Einfluß von UV-Licht

B e s c h r e i b u n g

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Schutz von Nukleinsäuren gegen eine Schädigung durch den Einfluß von UV-Licht. Sie betrifft vor allem ein Verfahren zum Schutz von mit einem UV-Licht induzierbarem Fluoreszenzfarbstoff (beispielsweise Ethidiumbromid) markierten, präparativ fraktionierten, insbesondere gelelektrophoretisch aufgetrennten Nukleinsäuren vor einer Schädigung durch das zur Anregung der Farbstoff-Fluoreszenz eingesetzte UV-Licht ohne wesentliche Vermindening der durch das UV-Licht induzierten Fluoreszenzemission

Nukleinsäuren (Desoxyribonukleinsäuren und Ribonukleinsäuren) besitzen als Träger der Erbinformation große biologische und medizinische Bedeutung Für zahlreiche gentechnische bzw molekularbiologische Anwedungen - sowohl in der biomedizinischen Forschung, Entwicklung und Produktion als auch in der medizinischen Diagnostik und Therapie - werden Nukleinsäuren gezielt vervielfältigt, modifiziert oder rekombiniert Die Mehrzahl der hierfür verwendeten Techniken beruht auf dem Einsatz isolierter, reiner und in ihrer gesamten Länge intakter Nukleinsäuren.

Zahlreiche gentechnische in vitro Techniken setzen voraus, daß Nukleinsäuren zumindest temporär sichtbar gemacht werden - beispielsweise um sie in einem Gel oder in einem Dichtegradienten zu lokalisieren. Das am weitesten verbreitete Verfahren zur sichtbaren Darstellung von Nukleinsäuren basiert darauf, die Nukleinsäuren durch Bindung eines Fluoreszenzfarbstoffes (beispielsweise Ethidiumbromid oder auch SYBR™ Green) zu markieren. Der gebundene Farbstoff emittiert Licht im sichtbaren Bereich, wenn er mit ultraviolettem Licht (UV-Licht) angeregt wird. Die Markierung von Nukleinsäuren mit einem Fluoreszenzfarbstoff und die anschließende sichtbare Darstellung durch Anregung mit UV-Licht ist für viele gentechnische Verfahren von zentraler Bedeutung, da diese Methode auch für den Nachweis und die Lokalisation kleinster Mengen an Nukleinsäuren geeignet ist (siehe beispielsweise Sambrook J, Fritsch EF, und Maniatis T, 1989, in: Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)

Der Nachteil des geschilderten Verfahrens besteht darin, daß Nukleinsäuren unter dem Einfluß von UV-Licht beschädigt werden. Bei analytischen Verfahren spielt diese Schädigung nur eine untergeordnete Rolle, da puritaformige Schaden der Nukleinsaure die meisten analytischen Verfahren nicht nachteilig beeinflussen Ganz anders ist die Situation bei praparativen Verfahren, d.h. bei Verfahren, bei denen die Nukleinsäuren nach der UV-Bestrahlung wiedergewonnen werden müssen, um sie anschließend als Ausgangsmaterial für weitere gentechnische Verfahren einzusetzen. In diesem Fall hängt der Erfolg der weiteren Schritte von der Unversehrtheit der eingesetzten Nukleinsäuren ab.

Der fachkundige Experte versucht die Schaden zu begrenzen, indem er Nukleinsäuren nur für kurze Zeit mit relativ langwelligem UV-Licht geπnger Intensität bestrahlt Dieser Strategie sind allerdings Grenzen gesetzt. Die Lokalisation diskreter Nukleinsaurebanden bedarf einer gewissen Mindestzeit, und die Verwendung langwelliger und schwacher UV-Quellen vermindert die Empfindlichkeit des Nukleinsäurenachweises drastisch. Als Stand der Technik gilt gegenwartig der möglichst kurz wahrende Einsatz von UV-Licht einer Wellenlange von 312 nm. Dies ist ein Kompromiß zwischen Schonung der Nukleinsäuren auf der einen Seite und hoher Empfindlichkeit ihres Nachweises auf der anderen Seite (siehe auch Brunk und Simpson, 1977, Anal Biochem 82:455-462, Sambrook J, Fritsch EF, und Maniatis T, 1989, in: Molecular Cloning a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Schutz von Nukleinsäuren vor dem schädigenden Einfluß von UV-Bestrahlungen bereitzustellen, um damit die genannten Nachteile vermeiden zu können.

Eine Losung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens der eingangs genannten Art, das sich dadurch auszeichnet, daß die Nukleinsäuren wahrend oder nach der Fraktionierung und vor oder während der UV-Licht-Bestrahlung mit einer Substanz behandelt werden, die Guanosin und/oder Cytidin und/oder Adenosin und/oder und/oder Uridin und/oder Thymidin und/oder Derivate davon umfaßt.

Besonders geeignete Derivate sind vor allem die Nukleoside selbst, wobei als Zuckerreste insbesondere Ribose und Desoxyribose in Betracht kommen. Ebenfalls gut geeignet sind die Mono-, Di- und/oder Triphosphate dieser Nukleoside, die entsprechenden Basen (Guanin, Uracil, Cytosin, Thyrnin und Adenin) und Oliogonukleotide, die Guanin-, Uracil-, Cytosin-, Thyrnin- und/oder Adeninreste enthalten

Der erfindungsgemaße Schutz der Nukleinsäuren mit Hilfe dieser Substanzen ist kostengünstig und mit geringem Aufwand durchführbar. Enzymatische Folgeverfahren, bei denen die präparierten Nukleinsäuren eingesetzt werden, werden nicht nachteilig beeinflußt Nachweisverfahren anhand von Fluoreszerj^arbstoffmarkierungen werden ebenfalls nicht beeinträchtigt. Überraschenderweise wird die durch die UV-Strahlung angeregte Licht-Emission des Fluoreszenzfarbstoffes im sichtbaren Bereich durch das erfindungsgemaße Verfahren praktisch nicht vermindert (siehe Fig. 1) D.h. im Gegensatz zu den bisherigen Verfahren zur Verringerung der UV-Schadigung wird durch das erfindungsgemaße Verfahren weder die Praktikabilitat noch die Empfindlichkeit eines solchen Nukleinsaurenachweises beeinträchtigt. Der Mechanismus der Schutzwirkung beruht demzufolge ganz offensichtlich nicht auf einer Absorption der UV-Strahlen durch die erfindungsgemaßen Schutzsubstanzen.

Die Substanz kann in gelöster Form oder an eine Matrix gebunden appliziert werden Eine geeignete Konzentration ist beispielsweise eine Konzentration zwischen 1 und 10 mmol/l, insbesondere etwa 5 mmol/1.

Es besteht die vorteilhafte Möglichkeit, daß die Substanz einem Gel und/oder einem Laufpuffer und/oder einer Färbelösung beigegeben wird Dadurch kann das erfindungsgemäße Schutzverfahren in ein herkömmliches Praparationsverfahren für bzw unter Einsatz von Nukleinsäuren problemlos eingegliedert werden, und noch dazu ohne nennenswerten zeitlichen oder technischen Mehraufwand.

Das erfindungsgemaße Verfahren besitzt eine besondere Bedeutung für die Langenfraktionierung von Nukleinsäuren. Bei der Anwendung gentechnischer Verfahren kommt es regelmäßig vor, daß die Nukleinsäuren von Interesse (z B spezifische Gene, Fragmente chromosomaler DNS, cDNS-Stücke, Vektoren, RNS, cRNS etc.) in einem Gemisch unterschiedlich langer Nukleinsaure-Molekule vorliegen oder in anderer Weise verunreinigt sind. Da der Erfolg zahlreicher enzymatischer Verfahren zur Vermehrung, Modifikation und Rekombination von Nukleinsäuren direkt von der Menge, der Reinheit und der Intaktheit der eingesetzten Nukleinsäuren abhängt, ist es notwendig, die gewünschten Nukleinsäuren bzw Nukleinsaurefragmente zuvor zu isolieren, zu reinigen und anzureichern. Die Isolierung von spezifischen Nukleinsäuren erfolgt meist nach dem Prinzip der praparativen Langenfraktionierung einschließlich Fluoreszenzfarbstoff¬ markierung und Detektion mittels UV-Bestrahlung.

Eine Ausführυngsvariante der Erfindung sieht deshalb vor, daß das erfindungsgemäße Schutzverfahren Teilschritt einer Langenfraktionierung von Nukleinsäuren ist.

Das Verfahren kann insbesondere in Kombination mit einer praparativen Gelelektrophorese durchgeführt werden.

Gelelektrophoretische Verfahren zur Langenfraktionierung von Nukleinsäuren sind außerordentlich trennscharf und in ihrer technischen Durchführung einfach Längenunterschiede von wenigen Basen reichen aus, um Nukleinsäuren gelelektrophoretisch sicher voneinander zu trennen. Etabliert haben sich hierbei die Agarose- und die Polyacrylamid-Gelelektrophorese Die Verfahren sind einfach anzuwenden und bedürfen nur eines geringen apparativen Aufwandes. Die praparative gelelektrophoretische Langenfraktionierung von Nukleinsäuren nach dem Stand der Technik umfaßt im Prinzip die folgenden Schritte:

(1) Beladung des Gels mit dem Nukieinsauregemisch und anschließende Elektrophorese

(2) Anfärben der in die Gelmatrix eingebetteten Nukleinsäuren mit Ethidiumbromid ( oder einem vergleichbaren Fluoreszenzfarbstoff wie z.B. SYBR™ Green)

(3) Identifikation der fraktionierten Nukleinsäuren und Ausschneiden der entsprechenden Gelblöcke unter Sichtkontrolle, d h. unter UV-Illumination bzw UV-Transillumination

(4) Extraktion der Nukleinsäuren aus den isolierten Gelblόcken

Solche praparativen gelelektrophoretischen Verfahren, bei denen die Nukleinsäuren mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Beleuchtung lokalisiert werden, sind jedoch bis¬ lang durch eine schlechte Qualität der isoUerten Nukleinsäuren gekennzeichnet D h. die Nukleinsäuren, die nach einer elektrophoretischen Langenfraktionierung aus einem Gel extrahiert werden, lassen sich zwar meist effizient ligieren (verbinden), enzymatische Folgeschritte, die in ihrer gesamten Lange intakte DNS-Matrizen voraussetzen, laufen dagegen nur mit unbefriedigender Effizienz ab

Der fachkundige Experte war deshalb häufig gezwungen, auf deutlich weniger trennscharfe Methoden wie Dichtegradientenzentrifügation oder Gelfiltration auszuweichen (Kieffer BL, 1991, Gene 109 115-119; Murphy AJM and Schimke RT, 1991 , Nucl Acids Res 19 3403-3408).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, daß die schlechte Qualität der gelelektrophoretisch iangenfraktionierten Nukleinsäuren auf der für die Lokalisation notwendigen UV-Bestrahlung beruht.

Mit der Bereitstellung des erfindungsgemaßen Verfahrens ist es nun erstmals möglich, auch in vielen der genannten Fallen, in denen das bisher nicht möglich war. die wesentlich trennscharferen praparativen Gelelektrophoresemethoden erfolgreich einzusetzen

Die erfindungsgemaße Schutzsubstanz kann selbstverständlich auch dann eingesetzt werden, wenn die Langenfraktionierung der Nukleinsäuren mittels Dichtegradientenzentrifügation durchgeführt wird

Die Bedeutung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Schutz von Nukleinsäuren vor UV-induzierter Schädigung erstreckt sich auf alle Anwendungen, bei denen Nukleinsäuren einer UV-Bestrahlung ausgesetzt werden Das erfindungsgemäße Verfahren ist für weite Bereiche der nicht-gewerblich und gewerblich genutzten Gen-

technik bzw Molekularbiologie von Vorteil Durch seine Anwendung wird letztlich nicht nur die Ausbeute zahlreicher Techniken gesteigert, bei denen Nukleinsäuren UV-Licht ausgesetzt werden, sondern indirekt auch die Effizienz verschiedenster molekularbiologischer und gentechnischer Methoden und Strategien, die auf die Verwendung dieser Nukleinsäuren aufbauen. Hierzu zahlen insbesondere die m vitro DNS-Rekombination zur Verknüpfung von DNS-Fragmenten und die in vitro Transkription zur Herstellung von cRNS-Kopien.

Die m vitro Rekombination mit anschließender Klonierung ist von zentraler Bedeutung für viele gentechnische und molekularbiologische Strategien Bei der in vitro Rekombination werden DNS-Fragmente durch Ligation neu verknüpft Dies eröffnet weitreichende Möglichkeiten für die kunstliche Neukombination von Nukleinsäuren bzw Veränderung von Genen. Da bei vielen Klonierungsstrategien (z B bei dem Erstellen von cDNS- und genomischen Bibliotheken) die Menge des Ausgangsmaterials limitiert ist bzw eine hohe Ausbeute an Klonen angestrebt wird, ist es von entscheidender Bedeutung, das Ausgangsmaterial effizient mit anderen DNS-Fragmenten zu verknüpfen und anschließend mit diesem Material Bakterien mit hoher Ausbeute zu transformieren Die Anzahl der resultierenden Klone ist ein direktes Maß für die Gute des gesamten Ver¬ fahrens Um eine hohe Anzahl an Klonen zu erzielen, müssen die zu verknüpfenden DNS-Fragmente vollständig intakt und frei von kontaminierenden Fragmenten vorliegen Die Praparation der Fragmente erfolgt üblicherweise mittels praparativer Langenfraktio¬ nierung und anschließender Lokalisation unter UV-Bestrahlung der Nukleinsäuren nach Färbung mit Ethidiumbromid. Der Einsatz des erfindungsgemaßen Verfahrens zum Schutz der Nukleinsäuren wahrend der UV-Bestrahlung erlaubt gegenüber den Verfahren nach dem Stand der Technik die Bereitstellung wesentlich größerer Mengen vollständig intakter DNS-Fragmente

cRNS-Kopien von entsprechenden DNS-Vorlagen besitzen für zahlreiche gentechnische und molekularbiologische Verfahren Bedeutung. Hierzu zahlen u a. die Herstellung von Sonden für Hybridisierungsversuche (z.B in situ Hybridisierung), die Expression von Genen in Oozyten, die Erstellung von Subtraktions-Bibliotheken, der RNase-Protection

Assay etc cRNS-Kopien werden mit Hilfe der in vitro Transkription erstellt. Der Erfolg dieses Verfahrens hangt von der Bereitstellung ausreichender Mengen an vollständig in¬ takten DNS-Matπzen ab

Weitere Anwendungsgebiete für das erfindungsgemaße Verfahren sind beispielsweise die Klonierung, die Polymerase-Kettenreaktion, die Amplifizierung und die Expression von genetischen Bauplanen in Eukaryonten und Prokaryonten, die Konstruktion von DNS- und RNS-Sonden, die Markierung von DNS durch die Nick-Translation und das Random Primed Labelling, verschiedene Hybridisierungsverfahren wie Southern- und Northern-Blotanalysen, die Aufschlüsselung genetischer Plane durch Sequenzierung etc (siehe auch Anwendungsbeispiele 2 und 3)

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Anwendungsbeispielen naher erläutert

Beispiel 1: Gelelektrophoretische Langenfraktionierung mit anschließender Lokaiisation der Ethidiumbromid-gefarbten Nukleinsäuren mitteis UV- Transillumination im Vergleich mit einem Verfahren nach dem Stand der Technik.

Gemessen wird der Anteil an vollständig intakter DNS nach elektrophoretischer Auftrennung, Färbung mit Ethidiumbromid und Isolierung der entsprechenden Gelblocke unter UV-Transillumination

Für die UV-Transillumination werden handelsübliche, speziell für diesen Zweck vorgesehene Gerate (312 nm) verwendet. Eingesetzt wird eine lineare doppelstrangige DNS von 4,8 kb Länge Die Standard-Elektrophorese (submarine Agaroseelektrophorese) wird nach Sambrook J, Fritsch EF, und Maniatis T (Molecular Cloning a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) durchgeführt

Verglichen wird das Verfahren nach dem Stand der Technik mit einem erfindungsgemaßen Verfahren, gemäß dem sowohl dem elektrophoretischen Laufpuffer

als auch dem Agarosegel eine der in Tabelle I genannten Substanzen in der angegebenen Konzentration zugesetzt wird.

Nach dem elektrophoretischen Lauf wird das Gel mit Ethidiumbromid angefärbt. Die DNS wird unter UV-Transillumination lokalisiert, die entsprechenden Gelblöcke innerhalb von 30 Sekunden herausgeschnitten. Anschließend wird die DNS aus den Gelblöcken extrahiert. Die Menge an in ihrer gesamten Länge intakter DNS wird mit Hilfe einer in vitro Transkription quantifiziert. Hierbei wird die DNS enzymatisch in RNS überschrieben Vollständige Transkripte entstehen nur dann, wenn die DNS-Matrize in ihrer gesamten Lange intakt ist - d.h. komplett durch die DNS-abhangige RNS- Polymerase abgelesen werden kann.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt Nach der praparativen Elektrophorese, die nach dem Stand der Technik durchgeführt wird, können lediglich 0,7 % der ursprunglich eingesetzten DNS vollständig intakt aus dem Gel isoliert werden. 99,3 % der DNS gehen verloren oder sind geschädigt. Im Gegensatz dazu können nach Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens 85 % der eingesetzten DNS vollständig intakt isoliert werden. Im einzelnen kann durch den Einsatz von Adenosin eine sechzehnmal bessere Ausbeute erzielt werden, durch den Einsatz von Cytidin eine dreinundsiebzigmal bessere Ausbeute, durch den Einsatz von Guanosin eine praktisch hundertmal bessere Ausbeute und durch den Einsatz einer Kombination dieser vier Nukleoside eine hundenzwanzigmal bessere Ausbeute.

Hervorzuheben ist die Tatsache, daß die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens trotz deutlicher Schutzwirkung zu keiner Beeinträchtigung der Empfindlichkeit des Nukleinsaurenachweises fuhrt, wie die Ergebnisse in Fig. 1 zeigen. Diese Abbildung vergleicht zwei Gele mit gleichen Mengen an DNS-Proben unter UV-TransiUumination (handelsüblicher 312 nm UV-Transilluminator). Gel A enthält als Schutz 1 mmol/1 Guanosin während Gel B dem Stand der Technik entspricht, also kein Guanosin enthält. Eine Abschwächung der durch das UV-Licht angeregten Emission im sichtbaren Bereich ist nicht zu beobachten. Fig. 4 zeigt die Konzentrationswirkungsbeziehung des Schutzeffektes.

Die Ergebnisse sind unabhängig von der verwendeten UV-Quelle Die Verwendung mehrerer UV-Transilluminatoren unterschiedlicher Hersteller führt zu übereinstimmenden Ergebnissen

Weitere Kontrollexperimente zeigen, daß der Schutz der Nukleinsäuren unabhängig ist von der Art (DNS, RNS) und Lange der eingesetzten Nukleinsäuren Zirkulare und lineare DNS-Fragmente werden gleichermaßen geschützt

Die Methode, nach der die Nukleinsäuren nach der Elektrophorese und der Lokalisation aus dem Gel extrahiert wird, hat keinen Einfluß auf den Erfolg des erfindungsgemaßen

Verfahrens

Die Wirksamkeit des erfindungsgemaßen Verfahrens ist außerdem unabhängig von der

Gelmatrix und dem Laufpuffer

Auch mit verschiedenen Agarose- (u a. auch Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt) bzw

Polyacrylamidgelen und verschiedenen Laufpuffersystemen werden vergleichbare

Ergebnisse erzielt Getestet wurden u a. Tris-Acetat-, Tris-Borat- und Tris-Phosphat-

Puffersysteme

Eine schutzende Wirkung wird schließlich auch dann erzielt, wenn das Gel erst nach dem gelelektrophoretischen Lauf erfindungsgemaß mit der schutzenden Substanz behandelt wird

Beispiel 2: Nachweis, Isolierung und in vitro Rekombination von Nukieinsäurefragmenten .

0,5 g Agarose werden mit 50 ml TAE-Puffer (40 mmol/1 TRIS Essigsaure, pH 8, 1 mmol/l EDTA), der zusatzlich 1 mmol/1 Guanosin enthalt, versetzt und bis zum vollständigen Losen der Agarose erhitzt. Anschließend wird die Losung in einen horizontalen Geltrager gegossen (Gelhohe 5 mm), mit einem Kamm für die Probentaschen versehen und bis zum Erstarren des Geles auf einer horizontalen Plattform gelagert Das Gel wird in der Elektrophoresekammer plaziert. Die Kammer wird mit

TAE-Puffer gefüllt, der zusatzlich 1 mmol/l Guanosin enthalt Die in Wasser gelosten Nukleinsaureproben werden im Verhältnis 3 Teile auf einen Teil mit 10 Vol % Glycerol, 0,01 Vol% Bromphenolblau und 0,05 Vol% Orange G in TAE-Puffer, der zusatzlich 1 mmol/l Guanosin enthält, gemischt und anschließend in die Probentaschen gefüllt. Die Nukleinsaureproben bestehen aus einem Gemisch unterschiedlich langer Nukleinsäuren (200 bp bis 7000 bp) Die Elektrophorese wird 45 Minuten lang bei einer Feldstarke von 5 V/cm durchgeführt. Dannach wird das Gel aus der Kammer herausgenommen und für 20 Minuten mit 1 μg/ml Ethidiumbromid in TAE-Puffer gefärbt, der ebenfalls 1 mmol/l Guanosin enthalt. Im Anschluß wird das Gel auf einen UV-Transilluminator plaziert (Anregungswellenlange. 312 nm). Die Nukleinsäuren werden für 45 Sekunden durch die UV-Beleuchtung sichtbar gemacht. Die Gelblocke, welche die Nukleinsäuren von Interesse enthalten, werden wahrend dieser Zeitspanne unter Sicht mit einem Skalpell aus dem Gel herausgetrennt.

Anschließend werden die Nukleinsäuren mit einem Standardverfahren aus den Gelblöcken extrahiert und in die weiteren Schritte der Klonierung eingesetzt. Der Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem die Nukleinsäuren wahrend der Elektrophorese und der anschließenden Lokalisation unter UV-Bestrahlung durch den Zusatz von 1 mmol/l Guanosin geschützt sind, ergibt eine um den Faktor 245 höhere Klonierungseffizienz (Fig. 2).

Wird anstelle von Guanosin eines der anderen Nukleoside (Cytidin. Adenosin, Uridin, Thymidin oder Mischungen davon) oder das entsprechende Nukleotid oder Desoxynukleotid eingesetzt, erhält man ebenfalls eine vielfach höhere Klonierungseffizienz (keine Abbildung hierzu)

Beispiel 3: Nachweis, Isolierung und in vitro Transkription von Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäurefragmenten zur Herstellung von cRNS-Kopien.

Der Einsatz des erfindungsgemäßen Schutzes der DNS wahrend der Lokalisation der entsprechenden Ethidiumbromid-gefarbten DNS-Stücke unter UV-Bestrahlung nach einer praparativen Gelelektrophorese wird experimentell mit dem Verfahren nach dem

Stand der Technik verglichen. Die Elektrophorese wird wie im Beispiel 2 detailliert beschrieben ausgeführt. Der Erfolg der anschließenden in vitro Transkription zur Herstellung einer cRNS-Sonde wird quantifiziert. Die Menge an vollständiger cRNS

3 ₂

(Vollangentranskript) wird über den Einbau von [α- PJUTP mit Hilfe der

Radioluminographie gemessen Der Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens zum

Schutz der Nukleinsäuren (durch den Zusatz von 1 mmol/l Guanosin), ergibt eine wesentlich höhere Ausbeute an Vollangentranskript (Fig. 3)

Wird anstelle von Guanosin eines der anderen Nukleoside (Cytidin. Adenosin, Uridin, Thymidin oder Mischungen davon) oder ein entsprechendes Nukleotid eingesetzt, erhalt man ebenfalls signifikant höhere Ausbeuten als mit den im Stand der Technik bekannten Verfahren

Beispiel 4: Nachweis und Isolierung von DNS-Fragmenten durch präparative Agarosegelelektrophorese zur Ampliflzierung durch die Polymerase- Kettenreaktion (PCR)

Nach elektrophoretischer Auftrennung, Färbung mit Ethidiumbromid und Isolierung aus den entsprechenden Gelblöcken unter UV-Transillumination wird die Intaktheit von DNS-Fragmenten durch die Polymerase-Kettenreaktion untersucht

Verglichen wird das Verfahren nach dem Stand der Technik mit einem erfindungsgemäßen Verfahren , gemäß dem sowohl dem elektrophoretischen Laufpuffer als auch dem Agarosegel eine der in Tabelle I genannten Substanzen in der angegebenen Konzentration zugesetzt wird

Die Präparation der DNS-Fragmente erfolgt wie in Beispiel 1, wobei hier jeweils 140 ng einer cDNS mit einer Lange von 1,8 kb eingesetzt werden Jeweils 10 pg der wiedergewonnenen DNS werden in 0,2 mmol/l je dNTP, 2,3 mmol/l MgCl ₂ , 2,5 U Taq DNS-Polymerase und zwei spezifischen Primern (27 und 33 b lang, je 0,5 μmol/l) in einem PCR-Puffer (100 μl) unter folgenden Bedingungen in der PCR eingesetzt: 25

Zyklen zu je 1 Minute 94°C, 2 Minuten 59°C und 2 Minuten 72°C Um die Produktausbeute zu bestimmen, wird ein Fünftel der Ansätze durch analytische Agarosegelelektrophorese überprüft.

Bei der Polymerase-Kettenreaktion müssen im Bereich zwischen den beiden Primem beide DNS-Strange durch eine DNS-abhangige DNS-Polymerase gegenläufig komplementär kopiert werden. Eine Schädigung der DNS kann die Synthese des gegenläufig komplementären Stranges unterbinden. Eine exponentielle Amplifikation setzt voraus, daß der gesamte Bereich zwischen den beiden Primern kopiert werden kann

Wie Fig. 5 zeigt, kann bei einer PCR mit DNS, die nach dem Stand der Technik isoliert worden ist, kein Syntheseprodukt nachgewiesen werden (Spur 1) Wird dem Elektrophorese-Puffer dagegen 1 mmol/l Guanosin zugesetzt, dann kann die gleiche Menge DNS mit guter Ausbeute amplifiziert werden (Spur 2).

Mit den übrigen (in Tabelle 1 genannten) erfindungsgemäßen Substanzen können ahnlich gute Ergebnisse erhalten werden (keine Abbildungen).

Der Vergleich der Produktausbeuten zeigt die Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik, die durch Anwendung des erfindungsgemaßen Verfahrens zur Gewinnung von Edukten für die Polymerase-Kettenreaktion erzielt werden kann

Beispiel 5: Aufreinigung von geschlossen-zirkulärer (Plasmid-) DNS mittels Ethidiumbromid (EtBr)-Cäsiumchlorid (CsCl)-Dichtegradienten- zentrifugation

Eine DNS-Probe, bestehend aus Plasmiden und chromosomaler DNS, wird mit 1 g Cäsiumchlorid (CsCl)-Salz pro 1 ml DNS-Lösung versetzt. Diese Mischung wird auf 30°C erwärmt und solange gerührt, bis das CsCl-Salz gelöst ist.

Pro 10 ml dieser DNS-CsCl-Losung werden 0,8 ml einer wässrigen Ethidiumbromid (EtBr)-Losung zugegeben und mit der DNS-CsCl-Losung vermischt Die Enddichte der DNS-CsCl-EtBr-Losung sollte 1,55 g/ml betragen (Refraktionsindex = 1,3860), und die Endkonzentration an EtBr sollte bei etwa 740 μg/ml liegen Diese DNS-CsCl-EtBr-Losung wird in Zentrifügenrohrchen gegeben und in einer Sorval- Zentrifüge SS34 (oder einem vergleichbaren Gerat) mit 8000 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Mit einer Pasteurpipette oder einer Spntze wird die klare, rote Losung unterhalb der Proteinschicht (oben in den Zentrifügenrohrchen) abgesaugt und in Beckmann-Zentrifügenrohrchen oder vergleichbare Gefäße überführt Die bestuckten Becknri^nn-Zentrifügenrohrchen (bzw deren Äquivalente) werden mit leichtem Paraffinöl aufgefüllt, verschlossen und in einer Beckmann- Vertikal-Zentrifüge (Ti65-Rotor) oder einer vergleichbaren Zentrifuge bei 20°C mit 45000 rpm für 16 Stunden zentrifugiert

Da die EtBr-Moleküle leicht in gestreckte oder offen-zirkuläre DNS interkalieren, - wobei sie diese noch weiter strecken (entwinden) und dadurch deren Schwimmdichte vermindern -, aber nur schwer in uberspriralisierte, geschlossen-zirkuläre DNS, bilden die ύberspiralisierten (EtBr-armen) DNS-Molekule in dem CsCl-EtBr-Gradienten an emer anderen Stelle eine Bande als die gestreckten und offen-zirkulären (EtBr-reichen) DNS- Molekule

Nach erfolgreicher Zentrifugation können die Positionen der beiden DNS-haltigen Banden unter UV-Licht-Bestrahlung identifiziert werden

Zur Entnahme der gereinigten Plasmid-DNS wird das Zentrifügenrohrchen seitlich angestochen und die entsprechende Bande mit einer Spritze abgesaugt

Das EtBr, das an die Plasmid-DNS gebunden ist, kann mit n-Butanol extrahiert und das CsCl mittels Dialyse entfernt werden

Diese an sich bekannte Verfahren wird erfindungsgemäß abgewandelt, indem die DNS- Lösung vor der ersten Zentrifugation mit 5 mmol/l einer der in Tabelle 2 genannten Substanzen versetzt wird.

Ein Vergleich des erfindungsgemäß abgewandelten Verfahrens mit dem Verfahren nach dem Stand der Technik anhand einer in vitro Transkription zeigt, daß die Ausbeute an intakter DNS mit dem erfindungsgemäß abgewandelten Verfahren signifikant größer ist, als mit dem altbekannten Verfahren.

Tabelle I

Schutz von DNS durch das erfindungsgemaße Verfahren am Beispiel einer Agarose- Gelelektrophorese mit anschließender Ethidiumbromidfarbung und Nukleinsaurelokalisation unter UV-Transillumination. Angegeben ist der Anteil der DNS, der nach der Elektrophorese mit anschließender UV-Bestrahlung vollständig intakt aus dem Gel extrahiert werden konnte.

Tabelle II

Schutz von DNS durch das erfindungsgemaße Verfahren am Beispiel einer Aufreinigung von geschlossen-zirkulärer (Plasmid-) DNS mittels Ethidiumbromid (EtBr)-Casiumchlorid (CsCl)-Dichtegradientenzentrifügatιon Angegeben ist der Anteil der DNS, der nach der Dichtegradientenzentrifügation und anschließender UV-Bestrahlung vollständig intakt aus dem Gradienten entnommen werden konnte, d h nach der Entnahme und nachfolgender in vitro Transkription zu vollständigen Transkripten führt