Campo de la invención

En la presente invención el objetivo buscado es la purificación de 7-sustituido-amino-desacetoxi-cefalospori- nas, mediante una tecnología especifica de filtración en membrana, evitando que la calidad del producto final sea insuficiente de cara a su posterior utilización, al verse acompañado de un gran número de impurezas.

Estado de la técnica anterior

Una de las etapas sintéticas de mayor importancia en la industria farmacéutica de los antibióticos β-lactámicos, es la reacción de expansión de anillo que permite acceder al esqueleto cefalosporánico, con un heterociclo de 6 miembros, a partir de penicilinas en donde el heterociclo es de 5 átomos.

(I (II)

Rl representa H; R2 puede ser fenilacético, fenoxiacé- tico, hexenoico, 2 hexenoico, 3 hexenoico u octanoico; R3 puede ser H, un catión mono o divaiente, o alquilo de 1-3 átomos de C.

La expansión es un caso especial de la reacción de Pummerer a partir de sulfóxidos de penicilinas ( I ) , que tras calentamiento y eliminación de agua dan lugar a las cefalos- porinas correspondientes (II). Existen gran cantidad de publicaciones donde se estudia con detalle esta reacción, basadas fundamentalmente en los trabajos ya clásicos de Morin et al. [J.Amer. Chem. Soc.85, 1986 (1963); ibid. 91, 1401 (1969)], y otros posteriores donde se desarrolla y hace viable comercialmente esta idea [Chou. Tetrahedron Lett, 725 (1974); Koming et al. J.Org. Chem, 40, 1346 (1975); Claes et al. J. Antibiotics 32820 (1979); Noyori et al. 37, 3899 (1981)].

En todas ellas, en mayor o menor medida, se hace referencia a la coexistencia junto con la reacción deseada, de otras laterales que conducen desgraciadamente a la formación de una amplia gama de productos no deseados, que impurifican sensiblemente el compuesto final.

El hecho de llevar a cabo un calentamiento que produzca la apertura y posterior cierre, en una molécula de extraordinaria labilidad, trae consigo grandes problemas de pureza en el producto final, debido a la existencia de gran número de subproductos, como bien recoge la amplia biblio¬ grafía sobre el tema [U.S. Patent. 3.275.626; 3.947.465; 4.000.129; 4.003.894; 4.159.267] y entre las que cabe destacar :

- productos de isomerización de doble enlace en el anillo cefem

- productos de descarboxilación

- productos de resinificación Por ello, una gran parte de los trabajos publicados sobre expansión de anillo centran sus esfuerzos en encontrar unos reactivos y condiciones de reacción que reduzcan los siempre elevados niveles de subproductos, y, por tanto, aumentar el rendimiento ( EP 0169144 A2) . La ultrafiltración es una técnica de separación de moléculas disueltas de acuerdo a su tamaño, mediante el paso de una disolución a través de un filtro lo suficientemente

fino como para retener la mayoría de las moléculas grandes, permitiendo el paso de las menores y de los disolventes. De este modo, la ultrafiltración produce una fracción retenida enriquecida, en moléculas grandes y un filtrado libre en gran medida de estas moléculas.

Uno de los factores especialmente relevante a la hora de llevar a cabo una purificación selectiva, mediante la técnica de ultrafiltración, lo constituye la elección de la membrana. Dicha elección, está influenciada por la propia composición química de la membrana, de una parte, lo que permitirá trabajar en determinados rangos de pH, presión y temperatura, y del valor específico del corte por peso molecular (Cutt off), de otra, en base al cual, se llevará a cabo la separación selectiva de las moléculas correspon¬ dientes a los distintos productos presentes.

En cuanto a la composición química, se conocen, entre otras, membranas de acetato de celulosa, polisulfonas, fluoropolímeros y polieter sulfonas, susceptibles de ser utilizadas en amplios rangos de presión, temperatura y pH. Respecto del denominado valor Cutt-off (peso molecular nominal de exclusión), de cada una de ellas, las posibilida¬ des existentes abarcan un margen enormemente elevado que comprende valores aproximados de este parámetro desde 2.000 a 500.000.

Por otro lado, no están claramente definidos los límites entre los que está comprendida la técnica de ultrafiltración, de manera que en su límite inferior, que depende fundamentalmente del tamaño del poro que permitirá alcanzar un determinado valor de Cutt-off, se empieza a hablar de una nueva técnica denominada nanofiltración, que responde, básicamente, a un tipo de técnica que emplea membranas con valores de peso molecular nominal de exclusión próximos a 2.000. La diferencia fundamental del procedimiento descrita en la presente invención con respecto a las técnicas de ultrafiltración y de aplicación conocida a la purificación

de caldos de fermentación complejos, consiste en que en el caso del presente invento se aplican las técnicas de ultrafiltración y/o nanofiltración a una disolución acuosa procedente de una etapa de síntesis química, en la que el producto sintetizado tiene una mayor pureza específica que en primer caso, y, a pesar de ello se ha logrado aplicar la tecnología de purificación a través de membranas, con un mayor grado de especificidad y por tanto de purificación.

El procedimiento descrito presenta toda una serie de ventajas, además del alto grado de pureza conseguida al emplear esta separación frente a los métodos clásicos conocidos hasta ahora, donde el uso de procedimientos químicos lleva aparejado el empleo de disolventes y/o reactivos con los consiguientes problemas de toxicidad y encarecimiento del proceso. La utilización de la ultrafil¬ tración permite trabajar en todo momento en ausencia de disolventes orgánicos y con bajos costes energéticos.

Descripción de la invención

En esta invención se pone a punto una técnica de filtración en membrana específica, para la purificación de disoluciones acuosas que contienen productos obtenidos por reacción de expansión de anillo a partir de sulfóxidos de penicilinas.

En la presente invención, hemos utilizado diversas membranas de ultrafiltración y de nanofiltración, en todos los casos con un valor de Cutt off inferior a 10.000, alcanzando resultados altamente satisfactorios para todas las membranas ensayadas. El control del grado de pureza que se alcanza mediante estas dos técnicas, se ha llevado a cabo a través de las determinaciones de potencia ( realizada por cromatografía HPLC) y de color ( absorbancia) , realizadas sobre el producto que se aisla por cristalización, en cada caso, de la disolución acuosa de partida y de la que se obtiene una vez tratada con la correspondiente membrana.

Así, el empleo de membranas de ultrafiltración y

nanofiltración proporciona un procedimiento de purificación muy importante, como lo demuestra el hecho de mejorar en valores de un 6-8 % la potencia HPLC del producto y reducir el valor de absorbancia (determinada, en todos los casos, en una disolución al 2 % en buffer de fosfatos 0.1 M de pH = 8.0 y a 415 nm), hasta un 50 % respecto del producto de partida. De este modo, y como ejemplo, cuando se parte de productos con valores de potencia HPLC próximos a 900 mcg/mg y valores de absorbancia del orden de 0.600, y se someten al proceso de purificación antes mencionado, se obtienen otros, con valores superiores a 960 mcg/mg, para la potencia HPLC y una absorbancia inferior a 0.300, respectivamente.

El procedimiento operativo que se ha seguido en las experiencias llevadas a cabo, que son el objetivo de la presente invención, responde a una única metodología en la que a partir de una disolución acuosa que contiene el producto denominado como ácido 7-fenilacetamido desacetoxi cefalosporánico (comúnmente cefalosporina-G) , junto a los subproductos resultantes de la reacción de expansión de anillo, por la que se obtiene dicho producto, se pasa a través de la correspondiente membrana seleccionada, en unas condiciones determinadas de pH (en el rango comprendido entre 5 y 8), temperatura (en el intervalo 25-45QC) y de presión (entre 5 y 20 bar) , obteniéndose una vez reducido el volumen entre 2 y 10 veces, una disolución ya purificada de la que se aisla un producto que responde a unos valores de potencia HPLC y color como los mencionados anteriormente.

Adicionalmente, la presente invención describe un proceso continuo en que las disoluciones así purificadas, son aptas para su utilización en etapas posteriores, como compuestos intermedios, sin necesidad de aislamiento. Procesos donde estos compuestos intermedios, obtenidos según el procedimiento descrito, pueden emplearse, son la prepara¬ ción del ácido 7-amino desacetoxi cefalosporánico, tanto por via química como enzimática, y, a su vez, éste en la síntesis de cefalexina.

Esta invención está ilustrada con los siguientes

ejemplos, en los que se recogen algunas de las condiciones de operación ensayadas.

EJEMPLO 1

De una disolución acuosa que contiene 97.5 g/1 de cefalosporina-G obtenida por síntesis, se aisla por crista¬ lización con ácido sulfúrico 6N hasta pH = 2.0 el compuesto mencionado con una potencia HPLC de 905 mcg/mg y una absorbancia de 0.550. Una parte alícuota de la disolución anterior, ajustada a pH=6.0 y 35 QC se pasa a través de una membrana de polisulfona tipo GR-90 pp (DOW CHEMICAL), siendo la presión de trabajo de 10 bar; una vez reducido el volumen cinco veces, tras sucesiva concentración, se obtiene un permeado del que se cristaliza mediante ajuste a pH = 2.0 con ácido sulfúrico 6N la cefalosporina-G con un valor de potencia HPLC de 970 mcg/mg y una absorbancia de 0.280.

EJEMPLO 2

Con una presión de trabajo de 15 bar, pH = 6.5 y temperatura 30CC, y utilizando la membrana del tipo GR-90 pp (DOW CHEMICAL) , se concentra hasta reducir el volumen de partida siete veces, una disolución acuosa que contiene 103.5 g/1 de la cefalosporina-G obtenida por síntesis, de la que se aisla por cristalización (como se recoge en el Ejemplo 1) un producto con una absorbancia de 0.570 y potencia HPLC de 912 mcg/mg, obteniéndose un permeado del que se cristaliza, con ácido sulfúrico 6N hasta pH = 2.0, la cefalosporina-G con potencia HPLC de 980 mcg/mg y color de 0.290.

EJEMPLO 3

El producto denominado cefalosporina-G que se cristaliza, en forma similar al Ejemplo 1, de una disolución acuosa obtenida mediante síntesis, que contiene 88.3 g/1 de

dicho producto, tiene una potencia HPLC de 905 mcg/mg y una absorbancia de 0.540. Cuando se pasa una parte alícuota de dicha disolución, a pH=6.0 y temperatura de 35 2C, a través de una membrana de ultrafiltración del tipo polietersulfona, concretamente la llamada AES-5 (AMT), a una presión de trabajo de 10 bar, se obtiene, después de reducir el volumen de partida seis veces, un permeado del que se asila, mediante cristalización a pH = 2.0 con ácido sulfúrico 6N, la cefalosporina-G con una absorbancia de 0.275 y potencia HPLC de 973 mcg/mg.

EJEMPLO 4

A partir de una disolución acuosa obtenida por síntesis, que contiene 98 g/1 de cefalosporina-G, se cristaliza dicho producto, de forma similar al Ejemplo 1, con una absorbancia de 0.580 y potencia HPLC de 907 mcg/mg. Cuando se pasa una parte alícuota de dicha disolución a través de una membrana de nanofiltración del tipo polisulfo- na sulfonada, concretamente la denominada ASP-10 (AMT), se obtiene, tras sucesiva concentración hasta reducir el volumen de partida diez veces, y operando en unas condicio¬ nes de pH = 6.5, temperatura de 302C y presión de 15 bar, un permeado final del que se aisla por cristalización con ácido sulfúrico 6N hasta pH 2.0 la cefalosporina-G con una potencia HPLC de 980 mcg/mg y una absorbancia de 0.300.

EJEMPLO 5

La cristalización a pH = 2.0 con ácido sulfúrico 6N de una disolución acuosa procedente de la síntesis, que contiene 110 g/1 de cefalosporina-G, conduce a un producto que tiene una potencia HPLC de 908 mcg/mg y una absorbancia de 0.550. Una parte alícuota de esta disolución, se ajusta a pH = 7.5 y se hace pasar a través de una membrana de nanofiltración, concretamente la G-50 (DESAL), manteniendo la temperatura a 25 QC y la presión de trabajo a 12 bar.

hasta reducir el volumen de partida ocho veces. Del permeado final obtenido se aisla mediante cristalización, con ácido sulfúrico 6N hasta pH = 2.0, la cefalosporina-G con una potencia HPLC de 978 mcg/mg y una absorbancia de 0.270.

EJEMPLO 6

Cristalizando en forma similar al Ejemplo 1 una disolución acuosa obtenida por síntesis, se obtienen 93.5 g/1 del producto denominado Cefalosporina-G, con una potencia HPLC de 865 mcg/mg y una absorbancia de 0.863. Cuando se pasa una parte alícuota de dicha disolución a pH = 7.0 y temperatura de 25 QC, a través de una membrana del tipo polisulfona GR-90 pp (DOW CHEMICAL") a una presión de trabajo de 15 bar, se obtiene, después de reducir el volumen de partida 8 veces, un permeado, del que se aisla por cristalización a pH = 2.0 con ácido sulfúrico 6N, la correspondiente Cefalosporina-G con unos valores de potencia HPLC y absorbancia de 930 mcg/mg y 0.390, respectivamente.

EJEMPLO 7

De una disolución acuosa obtenida mediante síntesis, se cristaliza el producto Cefalosporina-G con una potencia de 935 mcg/mg y absorbancia de 0.420. Una parte alícuota de dicha disolución se pasa a través de una membrana del tipo polisulfona, en concreto la denominada GR-90 pp (DOW CHEMICAL), hasta reducir el volumen de partida siete veces, en las siguientes condiciones de operación : pH = 7.0; Temperatura = 25 2C; Presión = 15 bar. De esta manera se obtiene un permeado, del que se aisla mediante cristaliza¬ ción a pH = 2.0 con ácido sulfúrico 6N, la cefalosporina-G purificada con unos valores de potencia HPLC y de absorban¬ cia de 985 mcg/mg y 0.160, respectivamente.

EJEMPLO 8

Un permeado obtenido según se describe en el Ejemplo 1, se diluye convenientemente con una disolución tampón de fosfato para obtener una concentración de cefalosporina-G en el rango de 40 g/1.

Por otro lado, se prepara una suspensión de Penicilina G (BOEHRINGER) en disolución tampón de fosfato en razón de 60 g de enzima por litro de disolución amortiguadora. La hidrólisis enzimática se lleva a cabo poniendo en contacto la disolución de cefalosporina G con una quinta parte en volumen de suspensión de amidasa de BOEHRINGER.

Una vez finalizada la conversión, se recupera la enzima por filtración y al filtrado se le añade medio volumen de metanol, cristalizándose a continuación, por ajuste a pH = 4 con ácido clorhídrico 12N, el ácido 7-amino desacetoxi cefalosporánico con un rendimiento del 95 %.