Procédé de séparation de certaines protéines du lacto- sérum ou u lait

L'invention concerne un procédé de préparation et de f actionnement des protéines do masse molaire élevée contenues dans un Liquide chargé d ¹ ce type de protéines.

Le lactosérum est un sous-produit de l'industrie fromagère, autrefois rejeté, que l'on cherche depuis quel¬ ques années à valoriser en extrayant de celui-ci certaines matières utiles. Typiquement, le lactosérum contient envi¬ ron 40-80g de matières sèches par L3t.ro, ces matières sè¬ ches étant rormées αe lactose, de matières minérales, et de matières azotées dont bb% en poids environ sont formées de protéines. Ces protéines sont formées à Leur tour, en poids, d'environ 80% d'albumines, 10% d' immunoglobulines et 10% de protéines diverses telles que la lactoferrine (2% environ) et la lactoperoxydase, et présentent un grand intérêt dans divers domaines (nutrition, préparation de laits maternisés, etc...) . On connaît déjà divers procédés visant à récupérer les protéines du lactosérum ou autre dérivé du lait.

Ainsi, FR-A-2 204 948 décrit un procédé d'obtention de concentré de protéines solubles dans l'eau, par exemple en ultra-filtrant du petit-lait, puis en le concentrant par passage sur un gel chromatographique. Ce procédé anté¬ rieur est un procédé global qui ne permet pas de séparer les différents types αe protéines contrairement au procédé de 1 ' invention.

B.N. Mathur et coll. dans le Journal of Dairy Science vol. 62, N° 1, Janvier 1?7 , pages 95-105, évoquent la possibilité de fractionner les protéines d'un concentré de protéines par filtration sur gel, mais sans en divulguer véritablement les modalités techniques. Si, par ailleurs, cet article mentionne 1 ' ultrafi Ltration comme J ' une des techniques permettant de préparer le concentré de protéi¬ nes, il ne suggère nullement, de conduire 1 'ultrafiltra- tion à un taux de concentration élevé, égal ou supérieur à

40 et avec une membrane dont le seuil de coupure approche celui préconisé par la présente invention.

FR-A-2 103 265 décrit un procédé de production d'un concentré de protéines à partir de petit-lait au moyen d'étapes d'ultrafiltration successives, éventuelle¬ ment suivies d'une étape de filtration sur gel. Ce procédé est aussi un procédé global qui ne vise pas à fractionner les différents types de protéines, contrairement au procédé de l'invention. FR-A-2 452 881 a trait à un procédé de séparation et de fractionnement de protéines animales ou végétales par traitement de sources de telles protéines, telles que, par exemple, le lactosérum ou le lait, par des tech¬ niques de chromâtograph±e d'exclusion et d'échange d'ions, la source de départ pouvant être prétraitée par diverses techniques incluant, entre autres, l'ultrafiltration. Le procédé implique l'emploi de plusieurs types de résines à. propriétés spécifiques. Aucune fonction de fractionnement n'est impartie à l'étape d'ultrafiltration qui sert un - quement à concentrer la source de départ.

FR-A-2 487 642, qui est une addition au précédent, vise un procédé du genre de celui de FR-A-2 452 881 dans laquelle la matière est soumise à une ultrafiltration sur membrane avant ou après le passage sur les résines. Les facteurs de concentration mis en jeu sont de l'ordre de 5 seulement. Comme pour FR-A-2 452 881 1'ultrafiltration n'est pas employée pour séparer les protéines de masse molaire élevée (supérieure a 50 000 daltons) des protéines de plus basse masse molaire, des peptides et des acides ¹ aminés.

Aucun des documents antérieurs précités ne décrit donc un procédé permettant de séparer sélectivement les protéines de masse molaire élevée d'un liquide les conte¬ nant. I existe donc un besoin pour un procédé permettant une telle séparation sélective.

L'invention vise à fournir un tel procédé-

Plus particulièrement, i ' invention concerne un procédé de séparation et de fractionnement des protéines de masse molaire élevée contenues dans un liquide chargé de ce type de protéines, qui comprend deux étapes : a) une étape d'ultrafiltration visant à produire un retentat enrichi en lesdites protéines et un perméat contenant le reste dudit liquide, et b) une étape de fractionnement sélectif du reten¬ tat obtenu en (a) sur un support chromatographique, procédé caractérisé en ce que :

(i) 1 'ultrafiltration est effectuée avec une membrane po¬ reuse ayant un seuil de coupure d'au moins 40000 daltons, (11) le liquide chargé de protéines à traiter par ultra¬ filtration présente un pH de 5 a 8,5 et une force ionique de 0,2 à 1 molaire, et

(m) 1 'ultrafiltration (a) est poursuivie jusqu'à obten¬ tion d'un facteur de concentration α au moins 40.

De préférence, 1 'ultrafiltration est poursuivie usqu'à obtention d un facteur de concentration d'au moins 100.

L'invention est particulièrement adaptée au cas où le liquide chargé de protéines est du lactosérum déca- séiné, préconcentré ou non, déminéralisé ou non, mais peut également être appliquée à d'autres liquides chargés de protéines de masse molaire élevée, par exemple du lait dérnicellé et décaséiné, préconcentre ou non, déminéralisé ou non, ou du lactosérum délipidé reconstitué par solubi- lisation à partir d'un lactosérum à l'état solide par des procédés classiques. On pourrait également traiter des substances d'origine végétale ( jus de fruits par exemple) ou animale (colostrum par exemple) , telles qu'obtenues ou après un prétraitement de celles-ci.

Les protéines contenues dans le lactosérum ou autre produit laitier, se différencient par leur masse molaire. On distingue ainsi : - la fraction des albumines c-l - lactalbumine 14000 daltons* environ - lactoglobulme 18000 daltons environ

- -

- la fraction des immunoglobulines 180000 daltons environ

- la fraction de la lactoferrine et de la iactoperoxydase 80000 daltons environ.

* Le dalton est l'unité utilisée pour définir la masse molaire d'une molécule. 1 dalton est égal à 1/16 de la masse d'un atome d'oxygène.

L'étape ca) d'ultrafiltration du procédé de l'invention a pour but de séparer du mieux possible le lactose et les albumines des fractions immunoglobulines et lactoferrine + Iactoperoxydase. La séparation n'est toutefois pas efficace à 100% car une fraction des protéi¬ nes de masse molaire élevée traverse la membrane et une fraction des protéines de masse molaire peu élevée est quand même retenue par la membrane. Le taux de rétention d'une protéine définit sa propension à être retenue par une membrane donnée dans des conditions données. Ce taux n'est jamais, en pratique, égal à 100%.

A cette fin, l'ultrafiltration (a) est effectuée avec une membrane semi-perméable ayant un seuil de coupure d'au moins 40000 daltons, c ^' est-à-dire retenant préféren- tiellement les molécules de masse molaire supérieure à

40000 daltons.

Avantageusement, la membrane utilisée aura un seuil de coupure entre 40000 et 80000 daltons environ. La membrane utilisée peut être de nature organique ou minérale. Avantageusement, 1 'ultrafiltration (a) est con¬ duite en au moins deux stades. Un premier stade est effec¬ tué avec une première membrane jusqu'à un taux de concen¬ tration de 5 à 10 par exemple, et un deuxième stade est opéré sur le retentat obtenu dans le premier stade avec une deuxième membrane jusqu'à obtention du taux de con¬ centration final désiré. Les première et deuxième membra¬ nes peuvent être de nature identique ou différente. Diverses membranes pouvant être employées pour réaliser I'ultrafiltration (a) sont disponibles dans le commerce. On peut citer, à titre d'exemples non limitatifs, les membranes organiques commercialisées sous les marques AMICON (Groupe GRACE) et PLEIADE (Groupe RHONE-POULENC) ou

les membranes minérales commercialisées sous la marque

CARBOSEP par la Société TECH-SEP (Groupe RHONE-POULENC).

Le liquide, tel que le lactosérum, soumis à

1 ' ultrafiltration (a) doit présenter un pH compris dans la gamme de 5 à 8,5 environ, de préférence de 7 à 8,5, et une force ionique comprise entre 0,2 et 1 molaire environ. La force ionique requise peut être obtenue en ajoutant un sel convenablement choisi, tel que le chlorure de sodium, au liquide à traiter. Pour éviter une saveur trop salée, on réglera de préférence la force ionique entre 0,2 et 0,5 molaire. Ces conditions se sont révélées nécessaires pour éviter un phénomène de polarisation important pouvant mo¬ difier le seuil de coupure de la membrane.

L'ultrafiltration (a) produit un perméat {formé principalement d'eau, de lactose et des albumines) et un retentat (formé principalement d'eau, des immunoglobuli¬ nes, de la lactoferrine et de la Iactoperoxydase). L' ultrafiltration (a) doit être conduite dans des condi¬ tions amenant un facteur de concentration final (rapport de liquide initial/volume de retentat) d'au moins 40 et pouvant atteindre 100 et plus. La seule limite imposée au facteur de concentration est que la concentration de pro¬ téines dissoutes dans le retentat ne devienne pas si éle¬ vée qu'elle provoque la gélification du retentat. Habituellement, la concentration limite des protéines est de l'ordre de 200-250 g/litre. Un facteur de concentration de 40 et plus représente un facteur de concentration inha¬ bituel. Habituellement, dans les procédés antérieurs met¬ tant en jeu une ultrafiltration, on utilise des facteurs de concentration inférieurs à 10, typiquement de 5 ou 6. Le facteur de concentration élevé utilisé dans le pré¬ sent procédé offre plusieurs avantages :

- il permet d'obtenir un retentat, concentré en immunoglo¬ bulines, lactoferrine et Iactoperoxydase, ce qui permet d'utiliser une installation de chromatographie compacte, donc économique, pour effectuer ensuite l'étape (b) ,

- il permet d'obtenir un enrichissement relatif important du retentat en les protéines ayant les taux de rétention

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par la membrane les plus élevés.

L'étape de f actionnement sélectif sur gel chroma- tographique du retentat provenant de 1'ultrafiltration (a) peut être conduite en faisant passer le retentat sur une colonne garnie d'un support chromatographique approprié à l'aide d'un agent d'élution. Ce fractionnement est basé sur les capacités différentes des molécules des diverses protéines contenues dans le retentat à pénétrer dans les , pores du support stationnaire. Les très grosses molécules 10 ne pénètrent pas dans le support et traversent donc plus rapidement le support chromatographique. Les plus petites molécules pénètrent par contre dans le support chromato¬ graphique et sont éluées plus lentement.

Pour la séparation, d'une part, de la fraction 15 immunoglobulines et, d'autre part, de la fraction lacto¬ ferrine + Iactoperoxydase, on peut utiliser un support chromatographique (souvent appelé gel chromatographique) se présentant sous la forme de billes et dont le domaine αe onctionnement correspond au moins à la gamme de masses 20 molaires des protéines à séparer, par exemple de 5000 à 250000 daltons. Un tel support séparera le retentat en ses constituants, suivant leur masse molaire, en deux fractions ou plus. Le support utilisé sera préalablement équilibré par un tampon de force ionique élevée afin de 25 limiter les associations protéines-protéines, notamment pour éviter la polymérisation éventuelle des bêta-lacto- globulines résiduelles.

Divers supports chromatographiques utilisables sont disponibles dans le commerce. A titre d'exemples non. 30 limitatifs on peut citer, par exemple, le SEPHADEX G 150 (dextrane réticulé) et le SEPHACRYL S200 (dextrane allyli- que réticulé par du N, '-méthylène bis-acrylamide) .

Comme agents d'élution, on peut utiliser, par exemple, du TRIS (tris(hydroxyméthyl)amino méthane), du 35 tampon phosphate (mélange de phosphates mono- et di-sodi- ques) , etc.. D'autres supports chromatographiques et d'autres agents d'élution utilisables seront évidents pour l'homme du métier. L'agent d'élution doit avoir un pH du

même ordre que celui du liquide à traiter.

A titre indicatif, on peut traiter a chaque cycle de fractionnement chromatographique un volume d'échantil¬ lon allant de 5 à 15% environ du volume du support chroma- tographique contenu dans la colonne et des débits d'élution allant de 0,5 à 1 fois environ le volume dudit support par heure. Ces conditions n'ont toutefois rien de critique et il est parfaitement à la portée de l'homme du métier de déterminer des conditions appropriées. La technique chromatographique exposée ci-dessus est également communément appelée filtration sur gel. Il y a lieu de noter, cependant, que l'invention n'est pas limitée à l'emploi de cette technique particulière. On pourrait, par exemple, avoir recours à une technique chromatographique utilisant des résines échangeuses d'ions, à une technique de chromatographie liquide haute pression, etc ..

La description qui va suivre, faite en se référant au dessin annexé, fera bien comprendre l'invention. Sur le dessin :

La figure 1 est une représentation schématique d'une installation d'ultrafiltration ;

La figure 2 est un représentation schématique d'une installation de fractionnement sur support chroma- tographique ; et

La figure 3 représente un diagramme d'élution ty¬ pique.

Sur la figure i, du lactosérum décaséiné est sto¬ cké dans un réservoir 1 muni à sa partie inférieure d'un filtre 2 en verre fritte, retenant les particules solides éventuellement présentes dans le lactosérum, et alimente une pompe péristaltique 3 de circulation qui envoie le lactosérum dans un module 4 d'ultrafiltration comprenant une membrane 5, logée dans un carter 6. Le perméat qui traverse la membrane se retrouve dans le carter et est envoyé dans le réservoir 7 de perméat. Le retentat qui est retenu par la membrane s'appauvrit progressivement en les constituants du perméat (principalement le lactose et

les albumines) et est renvoyé dans le réservoir 1 d'où il peut être recyclé au module 4 autant de fois que nécessai¬ re. Des manomètres 8 et 9 et un débitmètre 10 permettent de connaître les caractéristiques de l'écoulement du ré- tentât. On arrête l'opération lorsque le facteur de con¬ centration intermédiaire désiré est atteint (typiquement 5 à 10) .

A l'aide de l'installation de la figure 1, on a traité un lactosérum fourni par un fabricant de fromage dont les caractéristiques étaient approximativement les suivantes :

- azote total : 1,21 g/1

- azote soluble 1,18 g/1

- pH 7,5 Ce lactosérum contenait environ 7,5 g/1 de protéi¬ nes solubles dont :

- albumines : 6 g/1

- fractions immunoglobulines 0,8 g/1

- fraction lactoferrine + Iactoperoxydase 0,12 g/1

Dans un premier stade d'ultrafiltration, on a uti¬ lisé, comme membrane 5, une membrane poreuse minérale CARB0SEP, type Ml (seuil de coupure 60-80000 daltons) et on a poursuivi ce stade jusqu'à obtention d'un fac- teur de concentration de 5,56. Le débit du perméat était

2 ssttaabbllee eet se maintenait à 85 litres/heure/m de surface de membrane

Plus de 90% de la lactoferrine présente dans le lactosérum de départ se retrouvent dans le retentat obtenu. Dans une deuxième étape d'ultrafiltration, on a utilisé comme membrane 5, un faisceau de fines fibres poreuses parallèles AMICON, type HIP 100-20 (seuil de coupure de 50000) constituées d'un polymère cellulosique de structure anisotrope et on a traité le retentat obtenu dans le premier stade jusqu'à obtention d'un facteur de concentration volumique de 22, soit un facteur de con¬ centration global de 22 x 5,56 = 121. Les teneurs en lac¬ toferrine et en protéines solubles du lactosérum de départ.

du retentat intermédiaire et du retentat final sont les suivantes : lactosérum retentat retentat initial intermédiaire final

Facteur de

5,56 121 concentration

Lactoferrine*, g/1 0,11 0,56 7,5

Protéines solubles

7,5 21,9 230 g/i

*Les teneurs en lactoferrine indiquées ont été déterminées par im uno-dif usion radiale. La précision estimée est de l'ordre de + 15%. Les teneurs en protéines solubles ont été déduites du dosage de l'azote par la mé¬ thode de Kjeldahl.

Comme dans le premier stade, on a constaté une

2 stabilité du débit du perméat à 85 1/h/m . Il est à noter que les stades d'ultrafiltration sont effectués de préfé¬ rence sur une plage de température de 30 à 50°C pour main¬ tenir le liquide traité à une viscosité appropriée. Si désiré, un échangeur de chaleur peut être prévu avant l'entrée du module d'ultrafiltration pour maintenir la température à une valeur appropriée.

Sur la figure 2, on a représenté une installation de fractionnement chromatographique du retentat final produit par 1 'ultrafiltration. Cette installation comprend un réservoir 11 du retentat à traiter et un réservoir 12 d'éluant reliés à une vanne à trois voies 13. Une pompe péristaltique 14 permet d'alimenter à volonté une colonne chromatographique 15 en retentat ou en éluant selon le réglage de la vanne 13. La colonne 15 est garnie d'un support ou gel chromatographique 16. A la sortie de la colonne 15, un détecteur optique 17 opérant à 280 nanomè- tres commandant des vannes 18, 19, 20 et 21 permet de diriger sélectivement les fractions correspondant à chacun des pics séparés par chromatographie ainsi que le reste

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d'éluant vers des cuves 22, 23, 24 et 25 respectivement. Le détecteur 17 est associé à un enregistreur 26. La colonne 15 avait un diamètre intérieur de 16 mm et était équipée de deux adaptateurs 27 permettant de régler la hauteur du support ou gel chromatographique. Cette hauteur a été réglée à 60 cm. La colonne était garnie d'un gel chroma¬ tographique SEPHADEX G 150 capable de séparer des molécules de masse molaire comprises entre 5000 et 300000 daltons. L'éluant utilisé est un tampon TRIS(tris-hydroxyméthyl/a- mino- éthane) 0,1 M, 1 M NaCl, pH 8 présentant une force ionique élevée limitant les agglomérations protéines-pro¬ téines. Le gel chromatographique était préalablement équi¬ libré dans un tampon de force ionique élevé et de pH du même ordre que celui de l'éluant. On a injecté dans la colonne un volume de retentat à traiter correspondant à 10% du volume de la colonne, soit environ 12 ml. Le débit d'élution a été réglé, au cours de trois essais, à 30, 40 et 60 cm/heure (60, 80 et 120 ml d' éluant/heure) ce qui correspondait à un cycle total de 120, 90 et 60 mn, respectivement. Dans tous les cas, on a obtenu la séparation de trois fractions, à sa¬ voir une fraction albumines résiduelles, une fraction lac¬ toferrine + Iactoperoxydase et une fraction immunoglobuli¬ nes. La figure 3 représente un diagramme d'élution typique montrant la séparation des pics des diverses frac¬ tions.