PROCESO PARA LA PRODUCCIóN DE BROMELINA POR MEDIO DE

SUSTANCIAS INDUCTORAS DE PROTEíNAS EN PLANTA DE PEñA ESTABLECD3AS in vitro.

CAMPO DE LA INVENCIóN

La presente invención se relaciona con el campo de la biotecnología y en particular con la obtención de metabolitos secundarios por inducción, tales como la bromelina de plantas del género Ananas spp., previamente establecidas in vitr&.

OBJETO DE LA INVENCIóN

El objeto de la invención es el desarrollo de un proceso innovador para extraer bromelina de los tejidos naturales de la planta de pifia establecidos e inducidos m vitro, con una mayor actividad proteolítica y en altas concentraciones _^ en comparación con la proteína que se genera de forma natural en la planta y que es extraída actualmente por metodologías tradicionales.

En este proceso se utilizan plántulas de pina establecidas e inducidas in vitro, las cuales se maceran en un amortiguador de fosfatos para realizar su extracción. Posteriormente se someten a procesos de filtrado, centrifugado, congelada y liofilizado para obtener así un extracto crudo de bromelina caracterizado con altos rendimientos en términos de protema y actividad especifica.

ANTECEDENTES

Actualmente existen alimentos llamados nutracéuticos, que además del valor nutritivo aportan beneficios a la salud, es el caso de la pifia {Ananas cσmosus L.) que es fiíente de una mezcla de cistein proteasas, la más abundante es la bromelina, proteína que presenta efectos benéficos sobre enfermedades como cáncer y trombosis coronaria (Mackay y col., 2003).

La bromelina como nutracéutíco tiene varias acciones farmacológicas, como inhibir la agregación plaquetaria y aumentar la absorción de otros medicamentos. La bromelina es bien absorbida en forma oral y la evidencia clínica y farmacológica indica que sus efectos terapéuticos mejoran cuando se administra en altas dosis. Aunque todavía no se conocen completamente sus mecanismos de acción, sí se ha demostrado que es un complemento alimenticio efectivo y seguro (Mackay y col., 2003).

La bromelina puede ayudar en el tratamiento de la trombosis coronaria que se caracteriza por un bloqueo de los vasos sanguíneos por coágulos estructurados por tina proteína llamada fibrina y que es responsable de al menos, la mitad de las muertes en países desarrollados como Gran Bretaña. Los ataques al corazón son a menudo causados por un bloqueo de los vasos sanguíneos que irrigan el corazón. Una situación similar se observa en los accidentes vasculares cerebrales (Felton, 1980).

La formación de coágulos sanguíneos es un proceso que ocurre naturalmente en individuos normales pero que está controlado por un delicado balance entre la formación de coágulos y su degradación. La bromelina parece promover selectivamente la degradación natural de coágulos de sangre, sin causar hemorragias en sujetos que presentan bloqueos en vasos sanguíneos. La sangre contiene una proteasa natural que degrada coágulos llamada plasmina, la cual debe ser activada desde su forma inactiva, el plasminógeno. Si este sistema natural no está balanceado, los niveles de plasminas pueden estar bajos, permitiendo que los coágulos persistan y bloqueen los vasos sanguíneos. Investigaciones realizadas por Steven Tanssing en Hawai, han demostrado que la bromelina puede estimular la conversión de plasminógeno en plasmina, lo cual permite deshacer eficientemente los coágulos de fibrina (Fernández, 2001).

La bromelina también presenta una propiedad "antitrombótica" mediante la cual bloquea la conversión de protrombina en trombina, reduciendo de este modo la formación de coágulos. El efecto antiinfiamatorio de la bromelina está relacionado con este sistema. Se ha sugerido que la bromelina es una droga antiinflamatoria mejor que las drogas no esteroidales _^ tal como lo es la aspirina. Mientras que la aspirina inhibe la síntesis de todas las prostaglandinas, la bromelina -es más selectiva e inhibe la producción sólo de aquellas que aumentan la inflamación, sin afectar las

antiinflamatorias. Por su parte, el trauma y el estrés prolongado tienden a desplazar el balance hacia las prostaglandinas proinflamatorias^ proceso que es contrarrestado por bromelifla que tiende a restablecer el equilibrio perdido (Fernández, 2001).

La bromelina presenta aplicaciones industríales como ablandador de carnes, preparación de postres, gelatinas de bajo contenido calórico y en el proceso de fabricación de cerveza entre otros. También presentan aplicaciones médicas por ser una proteína cuya actividad enzimática le permite proporcionar beneficios en enfermedades como trombosis coronaria _^ ulceras gástricas e intestinales como modulador del sistema inmunológico y en el tratamiento de cáncer.

La bromelina es una proteasa que se ha encontrado en tejidos de plantas de la familia Bromeíiaceae, de las cuales la pifia (Anmtas cσmosus L.) es la más conocida. Esta enzima juega un papel fisiológico muy importante _^ al intervenir en reacciones metabólicas y proteger el vegetal del ataque de plagas y enfermedades, también influye de manera especial en el metabolismo nitrogenado durante la etapa de floración (Chávez y col., 1998).

Propiedades bioquímicas; de Ia bromelina son las siguientes: La bromelina pertenece al grupo de las cistein proteasas y según Murachi y col. (1964), entre sus propiedades más importantes se encuentran:

• pH óptimo aproximadamente 7 (Inagami y Murachi 1963).

• Estabilidad: La enzima mantiene su actividad sobre caseína a 50° C por 24 horas en un rango de pH de 4 a 10. Es estable en soluciones 25% de metanol (v/v) a 25° C por 20 min, y pierde un 50% de actividad al calentarse la solución enzimática a 55° C por 20 min a pH 6 (Whitaker y El-Gharbawi, 1963).

• La liofilización causa un 27% de pérdida de la actividad. (Murachi y col., 1964). • Pureza: Ha sido purificada por cromatografía líquida y la homogeneidad de la enzima se ha verificado mediante ultracentrifugación, sedimentación, electroforesis de disco en gel de acrilamida y análisis difusional. (Murachi y Tachibana, 1966).

El principal residuo amino terminal es la valina (Val) y el carboxilo terminal es glicina

(GIy). La enzima es una glicoproteína que contiene mañosa^ xilosa, fucosa y N-acetil- D-glucosamina, tiene un oligosacárido por molécula, el cual está covalentemente unido a la cadena peptídica (Feinstein y Whitaker, 1964).

La bromelina, obtenida de tallos de desecho, tiene un grupo sulfhidrilo reactivo por molécula, el cual es esencial para la catálisis enzimática (Murachi e Inagami, 1965). Las secuencias propuestas de aminoácidos en el sitio activo son:

Cys-Gly-Ala-Cys-Tϊp (Chao y Liener, 1967)

Asn-Gln-Asp-Pro-Cys-Gly-Ala-Cys-Trp (Husain y Lowe, 1968)

Propiedades físicas de la brometina.

Se indican las propiedades físicas de la bromelina obtenida de tallos, los datos sugieren que la enzima es una proteína básica con un peso molecular de aproximadamente 33,OOO Da (Yasuda y col., 1970).

a: Por Sedimentación-Difusión. b: Por constante ^" de Sedimentación y Viscosidad intrínseca. c: Por método de Archibald (Yasuda y col., 1970).

Procesos tradicionales de obtención.

Actualmente y de forma tradicional, el proceso de obtención de bromelina inicia con la molienda de tallos de plantas cultivadas sobre suelo para- la extracción y purificación del metábolito.

El proceso de preparación de bromelina que menciona la patente US3002891, consiste en la obtención de bromelina a partir de jugo de tallo de pifia dando como resultado una enzima con solubilidad, actividad y color satisfactorio en comparación con las extracciones que se realizan a partir del jugo del fruto de pifia.

La patente US3446626 protege un método de preparación de una solución de bromelina para inyección "antimortem" que se suministra a animales a fin de suavizar la carne. Se prepara la bromelina en una solución inyectable con un pH de 7.5 y se aplica 6 horas antes de la muerte del animal para causar la tenderización o suavización de la carne.

La Patente US3455787 menciona la extracción de bromelina a partir de tallo de pifia que involucra moler el tallo, extraer el líquido por medio de presión y centrifugación para precipitar cristales finos. Posteriormente, el líquido sobrante es centrifugado nuevamente. Durante el enfriamiento del centrifugado se utilizan solventes orgánicos y sales, así como detergentes solubles para realizar la precipitación.

Otra manera de obtener bromelina se menciona en la patente US3699001 en la cual se extrae el jugo, sometiendo los tallos a un tratamiento a bajas temperaturas, realizando una precipitación fraccionada a partir del jugo clarificado con compuestos orgánicos y liberación de Bromelina precipitada con compuestos orgánicos fríos.

Heinicke y Gortner reportaron un método cetónico para extraer bromelina, en el que el jugo de tallo se enfrió de 0-4° C, se centrifugó y el sobrenadante se colectó, repitiéndose dos veces la extracción y posteriormente se secó a vacío y se maceró reduciéndose a polvo de acetona, obteniéndose 2-5g de extracto por cada kilogramo de muestra fresca. Las pruebas demostraron que por medio del fraccionamiento con sulfato de amonio obtuvieron menos cantidad de proteína 0.871g pero con más actividad proteolítica 1.64 U/mg ^'1 .

Murachi y colaboradores, reportaron un procedimiento de purificación a partir del extracto crudo de proteínas del tallo, el cual fue suspendido en amortiguador fosfato de potasio pH 6.1 por 30 minutos, la suspensión se centrifugó a 5000 rpm durante 20 minutos, el precipitado se desechó y el sobrenadante se dividió en diferentes fracciones, las cuales fueron tratadas de diferente manera con Ia finalidad de comparar la pureza de la bromelina obtenida.

Estos procesos mencionan que obtienen la proteína a partir de plantas cosechadas en campo y presentan la desventaja de ser un extracto crudo, no purificado,

lo que provoca que contengan diversas moléculas que presentan actividades reducidas y baja calidad en los extractos.

Proceso de obtención por inducción. La presente invención considera la utilización de plantas establecidas in vrtro e inducidas por sustancias a estrés para producir la proteína. A este respecto, no se encontraron trabajos que mencionen o expresen una inducción directa para obtener bromelina en pina, únicamente se ha hecho para fines de estudiar la respuesta de la planta a diversos factores ambientales, entre ellos la sequía que es considerada como uno de los fenómenos ambientales más nocivos para la vida humana, por lo que se inició con la identificación y caracterización molecular de algunas proteínas cuya aparición coincide con el estrés. Como respuesta al déficit hídrico en el suelo provocado por el cloruro de sodio, las plantas producen una molécula reguladora del crecimiento, el ácido abscísico (AB A). Este es transportado por el xilema desde la raíz a hojas maduras en donde induce el cierre de estomas para evitar de esta manera una mayor pérdida de agua.

Existen inductores de proteínas por medio de estrés hídrico que buscan resistencia ante un déficit hídrico en las plantas como el maíz en donde se expresa la quinasa CK2 aumentando la tolerancia de los embriones ante un estrés hídrico.

Como el caso de la cebada, en donde se expresan proteínas 14-3-3 que actúan como reguladores de tolerancia frente la desecación de la planta. Por otro lado, hay otra serie de trabajos sobre la inducción de proteínas por estrés osmótico en raíces de cebada. En este caso los tratamientos con sal inducen o incrementan la síntesis de varias proteínas, destacando dos de ellas de 26 y 27 kD de peso molecular.

En estudios la atención se centró en la proteína de 26 kD conocida como osmotina, ésta presenta homología con otras proteínas involucradas en mecanismos de defensa en plantas, como inhibidores de proteasas, amilas de maíz y la proteína NP24 inducible por sal en el tomate (Singh y col., 1989).

Otro mecanismo de inducción de proteínas es por el ataque de patógenos o heridas causadas a la planta. Esta se defiende utilizando diversas estrategias, como la síntesis de metabolitos secundarios (MS) y la expresión de proteínas con actividades tóxicas hacia el patógeno. Un activador de esta defensa ha sido el AS (ácido salicílico) ya que se ha utilizado con éxito a nivel comercial en el control y prevención de ciertos patógenos así como en la resistencia al estrés causado por temperaturas extremas, por presencia de metales pesados y por herbicidas.

Dicha resistencia es mediada por diferentes proteínas PR (proteínas de resistencia), al parecer activada a través de distintas vías, unas dependientes de AS, otras de ácido jasmάmco (JA), óxido nítrico (NO) o etileno (Leszefc S. y Jankiewicz., 2003).

En el caso de aplicación exógena de compuestos activadores, se sabe que cada compuesto químico induce la expresión de diferentes proteínas PR. Tal es el caso del tabaco donde la aplicación exógena de AS da lugar a la inducción de proteínas de defensa (PR) como PR-I, quitinasa y b -1,3-gluconasa (Leszek S. y Jankiewicz., 2003). Sin embargo, los inductores anteriormente mencionados no provocan proteínas con actividad enzimática.

DESCRIPCIóN DETALLADA DE LA INVENCIóN

El objeto general de la presente invención constituye un proceso para k obtención de bromelina con una mayor actividad proteolítica y en mayor concentración en el tejido vegetal de la planta de pifia obtenida e inducida in vitro,, en comparación con la proteína que genera la planta de <mmpo de forma natural y que se extrae de forma tradicional.

El presente proceso de obtención de bromelina por medio de sustancias inductoras de proteínas en plantas de pifia {Ananas comosus), comprende las siguientes etapas:

Selección del material vegetativo

Se seleccionan plantas de Ananas comosus en campo, las cuales deben tener 1 -2 años de edad, 50 cm de altura, un diámetro foliar de 90 cm, y que tenga al menos 2 hijuelos

originados de raíz, donde dicho hijuelo tiene una altura de 15 a 20 cm, un diámetro de 4-6 cm, un peso de 200-50Og y 5 meses de edad; dichas características permiten la selección de un hijuelo joven que facilita el establecimiento m vitrσ.

Establecimiento del cultivo

Los hijuelos seleccionados de la etapa anterior se desprenden de manera manual, y ya en el laboratorio, se eliminan sus hojas y pedúnculos de la roseta para descubrir el meristemo apical e inmediatamente se sumergen en una solución de hipoclorito de sodio al 20 % durante 20 minutoS _j después son llevados a una campana de flujo laminar para realizar lavados continuos con agua estéril a una temperatura ambiente, para eliminar residuos del hipoclorito de sodio.

Después se seleccionan los meristemos apicales que no hallan sido dañados por el hipoclorito de sodio, para obtener explantes de 6x6x4 mm, para lo cual se hacen cortes perimetrales con el propósito de eliminar el tejido externo oxidado por el efecto del hipoclorito de sodio.

Dichos expíantes son sembrados en un medio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado, considerado para esta etapa "MS de establecimiento" adicionado con lmg/L de BAP (6-Beneilaminopurina), 30 g/L de sacarosa, 2 g/L de gel-rite y un pH de 5.7 ± 0.01.

Finalmente, los explantes sembrados son incubados en una cámara de crecimiento, a 27± 2 ^o C, un fotoperíodo de 16 h/luz y Sh/oscuridad durante 30 días, en donde se obtiene un brote de 1-2 cm de altura con al menos cuatro hojas, pero dichos brotes aun no deben de tener brotes axilares.

Multiplicación de propágalos

Los brotes de la etapa anterior, (manteniendo las condiciones de asepsia), se les aplica un corte longitudinal central, de tal manera que se obtienen dos partes, las cuales son sembradas τn vitrσ en un medio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado, considerado para esta etapa "MS de propagación" adicionado con 4-8 mg/L de BAP (6-Bencilaminopurina), 30 g/L de sacarosa, 2 g/L de gel-rite y un pH de 5.7 ± 0.01.

Estos brotes son incubados en una cámara de crecimiento a 27± 2 ^a C, a un fotoperíodo de 16 Muz y 8h/oscuridad durante 30 días, periodo en el cual, cada brote tiene una producción de 4-12 brotes laterales, de 0.5-0.7 cm de altura.

Esta etapa se repite al menos una vez, según el número de brotes que se desee obtener, por lo tanto los brotes obtenidos de esta etapa se les realizan las mismas condiciones de propagación por las que pasaron sus progenitores. Una vez obtenida la cantidad de brotes deseados, los brotes pasan a la siguiente etapa que es la inducción de bromeíina.

Inducción de bromelina

En esta etapa se realiza una selección de las plántulas obtenidas en la etapa anterior las cuales poseen un tamaño de 1-2 cm de altura, un promedio de 3-5 hojas y un peso de 120-250 mg, las cuales son sembradas in yitro en un medio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado, considerado para esta etapa "MS de inducción" adicionado con 30 g/L de sacarosa, 2 g/L de gel-rite y Sacarosa (30 - 90g/L) como inductor de estrés osmótico.

Los brotes se colocan en una cámara de crecimiento a 27± 2 ^o C, a un fotoperíodo de 16 h/luz y 8h/oscuridad, durante 7- 45 días, que es cuando los brotes presentan un tamaño de 2-5 cm, una formación de 6-10 hojas y un sistema radicular completo..

En el transcurso de esta etapa es recomendable hacer evaluación de la concentración de la bromelina total (μg proteína/g tejido) según el método de Bradford, la actividad específica de la enzima (U/mg proteína) por el método Dapeau (1976), a los 7, 15, 30 y 45 días para que de esta manera se logre saber el efecto del periodo de inducción en relación a la producción de bromelina. Cuando se tenga una actividad enzimática de (5- 6 U/mg de proteína), es el momento idóneo para hacer la extracción de la bromelina.

Extracción de la bromelina Las plantas se lavan en agua corriente para eliminar ios restos del cultivo, después se someten a una primera extracción, pasadas a través de un filtro prensa para obtener un primer jugo que tiene de 60-80% de bromelina, el cual es almacenado a (0-5° C).

El bagazo resultante, que obviamente aun contiene bromelina, es disuelto en un amortiguador de extracción, que contiene fosfato de potasio (K ₂ PO ₄ ) frío (0-5° C) para evitar la desnaturalización de la enzima, a una concentración de 0.03 a 0.2 M, a pH de

5.3 a 7.2, dejándose reposar de 20 a.30 minutos, para después pasar la mezcla al filtro prensa y obtener un segundo jugo de esta extracción; se prosigue a mezclar y homogenizar el primer jugo con el segundo jugo, a 2000- 5000 rpm durante 1-2 minutos, y después centrifugar a 5000-10 000 rpm de 15 -20 minutos, a 0-4° C para eliminar el precipitado y recuperar el sobrenadante el cual es conservado de -80 a 0° C y finalmente se liofíliza para lo cual dicho extracto debe contener por lo menos de un 10-15% de sólidos.

EXTRACTO CRUDO DEBROMELINA

Un gramo de extracto crudo, obtenido por el proceso antes descrito, se constituye de: compuestos fenólicos de 0.42- 3.7 mg,. clorofila de. 0.9-1 jO38 mg. y proteína total de 0.053-0.106 Ug.

Por lo tanto un gramo de extracto crudo tiene una actividad enzimática de 4.5-6.5 U/mg de proteína, actividad enzimática que no se ha encontrado en los extractos convencionales y una actividad deperoxidasas de 0.9-7-2.3-U/mg-de proteína.

El extracto crudo que se. obtiene a partir de esta inyención puede emplearse para aplicaciones biotecnológicas y farmacéuticas por presentar alta actividad enzimática.

Debido a la confusión que. se ha originado en la preparación, del medio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado del tradicional, es importante señalar que el modo de preparación es a partir de soluciones madre (Cuadro 1). A partir de este medio se prepararon los medios MS de establecimiento, MS de propagación y el MS de inducción.

Por lo tanto la invención también comprende dos medios de cultivo novedosos, el de propagación y el de inducción.

La modificación al medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962), consiste en que la solución de nitratos no se prepara para tenería en stock, sino que se prepara al momento de aplicarla en la preparación del medio, como se indica, en el siguiente proceso de preparación del medio a partir de soluciones madre:

1. En un vaso de precipitado- colocar 850ml de H ₂ Q destilada, agregar el volumen indicado de las soluciones concentradas:

2. Pesar, añadir y agitar basta disolver los síguientes reactivos:

3. Ajustar el pH del medio a 5.7 con hidróxido de sodio (NaOH) a 1N o ácido clorhídrico (HC1) a 1N y aforar a 1 litro.

4. Agregar el gelificante (gel-rite) 2g/L y calentar hasta lograr disolverlo.

5. Vaciar 30ml MS tradicional a frascos de capacidad de 460ml y agregar los regaladores de crecimiento, esterilizara 121° C, a una presión de 1.2 kg/cm ² por 15 minutos. En este punto se puede agregar el regulador de. crecimiento en cantidades de Img/L de BAP y el MS es denominado de establecimiento o si se le agrega de 4-Smg/L BAP es denominado MS de propagación.

6. En caso de prepararse el MS de inducción se considera hasta el punto numero 4 y se adicionan las sustancias indαctoras ya sea el cloruro de sodio NaCl a 0.1 - 4.5g/L,

Sacarosa a 40 - 90g/L y ácido salicílico a 0.001 -2.0 mMen. combinación o por separado, una vez agregando el inductor se vacían 30mi a frascos de capacidad de 460 ml y se esteriliza a 121° C, a una presión de 1.2 kg/cm ² por 15 minutos, con

excepción del medio contenga ácido salicílico, en ese -caso el medio es esterilizado sin el inductor y el inductor es agregado al medio hasta, que este es esterizado por filtración y bajo condiciones asépticas.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1. INDUCCIóN DE BROMELINA

El objetivo de esta etapa fue inducir la producción de bromeiina en plantas de piña por medio de sustancias inductoras (Sacarosa, NaCl y ácido- Salicítíco) con alta actividad enzimátíca.

Para realizar la evaluación de los inductores se realizó un diseño factorial de 3x3x3 con tres inductores a tres concentraciones diferentes y con tres tiempos de monitoreo (Cuadro 4), para cada tratamiento son asignadas tres unidades experimentales como repeticiones con tres plantas por unidad experimental. Las evaluaciones son realizadas utilizando a los inductores por separado o en combinación dando un total de 64 tratamientos.

Los parámetros evaluados son la concentración de la protema, total (μg proteína/g tejido) según el método de Bradford, la actividad específica de la enzima (U/mg proteína) por el método Dapeau (1976), a los 7, 15, 30 y 45 días durante la inducción.

La inducción se inició con la selección de los brotes previamente establecidos in vitro presentaron un tamaño de 2 cm con un promedio de 3 hojas y con un peso de 120 mg. Estas plantas se sembraron en un MS de inducción sin regulador de crecimiento y

agregando cloruro de sodio NaCl a 0.1 - 4.5 g/L como inductor de estrés hídrico,

Sacarosa a 30 - 90 g/L. como inductor de estrés osmótico y ácido salicílico a 0.001 -2.0 mM como inductor de resistencia a patógenos, dichas sustancia inductoras son añadidas en combinación (dos o más inductores) o por separado (un sólo inductor) según el tratamiento (Cuadro 5).

Una vez agregados los inductores al medio MS modificado se esterilizó a 121° C, a una presión de 1.2 kg/cm ² durante 20 minutos. Los tratamientos que contenían ácido salicílico, primero se esterilizó el medio MS modificado y posteriormente se le añadió el ácido, el cual fue esterilizado por medio de filtración, bajo condiciones asépticas en campana de flujo laminar. Aquí se recomienda agregar el ácido al medio antes de que se enfríe para lograr la homogenización del inductor con el medio antes de que éste se solidifique.

Los brotes son sembrados en condiciones asépticas dentro de frascos de 460 ml que contienen 30 ml de MS de inducción, dichos frascos son cerrados y sellados con cinta transparente para evitar cualquier filtración de aire y consigo la contaminación de los mismos.

Los tratamientos son trasladados a un cuarta de crecimiento bajo condiciones controladas a 27+ 2° C y un fotoperíodo de 16 h/luz y 8h/oscuridad por un periodo de 7, 15, 30 y 45 días.

Una vez trascurridos los primeros 7 días de inducción se lleva a cabo la extracción enzimática con Ia finalidad de obtener un extracto crudo. Se toman tres muestras de 30 ug/ml por cada tratamiento para determinar por triplicado la actividad específica.

Durante la evaluación de los inductores se puede concluir que todos los inductores, aplicados presentaron diferencias estadísticas, es decir a todos los tratamientos que se les aplicó una sustancia inductora, mostraron un efecto positivo ai producir bromelína en mayor actividad enzimática que los tratamientos sin inductores (testigos), el cuadro 6 muestra las diferencias de medias de los tratamientos que resultaron ser estadísticamente significativos, es decir los que presentaron las máximas actividades especificas durante los 15, 30y 45 días.

El comportamiento de los inductores con respecto al tiempo es el siguiente.

A los 7 días hay la presencia, significativa de la. enzima, a. 15 días aumenta la producción de bromelina, a los 30 disminuye y a los 45-días aumenta.

La siguiente es una suposición: La planta al verse amenazada produce proteínas de defensa en este caso bromelina la cual da a suponer que se trata de una proteína de respuesta rápida por presentar actividad enzimática a los 7 días de inducción y presentar sα máximo en actividad específica a los 15 días, al cabo de 30 días las plantas se adaptan, a sus condiciones por lo que se produce bromelina en menores cantidades, a los 45 días de inducción las plantas se ven sometidas a un. estrés por la escasez de. lo. nutrientes del medio y comienzan a producir de nuevo la bromelina pero en cantidades menores a las del inicio.

EJEMPLO 2. PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIóN DE BROMELINA Se tomaron plántulas cultivadas in vitro en los diferentes medios de cultiva señalados en la presente invención, se enjuagaran con agua corriente, pata eliminar el medio MS de inducción. Se pesaron 330 g de plantas, se colocaron en un extractor para su molienda y se obtuvieron 200 mi de jugo (primera extracción) que fueron almacenados a una temperatura de 4 °C. Al bagazo obtenido de la extracción se le adicionaron 670

mi de amortiguador de extracción (fosfato de potasio monobásico y fosfato de potasio dibásico) a un pH de 6.1 y una concentración de 0.05M; dejándolo reposar durante 20 minutos para posteriormente colectar a la enzima pasándolo a través de un extractor y así obtener el segundo jugo. EL siguiente paso es mezclar y homogenizar durante 1 minuto a 2000 rpm el jugo de la primera extracción con el de la segunda extracción y centrifugar a 10000 rpm durante. 20 min. a 4° C, para, posteriormente recuperar el sobrenadante con un volumen aproximado de 800 mi el cual es congelado a -80° C y liofilizado (10% de sólidos) para su conservación.

El procedimiento de. extracción, se aplicó para todos los tratamientos, a los cuales se les determinó la cantidad de proteína presente (Bradford) expresándose en mg de proteína por mi de extracto. Se utilizó, una curva estándar para los ensayos de proteínas. El estándar utilizado fue albúmina de suero bovino de 0.20-1.0 mg/ml.

Se obtuvieron en base a los resultados, las siguientes actividades especificas comparándolas con la bromelina comercial de importación y bromelina a partir de plantas in vitro inducidas.

Al realizar distintas pruebas de inducción de producción de bromelina, se obtiene una mayor actividad especifica utilizando como inductor sacarosa en un rango de 30 - 90g/L; en este caso la adición, de. sacarosa al medio provoca un estrés osmótico en la planta la cual utiliza como respuesta natural para la producción de bromelina.

Con el uso de los inductores en la propagación de plantas de pina in vitro se genera una mayor actividad enzimática desde, un 200 hasta, un 600% en comparación con la bromelina producida de forma natural en las plantas de pina cultivadas tradicionalmente.

La bromelina extraída a través, de. este procedimiento no requiere de métodos de. purificación para aumentar su actividad proteoíítica específica; la cual es ya mayor que la actividad proteolítica de la hromelina obtenida por los métodos de extracción actuales que incluyen una etapa de purificación.

El no someter a la bromelina a un proceso de purificación hace mucho más rentable su producción y minimiza las perdidas de la materia prima durante el proceso de purificación.

BIBLIOGRAFíA

1. Chao L.P. y I. E. Liener. 1967. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27: 100.

2. Chávez P. M., Márquez P. M., Hernández, Rodríguez A G. y B. Santos. 1998. "Certificado de autor de invenciónt".Oficina Cubana de la propiedad industrial. 3. Feinstein G. yJ.R. Whitaker. 1964. Biochemistry 3 : 1050.

4. Felton GE. 1980. Fibrinolytic and antithromhαtic action of bromelain may eliminate thrombosis in heart patients. Med Hypotheses; 6:1123-1133.

5. Fernández G. M. 2001. BremeliBaíel lado útil de comer piñas. Unidad de biología- celular. Universidad de Chile. 6. Heinicke R. M. y W.A. Gortner. 1957 Econ Bot. 11: 225.

7. Husain S.S. y G. Lowe. 1968. -Chem. Commun. p: 1387.

8. Inagami T. y T. MurachL L963. Biochemistry 2: 1439.

9. Leszefc S. y Janfciewicz. 2003. Reguladores del crecimiento, desarrollo y resistencia en plantas. Propiedades y acción. (l):321-350. 10. MacKay Douglas ND y Miller Lan L. 2003. Nutritional support for wound healing. Alternative Medicine. Review. 8:.359-377.

11. Murachi T. y T. Inagami. 1965. Biochemistry 4: 2815.

12. Murachi T. y A. Tachibana. 1966. Biochemistry 5: 2756.

13. Murachi T., Yasui M. y Y. Yasuda. 1964. Biochemistry. 3: 48.

14. Murashige T. y F. Skoog. 1962. A revised médium- for rapid-growth and biossays with tobaceo culture. Phisiol. Plant. 15: 473.

15. Singh, N. K., Handa, A. K,Hasegewa, P. M. and Bressan, R. A. 1989. Molecular cloning of osmotin and regulation of its expression by ABA and adaptation to low water potential. Plant Physiol. 90:1096- 1101.

16. Yasuda Y. N. Takahashi y T. Murachi. 1970. Biochemistry 9: 25.

17. Whitaker J. R. y M. El-Gharbawi. 1-963. Biochemistry 2: 476.