Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Rückgewinnung von Guanidinsalzen aus verdünnten und verunreinigten wäßrigen Lösungen.

Guanidinsalze stellen wichtige Produkte bei organischen Syntheseverfahren sowie bei biotechnologischen Prozessen dar. Aus diesem Grund fallen bei den entsprechenden technischen Anwendungen große Mengen an Abwässern an, die neben Guanidinsalzen noch weitere zahlreiche Verunreinigungen organischer aber auch anorganischer Herkunft enthalten können. So sind entsprechende Guanidinsalzlösungen, wie sie bspw. in der Chromatographie, bei der De- bzw. Renaturierung von Proteinlösungen oder Auflösung von Inclusion-Bodies eingesetzt werden, in der Regel mit Restproteinen, reduzierenden Verbindungen (wie z. B. Sulfiden), nichtionischen Detergentien oder Puffersalzen verunreinigt. Außerdem ist die Konzentration der Guanidinsalze in diesen Lösungen sehr starken Schwankungen unterworfen.

In wirtschaftlicher Hinsicht aber auch aus Gründen des Umweltschutzes besteht ein großes Interesse, die betreffenden Guanidinsalze zu isolieren bzw. sie in möglichst reiner Form wieder zurückzugewinnen. Als einzige technische Möglichkeit bot es sich bisher an, die verdünnten Lösungen zuerst aufzukonzentrieren und anschließend die Guanidinsalze durch Kristallisation zu reinigen. Besonders nachteilig bei dieser Methode ist der hohe Energieaufwand, der zum Abdampfen der zum Teil großen Mengen an Wasser erforderlich ist. Außerdem bereitet die saubere Abtrennung der Verunreinigungen

durch Kristallisation erhebliche Probleme, weshalb zur Rückgewinnung von einigermaßen reinen Produkten ein mehrfaches Umkristallisieren erforderlich ist und dieses Verfahren deshalb technisch ziemlich aufwendig erscheint.

Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Rückgewinnung von Guanidinsalzen aus verdünnten und verunreinigten wäßrigen Lösungen zu entwickeln, welches die genannten Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist, sondern es mit geringem technischen Aufwand ermöglicht, Guanidinsalze in hoher Reinheit aus diesen Lösungen zu isolieren.

Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man die entsprechende wäßrige Lösung (Diluat) einer Elektrodialyse unterwirft und das Guanidinsalz auf der Konzentratseite in aufkonzentrierter Form anreichert.

Eine detaillierte Übersicht zum Prinzip der Elektrodialyse und deren Anwendung findet sich bei J. Fritsch et al. , "Elektrodialyse und Diffusionsdialyse", Galvanotechnik, Heft 7, 1991, Eugen G. Lenze Verlag, Saulgau.

Es hat sich nämlich überraschenderweise gezeigt, daß man auf diese Weise das entsprechende Guanidinsalz weitgehend von allen Verunreinigungen abtrennen und gleichzeitig (auf der Konzentratseite) ein Produkt in sehr hoher Konzentration gewinnen kann.

Aus der US-PS 4,678,553 ist zwar ein Verfahren zur Rückgewinnung von Polypeptiden und Proteinen aus Guanidinsalze enthaltenden Lösungen mit Hilfe der Elektrodialyse bekannt, doch liegen die Guanidinsalze hierbei in relativ konzentrierter Form vor und werden im Laufe der Elektrodialyse verdünnt.

Beim Verfahren entsprechend der vorliegenden Erfindung werden Guanidinsalzlösungen, die teilweise eine Konzentration von < 1 Gew.-% aufweisen, elektrodialysiert. Als Guanidinsalze können hierbei prakisch alle technisch wichtigen Salze eingesetzt werden wie z. B. Guanidinhydrochlorid, -sulfamat, -phosphat, -sulfat, -thiocyanat oder -nitrat.

Die Elektrodialyse selbst kann in den technisch üblichen Elektrodialyse-Zellen durchgeführt werden, die mit den bekannten ionenselektiven Membranen (im wesentlichen Ionenaustauschermembranen) ausgestattet sind. Im Hinblick auf die zu verwendende Elektrodenspülung hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, auf Guanidinsalzlösungen zurückzugreifen wie z. B. Guanidinphosphat oder -sulfat. Auf diese Weise wird sichergestellt, daß in das Konzentrat keine unerwünschten Verunreinigungen miteingeschleust werden.

Die elektrischen Parameter wie Stromdichte und Spannung können entsprechend den technischen Möglichkeiten der Elektrodialyse-Zellen in gewissen Grenzen variiert werden. Technisch sinnvoll sind normalerweise 200 bis 1 000 A/m ² , insbesondere 300 bis 700 A/m ² Elektrodenfläche, und Spannungen von ca. 0,5 bis 3 Volt pro Zellpaar.

Um einen einigermaßen befriedigenden Durchsatz erzielen zu können, werden in technisch üblicher Weise eine Vielzahl von Zellpaaren zu sogn. Membranstapeln zusammengefaßt, deren Anzahl in der Regel bei 5 bis 500, vorzugsweise 300 bis 400, Zellpaaren pro Stapel liegt.

In der Praxis wird das erfindungsgemäße Verfahren in der Weise durchgeführt, daß man die verdünnte und

verunreinigte wäßrige Lösung (Diluat) kontinuierlich in die Zellpaare pumpt, die Elektrodialyse bei gewünschter Stromdichte und Spannung durchführt und das Konzentrat mit den angereicherten Guanidinsalzen kontinuierlich abzieht.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht nun darin, daß die Elektrodialyse in einem sehr weiten pH-Bereich durchgeführt werden kann, der vorzugsweise zwischen 0 und 12 liegt und der nur von der Säure- oder Laugenbeständigkeit des eingesetzten Membranmaterials abhängig ist. Dies hat den großen Vorteil, daß man die eingesetzten Eluate normalerweise ohne große Vorbehandlung mit sauren oder alkalischen Zusätzen einsetzen kann.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Elektrodialyse in zwei oder mehreren Stufen durchgeführt, wobei die betreffenden Membranstapel in Serie geschaltet werden, d. h. das Konzentrat aus dem ersten Membranstapel wird als Diluat im zweiten Membranstapel eingesetzt usw. Auf diese Weise ist eine weitere Aufkonzentrierung der betreffenden Eluate möglich. Während in der ersten Stufe das Eluat bspw. mit einer Konzentration < 1 Gew.-% bezogen auf das betreffende Guanidinsalz eingesetzt wird, besitzt das Konzentrat nach der ersten Stufe bereits eine Konzentration an Guanidinsalz von 10 bis 20 Gew.-%, nach der zweiten Stufe 20 bis 35 Gew.-%. Mit den derzeit zur Verfügung stehenden Elektrodialyse-Zellen ist eine Aufkonzentrierung der entsprechenden Guanidinsalzlösungen bis maximal 35 bis 50 Gew.-% möglich.

Diese aufkonzentrierten Lösungen weisen bereits eine sehr hohe Reinheit auf, die bei > 98 % liegt und die in der Regel nur geringe Mengen an anderen Salzen aufweisen. Falls erwünscht oder erforderlich, kann man an den Elektrodialyseschritt ohne weiteres eine Kristallisationsstufe anschließen, um das betreffende Salz in fester Form zu gewinnen.

Die besonderen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen im wesentlichen darin, daß man ausgehend von relativ stark verdünnten Lösungen mit stark schwankenden Verunreinigungen ohne großen technischen und energetischen Aufwand das Guanidinsalz bis zu einer

Konzentration von 35 bis 50 Gew.-% aufkonzentrieren und gleichzeitig die in den Ausgangslösungen enthaltenen Verunreinigungen praktisch vollständig abtrennen kann.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiele

Beschreibung der Apparatur:

Die Durchführung der Beispiele erfolgte in einer Elektrodialyse-Vorrichtung, die gemäß den Patentansprüchen in der Weise modifiziert wurde, daß 2 Zellstapel, bestückt mit jeweils 7 kationenselektiven Membranen, 5 anionenselektiven Membranen und 11 Abstandshaltern (jeweils 5 Zellpaare), einem Membranabstand von 0,5 mm und einer effektiven Querschnittsfläche von 58 cm in Serie geschalten wurden. Es ergaben sich somit 4 voneinander getrennte Kreisläufe:

Diluat 1: die Lösung, aus der das Salz zurückgewonnen werden soll

Konzentrat 1: eine intermediäre Lösung, in der sowohl eine erste Stufe der Aufkonzentrierung wie auch der Aufreinigung stattfindet

Diluat 2: ist gleich Konzentrat 1

Konzentrat 2: die Lösung, in der die zweite Stufe der Aufkonzentrierung stattfindet und das zurückgewonnene Salz durch einen Überlauf kontinuierlich entfernt wird

Elektrodenspülung: eine Lösung von chloridfreien

Guanidinsalzen, die verhindern sollen, daß an der Anode eine Chlorgasentwicklung stattfindet

Beispiel 1

30 kg einer Lösung von Guanidiniumchlorid aus der Herstellung eines rekombinanten Proteins (Diluat 1 ) werden in oben genannter Apparatur für 83 Stunden elektrodialysiert. In beiden Stromkreisen wird ein konstanter maximaler Wert der Stromstärke von 4 Ampere eingestellt, wobei die dafür notwendige Spannung automatisch entsprechend dem jeweiligen Widerstand des Zellstapels eingeregelt wird, jedoch auf ein Maximum von 12 Volt begrenzt wird. Das Produkt (Konzentrat 2) wurde in einem Überlaufbehälter gesammelt. Die Elektrodialyse wurde beendet, als Ausfällungen im Diluat 1 die Strömungsgeschwindigkeit auf unter 30 % des Anfangswertes herabsetzten.

Anfangsbedingungen der Elektrodialyse:

Diluat 1: siehe unten

Konzentrat 1 = Diluat 2: 1 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumchlorid Konzentrat 2: 1 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumchlorid Elektrodenspülung: 8 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumdihydrogenphosphat

Zustandparameter Diluat 1 Konzentrat 2

Leitfähigkeit-Anfang [mScm- -- ] 163 10 Leitfähigkeit-Ende [mScm- * ] 105 190 Guanidiniumchlorid-Anfang [Gew.- ^■ %%]] ccaa.. 2233 1 Guanidiniumchlorid-Ende [Gew.-%] 9 46

TRIS-Puffer-Anfang [mM] ca. 25 n.b. TRIS-Puffer-Ende [mM] n.b. < 1 Dithioerythritol-Ende [mM] ca. 15 nicht nachweisbar Glutathion-Ende [mM] ca. 15 nicht nachweisbar EDTA-Ende [mM] ca. 7 nicht bestimmt Proteine-Ende [Gew.-%] < 0,5 nicht nachweisbar Brij-35-Ende [Gew.-%] < 0,5 nicht nachweisbar Eisen-Ende [mg/kg] ca. 5 < 0,5

Aus der Lösung aus Konzentrat 2 kann durch nachfolgende Kristallisation ein technisch reines Guanidiniumchlorid (Gehalt > 98,5 Gew.-%) gewonnen werden, das sich für den erneuten Einsatz in der Gewinnung rekombinanter Proteine eignet.

Beispiel 2

25 kg einer Lösung von Guanidiniumchlorid aus der Herstellung eines rekombinanten Proteins (Diluat 1 ) werden in oben genannter Apparatur für 50 Stunden elektrodialysiert. In beiden Stromkreisen wird ein konstanter maximaler Wert der Stromstärke von 3 Ampere eingestellt, wobei die dafür notwendige Spannung automatisch entsprechend dem jeweiligen Widerstand des Zellstapels eingeregelt wird, jedoch auf ein Maximum von 12 Volt begrenzt wird. Das Produkt (Konzentrat 2) wurde in einem Überlaufbehälter gesammelt.

Anfangsbedingungen der Elektrodialyse:

Diluat 1: siehe unten

Konzentrat 1 = Diluat 2: 1 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumchlorid Konzentrat 2: 1 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumchlorid Elektxodenspülung: 8 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumdihydrogenphosphat

Zustandparameter Diluat 1 Konzentrat 2

Leitfähigkeit-Anfang [mScm- ^l ] 67 10 Leitfähigkeit-Ende [mScm- - ¹ ] 0,2 147 Guanidiniumchlorid-Anfang [Gew.-%] ca. 8 1 Guanidiniumchlorid-Ende [Gew.-%] < 0,5 42 TRIS-Puffer-Anfang [mM] ca. 25 n.b. TRIS-Puffer-Ende [mM] n.b. < 1

Natriumacetat-Ende [Gew.-%] 0,1 0,1 Dithioerythritol-Ende [mM] ca. 15 nicht nachweisbar Glutathion-Ende [mM] ca. 15 nicht nachweisbar

EDTA-Ende [mM] ca. 5 nicht bestimmt

Proteine-Ende [Gew.-%] < 0,5 nicht nachweisbar

Benzamidin Hydrochlorid [Gew.-%] 0,05 0,05 Eisen-Ende [mg/kg] ca. 2 < 0,5

Aus der Lösung aus Konzentrat 2 kann durch nachfolgende Kristallisation ein technisch reines Guanidiniumchlorid (Gehalt > 98,5 Gew.-%) gewonnen werden, das sich für den erneuten Einsatz in der Gewinnung rekombinanter Proteine eignet.

Beispiel 3

2,5 kg einer Lösung von Guanidiniumthiocyanat, technisch reine Qualität, werden in oben genannter Apparatur für 43 Stunden elektrodialysiert. In beiden Stromkreisen wird ein konstanter maximaler Wert der Spannung von 6 Volt eingestellt, wobei die dafür notwendige Stromstärke automatisch entsprechend dem jeweiligen Widerstand des Zellstapels eingeregelt wird, jedoch auf ein Maximum von 3 Ampere begrenzt wird. Das Produkt (Konzentrat 2) wurde in einem Überlaufbehälter gesammelt.

Anfangsbedingungen der Elektrodialyse:

Diluat 1: siehe unten

Konzentrat 1 = Diluat 2: 1 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumthiocyanat Konzentrat 2: 1 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumthiocyanat Elektrodenspülung: 8 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumdihydrogenphosphat

Zustandparameter Diluat 1 Konzentrat 2

Leitfähigkeit-Anfang [mScm- ^x ] 70 < 1

Leitfähigkeit-Ende [mScm- * ] 2 135

Guanidiniumthiocyanat-Anfang [Gew.-%] ca. 7 1

Guanidiniumthiocyanat-Ende [Gew.-%] < 0,3 17

Eisen-Anfang [mg/kg] ca. 5 < 0, 1

Eisen-Ende [mg/kg] ca. 2 < 0,3

Aus der Lösung aus Konzentrat 2 kann durch nachfolgende Kristallisation ein technisch reines Guanidiniumthiocyanat (Gehalt > 99 Gew.-%) gewonnen werden, das sich für den erneuten Einsatz in der Gewinnung rekombinanter Proteine oder für die Molekularbiologie eignet.

Beispiel 4

2,5 kg einer Lösung von Guanidiniumdihydrogenphosphat, technisch reine Qualität, werden in oben genannter Apparatur für 73 Stunden elektrodialysiert. In beiden Stromkreisen wird ein konstanter maximaler Wert der Spannung von 12 Volt eingestellt, wobei die dafür notwendige Stromstärke automatisch entsprechend dem jeweiligen Widerstand des Zellstapels eingeregelt wird, jedoch auf ein Maximum von 4 Ampere begrenzt wird. Das Produkt (Konzentrat 2) wurde in einem Überlaufbehälter gesammelt.

Anfangsbedingungen der Elektrodialyse:

Diluat 1: siehe unten

Konzentrat 1 = Diluat 2: 0,1 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumdihydrogenphosphat Konzentrat 2: 0,1 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumdihydrogenphosphat Elektrodenspülung: 8 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumdihydrogenphosphat

Zustandparameter Diluat 1 Konzentrat 2

Leitfähigkeit-Anfang [mScm- - ¹ ] 35 0,1

Leitfähigkeit-Ende [mScm- ^•> ] 0,2 59

Guanidiniumdihydrogenphosphat-

Anfang [Gew.-%] ca. 11 0,1

Guanidiniumdihydrogenphosphat-

Ende [Gew.-%] < 0, 3 23

Eisen-Anfang [mg/kg] ca . 3 < 0 , 1

Eisen-Ende [mg/kg] ca . 1 < 0, 3

Aus der Lösung aus Konzentrat 2 kann durch nachfolgende Kristallisation ein technisch reines Guanidiniumdihydrogenphosphat (Gehalt > 99 Gew.-%) gewonnen werden, das sich für den üblichen Einsatz z. B. in der Herstellung von Flammschutzausrüstungen eignet.

Beispiel 5

1065 kg einer Lösung von Guanidiniumchlorid aus der Herstellung eines rekombinanten Proteins (Diluat 1) werden in einer Apparatur wie in der Beschreibung der Patentansprüche mit 2 in Serie geschalteten Membranstapeln zu jeweils 25 Zellpaaren einer effektiven Querschnittsfläche von 0,16 m und einem Membranabstand von 0,5 mm für 60 Stunden elektrodialysiert. In beiden Stromkreisen wird ein konstanter Anfangswert der Stromstärke von 60 Ampere eingestellt, wobei die dafür notwendige Spannung automatisch entsprechend dem jeweiligen Widerstand des Zellstapels eingeregelt wird, jedoch auf ein Maximum von 36 Volt begrenzt wird. Mit Abnahme der Leitfähigkeit im Diluat 1 Kreislauf werden die Stromstärken entsprechend der mit 36 Volt maximal erreichbaren Stromstärke im Diluat 1 Kreislauf in mehreren Schritten erniedrigt. Das Produkt (Konzentrat 2) wurde in einem Überlaufbehälter gesammelt. Die Elektrodialyse wurde durch übliche Spülzyklen unterbrochen, als Ausfällungen im Diluat 1 die Strömungsgeschwindigkeit auf unter 30 % des Anfangswertes herabsetzten und nach Freispülung wieder fortgesetzt.

Anfangsbedingungen der Elektrodialyse:

Diluat 1: siehe unten

Konzentrat 1 = Diluat 2: 5 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumchlorid Konzentrat 2: 5 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumchlorid Elektrodenspülung: 8 Gew.-% wässr. Lösung von

Guanidiniumdihydrogenphosphat

Messprotokoll:

Zeit Diluat 1 Diluat 2 Überlauf K-2

[ ] [kg] [mScπr -- ] [Gew.-%] [Gew.-%] [kg] [Gew.-%]

0 1065 120 17,1 — 0

20,75 948 87 13,0 21,2 51,8 33,5

41,75 812 45 7,5 23,6 110,8 36,2

59,5 703 2 0,7 28,7 172,6 35,5

Die mittlere Stromausbeute betrug 57 %.

Aus der Lösung aus Konzentrat 2 kann durch nachfolgende Kristallisation ein technisch reines Guanidiniumchlorid (Gehalt > 98,5 Gew.-%) gewonnen werden, das sich für den erneuten Einsatz z. B. in der Gewinnung rekombinanter Proteine eignet.