-11. Total Synthesis of (±)-Carnosic Acid Dimethyl Ether and (±)-Carnosol Dimethyl Ether' THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY vol. 41, no. 6, 1976, pages 1005 - 1015
Attorney, Agent or Firm:
Willigence IPR Firm (NOGISAKA Business Court, 1-20-2 MINAMI AOYAMA MINATO-KU Tokyo, 62, 〒1070062, JP)
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Claims:
下記一般式(1)で表されるピシフェリン酸誘導体と、
(上記一般式(1)において、R 1 は、COO R 3 、ヒドロキシメチル基、アルデヒド基のいずれかであり、R 2 及びR 3 は、それぞれ独立に水素原子または炭素数1ないし6のアルキル基を表す。)
下記一般式(2)ないし一般式(4)で表されるいずれかの酸化剤、
 
(上記一般式(2)及び(4)において、R 4 、R 5 及びR 6 は、それぞれ独立に水素原子または炭素数1ないし6のアルキル基、アリル基、フェニル基、ハロゲン化フェニル基、ハロゲン化アルキル基のいずれかを表す。上記一般式(3)において、Xは、ハロゲン原子、nは1又は2を表す。)
を、反応させることにより、酸化する第1の工程と、
前記第1の工程において生成するピシフェリン酸誘導体中間体を還元反応又は加水分解反応をさせる第2の工程を有することを特徴とする下記一般式(5)で表される
抗酸化活性物質の製造方法。
(下記一般式(5)中、R 1 は、COOR 4 、ヒドロキシメチル基、アルデヒド基のいずれかであり、R 2 、R 7 及びR 4 は、それぞれ独立に水素原子または炭素数1ないし6のアルキル基、アリル基、フェニル基、ハロゲン化フェニル基のいずれかを表す。)
 前記酸化剤が、一般式(3)において、X=Iであり、かつn=1である2-ヨードキシ安息香酸(IBXと言う)であることを特徴とする請求項1に記載の抗酸化活性物質の製造方法。
 前記酸化剤が、一般式(4)で表される2-ヨードキシ安息香酸トリアシルエステル誘導体であることを特徴とする請求項1に記載のローズマリーの抗酸化活性物質の製造方法。
 請求項1ないし請求項3の何れか1項に記載の製造方法により、製造した抗酸化活性物質。
 請求項4に記載の抗酸化活性物質を含有することを特徴とする糖尿病抑制剤。
 請求項4に記載の抗酸化活性物質を含有することを特徴とするアルツハイマー病抑制剤。
 請求項4に記載の抗酸化活性物質を含有することを特徴とするニキビ治療薬。
 
Description:
抗酸化活性物質の製造方法

 本発明は、抗酸化活性物質の製造方法に する。さらに詳しくは、サワラ等はじめと る樹木を原料とするカルノシン酸及びその 導体の製造方法に関する。

 ローズマリー、セージ、シソ、オレガノ バジル、タイム、マジョラム、ペパーミン 等のシソ科植物は、全世界に広く分布し、 200属3500種が知られている。上記シソ科植物 に含まれる抗酸化物活性物質を構造的な特徴 から分類するとフェノール性ジテルペン、カ フェ酸誘導体、フラボノイド、ビフェニル誘 導体の4つの型に大別される。

 上記シソ科植物の中でも、ローズマリー 、古くから肉料理の香辛料や民間薬として られ、カルノシン酸、カルノソール、ロス ノールに代表される強い抗酸化活性成分を 有することが広く知られている(非特許文献 1)。近年、このようなローズマリーが含有す 上記抗酸化活性物質は、抗菌活性、脳神経 胞死防止効果、脳血症の治療・予防効果、 ルツハイマー病予防効果、脂肪吸収防止効 、抗炎症作用、糖尿病患者の血糖値低下効 、美白効果など様々な活性が報告されてお 、食品添加物、サプリメント、医薬等とし の利用が検討されている(特許文献1及び非 許文献2ないし非特許文献4)。

 例えば、ローズマリー及びセージからなる より選択される少なくとも1種の植物由来の 抽出物を有効成分として含有する、神経突起 伸長剤が開示されている(特許文献2)。
 上記抽出物の一例であるカルノシン酸は、 ーズマリー等の所定部位をアルコールにて 出して得られることが開示されている。し しながら、ローズマリーの全草5000グラムに 対し、アルコール処理等を行い得られるロー ズマリーの抽出物から分離されたカルノシン 酸は、わずか1.5グラムであり、製造効率とし ては十分でないという問題点がある。

 また、上記抗酸化活性物質の一つである ルノシン酸を抽出する方法として、ローズ リーの葉を水溶性酸の存在下で、低級アル ルアルコール水溶液で処理して、さらに任 にカルノシン酸を抽出して精製することを む方法が開示されている(特許文献3及び特 文献4)。しかしながら、上記これらの方法に おいては、カルノシン酸の出発原料としてロ ーズマリーの葉を使用している。ローズマリ ーの葉は、生産量と価格によりその供給量は 大きく変わりものであり、安価にしかも大量 にカルノシン酸を供給できる製造方法という 観点からすれば十分ではない。

 一方、サワラは、日本特産の針葉樹であ 、天然生は栃木、群馬、及び長野県上高地 どに多く分布している。その葉及び樹皮に 、カルノシン酸の原料となる、ピシフェリ 酸等の関連化合物を大量に含有する(非特許 文献5)。さらにサワラには、現在、合成食品 加物として使用されているジブチルヒドロ シトルエン(BHT)やブチルヒドロキシアニソ ル(BHA)と同様活性を有する特定の物質が含ま れていることが明らかになっている。上記合 成食品添加物として使用されているジブチル ヒドロキシトルエン(BHT)やブチルヒドロキシ ニソール(BHA)等が発がん性など人体に影響 及ぼすことを鑑みれば、サワラを有効利用 た活用法が期待されているところである。

 このようにサワラ等の樹木は、植物資源 して有望であるが、それらの成分の際立っ 利用方法は開発されていない。一方、ロー マリー等の主要抗酸化活性物質であるカル シン酸の効率的な製造方法は開示されてい い。

 なお、本件特許出願人は、本件発明に関連 る文献公知発明が記載された刊行物として 以下の技術文献を開示する。

特開2001-158745号公報

特開2007-230945号公報

特表2001-518072号公報

特開2003-55686号公報 多田全宏、「シソ科香草に含まれる抗酸 化活性物質の生理活性」、FFIジャーナル オ  ジャパン、2000年、184号 S. C.Etter, 「Spices & Medicinal Plants」, Journal of Herbs,  11, 121-159 (2004) T. Satoh,K. Kosaka, K. Itoh, A. Kobayashi, M.  Yamamoto, Y. Shimojo, C. Kitajima, J. Cui,J. Kamins, S. Okamoto, M. Izumi, T. Shirasawa, S. A. Lipton,  「J. Neurochem.」, 104, 1116-1131 (2008) K.Ninomiya, H. Matsuda, H. Shimoda, N. Nishida, N. Kasajima, T. Yoshino, T.Morikawa, M. Yoshikawa,  Bioorg. Med. Chem. Lett.」, 14 (8), 1943-1946(2004) du Xiao,M. Kuroyanagi, T. Itani, H. Tatsuura, M . Udayama, M. Murakami, K. Umehara, N.Kawahara, 「Ch em. Pharm. Bull.」, 49 (11), 1479-1481 (2001).

 以上のような状況に鑑み、本発明の課題 、日本の山野に広く存在する樹木であるサ ラ等の常緑広葉樹を出発原料とし、カルノ ン酸及びその誘導体等を抽出して、抗酸化 性物質を製造する方法を提供することある

 本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭 研究した結果、サワラ等を原料とし、その 出物であるピシフェリン酸等の化合物のフ ノールのオルト位を特定の酸化剤により酸 することにより、強抗酸化活性成分である ルノシン酸及びその誘導体を製造すること できることを見出し、本発明を完成するに った。

 本発明は、以下の技術的事項から構成され 。すなわち、
[1] 下記一般式(1)で表されるピシフェリン酸 導体と、

(上記一般式(1)において、R 1 は、COOR 3 、ヒドロキシメチル基、アルデヒド基のいず れかであり、R 2 及びR 3 は、それぞれ独立に水素原子または炭素数1 いし6のアルキル基を表す。)
下記一般式(2)ないし一般式(4)で表されるいず れかの酸化剤、

(上記一般式(2)及び(4)において、R 4 、R 5 及びR 6 は、それぞれ独立に水素原子または炭素数1 いし6のアルキル基、アリル基、フェニル基 ハロゲン化フェニル基、ハロゲン化アルキ 基のいずれかを表す。上記一般式(3)におい 、Xは、ハロゲン原子、nは1又は2を表す。)
を、反応させることにより、酸化する第1の 程と、
前記第1の工程において生成するピシフェリ 酸誘導体中間体を還元反応又は加水分解反 をさせる第2の工程を有することを特徴とす 下記一般式(5)で表される

抗酸化活性物質の製造方法。
(下記一般式(5)中、R 1 は、COOR 4 、ヒドロキシメチル基、アルデヒド基のいず れかであり、R 2 、R 7 及びR 4 は、それぞれ独立に水素原子または炭素数1 いし6のアルキル基、アリル基、フェニル基 ハロゲン化フェニル基のいずれかを表す。)
[2] 前記酸化剤が、一般式(3)において、X=Iで り、かつn=1である2-ヨードキシ安息香酸(IBX 言う)であることを特徴とする[1]に記載の抗 酸化活性物質の製造方法。
[3]前記酸化剤が、一般式(4)で表される2-ヨー キシ安息香酸トリアシルエステル誘導体で ることを特徴とする[1]に記載のローズマリ の抗酸化活性物質の製造方法。
[4] [1]ないし[3]の何れかに記載の製造方法に り、製造した抗酸化活性物質。
[5] [4]に記載の抗酸化活性物質を含有するこ を特徴とする糖尿病抑制剤。
[6] [4]に記載の抗酸化活性物質を含有するこ を特徴とするアルツハイマー病抑制剤。
[7] [4]に記載の抗酸化活性物質を含有するこ を特徴とするニキビ治療薬。

 本発明によれば、サワラから極めて高い 率にて、カルノシン酸等に代表される抗酸 活性物質を簡易かつ大量に製造することが きる。また、本発明によれば、安価な特定 酸化開始剤を使用することにより、簡易な 程によりカルノシン酸等の抗酸化活性物質 製造することができる。

 以下、本発明の実施の形態を詳細に説明 る。

(サワラ等の樹木ついて)
 本発明の抗酸化活性物質の製造方法は、ま 、サワラ等樹木から、ピシフェリン酸及び の誘導体を抽出し、特定の過酸化物により ピシフェリン酸等のフェノールのオルト位 酸化し、その後還元反応または加水分解す 工程を有することを特徴とするものである

 本発明において、抗酸化活性物質とは、 えばカルノシン酸、カルノソール、ロスマ ール等に代表される強い抗酸化活性を有す 化合物をいう。本発明において「抗酸化活 物質」とは、ローズマリーのみから抽出し ものした以外にも、セージ、シソ、オレガ 、バジル等のローズマリー以外のシソ科植 を出発原料とし、又はこれらの出発原料を み合わせたものを出発原料として製造され 組成物を含むものである。本発明の抗酸化 性物質の製造方法に使用される原料は、本 明の製造方法の目的物質であるカルノシン 等の原料となる、ピシフェリン酸及びその 導体をその成分に含んでいればよく、特に 限されるものではないが、例えば、ヒノキ のサワラ属の樹木を例示することができる 上記樹木としては、例えばサワラ、シノブ バ、オウゴンシノブヒバ、ヒムロおよびヒ クヒバを例示することができる。上記例示 た針葉樹の中でも、その生産量及び取り扱 の観点から、サワラが好ましく、これらの 料を混合して使用することもできる。以下 本発明の製造方法の目的物質である抗酸化 性物質の出発原料となるピシフェリン酸及 その誘導体の一般式を示す。

 上記一般式において、R 1 は、COOR 3 、ヒドロキシメチル基、アルデヒド基のいず れかである。すなわち、R 1 は、カルボキシル基、カルボン酸エステル基 、ヒドロキシメチル基、アルデヒド基である 。

 R 2 、R 3 は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数1 いし6のアルキル基であり、炭素数1ないし6 アルキル基としては、メチル基、エチル基 n-プロピル基、i-プロピル基、n-ブチル基、se c-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、n- キシル基等を例示することができる。上記 般式において、R 1 がカルボキシル基(R 1 =COOH)かつR 2 が水素原子(R 2 =H)である場合には、下記化学式で示されるピ シフェリン酸となる。なお、ピシフェリン酸 は、サワラに最も多く含まれているジテルペ ンであり、かつ化学的に安定かつ、無色、無 臭の結晶である。また、R 1 がメトキシカルボニル基(R 1 =COOCH 3 )かつR 2 が水素原子(R 2 =H)である場合には、ピシフェリン酸メチル、 R 1 がカルボキシル基(R 1 =COOH)かつR 2 が水素原子(R 2 = CH 3 )である場合には、o-メチルピシフェリン酸メ チルとなる。

 サワラは、日本国の至るところで入手す ことができる常緑高木であり、きわめて容 に入手することができる。さらに、サワラ 、入手容易でありかつ、大量に存在するバ オマスである。なお、本発明においては、 ワラの部位の中で、ピシフェリン酸とその 導体化合物を多く含むのでもその葉と樹皮 使用するのが好ましい。

 サワラ等の原料から、ピシフェリン酸等 抽出する方法としては、特に制限されるも ではないが、例えば、以下の方法により抽 することができる。すなわち、サワラ等の 料を溶媒に浸漬又は溶媒によって還流する とにより容易に抽出することができる。使 できる溶媒としては、水、アルコール、ア カン、カルボン酸、エステル、ケトンを例 することができる。また、これら溶媒は、 独で使用することもでき、これら2種類以上 を適宜混合して使用することもできる。

 上記アルコールとしては、メタノール、 タノール、1-プロパノール、2-プロパノール 、1-ブタノール、2-ブタノール、2-メチル1-プ パノール、t-ブチルアルコール、1-ペンタノ ール、2-ペンタノール、3-ペンタノール、2-メ チル1-ブタノール、3-メチル1-ブタノール、2 2ジメチル1-プロパノールなどが挙げられる また上記アルカンとしては、ペンタン、へ サン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカ などが挙げられる。

 ケトンとしては、アセトン、メチルエチ ケトン(MEK)、ジエチルケトンが挙げられる また、必要に応じて、上記の有機溶媒から 種類以上を採択して混合溶液として使用す こともできる。上記溶媒の中でも、安全性 の取り扱いの観点から、水、アルコールの 独又は水とアルコールとの混合溶媒を使用 ることが好ましい。特に好ましくは水とエ ノールの混合溶媒とするのが好ましい。

 上記溶媒抽出を行う場合の抽出時間及び 出温度は、原料の種類により適宜設定する とができる。例えば、原料をサワラとし、 出する溶媒としてメタノールを採択して抽 する場合には、その抽出温度を還流温度に る事が望ましく、抽出反応時を10時間ない 24時間とすることができる。上記抽出方法に より、生成した下記一般式で示されるピシフ ェリン酸及びその誘導体を含有する溶液を抽 出後、濃縮し、カラムクロマトグラフィーに て分離後、再結晶によって精製することがで きる。

(ピシフェリン酸のオルト位酸化)
 本発明の抗酸化活性物質の製造方法は、上 化学式で示されるピシフェリン酸及びその 導体の構造式中、フェノールのオルト位酸 反応に際して、下記一般式で示される特定 過酸化物を採択した点に特徴を有する。す わち、本発明においては、下記一般式で表 れる酸化剤を使用し、ピシフェリン酸及び の誘導体のフェノールのオルト位を酸化す ものである。

(上記一般式(2)及び一般式(4)において、また R 4 、R 5 及びR 6 は、それぞれ独立に水素原子または炭素数1 いし6のアルキル基、アリル基、フェニル基 ハロゲン化フェニル基、ハロゲン化アルキ 基のいずれかを表す。上記一般式(3)におい 、Xは、ハロゲン原子、nは1又は2を表す。)

 一般に、フェノール類のオルト位酸化反応 おいて採択される方法としては、セレン酸 物による直接酸化方法、過酸化ベンゾイル よる酸化方法、空気酸化、2-Iodoxybenzoic acid( 以下、「IBX」と言います。)による酸化等方 を例示することができるが、これに限定さ るものではない。本発明においては、種々 酸化剤を使用することによって、例えばサ ラ属樹種等から抽出される、ピシフェリン 誘導体を酸化することができる。例えば、 アシル類を表す上記一般式(2)において、R 4 及びR 5 をハロゲン化フェニルとしたハロゲン化フェ ニルとしたメタクロロ過酸化ベンゾイル(mCBPO )と、ハロゲン化フェニルとハロゲン化アル ル基としたクロロアセチルメタクロロ過酸 ベンゾイル(CAMCBPO)を使用することができる 、これらの酸化剤に何ら限定されない。ま 、上記IBXの中でも酸化効率及び安全性の観 から、上記一般式(3)の中でも、Xをヨウ素と 、n=1としたIBXが特に好ましい。この点、後 する実施例においては、酸化剤としてIBXや 酸化ジアシルを用いたがこれに限定されな 。本発明においては、酸化剤として、上記 般式で表される安息香酸誘導体を使用する ともできる。

 上記酸化剤の中でも、IBXによる酸化では 酸化物が更に酸化され、複雑な混合物を生 することが多い。IBXによるオルト位酸化で 、酸化物が更に酸化され、オルト-キノンを 生成するが、一般的にオルト-キノンは不安 で分解しやすいので水素化ナトリウムよっ 速やかに還元することによってカテコール 変換した。また、安全かつ取り扱いが簡便 酸化剤としてメタクロロ過酸化ベンゾイル(m CBPO)とクロロアセチルメタクロロ過酸化ベン イル(CAMCBPO)を開発した。

 なお、本発明で使用する酸化剤である上 IBXは、2-ヨード安息香酸から所定の条件に 、簡易に製造することができる。以下に反 式を示す。

(オルト位酸化後のエステル基の還元的除去)
 IBXによる酸化後の生成したオルトキノンの 元反応に使用される還元剤としては、カル キシル基を還元しない程度の緩やかな還元 を有する触媒であれば特に制限されるもの はないが、たとえば、トリアルコキシ水素 アルミニウムリチウム[LiAlH(OR) 3 ]、水素化ホウ素リチウム(LiBH 4 )水素化ホウ素ナトリウム、トリアルキル水 化ホウ素リチウム(LiR 3 BH)及びジアルキル水素化アルミニウムを例示 することができる。なお、これらの還元剤は 単独で使用してもよいし、組み合わせて使用 してもよい。

(オルト位酸化後のエステル基の加水分解)
 また、オルト位酸化後のエステル基は加水 解によっても除去することができる。加水 解反応の触媒としては、水酸化ナトリウム 水酸化リチウム、水酸化カリウム、炭酸ナ リウム、炭酸カリウムなどの塩基類と水― タノール、水―エタノールなどの溶媒の組 合わせが考えられる。

 これらの還元反応または加水分解により 本発明の製造方法において目的とする抗酸 活性物質を製造することができる。このよ に本発明においては、入手可能で安価な過 化物を使用してピシフェリン酸等の化合物 フェノールのオルト位を効率よく酸化する とができる結果、抗酸化活性物質を高い効 で製造することができる。

 さらに、本発明においては、製造された 酸化活性物質を既知の方法によりカルノソ ルおよびロスマノールに変換することがで る。例えば、カルノソールは、カルノシン をDDQ、酸化銀または空気などによって酸化 ると、生成するキノンーキノンメチド互変 性体がラクトン化し、製造することがきる ロスマノールは、カルノソールを塩化メチ ン中、ピリジニウムクロロクロメート(PCC) よる酸化、または、炭酸水素ナトリウム存 下、空気による酸化によって製造すること できる。

 酸化剤として、IBXを使用し、さらに生成 たオルトキノンを水素化ホウ素ナトリウム の還元剤を使用してエステル基を還元する とができる。以下に反応式を示す。さらに 加水分解をすることにより、以下のIBXを用 たカルノシン酸の合成方法により、カルノ ン酸を製造することができる。

 このように本発明の製造方法によればカ ノシン酸及びその誘導体の抗酸化活性物質 簡易かつ容易にしかも大量に製造すること できる。更にこれらの抗酸化活性物質を原 としてカルノソール、ロスマノール等の有 な化合物を大量に製造することができる。

 以下、本発明について実施例を用いて説 するが、本発明は、何らこれらに限定され ものではない。

(実施例1)
<ピシフェリン酸の分離>
 サワラの葉(東京都府中市晴見町東京農工大 学農学部森林から採取)を採取し、そのまま 発原料とした。上記サワラの葉160gを秤量し メタノール約800ml中で約65℃にて、24時間還 した。次に、上記還流操作により得られた タノール抽出液を減圧濃縮した後、酢酸エ ルと水により液/液による抽出操作を行った 。さらに、上記抽出操作後、酢酸エチル層を 濃縮し、その濃縮物をシリカゲル、ヘキサン /酢酸エチル(体積比3:1)を用いて、カラムクロ マトグラフィーを行った。ピシフェリン酸を 含む画分を濃縮後、再度同様にカラムクロマ トグラフィーを行い、得られたピシフェリン 酸を含む画分をヘキサン/酢酸エチル(体積比3 :1)を用いて結晶化させ、目的化合物であるピ シフェリン酸248 mgを得た。

 上記生成したピシフェリン酸の融点及びそ 微細構造をそれぞれ、融点測定器及び 1 H-NMR、 13 C-NMRにより測定した。なお、融点測定器は、 Laboratory Device社製MEL-TEMPを使用し、補正なし 条件下で測定した。 1 H-NMRおよび 13 C-NMRの測定は、日本電子社製JEOL
alpha-600 ( 1 H: 600 MHz,  13 C: 150.8 MHz) スペクトロメーターを使用し。 クロロホルム中テトラメチルシランを標準 して測定した。

 図1にピシフェリン酸の分析結果を示す。
 ピシフェリン酸:
m.p. 174-180 ℃ ;  1 H-NMR
(600 MHz, CDCl 3 ) δ: 6.89 (1H, s), 6.67 (1H, s), 3.10 (1H, sept.,  J = 6.6 Hz), 2.89
(1H, dd, J = 16.2, 6.0 Hz), 2.82-2.76 (2H, m), 2.4 6 (1H, dddd, J = 13.1, 12.0,
11.0, 5.9 Hz), 1.94 (1H, m), 1.87 (1H, ddd, J = 1 1.0, 4.4, 2.8 Hz), 1.60 (1H,
ddd, J = 13.7, 3.4, 3.1 Hz), 1.49 (1H, dd, J = 1 3.2, 1.8 Hz), 1.45 (1H, d, J =
12.6 Hz), 1.24 (2H, m), 1.22 (3H, d, J = 6.6 Hz),  1.21 (3H, d, J = 6.6 Hz),
0.96 (3H, s), 0.82 (3H, s)

13 C-NMR (150 MHz,
CDCl 3 ) δ: 181.2, 150.6, 138.2, 133.5, 129.2,
127.4, 112.3, 52.2, 47.5, 41.7, 36.7, 34.0, 32.1, 29 .3, 26.8, 22.6, 22.3, 20.3,
20.1, 18.6.

<ピシフェリン酸のオルト位酸化>
 ピシフェリン酸(200mg:0.63mmol)を塩化メチレン (10ml)に溶解させた後、m‐クロロ過酸化ベン イル(590mg:1.9mmol)を加え溶解させた。この溶 を室温、アルゴン下で16時間放置した後、濃 縮した。濃縮残渣は酢酸エチルに溶かし、ヘ キサンを加えて析出した結晶をロ別した。母 液を更に濃縮しオルト位酸化されたカルノシ ン酸モノエステル含む混合物が得られた。こ の混合物をカラムクロマトグラフィー(酢酸 チルーヘキサン)を行いカルノシン酸モノエ テルの粗生成物(130 mg)を得た。
 カルノシン酸モノエステル : light yellow po wder ;  1 H-NMR
(600 MHz, CDCl 3 ) δ: 8.20 (1H, s), 8.10 (1H, dd, J = 7.5, 1.8 H z), 7.60 (1H, dd, J =
8.4, 1.8 Hz), 7.45 (1H, t, J = 8.4 Hz), 6.69 (1H,  s), 3.35-3.32 (1H,m),
2.97-2.86 (2H, m), 2.40-2.33 (1H, m), 1.91-1.87 (2H, m), 1.61-1.59 (2H, m),
1.52-1.48 (1H, m), 1.34-1.25 (2H, m), 1.20 (3H, d,  J = 6.6 Hz), 1.17 (3H, d, J
= 6.6 Hz), 1.01 (3H, s), 0.89 (3H, s) 

13 C-NMR (150 MHz,
CDCl 3 ) δ: 180.17, 163.70, 140.06, 136.69,
135.71, 134.81, 133.62, 130.97, 130.32, 129.94, 128.43 , 124.77, 119.2, 53.82,
48.36, 41.59, 34.32, 34.29, 32.59, 31.99, 27.64, 22.9 4, 22.75, 21.16, 20.05,
18.54

 以上の結果より、カルノシン酸モノエステ を含む分画をこれ以上精製することなく、 元的条件下でエステル基を加水分解し、水 基への誘導を行なった。カルノシン酸モノ ステル
を含む分画(70 mg)をメタノール(9ml)に溶かし 1%-NaOH(1ml)と水素化ホウ素ナトリウム(13.2 mg) 加え、アルゴン下2時間加熱還流した。生成 物は1M塩酸で酸性にし、食塩水―酢酸エチル 抽出した。抽出液は食塩水で洗浄、無水硫 マグネシウムで乾燥、濃縮した。濃縮残渣 ヘキサン抽出し、抽出液を濃縮し、濃縮残 をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘ キサン-酢酸エチル 5:1後に3:1)で精製し、カ ノシン酸 (23 mg)を得た。

 カルノシン酸:  1 H-NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ: 6.58
(1H, s), 3.35-3.31 (1H,m), 3.20 (1H, sept, J = 7.2 Hz), 2.85-2.79 (2H, m),
2.42-2.37 (1H, m), 1.92-1.78 (2H, m), 1.65-1.49 (3H, m), 1.36-1.22 (2H, m),
1.22 (3H, d, J = 3.0 Hz), 1.20 (3H, d, J = 3.0  Hz), 1.01 (3H, s), 0.93 (3H, s);
13 C-NMR (150 MHz, CDCl 3 ) δ: 182.63,
142.06, 141.53, 133.70, 128.92, 122.04, 119.44, 53.96,  48.76, 41.88, 34.44,
34.41, 32.60, 31.48, 27.16, 22.68, 22.47, 21.85, 20.3 8, 18.88.
 以上より、ピシフェリン酸からカルノシン までの2段階の総収率は25-55%であった。

(実施例2)
<クロロアセチルメタクロロ過酸化ベンゾ ル(CAMCBPO)を用いたカルノシン酸の合成>
 クロロ酢酸(59.7
mg, 0.63 mmol)を塩化メチレン(15 ml)に溶解し、 ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC, 143.5 m g, 0.70 mmol)を加え、アルゴン気流下0 ℃で15 分撹拌した後、メタクロロか過安息香酸(mCPB A, 152.7 mg, 0.88 mmol)を加え、アルゴン気流下 0 ℃で30 分撹拌し,クロロアセチルメタクロ 過酸化ベンゾイル(CAMCBPO)を生成させた。こ 反応液に、ピシフェリン酸(100 mg, 0.32
mmol)を加え、アルゴン気流下0 ℃→室温で66  時間撹拌した。セライトにより、dicyclohexylure aを濾過し、母液を濃縮後、酢酸エチルとブ インによって液‐液抽出した後、MgSO 4 で乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィー(hexane : EtOAc = 5 : 1) に供し、カルノシン酸モノエステルを含む租 生成画分(71.1 mg)を得た。この画分をこれ以 精製することなく、MeOH(9 ml)に溶解し、水素 化ホウ素ナトリウム(35.9 mg, 0.95 mmol)を加え さらに水酸化ナトリウム水溶液(1%水溶液, 1  ml)を加えアルゴン気流下2時間加熱還流した 。1 N塩酸によって反応を停止し、ヘキサン 液‐液抽出し、有機層を飽和NaHCO 3 及びブラインで洗浄した後MgSO 4 で乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィー(hexane : EtOAc = 10 : 1 )に供し、租生成であるカルノシン酸(23.3
mg, 0.07 mmol, 22.4%)を得た(化13を参照)。)
(実施例3)
 フェノール類のオルト位酸化反応において 用する、酸化剤としてIBXを使用し、生成物 還元する事によって、カルノシン酸を製造 た。
<2-iodxybenzoic
acid (IBX)の製造>
 過硫酸カリウム塩(デュポン社商品名:Oxone)(1 4.9 g, 26.0 mmol)を水(90 ml)に溶解し、2-iodobenzo ic acid (2.0 g, 8.00 mmol)を加え、70℃で3時間 拌した。反応液を1時間氷冷し、生成した結 を吸引濾過し、水(6×40 ml)とacetone(2×40
ml)で洗浄した。結晶個体を室温で乾燥させIBX (0.57 g, 2.03 mmol)を収率25%で得た。

 IBX ; white
powder ; m.p. ; 232-233 ℃ ;  1 H-NMR (600 MHz, d 6 -DMSO) δ ;
8.15(1H, d, J = 7.8 Hz), 8.04(1H, d, J = 7.2 Hz),  8.00(1H, t, J = 7.9 Hz),
7.85(1H, t, J = 7.8 Hz) ;  13 C-NMR
(150 MHz, d 6 -DMSO) δ ; 167.49, 146.55, 133.38, 132.95, 131.43,  130.08, 124.99

<IBXを用いたカルノシン酸の合成>
 ピシフェリン酸(316.4
mg, 1.00 mmol)を無水DMF(5 ml)に溶解し、IBX(336.0 mg, 1.20 mmol)を加え、アルゴン気流下室温で1 時間攪拌した。TLCにて酸化反応進行を確認後 、反応液にNaBH 4( 378.3 mg,
10 mmol)を加えアルゴン気流下室温で6時間攪 した。その後1 M HClを加え反応を停止させ Hexaneで液-液抽出した後、有機層をbrineで洗 した。その後MgSO 4 で乾燥し、濃縮した後にシリカゲルカラムク ロマトグラフィー(hexane : EtOAc = 10 : 1)で 製し、カルノシン酸(114.3
mg, 0.34 mmol)を34%の収率で得た。

 カルノシン酸;
yellow powder ;  1 H-NMR
(600 MHz, CDCl 3 ) δ ;
6.57 (1H, s), 3.30 (1H,d, J = 12 Hz ), 3.17 (1H, sept, J = 7.2 Hz), 2.86-2.78
(2H, m), 2.42-2.35 (1H, m), 1.88-1.85 (1H, m), 1.75 (1H, t, J = 12 Hz),
1.62-1.56 (2H, m), 1,48 (1H, d, J = 12 Hz), 1.34-1 .23 (2H, m), 1.21 (3H, d, J =
3.0 Hz), 1.20 (3H, d, J = 3.0 Hz), 1.01 (3H, s), 0.90 (3H, s);  13 C-NMR (150 MHz, CDCl 3 ) δ ; 183.39, 142.10,
141.32, 133.79, 129.02, 122.08, 119.38, 53.95, 48.67, 41.81, 34.46, 34.33,
32.59, 31.44, 27.13, 22.49, 22.12, 21.69, 20.31, 18.8 3

 以上の実施例から、サワラから高い収量で リフェリン酸(Pisiferic acid)を分離精製し、 れをオルト位酸化することにより、ローズ リーの主要抗酸化活性物質である
カルノシン酸(Carnosic
acid)を効率的に製造する事ができることが理 される。

 上記実施例は、近年、アルツハイマー病 様々な生活習慣病の予防効果があることで 目されているローズマリーの主用抗酸化活 物質を、木材資源として大量植林されてい サワラの葉から供給する事を可能にしたも であり、その技術的意義は極めて大きい。

(実施例4及び実施例5)
<抗菌活性の測定>
 実施例1によって合成したローズマリーの主 要抗酸化活性物質であるカルノシン酸(実施 4)およびこのカルノシン酸から合成したカル ソール(実施例5)を用いて、抗メチシリン耐性 黄色ブドウ球菌活性(抗MRSA活性)および抗アク ネ菌活性を測定した。すなわち、ニキビ(座 )は思春期頃から皮膚に生ずる慢性炎症性疾 で、ニキビの発症と悪化は食生活やストレ などの要因と毛穴に寄生したアクネ菌や黄 ブドウ球菌、皮膚ブドウ球菌の増殖(感染症 )が重要な役割を果たすと考えられている。 在までに本疾患の治療薬として使用が認め れている医療用外用抗菌薬は、種類が少な 古いものが多く、臨床治療に応用できる薬 が少ない。このため、日本のみならず海外 もニキビ(座瘡)の治療効果を持つ新規の有効 な治療薬が求められている。このような観点 から、合成したローズマリーの主要抗酸化活 性物質を用いて、抗メチシリン耐性黄色ブド ウ球菌活性および抗アクネ菌活性を測定した 。また、比較例として、実施例4及び実施例5 同様な条件下におけるバンコマイシン(比較 例1)及びアンピシリン(比較例2)の場合の抗メ シリン耐性黄色ブドウ球菌活性(抗MRSA活性) よび抗アクネ菌活性を測定した。測定結果 表1に示す。

 なお、抗アクネ菌活性の測定は、以下の うに行った。すなわち、実施例1で得られた 抗酸化活性物質を試料として、プルロニック L44(ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピ ン)にて10倍にて希釈し、これをアクネ菌用 地に10重量%希釈することで試料を1.0重量%濃 に調製した。コントロールとしては10重量% ルロニックL-44を用いた。GAM液体培地にてア クネ菌を24時間培養した後、沈殿させ、アク 菌用培地にて上記GAM液体培地を2回洗浄し、 これを接種菌液として試料に接種した。その 後、24時間、48時間後に残存菌数をカウント た。カウントは、アクネ菌用培地を用いて1. 0~100,000倍まで段階希釈し、平板塗抹法を用い 嫌気的に培養後カウントした。なお、上記抗 アクネ菌活性測定と同様の条件にてメチシレ ン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)に対する抗菌活性 の測定を行った。

 表1によれば、本発明の抗酸化活性物質の 製造方法により得られた主要な抗酸化活性物 質は、顕著な抗菌活性を有しており、これら の結果は、本発明の抗酸化活性物質がニキビ 治療薬として有用である可能性を示している 。

 本発明の抗酸化活性物質の製造方法は、 材資源として大量に植林されているサワラ 原料とした抗酸化活性物質の製造方法であ ので、林業及び環境技術分野の発展に貢献 ることができる。さらに、本発明のカルノ ン酸の製造方法は、医薬及び医療技術分野 技術革新に大きく貢献することができる。