RODRÍGUEZ SÁNCHEZ, Álvaro Carlos (Avenida Eugenio Garza Sada #2501 Sur, Colonia TecnológicoC.P, Monterrey Nuevo León, 64849, MX)
MUÑOZ SANTANA, Sandra (Avenida Eugenio Garza Sada #2501 Sur, Colonia TecnológicoC.P, Monterrey Nuevo León, 64849, MX)
MARTÍNEZ VALDEZ, Laura Helena (Avenida Eugenio Garza Sada #2501 Sur, Colonia TecnológicoC.P, Monterrey Nuevo León, 64849, MX)
RAMÍREZ MEDRANO, Alicia (Avenida Eugenio Garza Sada #2501 Sur, Colonia TecnológicoC.P, Monterrey Nuevo León, 64849, MX)
ÁLVAREZ, Mario Moisés (Avenida Eugenio Garza Sada #2501 Sur, Colonia TecnológicoC.P, Monterrey Nuevo León, 64849, MX)
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| REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficiente mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas: 1. Un proceso para la producción de L-lactato, caracterizado porque comprende las etapas de: a) inocular un medio de cultivo sintético o natural que tiene como fuente de carbono lactosa, con Lactococcus lactis subespecie lactis microorganismo productor de L-ácido láctico y con tolerancia a sobrevivir en un medio con L-lactato; b) producir y acumular de forma continua, semicontinua o por lotes el L- lactato en el medio de cultivo, manteniendo condiciones de anaerobiosis que permitan a Lactococcus lactis subespecie lactis producir L-ácido láctico a partir de lactosa y que permitan a su vez transformar el L-ácido láctico a su forma disociada de L-lactato; y c) extraer determinado volumen de caldo fermentado del reactor biológico, 2. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cultivo es preferentemente natural. 3. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con la reivindicación 1 y 2, caracterizado porque el medio de cultivo natural, es lactosuero. 4. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con las reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de lactosa en el medio de cultivo se encuentra comprendida en el rango de 40 a 140 g/L, preferentemente entre 60 a 90 g/L y más preferentemente entre 70 a 80 g L. 5. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con las reivindicaciones 1, caracterizado porque en la etapa a) el medio de cultivo se encuentra estéril antes de la inoculación. 6. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con las reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cultivo comprende la adición de extracto de levadura a una concentración en el rango comprendido entre 0 a 10 g/L, preferentemente entre 5 a 10 g/L. 7. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa a) comprende añadir biomasa seca y/o liofilizada, en una concentración de al menos 0.1 gramos de biomasa seca o liofilizada por litro de medio de cultivo, con una viabilidad de al menos lxl O8 unidades formadores de colonia por gramo de masa seca y/o liofilizada. 8. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa a) comprende añadir la biomasa disuelta en un medio nutritivo de inoculación, agregando al menos 1 mi de solución de inoculo por litro de medio de cultivo con una viabilidad de al menos lxl O7 unidades formadores de colonia por mililitro de solución de inoculo. 9. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa b) la producción de L-lactato en el caldo fermentado, se lleva a cabo a un rango de temperatura comprendido entre 22 a 29°C. 10. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa b) el pH del caldo fermentado se mantiene en un valor constante en el rango comprendido entre 5 y 6 mediante la adición de una solución básica. . . . 11. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa b) se mantienen estrictas condiciones anaerobias. 12. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque en la etapa b) la concentración de etanol, ácido acético y/o ácido fórmico nunca supera el valor de 0.3 gramos por litro de caldo fermentado. 13. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa b) la concentración de galactosa o glucosa nunca es superior a los 0.3 gramos por litro de caldo fermentado. 14. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa b) el L-lactato se produce a una tasa global de por lo menos 0.5 g/L h. 15. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa c) se extrae el caldo fermentado con una concentración de L-lactato de al menos 20 g/L. 16. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cuando la producción de L-lactato es por lotes la etapa c) de recuperación, se realiza extrayendo la totalidad del medio de cultivo fermentado. 17. El proceso para la producción de L-lactato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cuando la producción de L-lactato es semicontinua o continua, la etapa c) de recuperación, es de forma intermitente. 18. El L-lactato obtenido de acuerdo al proceso de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque tiene una pureza óptica de al menos 90%. |
FERMENTACIÓN DE LACTOSUERO CON LACTOCOCCUS LACTIS
SUBESPECIE LACTIS.
DESCRIPCIÓN
CAMPO DE LA INVENCION.
La presente invención se relaciona con un proceso para producir L-lactato por fermentación de lactosa presente en un subproducto de la industria láctea, mediante Lactococcus lactis subespecie lactis.
OBJETO DE LA INVENCIÓN.
La presente invención tiene por objeto proveer un proceso para la producción de
L-lactato mediante la fermentación de lactosuero utilizando una cepa de Lactococcus lactis subespecie lactis.
ANTECEDENTES.
El lactato es un compuesto que se utiliza en una gran gama de formulaciones dentro de la industria alimentaria, cosmética, química y farmacéutica. Esta molécula es empleada como conservador, regulador de pH, saborizante, humectante y constituyente en productos cosméticos. Asimismo, el lactato puede ser empleado como precursor de otros compuestos, destacando entre ellos el ácido láctico. El lactato es la forma no disociada del ácido láctico, por lo que la conversión de lactato a ácido láctico depende básicamente del pH de la solución y la concentración global de la mezcla.
Así, una molécula de lactato es generada cuando una molécula de ácido láctico es neutralizada por acción de un agente alcalino, produciéndose así una sal de ácido láctico, es decir el lactato.
Por su parte, el ácido láctico es un compuesto químico muy versátil que es producido sintéticamente por la hidrólisis de lactonitrilo o bien por la fermentación de azúcares. Según lo reportado por K. Hofvendahl et al., alrededor del 90% de la producción de ácido láctico a nivel global se efectúa a través de un proceso fermentativo; esto se debe a que esta tecnología ofrece ventajas como la elección del microorganismo productor de ácido láctico, la obtención de un producto ópticamente puro y el uso de sustratos provenientes de fuentes renovables (Factors affecting the fermentative lactic acid production from renewable resources, Enzyme and Microbial Technology 26 (2000) 87-107).
Existen diversos carbohidratos que pueden ser empleados como materia prima fermentable para la producción de ácido láctico, algunos de los azucares fermentables que se utilizan son por ejemplo la glucosa, la galactosa, la lactosa, la melibiosa, la fructosa y la sacarosa. A nivel industrial, dichos carbohidratos fermentables son obtenidos a partir de cultivos tales como el maíz, el trigo, la caña de azúcar, el azúcar del betabel o el sorgo, por mencionar algunos. Sin embargo, la creciente demanda de estos productos para la industria de alimentos ha generado una escasez de los insumos seguida de un alza en el precio de los mismos. Por ello, nuevas fuentes de carbohidratos fermentables con mayor disponibilidad y menor costo son demandas. Respondiendo a esta demanda, diversos procedimientos exploran el lactosuero como fuente de carbohidratos fermentables.
De acuerdo con Y. G. Lomas De León y C. Rojas De Gante, el lactosuero es el subproducto más abundante de la industria láctea y principalmente de la manufactura del queso. Representa el 90% del volumen total de la leche que se utiliza, contiene alrededor del 50% de los sólidos de la leche, de la cual se separa gran parte de la proteína y de la grasa, quedando en el suero 25% de las proteínas de la leche utilizada, 8% de materia grasa y aproximadamente 95% de lactosa (Aprovechamiento de Suero de Leche de Cabra como Sustrato para el Desarrollo de un Producto Fermentado Probiótico con Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus, 2005).
A pesar de que la fermentación de carbohidratos representa una alternativa técnicamente viable, cuenta con una desventaja: la conversión de azúcares a ácido láctico genera una abrupta caída de pH en el medio de reacción, disminuyendo así la tasa de producción de ácido láctico por los microorganismos. La velocidad con la cual el pH del medio disminuye y el valor final que alcanza depende tanto del microorganismo empleado así como de las condiciones de fermentación. Más aún, la inhibición derivada de un pH bajo puede desviar la ruta metabólica de algunos microorganismos y generar otros metabolitos diferentes al ácido láctico, como pueden ser: etanol, ácido acético y/o ácido fórmico. Este tipo de procesos tienen rendimientos de conversión de sustrato bajos, ya que el azúcar no es empleado para generar el producto de interés, lo que se traduce a procesos menos rentables. Aunado a esta problemática, el tener más de un producto metabólico en el caldo de cultivo fermentado, dificulta e incrementa el número de operaciones unitarias destinadas a la recuperación primaria y purificación del ácido láctico. El obtener un caldo fermentado con la menor cantidad de contaminantes tendría implicaciones sustanciales sobre los costos operacionales de la purificación del ácido láctico.
En el estado de la técnica se encontraron datos desde 1955 concernientes a métodos y procedimientos para la obtención de ácido láctico mediante fermentación. En ese año, se describió un procedimiento para la obtención de ácido láctico y lactato cálcico por fermentación con cepas bacterianas lácticas a partir de caldos azucarados (ESO 1216084). En dicho documento se establece que la fermentación se debe efectuar a un pH constante de 7 y se establece como fuente principal de carbohidratos fermentables el azúcar de la algarroba. En 1983, la patente "Procedimiento para la obtención de ácido D- o L- láctico ópticamente puro" (ES8305044) presentó un procedimiento de fermentación en un medio acuoso nutritivo por medio de un microorganismo a un pH de 4 a 6 y que además contenía levadura de cerveza. En dicho documento se establece que la temperatura de fermentación se debe encontrar en un rango de entre 40 a 60 °C y que debe existir un pretratamiento de cocido de medio con N 2 durante 4 horas. Además, no se especifica el microorganismo que se debe emplear para alcanzar la mayor concentración de ácido láctico o si se llega a generar otro producto de fermentación.
En 1998, la patente "Fermentación de ácido láctico a pH bajo" (PA/a/2000/003606), menciona el aislamiento de cepas bacterianas homolácticas ácido- tolerantes de agua de infusión de maíz; la incubación de dichas cepas se realiza en un medio nutriente a un pH de 4 o menor y a una temperatura de al menos 30°C. En el mismo año se publicó la solicitud de patente W09828433, en la que se describe la producción de ácido láctico por fermentación de una bacteria ácido-láctica en un medio nutriente que contiene proteínas de lactosuero, al cual se le adiciona por lo menos una proteasa para la hidrólisis de las proteínas y amoniaco para el control de pH. En el 2004, se publicó la solicitud de patente "Method for producing lactic acid" (US2004033573) en la que se describe un método para la producción y aislamiento de ácido láctico. La fermentación descrita se efectúa por bacterias ácido-lácticas en un líquido conteniendo azúcar, proteínas y al menos una proteasa. No obstante, no se menciona la temperatura que se debe mantener durante la fermentación y además se menciona la presencia de productos diferentes al ácido láctico.
En la patente ES2321269 'Trocedimiento biotecnológico de obtención de ácido láctico natural" se describe el uso de suero de quesería como sustrato para la fermentación con bacterias lácticas. El proceso es llevado a cabo sin ajuste de pH, en el cual se separa el ácido láctico obtenido mediante un sistema de filtrado. No obstante, no se incluyen datos acerca de la concentración de ácido láctico alcanzada ni la presencia de metabolitos diferentes al ácido láctico. En "Process for the production of lactic acid by fermentation of whey" (EP0265409) se menciona un proceso que incluye la fermentación de lactosuero permeado por una bacteria del género Lactobacillus. Durante el proceso se mantiene una temperatura en el rango de 28 a 45°C y se controla el pH con el uso de una resina de intercambio aniónico. La solicitud de patente CN 100999744A establece un proceso para la producción de L-Ácido Láctico y/o D-Ácido Láctico a través de la fermentación mediada por bacilos. La reacción de fermentación es efectuada a una temperatura comprendida en el rango de 36 a 45 °C y emplea como materia prima caña de azúcar y/o sorgo dulce.
En la práctica se han utilizado diferentes géneros de bacterias ácido-lácticas para la producción de ácido láctico por fermentación. Particularmente, la bacteria Lactococcus lactis subespecie lactis ha sido utilizada principalmente en la industria para la manufactura de productos lácteos como queso y leche. Las industrias involucradas han tratado de mejorar y optimizar las condiciones en las que crece y se desarrolla la bacteria por medio de la manipulación de su ambiente; sin embargo, la investigación continua en vías de obtener beneficios adicionales en base a su aprovechamiento para la generación de otros productos tales como el ácido láctico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS.
Figura 1. Diagrama de flujo del proceso propuesto para la producción de L-lactato mediante fermentación de lactosuero con Lactococcus lactis subespecie lactis.
Figura 2. Gráfica que muestra la cinética de crecimiento microbiano basada en lecturas de absorbancia a 570nm a través del tiempo para el inoculo del Ejemplo 2.
Figura 3. Gráfica que muestra la cinética de la concentración de los diferentes compuestos de interés que se generan (ácido láctico, etanol, acetato) o consumen (lactosa, galactosa, glucosa) durante el proceso de fermentación a través del tiempo para el Ejemplo 3.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN.
Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un proceso industrialmente eficiente para obtener L-lactato útil como conservador, regulador de pH, saborizante, humectante y constituyente de productos cosméticos; mediante la fermentación de un producto de bajo valor para la industria láctea, como es el lactosuero.
En la presente invención se describe un proceso para la producción de L-lactato a partir de la fermentación de lactosuero efectuada por el microorganismo Lactococcus lactis subespecie lactis.
La cepa de Lactococcus lactis subespecie lactis empleada en el invento propuesto se caracteriza por ser una bacteria Gram positiva, catalasa negativa, anaerobia facultativa, mesófila, no formadora de esporas, con un tamaño de entre 0.4 a 1.4 um, cuya morfología es de cocos, ovoides y/o esferas. La bacteria es capaz de producir compuestos (ej. nisina y L-Ácido Láctico) que han sido catalogados como GRAS (Generally Recognized as Safé) por la FDA (Food and Drug Administration). Así en el proceso descrito, Lactococcus lactis subespecie lactis es empleada para producir L- Ácido láctico, aprovechando la alta tolerancia que tiene la bacteria a este compuesto.
El presente proceso para la producción de L-lactato contempla las siguientes etapas: la etapa de inocular (a) el medio de cultivo con Lactococcus lactis subespecie lactis, la etapa de producir y acumular (b) el L-lactato en el medio de cultivo y la etapa de extraer (c) determinado volumen de caldo fermentado del reactor biológico (Ver Figura 1). A continuación, se describe detalladamente cada una de las etapas: a) Inocular el medio de cultivo con Lactococcus lactis subespecie lactis.
El medio de cultivo utilizado para la producción de L-lactato relacionado con la presente invención, opcionalmente es un medio de cultivo sintético o medio de cultivo natural, siempre y cuando este medio de cultivo contenga apropiadamente lactosa, una fuente de nitrógeno y cantidades en trazas de los nutrientes que requiera el microorganismo.
El medio de cultivo sintético, es comúnmente utilizado en los procesos convencionales para obtener lactato, aun y que el aporte de cada uno de los componentes sea añadido individualmente para formular una solución nutritiva para microorganismos productores de lactato.
En la presente invención se prefiere un medio de cultivo natural, y para efectos de esta solicitud de patente con el término "medio de cultivo" nos referiremos a una solución acuosa homogénea cuyo constituyente principal es lactosuero, un producto de bajo valor comercial en la industria láctea y aquí aprovechado por su capacidad de proveer los nutrientes necesarios para que Lactococcus lactis subespecie lactis produzca L-lactato.
El lactosuero contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, factores de crecimiento que incluyen, por ejemplo, las vitaminas B, aminoácidos, nucleotidos y minerales, que participan como precursores anabólicos en la síntesis de biomasa y producción de L-lactato. De esta manera, el lactosuero proporciona agua, fuente de carbono, proteínas, calcio, tiamina (vitamina Bl), 1 riboflavina (vitamina B2), niacina (vitamina B3), minerales y otros factores de crecimiento que requiere Lactococcus lactis subespecie lactis para la producción de L-Lactato. Adicionalmente, es posible suplementar el lactosuero con extracto de levadura a una concentración en el rango comprendido entre 0 a 10 g L, preferentemente entre 5 a 10 g/L, con ello, se brinda una fuente adicional de nitrógeno, vitaminas y otros factores de crecimiento al medio de cultivo.
El lactosuero empleado como materia prima del presente proceso, puede ser de dos tipos: "lactosuero virgen" o "lactosuero pretratado"; entendiéndose por "lactosuero virgen" todo aquel lactosuero que no ha sufrido ningún tipo de tratamiento o procesamiento después de haber sido producido; y como "lactosuero pretratado" a aquel que se le ha efectuado algún tipo de tratamiento después de haber sido producido, por ejemplo pasteurización, clarificación, desmineralización y/o secado.
Independientemente, del tipo de lactosuero empleado se debe asegurar que:
i. la concentración de lactosa en el medio de cultivo al inicio del presente proceso se encuentre en el rango comprendido entre 40 a 140 g/1, preferentemente entre 60 a 90 g/L y más preferentemente entre 70 a 80 g/L, esto se logra incrementando o disminuyendo la cantidad de agua del lactosuero según sea el caso.
ii. el lactosuero se encuentre libre de cualquier carga microbiana. Para garantizar la reproducibilidad del proceso, el lactosuero empleado en la formulación del medio de cultivo debe encontrarse estéril. En esta etapa se deben emplear técnicas de esterilización que eliminen toda carga microbiana pero que garanticen la integridad de los nutrientes presentes en el lactosuero; así, para efectuar la esterilización se recomienda el uso de operaciones unitarias de microfiltración. En otra modalidad de la invención se pueden implementar operaciones de ultrafiltración, con tamaños de poro que comprenden un rango de entre 5,000 a 100,000 Da, que además de garantizar la esterilidad del lactosuero, disminuyan la cantidad de partículas inertes y un posible exceso de compuestos nutritivos, como pueden ser las proteínas del lactosuero.
De esta forma, el medio de cultivo cuenta con las propiedades físicas, químicas y biológicas idóneas para la incubación de Lactococcus lactis subespecie lactis y producción de L-lactato.
Durante la etapa de inocular el medio de cultivo, Lactococcus lactis subespecie lactis puede ser añadido al medio de cultivo como biomasa liofilizada, seca y/o disuelta en un medio acuoso.
Cuando la inoculación se efectúa empleando la cepa liofilizada o seca, se debe agregar la biomasa en una concentración de al menos 0.1 gramos de biomasa seca o liofilizada por litro de medio de cultivo, con una viabilidad de al menos lxl 0 8 unidades formadores de colonia por gramo de masa seca y/o liofilizada. Si la inoculación se lleva a cabo con Lactococcus lactis subespecie lactis disuelto en medio acuoso, se debe agregar al menos 1 mi de solución de inoculación por litro de medio de cultivo con una viabilidad de al menos lxl O 7 unidades formadores de colonia por mililitro de medio acuoso; para efectos de la presente, en cuanto la biomasa liofilizada es disuelta en el medio acuoso la nueva mezcla recibe el nombre de solución de inoculación. b) Producir y acumular el L-lactato en el medio de cultivo.
En esta etapa se establecen las condiciones aptas para que Lactococcus lactis subespecie lactis atraviese las fases de crecimiento microbiano de latencia, exponencial y estacionaria. La producción de L- Acido láctico se presenta cuando Lactococcus lactis subespecie lactis abandona la fase de latencia y comienza su fase de crecimiento exponencial.
La producción de L-ácido láctico en el caldo fermentado conlleva a una disminución en el pH de la solución. En la presente "caldo fermentado" se refiere a la solución acuosa homogénea, que originalmente era el medio de cultivo, pero que después de la etapa de inoculación ha sufrido un cambio en su composición debido a la reacción de fermentación; los principales cambios en la composición implican un aumento en la concentración de biomasa y L-lactato. Si la reacción de fermentación continuará sin la adición de un agente alcalino, el pH del caldo fermentado alcanzaría un valor inferior a 4 generando una inhibición en la producción de L-Acido Láctico; en dichas instancias la productividad global en la producción de L-Ácido láctico sería inferior a los 0.3 gramos de L-Ácido láctico por litro de caldo fermentado por hora. Para evitar que dicho proceso inhibitorio tome lugar, la presente invención contempla mantener el pH del caldo fermentado en un valor constante en el rango comprendido entre 5 y 6 mediante la adición de una solución básica, por ejemplo de hidróxido de sodio;, preferentemente, dicha solución debe encontrarse a un valor de pH en el rango comprendido entre 10 y 14 para adicionar el menor volumen de solución básica posible al recipiente de fermentación. Al agregar el agente alcalino, se genera L-lactato por la reacción de neutralización entre el L-Ácido láctico y el grupo básico del agente alcalino.
En la presente invención, la producción de L-lactato se caracteriza por ocurrir en el caldo fermentado a un valor de temperatura constante en el rango comprendido entre 22 a 29°C, preferentemente entre 25 a 29°C. El operar dentro de este rango de temperatura constituye un ahorro energético sustancial frente a procesos convencionales que exigen temperaturas de fermentación de al menos 30°C. Durante la etapa de producción y acumulación se deben mantener estrictas condiciones anaerobias en el caldo fermentado, a modo de no causar estrés oxidativo en Lactococcus lactis subespecie lactis que ocasione la generación de subproductos diferentes al ácido láctico como acetoina, diacetil, ácido acético y/o etanol, ya que bajo condiciones aeróbicas puede darse una fermentación heteroláctica. En la presente "estrictas condiciones anaerobias" indica que el caldo fermentado no es suministrado con aire o alguno de sus componentes individuales como por ejemplo nitrógeno, oxígeno y dióxido de carbono. La única incorporación de dichos gases atmosféricos hacia el caldo fermentado se da por la difusión natural que existe de la fase gaseosa a la fase liquida, entendiéndose por fase gaseosa al espacio libre dentro del tanque de fermentación, y por fase líquida al caldo fermentado.
Así, las condiciones de operación descritas en la presente etapa permiten:
i. obtener L-ácido láctico como único producto de fermentación, de manera que la concentración de etanol, ácido acético y/o ácido fórmico a lo largo de la fermentación nunca supera el valor de 0.3 gramos por litro de caldo fermentado.
ii. a Lactococcus lactis subespecie lactis hacer uso integral de la lactosa impidiendo la acumulación de glucosa y galactosa en el caldo fermentado, a diferencia de lo que sucede con otros microorganismos (ej. Lactobacillus casei y Lactobacillus helveticus) bajo las mismas condiciones de operación. Así, la concentración en el caldo fermentado de galactosa o glucosa durante la etapa de producción y acumulación jamás es superior a los 0.3 gramos por litro de caldo fermentado.
La reacción de fermentación mediante Lactococcus lactis subespecie lactis bajo las condiciones de operación descritas brindan una tasa de producción global de L- lactato de por lo menos 0.5 g/l/h, preferiblemente de al menos 1.5 g/l/h y más preferiblemente de al menos 3 g/l/h. c) Extraer determinado volumen de caldo fermentado del reactor biológico.
El presente proceso de producción de L-lactato puede correrse en una manera continua, semicontinua o por lotes, por lo que la cantidad de caldo fermentado recuperado depende de si se trata de un sistema de proceso cerrado o abierto. Cuando el proceso se efectúa por lotes (sistema de proceso cerrado) la totalidad del caldo fermentado es extraído del reactor biológico; esto sucede una vez que la concentración de L-lactato en el caldo fermentado sea de al menos 20 g/1, preferiblemente de al menos 50 g/1 y muy preferiblemente de al menos 80 g/L. Por otra parte, si se elige correr el presente proceso de forma continua (sistema de proceso abierto), la extracción se da de forma ininterrumpida a partir de que la concentración de L-lactato en el caldo fermentado sea de al menos 20 g/L, preferiblemente de al menos 40 g/1 y muy preferiblemente de al menos 60 g/L. Cuando el proceso es operado de forma continua, el volumen que ocupa el caldo fermentado dentro del reactor biológico debe mantenerse constate a un volumen de operación de por lo menos 70% del volumen total del recipiente de fermentación. Así, el volumen de caldo fermentado extraído debe ser compensado suministrando de forma continua un volumen equivalente de medio de cultivo al reactor biológico.
Al operar de forma semicontinua, se realiza una extracción parcial del caldo fermentado, con una concentración de L-lactato de al menos 20 g/L, preferiblemente de al menos 40 g/1 y muy preferiblemente de al menos 60 g/L. Dicha extracción parcial se caracteriza por ser una separación drástica de hasta el 99% del volumen total del caldo fermentado, preferentemente de hasta el 75% del volumen total del caldo fermentado y muy preferentemente hasta el 50% del volumen total del caldo fermentado originalmente contenido en el reactor biológico. En la presente "separación drástica" se refiere a la extracción de cierto volumen de caldo fermentado en un solo paso y de manera abrupta. Para compensar la pérdida de volumen generado por la extracción parcial de caldo fermentado, un nuevo volumen de medio de cultivo, equivalente al volumen recuperado de caldo fermentado, es suministrado al reactor biológico; de esta forma, se mantiene un volumen de operación de por lo menos 70% del volumen total del reactor biológico, conservando así las condiciones anaeróbicas de la reacción de fermentación. En la modalidad semicontinua, el volumen de caldo fermentado que permanece en el reactor biológico funge como inoculo para el nuevo medio de cultivo que es incorporado; así, la biomasa se encuentra previamente adaptada al caldo fermentado y la fase de crecimiento se da de forma acelerada, disminuyendo así el tiempo requerido para que el caldo fermentado alcance una concentración de L-lactato de al menos 20 g/L. En cualquiera de las modalidades de la invención (continua, semicontinua o por lotes) se extrae un caldo fermentado con una concentración de L-lactato de al menos 20 g/L y con una pureza óptica mayor al 90%. Además, el efluente se caracteriza por no contener productos de fermentación diferentes al L-ácido láctico, por ejemplo ácido acético, ácido fórmico y/o etanol, en una concentración mayor a los 0.3 g/L. Análogamente, el caldo fermentado recuperado no tiene carbohidratos diferentes a lactosa, por ejemplo glucosa y/o galactosa en una concentración mayor a los 0.3 g/L. De esta manera, la corriente extraída tiene una mínima concentración de compuestos con propiedades físicas, químicas y bioquímicas similares a las del L-lactato, los cuales fungen como los contaminantes más difícilmente separables del L-lactato.
Es así como a diferencia de otros procesos, la presente invención además de contar con una etapa de fermentación eficiente en términos de producción de L-lactato, se encuentra diseñada para simplificar y facilitar la implementación de operaciones unitarias de purificación de L-lactato; mismas operaciones unitarias que pueden ser ejecutadas una vez concluido el presente proceso de producción.
La presente invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos ilustrativos.
EJEMPLOS. Ejemplo 1. Inoculación de medio de cultivo con biomasa liofílizada
El proceso para la producción de L-lactato referido comienza preparando medio de cultivo usando lactosuero seco con un máximo de 4% peso de humedad. Para obtener la concentración deseada, se agregó agua bidestilada al lactosuero de modo que alcanzara una concentración de lactosa de 70g/l. La mezcla obtenida se homogenizó a temperatura ambiente y después se sometió a un proceso de ultrafiltracion con una membrana de 10 kDa para eliminar toda carga microbiana. El filtrado estéril obtenido se suministró hasta el 70% del volumen total de un tanque de fermentación con capacidad total de 7 litros con la finalidad de mantener las condiciones anaerobias necesarias para la generación de L-lactato. El medio de cultivo se suplemento con extracto de levadura a una concentración de 5 g/1 y la mezcla se calentó hasta 28°C.
La inoculación del medio se efectuó incorporando 0.2 gramos de masa liofílizada de Lactococcus lactis subespecie lactis por litro de medio de cultivo con una viabilidad de lxl O 12 unidades formadoras de colonia por gramo de masa liofílizada. Ejemplo 2. Inoculación del medio de cultivo con una solución de inoculo
Se preparó una solución de inoculación disolviendo 1 gramo de biomasa liofilizada de Lactococcus lactis subespecie lactis en 50 mi de medio acuoso. Dicha masa liofilizada presentaba una viabilidad de lxlO 12 unidades formadoras de colonia por gramo de masa liofilizada. En el presente ejemplo, el medio acuoso empleado para formular la solución de inoculo era medio de cultivo preparado según lo referido en el Ejemplo 1.
La solución de inoculación fue mantenida a una temperatura de 28° C por un periodo de tiempo de 8 horas para que Lactococcus lactis subespecie lactis alcanzara la fase exponencial de su crecimiento (Ver Figura 2) y la mezcla tuviera una concentración de 3 gramos de biomasa húmeda por litro de solución de inoculación. Finalmente, la inoculación del medio de cultivo, previamente preparado y suministrado al tanque de fermentación acorde a lo descrito en el Ejemplo 1, se efectuó incorporándole los 50 mi de solución de inoculación.
Ejemplo 3. Producción y acumulación de L-lactato
El proceso para la producción de L-lactato referido en este ejemplo se llevó a cabo en medio de cultivo previamente preparado y suministrado al tanque de fermentación, acorde a lo descrito en el Ejemplo 1, y previamente inoculado, conforme a lo descrito en el Ejemplo 2. Durante toda la etapa de incubación se mantuvo la temperatura en un valor de 28 grados Celsius, y el pH en un valor de 6 por la adición de hidróxido de sodio. Las concentraciones de L-lactato, de lactosa, de etanol, de ácido acético, de glucosa y de galactosa presentes en el caldo fermentado fueron medidas a lo largo de la etapa de incubación. Los resultados se muestran en la Tabla 1. El L-lactato alcanzó una concentración de 29.9 g 1 en un periodo de 15 horas, sin embargo el proceso continuó hasta que la lactosa llegó una concentración de 0.5 g 1 (Ver Figura 3). Tabla 1
Concentración de compuestos durante la etapa de incubación
Tiempo Lactosa L-Lactato Glucosa Galactosa A. Acético Etanol (hrs) (g L) (g L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L)
- 70 0 0 0 0 0
0.0 68.5 0 0 0 0 0
1.0 66.7 0 0 0 0 0
2.0 68.4 0 0 0 0 0
3.0 68.7 0 0 0 0 0
4.0 68.5 0.7 0 0 0 0
6.0 67.0 1.3 0 0 0 0
7.0 67.5 1.8 0 0 0 0
8.0 65.7 3.3 0 0 0 0
9.0 62.9 5.9 0 0 0 0
9.7 60.0 8.2 0 0 0 0
11.0 54.2 13.0 0 0 0 0
12.0 49.4 17.7 0 0 0 0
13.0 44.4 22.6 0 0.18 0 0
15.0 35.7 29.9 0 0.20 0 0
23.3 22.0 44.5 0 0.27 0 0
24.0 20.4 46.1 0 0.26 0 0
26.0 18.5 47.9 0 0.24 0 0
28.0 14.9 51.5 0 0.22 0 0
30.0 9.6 55.9 0 0.24 0 0
35.0 3.9 56.1 0 0.24 0 0
40.0 0.5 61.1 0 0.27 0 0