Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Trennung von Substanzen mittels einer geeigneten Membran gemäß Anspruch 1 bis 8.

Trennprozesse sind ein wesentlicher Bestandteil aller (bio) chemischen Synthesen. So ist die Trennung von Substanzen für die Gewinnung von Produkten, die während oder nach Synthesen gebildet werden bzw. worden sind, unerläßlich. Sie stellt für die Syntheseplanung bei Produktionen im großen Maßstab ein wichtiges Kriterium dar. Vielfach entscheidet gerade die Abtrennung von Zwischen¬ oder Endprodukten in einer geforderten Qualität über den möglichen Syntheseweg.

Bei katalytischen Reaktionen bzw. bei Reaktionen, die Synthesehilfsstoffe benötigen, kann zusätzlich die Abtrennung dieser Hilfsstoffe vom gebildeten Produkt wichtig werden. Denn Synthesehilfsstoffe, wie beispielsweise Katalysatoren bei chemischen Synthesen oder auch Cofaktoren bei enzymatischen Synthesen, sind in der Regel sehr kostspielig. Daher ist es das Ziel, die Synthesehilfsstoffe so effektiv wie möglich zu nutzen, um die Kosten von Synthesen weitestgehend zu vermindern. Dafür werden zum einen die für entsprechende Synthesen einzusetzenden Mengen an Hilfsstoffen möglichst gering gehalten. Zum anderen gibt es aber auch bereits verschiedene Ansätze, um eine verbesserte Ausnutzung von Synthesehilfsstoffen zu ermöglichen. Dazu zählen

insbesondere Versuche, die während der Synthesen gebildeten Produkte vom Hilfsstoff zu trennen, um eine Wiederverwendung des Hilfsstoffes zu erreichen.

Die Trennung von Produkten vom Synthesehilfsstoff wurde bisher auf verschiedene Weise verwirklicht. So werden beispielsweise die Hilfsstoffe bzw. Katalysatoren auf Trägern immobilisiert, wobei aber häufig die Kontaktflächen zwischen Hilfsstoff und Träger stark vermindert sind, was man durch eine entsprechende Erhöhung der Porosität des Trägermaterials zu kompensieren versucht. Auch ist der

Immobilisierungsvorgang in Bezug auf den Arbeitsaufwand und den Katalysatorverlust nicht unproblematisch. Desweiteren resultiert eine Immobilisierung häufig in einer veränderten Wirkweise des Hilfsstoffes.

Eine weitere Möglichkeit zur Trennung von Produkten vom

Synthesehilfsstoff erfolgt durch Einsatz von Membranen. So werden beispielsweise die bei enzymatischen Umsetzungen eingesetzten Enzyme durch Membranen von der übrigen Reaktionslösung abgetrennt. Allerdings ist eine solche Abtrennung deshalb möglich, weil die Molmasseunterschiede zwischen Enzym bzw. Protein und den übrigen Reaktionsteilnehmern, wie Substrate, Produkte, Cokatalysator bzw. Cofaktor u.a., in der Regel sehr groß sind: So liegt die Molmasse von Enzymen in einem Bereich von 40 000 g/mol, die der übrigen Reaktionsteilήehmern häufig unter 1 000 g/mol. In Figur 1 ist die Retentionsrate von käuflich zu erwerbenden Membranen (amicon) gegen die Molmasse aufgetragen. Wie aus dieser Figur hervorgeht, lassen sich Enzyme in dem genannten Molmassebereich leicht durch eine Membran, wie beispielsweise der YMIO-Membran,

von den übrigen Substanzen mit einer Molmasse unter 1 000 g/mol abtrennen.

Betrachtet man die Graphik der Membranen mit geringerer Porengroße, z.B. für die Membran YC05 (nominelle Trenngrenze 500 g/mol) , muß man feststellen, daß nicht mehr von einer Trenngrenze gesprochen werden sollte. Es entsteht vielmehr ein Massenbereich, bei dem eine mehr oder weniger gute Retention der Moleküle auftritt. Diese Tendenz ist bereits bei den Membranen YM1 (nominelle Trenngrenze 1 000 g/mol) und YM3 (nominelle Trenngrenze 3 000 g/mol) zu erkennen. Versucht man also eine Trennung von Substanzen, deren Molmassedifferenz bezogen auf die nominelle Trenngrenze relativ gering ist, so findet man bei hohen nominellen Trenngrenzen (wie z.B. bei YM10-, YM30-, YM100- Membranen) gute Retentionsunterschiede, wahrend man bei geringen nominellen Trenngrenzen (wie z.B. bei YC05-, YM1-, YM3-Membranen) keine oder kaum Retentionsunterschiede findet .

Soll beispielsweise der bei enzymatischen Umsetzungen ebenfalls häufig einzusetzende Hilfsstoff bzw. Cofaktor NAD(P) oder NAD(P)H, dessen Molmasse bei etwa 700 g/mol liegt, von gebildeten Produkten mit einer Molmasse beispielsweise bei 150 g/mol getrennt werden, ist eine Separation mittels Membranen, wie in Figur 1 dargestellt, nicht mehr möglich: Bei Verwendung einer YC05-Membran gemäß Figur 1 wäre damit zu rechnen, daß etwa 75 % des Produkts von der Membran zurückgehalten werden und damit keine effektive Trennung zwischen Cofaktor und Produkt stattfindet. Bei Verwendung einer YMl-Membran gemäß Figur 1 wurde zwar das Produkt nicht zurückgehalten; dafür würde

aber auch ein relativ großer Anteil des Cofaktors die Membran passieren und damit ebenfalls keine effektive Abtrennung beider Substanzen erfolgen. Dieses, aus enzymkatalysierten Umsetzungen angeführte Beispiel ist selbstverständlich auch auf andere Umsetzungen übertragbar: So werden beispielsweise in der chemischen Katalyse wertvolle Hilfsstoffe, darunter auch Katalysatoren, eingesetzt, deren Wiederverwendung von großer Bedeutung ist. Aber auch in diesen Fällen ist der Molmasseunterschied zwischen Produkt und Katalysator bzw. Hilfsstoff häufig so gering, daß mit einer Trennung der Substanzen mittels Membranen nicht zu rechnen ist.

Um trotzdem eine Abtrennung durch Filtration zu ermöglichen, wurden abzutrennende Substanzen, wie z.B. Synthesehilfsstoffe, derart vergrößert, daß sie sich in ihrer molaren Masse und ihrem sterischen Anspruch um Größenordnungen von denen der weiteren Substanzen bzw. der gebildeten Produkte unterscheiden, um eine Rückhaltung mittels geeigneter Membranen zu erreichen. Die Hauptnachteile einer solchen Vorgehensweise sind aber auch hier -wie bereits oben für die Immobilisierung der Hilfsstoffe erwähnt - hohe Verluste des Hilfsstoffes, z.B. während der Polymeranbindung, sowie veränderte Eigenschaften: Beispielsweise wird durch chemische Modifizierung von Cofaktoren, die im übrigen bisher nur für eine geringe Anzahl von Cofaktoren durchgeführt werden konnte, häufig die Affinität des Enzyms zu den Cofaktoren herabgesetzt.

Es wurde nunmehr überraschenderweise gefunden, daß eine Trennung von Substanzen mittels Membranen mit niedriger

Trenngrenze auch dann erfolgt, wenn die

Molmasseunterschiede zwischen den Substanzen relativ gering sind. Dafür sollte die Molmasse einer Substanz Si 70 bis 1 000 g/mol, die Molmasse einer weiteren Substanz ≤2 300 bis 2 000 g/mol, die Molmassedifferenz S2 minus Sι_ 200 bis 1 000 g/mol, der Quotient (S2 minus Sι_)/S2 0,5 bis 0,9 und die Retentionsrate von S2 mindestens 75 bis 80 % betragen. Für das Trennverfahren geeignete Membranen sind solche, die im Handel in der Regel als Nanofiltrations- oder Umkehrosmosemembranen bezeichnet werden. Eine für eine Trennung optimale Membran kann durch Versuche ermittelt werden, wobei Herstellerangaben über nominelle Trenngrenzen oder Salzretentionsraten nur als Anhaltspunkte dienen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren sind Substanzen mit den folgenden Molmassen sehr gut trennbar, wobei die

Retentionsrate der Substanz S2 95 bis zu 100 % beträgt:

Molma:sse

(g/mol)

Sl S2 S _] _ minus S2 (Si minus S2) /S2

70 300 230 0,767

70 350 280 0,800

70 700 630 0,900

100 550 450 0,818

112200 884400 772200 0,857

130 720 590 0,819

500 1000 500 0,500

500 1500 1000 0, 667

1000 2000 1000 0,500

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Trennung von in Gegenwart eines Synthesehilfsstoffes gebildeten Produkten vom Synthesehilfsstoff geeignet. Damit können aus enzymkatalysierten Umsetzungen erhaltene Produkte von Cofaktoren oder auch aus chemischer, vorzugsweise asymmetrischer chemischer Katalyse erhaltene Produkte vom Katalysator getrennt werden. Insbesondere bei enzymkatalysierten Umsetzungen erfolgt eine äußerst effektive Trennung von Produkten und Cofaktoren, wie NAD(P), FAD oder PQQ. Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist damit eine Rückhaltung von Hilfsstoffen bzw. Abtrennung von Produkten, insbesondere von Epoxiden, Aminosäuren, Alkoholen oder -Hydroxysäuren, bei vergleichbaren Größenordnungen, aber leicht unterschiedlichen Retentionen möglich. Auch können Trennungen in allen Lösungsmitteln und unter allen membranverträglichen Bedingungen durchgeführt werden. Zudem sind die Hilfsstoffe ohne Veränderung einsetzbar und verlieren damit auch nicht ihre typischen Charakteristika.

Desweiteren kann das Verfahren aber auch zur Trennung einer Vielzahl weiterer Substanzen eingesetzt werden, z.B. solcher Substanzen, die in Tabelle 1 beispielhaft aufgeführt sind. Dabei handelt es sich bei Substanz 2 teilweise um nicht-komplexierte Liganden eines Synthesehilfsstoffes; für Substanz 1 gelten hinsichtlich der Molmassebereiche die erfindungsgemäßen Bedingungen.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen sowie dreier Ausführungsbeispiele näher erläutert.

ERSATZBUTT(REGEL26)

Es zeigen schematisch für die enzymatische Katalyse (Beispiel 1 und 2) :

Figur 2 : eine Reaktion, wie sie in einem Membranreaktor durchgeführt wurde. Ein Substrat S wird in einer durch Enzym 1 katalysierten Reaktion zu einem Produkt P umgesetzt. Dazu wird ein Cofaktor, hier NADH, benötigt, der zu NAD ⁺ abreagiert und in einer zweiten Reaktion, durch ein Enzym 2 katalysierten Reaktion (Oxidation von Ameisensäure, HCOOH, zu CO2) regeneriert wird.

Figur 3: Einsatz einer Nanofiltrations- (NF) bzw.

Umkehrosmosemembran (RO) in einem Membranreaktor (1) . Die Substrat, Cofaktor und HCOOH enthaltene Feedlösung wird dem Reaktor über eine Pumpe (3) zugeführt. Die NF-/RO-Membran (2) hält nun die Enzyme (4) und einen Teil der Cofaktoren zurück, während nicht abreagiertes Substrat und entstandenes Produkt sowie der geringe Anteil des Cofaktors die Membran passieren.

Die in Figur 3 dargestellte Anordnung wurde zur Produktion von chiralen Alkoholen und Aminosäuren verwendet . Die Prozessbedingungen sind in den beiden nachfolgenden Beispielen (Beispiel 1 und Beispiel 2) aufgeführt.

Tabelle 2 zeigt schließlich die Retentionen der in den Ausführungsbeispielen eingesetzten Substrate bzw. erhaltenen Produkte und der Katalysatoren bzw. Hilfsstoffe in Abhängigkeit der molaren Masse, Konzentration und

Verweilzeit. Desweiteren sind auch die für einige weitere Substanzen gemessenen Retentionen angegeben.

Beispiel 1

In einem 10 ml - Enzymmembranreaktor (EMR) mit einer Umkehrosmosemembran (ROM 365, amafilter) wurden die Enzyme:

Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir : 0,5 U/mL Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii : 0,5 U/mL

gegeben und als Feedlösung eine wäßrige Lösung von pH 7,0 mit

[Acetophenon] = 7 mM

[Magnesiumchlorid] = 1 mM [NADP+] = 25 μM (entspricht 5 % der im Reaktor beabsichtigten Konzentration)

[Natriumformiat] = 100 mM

[di-Kaliumhydrogenphosphat] = 50 mM

Bei einer Verweilzeit von 1 h und einer Reaktionstemperatur von 25°C betrug der Umsatz bezüglich des Substrates Acetophenons 75 %.

Zu Beginn der Reaktion wurde die Konzentration des Cofaktors im Reaktor durch eine einmalige Zugabe an Cofaktor auf 0,5 mM angehoben. Die dem Reaktor zugeführte Lösung enthielt nur 5 % dieser Cofaktor Konzentration. D.h., daß das Rückhaltevermögen der Membran so hoch ist, daß der geringe Anteil des permeierenden Cofaktors durch diese 5 % ersetzt werden kann. Auch die thermische Deaktivierung des Cofaktors wird durch diese geringe Menge aufgefangen.

ERSATZBLAH(REGEL26)

Die Wechselzahl des Cofaktors betrug 204 molp / mol _NAD (75 % x 7 mM / 25 μM) .

Ohne den Einsatz der RO-Metnbran ergäbe sich eine Wechselzahl von 10,5 molp / mol _NAJ:ι (75 % x 7 mM / 500 μM) . Somit ergibt sich durch die durch Retention mögliche Rezyklierung des Cofaktors eine 20 - fach bessere Ausnutzung des teuren Cofaktors.

Trotz der Retention von Acetophenon bzw. Phenylethanol konnte keine Anreicherung dieser Substanzen im Reaktor festgestellt werden.

Beispiel 2

In einem 10 ml - Enzymmembranreaktor (EMR) mit einer Umkehrosmosemembran (ROM 365, amafilter) wurden die Enzyme:

Aminosäuredehydrogenase aus Bacillus sp. : 15 U/mL Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii ; 15 U/mL

gegeben und als Feedlösung eine mit NH3 auf pH 8 gebrachte wäßrige Lösung mit

[Trimethylpyruvat] = 500 mM [Ameisensäure] = 1,0 M [NAD+] = 0,08 mM (entspricht 33 % der im Reaktor beabsichtigten Konzentration)

Bei einer Verweilzeit von 4 h und einer Reaktionstemperatur von 30°C betrug der Umsatz bezüglich des Substrates Trimethylpyruvat 95 %.

Zu Beginn der Reaktion wurde die Konzentration des Cofaktors im Reaktor durch eine einmalige Zugabe an Cofaktor auf 0,2 mM angehoben. Die dem Reaktor zugeführte Lösung enthielt nur 33 % dieser Cofaktor Konzentration. Im Gegensatz zu Beispiel 1 sind die Reaktionsbedingungen für den Cofaktor sehr ungünstig, so daß aufgrund des pH-Werts und der Temperatur eine deutlich höhere Deaktivierung des Cofaktors NAD(H) auftritt, die durch eine entsprechend höhere Cofaktorkonzentration in der Substratlösung kompensiert werden muß. D.h., daß mit einem Großteil der zugeführten Cofaktormenge ausschließlich der deaktivierte Cofaktor ausgeglichen werden muß. Selbst für diesen Fall kann immer noch ein Drittel des Cofaktors durch Anwendung der RO-Membran eingespart werden.

Die Wechselzahl des Cofaktors betrug 7920 molp /

(95 % x 500 mM / 0,08 mM) .

Ohne den Einsatz der RO-Membran ergäbe sich eine

Wechselzahl von 2375 molp / mol _NAD (95 % x 500 mM /

Somit ergibt sich durch die durch Retention mögliche

Rezyklierung des Cofaktors eine 3,3 - fach bessere

Ausnutzung des teuren Cofaktors.

Demgegenüber lag die Retentionsrate des Substrats Trimethylpyruvat bzw. des gebildeten Produkts tert. Leucin bei nur 2 %.

Beispiel 3

In einem 10 ml EMR (Versuchsaufbau entspricht dem von Figur 2) wird eine Nanofiltrationsmembran (Celfa CMF-KX- 060, bzw. Membrane Products:MPF 60) durch spülen mit 1.) Aceton und 2.) Dichlormethan konditioniert. Nun wird die in Dichlormethan gelöste, eingewogene Ligandmenge (Ligand des Jacobsen-Katalysators, siehe Figur 4) eingespült. Die während des Einspülvorgangs austretende Lösung wird aufgefangen, und die Ligandkonzentration photometrisch bestimmt, um die im Reaktor verbliebene Ligandmenge ausrechnen zu können. Bei einer Flußrate von 20 ml/h (= Verweilzeit von 0,5 h) wird nun die austretende Lösung jeweils über einen Zeitraum von 1 Stunde aufgefangen und ebenfalls die Ligandkonzentration in diesem Permeat photometrisch bestimmt. Man erhält so die Möglichkeit die permeierte Menge Ligand pro Zeiteinheit auszurechnen und mit der im Reaktor verbleibenden Ligandmenge ins Verhältnis zu setzen.

Hieraus ergeben sich über einen Zeitraum von 7 Verweilzeiten bis zum Abbruch des Versuchs Retentionen von über 97 %.

Nach demselben Verfahren wird die Retention von Styren, einem möglichen Substrat für die enantioselektive Epoxidierung, bestimmt. Als Analytik wurde hier eine gaschromatographische Methode gewählt.

Es ergeben sich für Styren Retentionen von unter 47 %, wobei auch hier eine Anreicherung der Substanz im Reaktor nicht erfolgte .

ERSATZBLAπ(REGEL26)

Tabelle 1

Substrat 2 Substrat 1

Name o. Substanzklasse Molgewicht Name o. Substanzklasse / (g/mol)

DIOP 498 Olef ine

NORPHOS 463 Olef ine

BINAP 623 Olef ine

Dendrimere 300-2000 Ketone

Sharpless -Liganden 300-600 Olef ine

PPPA 429 Ketone

X-Pybox 305-318 Ketone

Ferrocenylphosphin « 660 Ketone, Aldehyde

Tabelle 2