Polymerkern und eine Siliziumdioxidschale mit kontrollierter Struktur und Oberfläche

[0001] Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Synthese von Mikropartikeln zur

Anwendung für analytische Zwecke und als Referenzmaterial z.B. in der Sensorik, in der medizinischen Diagnostik und der Forschung. Insbesondere betrifft die Anmeldung hybride Mikropartikel umfassend einen Polymerkern und eine Silikatschale, sowie Silikathohlsphären.

[0002] Für partikelbasierte analytische Anwendungen werden bevorzugt entweder sphärische Polymerpartikel oder Siliziumdioxidpartikel eingesetzt. Geeignete Partikel sind in der Regel wenige Mikrometer groß, z.B. 5 - 7 μιη (Hersteller: BD™ cytometric bead array oder Luminex xMAP ^® ) oder 3 μιη (Hersteller: Illumina) und weisen eine im Wesentlichen enge Größen Verteilung auf (Monodispersität nach NIST: üblicherweise 90% der Partikel innerhalb 5% der Abweichung des Medians). Aus Sicht typischer Anwendungen wird ein Größenbereich eines mittleren Partikeldurchmessers von etwa 0,5 μιη bis 10 μιη bevorzugt. Dieser Bereich ergibt sich aus dem Verhalten, umfassend Sedimentation und Lichtstreuung, der bei ihrer Anwendung typischerweise in wässrigen Lösungen dispergierten Partikel und dem jeweils eingesetzten Messverfahren. Partikel mit geringerem Durchmesser bis 500 nm sind in bildgebenden und streulichtbasierten Verfahren nur schwer detektierbar, größere Partikel (größer 10 μιη) sind zunehmend raschen Sedimentationsprozessen ausgesetzt und deshalb für fluidische Hochdurchsatzmethoden ungeeignet.

[0003] Der Ausdruck„etwa",„ca." und„im Wesentlichen" bedeutet im hier

verwendeten Zusammenhang eine Abweichung des jeweiligen Parameters vom benannten Wert um nicht mehr als + 10%, typischerweise um + 5%, und kommt damit einer solchen möglichen oder tatsächlich vorliegenden Schwankung des betreffenden Parameters gleich, die keinen oder nur einen vernachlässigbar geringen Einfluss auf eine jeweils resultierende technische Wirkung des betreffenden Parameters hat.

[0004] Der Bereich zwischen 0,5 und 10 μιη wird für partikelbasierte Anwendungen bevorzugt. Hierbei ist stets auf die Sedimentation der Partikel zu achten, die weder zu langsam sein soll und damit zu langwierigen Trenn- bzw. Waschschritten bei z.B.

Zentrifugation führen kann, noch zu schnell erfolgen soll, damit während einer Messung an Partikelensembles oder sequentiell an einzelnen Partikeln (bspw. Charakterisierung oder Anwendung der Partikel mit streulichtbasierten Verfahren, Hochdurchsatzverfahren) die Partikel mit der Zeit nicht sedimentieren und damit das Messsignal verfälschen. [0005] Sphärische Polymerpartikel, insbesondre Polystyrol-Partikel, nachfolgend auch als Polymerkern bezeichnet, können im interessierenden Größenbereich mit einer jeweils engen Größenverteilung leicht in größeren Maßstäben bis mehrere Gramm hergestellt werden. Jedoch sind Polymerpartikel nur eingeschränkt einer nachträglichen chemischen

Oberflächenmodifizierung zugänglich. Insbesondere ist ihre nachträgliche Modifizierung auf chemische Reaktionen bereits vorhandener Gruppen beschränkt, sodass jeweils benötigte funktionelle Gruppen in Form von Ko-Monomeren bereits in dem zur Partikelsynthese verwendeten Reaktionsansatz vorliegen müssen. Ebenso zeichnen sich Polystyrol-Partikel durch eine niedrige Materialdichte von etwa 1,05 g/mL aus, weshalb sie zwar kolloidal stabil in wässriger Lösung vorliegen, zur Trennung z.B. mittels Zentrifugation aber entweder lange Zeiten oder sehr hohe Drehzahlen notwendig sind. Meist werden Polystyrol-Partikel daher in größeren Durchmessern größer 3 μιη eingesetzt.

[0006] Im Gegensatz hierzu können Siliziumdioxidpartikel, nachfolgend Silikat- Mikropartikel genannt, mit Hilfe von organischen Chlorsilan- oder Alkoxysilan-Derivaten leicht nachträglich funktionalisiert werden. Jedoch sedimentieren sie auf Grund der hohen Materialdichte von etwa 2,0 + 0,2 g/mL in wässrigen Medien rasch. Zudem erfordert die Synthese von Silikat-Mikropartikel jenseits des klassischen„Stöber-Bereichs", also mit einem mittleren Durchmesser der Partikel größer 1 μιη, mehrstufige und aufwändige Verfahren.

[0007] Eine weitere, aus Sicht der Anwendung wichtige, Materialeigenschaft ist die Lichtstreuung am einzelnen Partikel, die maßgeblich über den Brechungsindex bestimmt wird. Eine effiziente Lichtstreuung ist in streulichtbasierten Verfahren eine wichtige

Voraussetzung. Hierbei zeichnen sich Polymerpartikel, wie z.B. Polystyrol-Partikel, durch einen geeignet hohen Brechungsindex von n = 1,59 (bei einer Anregungswellenlänge von 589 nm) aus, während Silikat-Mikropartikel einen niedrigeren Wert von n = 1,46 (bei einer Anregungswellenlänge von 589 nm) zeigen. Bei gleicher Größe und Anregunswellenlänge resultiert das in einer niedrigen Streulichtintensität einzelner Silikat-Mikropartikel, z.B. in der Durchflusszytometrie, im Vergleich zu Polystyrol-Mikropartikeln.

[0008] Bevorzugt weisen die erhaltenen Partikel in optischen Anwendungen eine

Streulichtintensität auf, die mindestens der des Polystyrol-Kerns entspricht oder darüber liegt. Analog ist von einem Brechungsindex auszugehen, der mindestens dem von reinen

Polystyrol-Kernen entspricht. Entsprechend der bevorzugten Verwendung der Partikel in partikelbasierten analytischen Anwendungen, wird die Streulichtintensität anhand der

Vorwärtsstreuung bei 180 °, Abk. FSC, und einer Anregungswellenläge von 488 nm mit der Durchflusszytometrie bestimmt und dabei der reine Polymerkern als Referenz verwendet. [0009] Eine weitere, aus Sicht der Anwendung wichtige, Materialeigenschaft ist die Kontrolle über die Struktur und damit verbundene Oberfläche der sphärischen Träger. Dieser Aspekt wird in bisherigen kommerziellen Lösungen nicht beachtet, da hierbei bisher bevorzugt mit reinen Polymer- bzw. Silikat-Mikropartikeln gearbeitet wird. Diese werden hinsichtlich der Struktur stets als ideale Kugeln mit glatter Oberfläche behandelt. Außer Acht gelassen wird hierbei die Möglichkeit, die Oberfläche pro Partikel zu erhöhen oder Struktur- Reaktivitäts-Beziehungen in den Vordergrund zu stellen.

[0010] Vor diesem Hintergrund besteht ein Bedarf an idealerweise monodispers vorliegenden sphärischen Mikropartikeln in einem Größenbereich zwischen 0,5 und 10,0 μιη mit silikatischer Oberfläche, die eine hinreichend effiziente Lichtstreuung und geeignete Sedimentationseigenschaften, bestimmbar über eine einstellbare Dichte zwischen p = 1,05 g/cm 3 und p = 1,8 g/cm 3 , bevorzugt zwischen p = 1,09 und p = 1,53 g/cm 3 in wässrigen Lösungen haben. Als praktikabler Ansatz zur Darstellung geeigneter Mikropartikel wird hier die Synthese von hybriden Kern-Schale-Partikeln verfolgt, wobei auf sphärischen

Polymerkernen mit enger Größenverteilung eine Schale aus Siliziumdioxid mit kontrollierter Struktur aufgebracht wird. Derartige Partikel werden hier als hybride Mikropartikel bezeichnet. Die Dichte derartiger Partikel errechnet sich hierbei aus der Summe des

Massenanteils des Polymerkerns mal der Dichte (p = 1,05 g/cm ³ ) und dem Massenanteil der Silikatschale mal der Dichte (p = 2,00 g/cm ³ ). Der Massenanteil von Polystyrol bzw. Silikat in einem hybriden Partikelverbund kann mittels thermogravimetrischer Analyse bestimmt werden. Die Anteile der Silikatschale an der Dichte der hybriden Mikropartikel liegen hierbei bevo

liege

ü

1.52

[0011] Vor diesem Hintergrund werden hybride Mikropartikel nach Anspruch 1, ein Verfahren zur Herstellung von derartigen Mikropartikeln nach Anspruch 11 , die Verwendung von 4,4'-Azobis(4-cyanopentansäure) als Initiator für eine radikalische Polymerisation nach Anspruch 22, ein chromatographischer Träger nach Anspruch 23 und ein Trägerpartikel für einen partikelbasierten Assay nach Anspruch 24 vorgeschlagen. Weitere Ausführungsformen, Modifikationen und Verbesserungen ergeben sich anhand der folgenden Beschreibung und Figuren sowie der beigefügten Ansprüche.

[0012] Gemäß einer ersten Ausführungsform werden Mikropartikel vorgeschlagen, die einen Polymerkern und eine den Polymerkern zumindest abschnittsweise umgebende Schale umfassen, wobei die Schale eine Siliziumdioxid-Schicht umfasst. Diese hybriden Mikro- Partikel werden erfindungsgemäß anhand des Verhältnisses der spezifischen äußeren, für eine Adsorption von Stickstoff zugänglichen, und also mittels gängiger Methoden über eine Isotherme bestimmbaren, Oberfläche zu derjenigen Oberfläche, welche ausgehend von einem arithmetischen mittleren Durchmesser der hybriden Mikropartikel unter Annahme einer idealen Kugelform derselben errechenbar ist, charakterisiert. Dieser Quotient von mittels Stickstoffadsorption bestimmter spezifischer Oberfläche und der aus einem arithmetischen mittleren Partikeldurchmesser errechneten Oberfläche des als ideale Kugel aufgefassten hybriden Mikropartikels wird nachfolgend als Rauheitsfaktor oder als RF-Wert bezeichnet.

[0013] Die externe Oberfläche wird bevorzugt mittels Stickstoffadsorption unter

Zugrundelegung der Anwendbarkeit einer BET-Isotherme zur Beschreibung des Adsorptionsund Desorptionsverlaufs von Stickstoff bei 77K bestimmt oder alternativ aus der Anzahl der die Silikatschale umfassenden Silikat-Nanopartikeln und deren Auswölbung bei

geschlossenen Schalen oder deren Größe und Anzahl bei offenen Silikatschalen abgeschätzt.

[0014] Falls keine Daten zur Stickstoffadsorption der Partikel vorliegen, so wird aus Kerngröße, Größe und Anzahl der die Siliziumdioxid-Schicht umfassenden Silikat- Nanopartikel der Wert der externen Oberfläche für offene Schalen berechnet: Anzahl der Partikel mal deren Oberfläche, bestimmbar über die Größe und Annahme einer idealen Kugel. Die Anzahl der Silikat-Nanopartikel wird wiederum über den Massenanteil von Silikat im hybriden Partikelverbund, bestimmbar mittels thermogravimetrischer Analyse (TGA), unter der Annahme einer mittleren Dichte von etwa 2,0 g/mL, berechnet. Für geschlossene Partikel, für die keine Stickstoffadsorptionsdaten vorliegen, wird der RF-Wert anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen der Partikel abgeschätzt. Dabei wird bei geschlossenen Schalen (glatt oder hügelig) jeweils die mittlere Auswölbung der die Silikatschale umfassenden, überwiegend miteinander verwachsenen Silikat-Nanopartikel beurteilt und deren Oberfläche berechnet. Damit ergeben sich theoretisch mögliche RF-Werte zwischen 1 und 2, in der Annahme von bis maximal zur Hälfte ihres Durchmessers ausgewölbten Silikat- Nanopartikeln. Die Größe der Silikat-Nanopartikel ist hierbei nicht relevant, da lediglich die Auswölbung den Zuwachs der Oberfläche bestimmt. Bei hügeligen hybriden Mikropartikeln erhaltene RF-Werte liegen real teilweise zwischen 2 und 3. Dies wird durch zusätzliche, teilweise über ihren mittleren Partikelradius hinaus ausgewölbte Silikat-Nanopartikel erzeugt, die an der Silikatschale anhaften bzw. mit dieser verwachsen sind.

[0015] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass über die mittels PVP einstellbare Struktur und also spezifische Oberfläche der Silikatschale eine einstellbare Belegungsdichte pro Partikel mit funktionellen Gruppen bzw. mit Liganden und/oder

Fluorophoren erreichbar ist. Weiterhin ist über die Struktur und Dicke der Silikatschale eine resultierende Dichte zwischen 1,05 und 1,8 g/cm 3 , bevorzugt zwischen 1,09 und 1,53 g/cm 3 , der hybriden Mikropartikel einstellbar. Weiterhin wird als Initiator für die radikalische Polymerisation der Polymerkerne bisher zumeist AIBN ((2,2'-azobisisobutyronitrile) verwendet, das umweltbelastend (H412) und giftig (H302, H332) ist. Weiterhin können mit AIBN nur schwer Partikel mit enger Größenverteilung unter Verwendung von PVP mit einem mittleren Molekulargewicht von kleiner 25.000 Dalton hergestellt werden, da der unpolare Initiator keine ausreichenden Ladungen auf der Oberfläche erzeugt, um das Partikel während der Synthese zu stabilisieren.

[0016] Weiter ist die vorgeschlagene Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, dass eine Oberflächenstruktur der Schale ausgewählt ist unter: glatt - wobei der RF-Wert zwischen 1 und 1,5 liegt; unter hügelig - wobei der RF-Wert der Schale zwischen 1,51 und 3 liegt; oder unter offen - wobei die hybride Struktur einen Rauheitsfaktor oberhalb von 3,01 hat.

[0017] Vorteile dieser kennzeichnenden Merkmale ergeben sich daraus, dass sich die Oberfläche der hybriden Mikropartikel und ihr RF-Wert durch die zu ihrer Herstellung eingesetzten Polymere einstellen lässt. So sind im Vergleich zu einer idealen Kugel bei glatten Schalen und RF- Werten von 1 bis 1,5 entsprechende Oberflächenzuwächse bis 50% möglich, bei hügeligen Schalen mit RF-Werten zwischen 1,51 und 3,0 sind Zuwächse bis zu 200% und bei zerklüfteten Schalen mit RF-Werten über 3,01, sind Zuwächse weit über 200% erreichbar.

[0018] Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Struktur der Schale weiter ausgewählt unter: offen, wobei die Schale umfassende Poren einen Porendurchmesser oberhalb von 50 nm (Makroporen) und/oder unterhalb von 50 nm (Mesoporen und Mikroporen) aufweisen und unter geschlossen, wobei die native Silikatschale keine Poren aufweist, insbesondere keine Mikroporen (Durchmesser kleiner 2 nm), keine Mesoporen (Durchmesser zwischen 2 und 50 nm) und keine Makroporen (Durchmesser größer 50 nm) aufweist.

[0019] Dabei wird auf das Vorhandensein von Poren einerseits auf Grund einer visuellen Beurteilung rasterelektronenmikroskopischer Aufnahmen der Partikel geschlossen (Meso- und Makroporen) oder alternativ (bevorzugt) an Hand eines Kurvenfitting der Adsorption gemäß einer BET-Isotherme und des damit erhaltenen C- Werts (Mikroporen) beurteilt bzw. der Beschreibbarkeit des Desorptionsverlaufs von Stickstoff (Mesoporen) an einer

Partikelprobe.

[0020] Die Angabe "kleiner 2 nm" ist nach unten nicht begrenzt, was zur Folge haben kann, dass sub-nanometergroße Poren in der Schale vorliegen. Erfindungsgemäß wird alternativ der sogenannte C-Wert als Bemessungsgrundlage verwendet und hier auch der Bereich auf C kleiner 200 ausgeweitet, sodass gerade das minimale Vorhandensein von Mikroporen nicht ausgeschlossen ist, die so bezeichneten Schalen also durchaus auch Mikroporen umfassen können. Die später noch eingehend beschriebene Verwendung des C- Wertes erscheint als geeignet, die tatsächlich vorliegende Porosität der Silikatschale indirekt zu beschreiben.

[0021] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass die Schalenstruktur zu unterschiedlichen sterischen Abschirmungen führt, weshalb die Oberfläche geschlossener Schalen (mit RF- Werten zwischen 1 und 3) für größerer Moleküle (größer 1 nm) wie zum Beispiel Biomoleküle (DNA, Proteine oder andere Biopolymere) besser zugänglich sind, während bei offenen Schalen (RF- Werte größer 3,01) nicht die gesamte Oberfläche zur kovalenten oder adsorptiven Bindung von großen Molekülen zur Verfügung steht. Kleinere Moleküle hingegen können an offenen Schalen problemlos binden, was hierbei eine besonders hohe Dichte an gebundenen kleinen Molekülen pro Partikel ermöglicht.

[0022] Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst der Polymerkern des

Mikropartikels eine Polymerkomponente, die ausgewählt ist unter Polystyrol, einem

Polystyrol-Derivat, und/oder einem Ko-Monomer. Die Moleküle der ausgewählten

Polymerkomponente weisen jeweils zumindest eine polymerisierbare Doppelbindung auf, sodass der Polymerkern sowohl aus alternierenden Ko-Polymeren, Block- Ko-Polymeren, als auch einer Mischung aus Polymer und Ko-Polymer bestehen kann.

[0023] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass z.B. Farbstoffe, die eine Doppelbindung besitzen, organische oder anorganische Nanopartikel, die mit einer polymerisierbaren Doppelbindung funktionalisiert sind oder andere Ko-Monomere in den Kern eingebaut werden können, um die Funktionalität (Farbe, Fluoreszenz, Vernetzungsgrad, Raman- Kodierung durch verschiedene Styrolderivate) des Polymerkerns zu bestimmen.

[0024] Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Polymerkern des Mikropartikels mit einem Polyvinylpyrrolidon (nachfolgend auch als PVP abgekürzt) ausgerüstet, wobei das PVP ein mittleres Molekulargewicht im Bereich von 7.000 Dalton bis 360.000 Dalton aufweist. [0025] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass mit Hilfe des PVP die spezifische Oberfläche und/oder die Struktur der Silikatschale der hybriden Mikropartikel gezielt einstellbar sind. Vorteilhaft ist PVP kommerziell in einer hinsichtlich seines

Molekulargewichts standardisierten Qualität (z.B. Kollidon oder Luviskol, BASF) oder (PVP 10, PVP40, PVP K-60 oder PVP360 CAS: 9003- 39- 8, Sigma Aldrich) kommerziell verfügbar.

[0026] Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das PVP kovalent an einer äußeren Oberfläche des Polymerkerns gebunden, da von einer Vernetzung der PVP-Ketten mit den ausbildenden Polystyrol-Oligomeren während der Kern-Polymerisation auszugehen ist

[0027] Vorteile dieser Ausführungsform umfassen eine gesteigerte Stabilität der Partikel während der und im Anschluss an die Polymerisation, zum Beispiel in Waschschritten, und die Möglichkeit, eine Silikatschale im Anschluss an die Synthese auf den Polymerkern aufzuwachsen, ohne diesen anderweitig modifizieren zu müssen.

[0028] Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfassen die hier beschriebenen hybriden Mikropartikel in nativer Form, d.h. so wie mittels der nachfolgend noch im Detail beschriebenen nasschemischen Synthese darstellbar, eine Schicht aus PVP, die auf dem Kern liegt und bei PI unterhalb der Siliziumdioxidschale, bei P2 zum Teil in die Schale eingebunden ist und bei P3 innerhalb der Meso- bzw. Makroporen der Schale liegt. Dies wird vor allem auf Grund der vorherrschenden Kräfte bestimmt, die zur Ausbildung der

Silikatschale auf dem Polymerkern verantwortlich sind. So wird bei Molekulargewichten unterhalb von 25.000 Da die Silikatschale vornehmlich durch elektrostatische und Säure- Base -Wechselwirkungen zwischen den Silikat- Nanopartikel und Kieselsäureintermediaten, die während des Beschichtungsprozesses auftreten, und der Carbonsäure, die durch den Initiator auf der Oberfläche vorliegen, direkt auf dem Kernpartikel ausgebildet. Hingegen ist bei einem Molekulargewicht des PVP oberhalb von 58.000 Da vornehmlich von der

Adsorption der Silikat-Nanopartikel an den PVP-Ketten auszugehen, da die Carbonsäuren durch die längeren PVP-Ketten abgeschirmt sind. Für PVP mit einem Molekulargewicht zwischen 25.000 Da und 58.000 Da ist von gemischten Kräften auszugehen. Bei längeren PVP-Kettenlängen werden mehr Adsorptionsplätze außerhalb der Kernoberfläche

bereitgestellt, an denen Silikat-Nanopartikel anhaften können, um eine offene Struktur auszubilden. Folglich liegen die PVP-Ketten bei geschlossenen, glatten Schalen unterhalb der Silikatschale, bei geschlossenen, hügeligen Schalen teilweise innerhalb der Schale und bei offenen Schalen zwischen den Silikat-Nanopartikeln. [0029] Vorteile dieser Ausführungsform umfassen die Möglichkeit, dass bei PI eine erhöhte Stabilität der Schale gegenüber thermischer Energie besteht, da die geschlossene Schale den inneren Polymerkern schützt. Bei Zersetzung des Kerns würde schließlich die Schale brechen, damit Verbrennungsprodukte entweichen können. Dies kann mittels thermogravimetrischer Analyse gezeigt werden, da hierbei erst bei einer Temperatur von größer 500°C ein Großteil des Polymerkerns verbrennt (vgl. Fig. 2).

[0030] Gemäß dem praktischen Ausführungsbeispiel P2 können hingegen, während einer thermischen Behandlung zwischen 50 und 200 °C, vorzugsweise bei 80 - 120 °C über einen Zeitraum von z.B. 5 Stunden, die PVP-Ketten aus der Schale verdrängt werden und somit Mikroporen zur Funktionalisierung innerhalb der Schale erzeugt werden. Gleichzeitig kann, analog zum praktischen Ausführungsbeispiel P3, bei dem von vornherein Mesoporen vorliegen, eine ungehinderte thermisch Zersetzung des Kerns bei Temperaturen oberhalb von 200°C herbeigeführt werden, weshalb die anschließend vorliegenden Silikathohlsphären (vgl. Fig. 5) intakt sind.

[0031] Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das einerseits am Polymerkern kovalent gebundene PVP gleichzeitig eine nicht kovalente Bindung zur Schale über

Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der Carbonylgruppe des PVP und den

Silanolgruppen der Silikatschale auf, wobei die Schale Siliziumdioxid, insbesondere eine Vielzahl von untereinander kovalent über Si-O-Si-Bindungen verbrückten Silikat- Nanopartikeln umfasst. In Abgrenzung der erhaltenen Strukturen ist hierbei von einer mehrheitlich verwachsenen Struktur der Silikat-Nanopartikel bei PI und P2 auszugehen. Es liegt demnach keine Schicht angelagerter Silikat-Nanopartikel vor, die eine offene

Schalenstruktur ausbilden, sondern eine geschlossene Schalenstruktur mit Rauheitsfaktoren zwischen 1,0 und 1,5, bzw. zwischen 1,51 und 3. In einem losen Verbund vorliegende Silikat- Nanopartikel, wie zum Beispiel in US 6103379 A oder US 6,479,146 Bl beschrieben, die der bei Ausführungsbeispiel P3 erhaltenen Struktur ähneln (analog dem verwendeten PVP mit 360.000 Dalton bei US6103379 A), resultieren in Rauheitsfaktoren größer 3,01. Zur

Bestimmung der Rauheitsfaktoren wird hierbei die externe Oberfläche durch die Anzahl an Silikat-Nanopartikeln mal deren Oberfläche, bestimmt über die mittlere Größe und Annahme einer idealen Kugel, berechnet. Die Anzahl an Silikat-Nanopartikeln ist wiederum über den Massenanteil (ermittelt durch thermogravimetrische Analyse) der Silikatschale im hybriden Partikel verbünd unter Berücksichtigung einer mittleren Dichte von 2.0 g/mL und einer mittleren Größe der Silikat-Nanopartikel bestimmbar. So liegen die Rauheitsfaktoren gemäß US 6,103,379 A bei 3,66, 5,92 und 8,15, analog zu den bestimmten TGA-Werten von 7,8%, 13,5 % und 18,5% bei einer Kerngröße von 1,8 μιη und einer mittleren Größe der Silikat- Nanopartikel von 30 nm. [0032] Überraschend erwies sich, dass die Dicke der Silikatschale maßgeblich durch die Wahl des PVP gesteuert werden kann. So sind die Schalen bei Mikropartikeln gemäß dem Ausführungsbeispiel PI zwischen 10 und 30 nm dick, bei P2 zwischen 30 und 45 nm und bei P3 zwischen 40 und 70 nm dick. Dabei wird jeweils ein Verhältnis von eingesetztem

Volumen TEOS zu eingesetzter Masse der Polymerkerne von 3 zu 1 gewählt, bspw. 3 mL TEOS bei lg eingesetzten Kernpartikeln. Darüber hinaus ändern sich die Dicke und auch die Struktur nicht mehr maßgeblich. Mengen an TEOS bis zu einem Verhältnis von 9 zu 1 wurden hier schrittweise getestet. Darunter, also bspw. bei einem Verhältnis von 1 zu 2 oder 1 zu 1, können jeweils kleinere Silikat- Nanopartikel in einfachen (Mono-)Lagen anhaften und so offene Strukturen auch bei niedrigeren PVP-Kettenlängen ausbilden. Aus Sicht der eingangs erwähnten Anwendungen der hybriden Mikropartikel sind geschlossene Schalen wünschenswert, da offene Schalen mitunter weniger stabil sind, Silikat-Nanopartikel z.B. abfallen können und - wie hier und auch anderenorts beschrieben - schlechtere analytische Signale bei größeren Biomolekülen erhalten werden. Aus Sicht einer analytischen

Anwendung in partikelbasierten Assays übertrifft der Nutzen durch Gewinn an Oberfläche lediglich bei Partikeln nach P3 gegebenenfalls die zuvor genannten Nachteile, insbesondere wenn kleinere Moleküle zur Anbindung an die hybriden Mikropartikel bevorzugt sind, oder kleinere Analyten im Assay getestet werden.

[0033] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass das

Herstellungsverfahren gut reproduzierbar ist, wenn eine Mindestmenge an TEOS von 3 zu 1 eingesetzt wird, da sich die Schalendicke und Struktur nicht mehr maßgeblich ändern.

[0034] Gemäß einer weiteren Ausführungsform weisen die vorgeschlagenen hybriden Mikropartikel, umfassend die oben bezeichnete geschlossene, glatte und/oder die oben bezeichnete geschlossene, hügelige Schalenstruktur, keine über den mittels Stickstoff- Adsorption ermittelten C-Wert nachweisbaren Mikroporen auf. Der nativen Silikatschale der betreffenden Mikropartikel fehlen also Mikro-, Meso-, und Makroporen.

[0035] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass im Gegensatz zu offenen Schalen die Zugänglichkeit der Oberfläche für verschieden große Moleküle für die analytische oder chromatographische Anwendung erhöht ist. Es können beispielsweise vergleichsweise weniger größere Biomoleküle (größer 1 nm) an die vorhandene Fläche bei offenen Strukturen binden, als bei geschlossenen Strukturen.

[0036] Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Mikropartikel vorgeschlagen, die an Stelle des Polymerkerns einen Hohlraum aufweisen, sodass die ursprünglich den

Polymerkern umschließende Siliziumdioxid-Schale jetzt den Hohlraum umschließt. Die Siliziumdioxid-Schale kann sowohl intakt und geschlossen oder intakt und offen sein, wobei das Mikropartikel im engeren Sinn eine Siliziumdioxid umfassende Hohlsphäre ist.

[0037] Vorteile ergeben sich direkt aus der Möglichkeit, die Struktur der hybriden Mikropartikel zu kontrollieren, da sich die Struktur der Silikatschale durch die thermische Zersetzung des Kerns nicht maßgeblich ändert. So können also glatte, hügelige und zerklüftete Hohlsphären erzeugt werden. Hierbei ist allerdings nicht mehr definiert, ob die Partikel geschlossen oder offen sind, da sich die Porenstruktur durch die Verbrennung von PVP maßgeblich ändern kann.

[0038] Strukturell kontrollierte Silikat-Hohlsphären eignen sich insbesondere zur Darstellung von mikroskaligen Objekten, die als vergleichsweise inerte, robuste und monodisperse Mimetika oder Referenzmaterialien für biologische oder artifizielle Vesikel oder Liposomen in entsprechenden Mess- und Prüfverfahren eingesetzt werden können.

[0039] Gemäß einer weiteren Ausführungsform weisen die vorstehend beschriebenen Partikel mit glatter oder hügeliger Schalenstruktur (Partikel PI und P2) und im Wesentlichen porenfreier Oberfläche eine mit wachsendem RF-Wert zunehmend wachsende spezifische Oberfläche auf.

[0040] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass diese Oberfläche zur Funktionalisierung zur Verfügung steht und im Vergleich zu reinen Polymerpartikeln eine höhere Dichte funktioneller Gruppen auf einem Partikel erzeugt werden kann.

[0041] Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung von sphärischen Mikropartikeln vorgeschlagen, die einen Polymerkern und eine Schale umfassen, wobei die Schale Siliziumdioxid umfasst und die Struktur der Silikatschale einen RF-Wert aufweist im Bereich von 1 bis 1,5 (geschlossene, glatte Schalenstruktur gemäß Ausführungsbeispiel PI); einen RF-Wert aufweist im Bereich von 1,51 bis 3 (geschlossene, hügelige Schalenstruktur gemäß Ausführungsbeispiel P2) oder einen RF-Wert größer 3,01 aufweist (entsprechend der offenen, zerklüfteten Schalenstruktur gemäß Ausführungsbeispiel P3).

[0042] Dabei ist der zur Kennzeichnung bzw. Unterscheidung der erfindungsgemäßen Partikel genutzte RF-Wert bestimmbar, indem zunächst die externe Oberfläche der hybriden Mikropartikel {A _hy bride _S Mikropartikel, extem ) abzüglich der Oberfläche von eventuell vorhandenen Mikroporen, mittels der t- Methode nach Lippens und de Boer bestimmt wird. Weiter wird eine mittlere ideale Oberfläche des hybriden Mikropartikels (Ahybrides Mikropartikel, ideal ) berechnet ausgehend von dem arithmetischen mittleren Partikeldurchmesser, der bei Annahme einer idealen Kugelform aller Partikel durch Bildauswertung elektronenmikroskopischer

Aufnahmen der Partikel bestimmbar ist. Nun wird das Verhältnis dieser externen Oberfläche zur mittleren idealen Oberfläche des hybriden Mikropartikels gebildet. Der erhaltene Quotient wird hier als RF-Wert bezeichnet: ^hybrides Mikropartikel.extern

Ahybrides Mikropartikel.ideal

[0043] Alternativ ausgedrückt ist der RF-Wert berechenbar als Quotient einer für die Adsorption von Stickstoff zugänglichen äußeren Oberfläche des hybriden Mikropartikels und der Oberfläche einer Kugel, die einen Durchmesser hat, der gleich dem arithmetischen mittleren Durchmesser der hybriden Mikropartikel ist. Dabei wird jedes der hybriden

Mikropartikel als ideale Kugel aufgefasst.

[0044] Insofern keine Stickstoffadsorptionsdaten vorliegen, so kann der RF-Wert anhand der elektronenmikroskopischen Aufnahmen abgeschätzt werden. Dabei wird bei

geschlossenen Schalen (glatt oder hügelig) jeweils die mittlere Auswölbung der die

Silikatschale umfassenden, überwiegend miteinander verwachsenen, Silikat- Nanopartikel beurteilt und deren Oberfläche berechnet. Damit ergeben sich theoretisch mögliche RF-Werte zwischen 1 und 2, bei Annahme bis maximal zur Hälfte ihres Durchmessers ausgewölbter Silikat-Nanopartikel. Die Größe der Silikat-Nanopartikel ist hierbei nicht relevant, da lediglich die Auswölbung den Zuwachs der Oberfläche bestimmt. Für hügelige hybride Mikropartikel erhaltene RF-Werte liegen real, bestimmbar mittels Stickstoffadsorption, teilweise zwischen 2 und 3. Dies wird durch zusätzliche, teilweise über ihren Radius hinaus ausgewölbte, Silikat-Nanopartikel, die an der Silikatschale anhaften bzw. mit dieser und/oder anderen Nanopartikeln verwachsen sind, verursacht.

[0045] Das hier vorgeschlagene Herstellungsverfahren umfasst zumindest die Schritte:

Darstellen von Polymerkernen mit Hilfe einer radikalischen

Polymerisationsreaktion;

Beschichten der Polymerkerne mit einer Silikatschale unter Verwendung eines Sol-Gel-Prozesses, und

Funktionalisieren einer äußeren Oberfläche der Silikatschale mit einem organischen Chlorsilan- oder Alkoxysilan-Derivat, wobei das Darstellen ein Verwenden eines homolytisch spaltbaren Initiators umfasst, der ausgewählt ist unter ACVA - bzw. 4,4'-Azobis(4-cyanopentansäure). [0046] Vorteile des Verfahrens umfassen die bereits vorstehend angesprochene

Überlegenheit der erhältlichen Hybridpartikel. Ein besonderer Vorteil der Verwendung von ACVA (4,4-Azobiscyanovaleric acid, CAS: 2638-94-0) als Radikalstarter für die

Polymerkkernsynthese ergibt sich daraus, dass ACVA als lagerbeständige Substanz keine außerordentlichen Vorsichtsmaßnahmen nach CLP-Verordnung bedarf. Darunter zählen zum einen die Handhabung im Labor, als auch die Schutzmaßnahmen bei Transport der Substanz. Weiter werden bei Einsatz von ACVA auf der Oberfläche der Partikel Carbonsäuregruppen ausgebildet. Diese sorgen für eine zusätzliche elektrostatische Stabilität der Partikel, weshalb auch Partikel mit PVP niedrigerem Molekulargewichts (kleiner 25.000 Da) in engen

Größenverteilungen darstellbar sind. Darüber hinaus sorgen sie für zusätzliche

Bindungsstellen direkt an der Oberfläche für die anschließende Beschichtung der

Silikatschale, da über Säure-Base -Wechselwirkungen sowohl Kieselsäureintermediate und/oder Silikat-Nanopartikel während des Beschichtungsprozesses daran anhaften können.

[0047] Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Struktur der Silikatschale des hybriden Mikropartikels durch ein mittleres Molekulargewicht des jeweils verwendeten PVP einstellbar. So wird für den Erhalt einer geschlossen Schalenstruktur (nach PI, vgl. Fig. la), mit einem RF-Wert im Bereich von 1 bis 1,5 und einer im Wesentlichen glatten äußeren Oberfläche, PVP mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 10.000 Dalton, also 7.000 bis 11.000 Dalton, an der äußeren Oberfläche des Polymerkerns kovalent gebunden. Für den Erhalt einer geschlossen Schalenstruktur (nach P2, vgl. Fig. lb) mit einem RF-Wert im Bereich von 1,51 bis 3 und einer im Wesentlichen hügeligen äußeren Oberfläche liegt hingegen PVP mit einem mittleren Molekulargewicht größer als 10.000 Dalton bis etwa 58.000 Dalton, bevorzugter Weise zwischen 25.000 Dalton und 58.000 Dalton an der äußeren Oberfläche des Polymerkerns kovalent gebunden vor. Für den Erhalt einer im wesentlichen offenen Schalenstruktur (nach P3, vgl. Fig. lc) wird erfindungsgemäß die kovalente

Verankerung eines PVP mit einem mittleren Molekulargewicht oberhalb von 58.000 Dalton vorgeschlagen, wobei eine bevorzugte zerklüftete Struktur der Silikatschale, die im

Wesentlichen aus einer Anlagerung von einzelnen Silikat-Nanopartikeln unterschiedlicher, aber im Wesentlichen einheitlicher Größe, in verschieden vielen und dichten Lagen, besteht. Hierbei können RF-Werte oberhalb von 3,01 eingestellt werden.

[0048] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass unmittelbar mit der Auswahl des Stabilisators PVP während der Kernpartikelsynthese die Struktur der darauf abgeschiedenen Silikatschale bestimmt werden kann. Dabei werden bei unterschiedlich großen Kernpartikeln jeweils dieselben Schalenstrukturen ausgebildet, es liegt also keine Abhängigkeit des Verhältnisses zwischen PVP- Kettenlänge und Kernpartikelgröße vor. [0049] Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden im vorstehend genannten Schritt „Darstellen von Polymerkernen" (vgl. Fig. 6; 1) die Polymerkerne in einem organischen Lösungsmittel mit einem Wasseranteil von 0 Vol-% bis zu 80 Vol-% synthetisiert, wobei als Monomer ein Styrol, ein Styrol-Derivat und/oder ein Ko-Monomer verwendet werden, die jeweils zumindest eine Art einer polymerisierbaren Doppelbindung aufweisen, wobei ein Polyvinylpyrrolidon zur Stabilisation der Polymerkerne dient, wobei ACVA als Initiator dient. Dabei wird unter einer polymerisierbaren Doppelbindung eine solche Doppelbindung verstanden, die in Gegenwart des Initiators zur Ausbildung eines Radikals neigt und so eine Vernetzung monomerer Komponenten und die Ausbildung eines Polymers ermöglicht.

[0050] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass durch Auswahl des organischen Lösungsmittels und den Anteil an Wasser die Größe der Partikel beeinflusst werden können. Dabei gilt, dass bei polaren Lösungsmitteln (z.B. höherer Wasseranteil) kleinere Partikel erzeugt werden, bzw. bei weniger polaren Lösungsmitteln (höherwertige Alkane, Toluol, Hexan etc.) größere Partikel erzeugt werden.

[0051] Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst der vorstehend genannte Schritt „Darstellen von Polymerkernen" ein Waschen der erhaltenen Polymerkerne mit einem organischen oder einem wässrigen Lösungsmittel oder mit einem Lösungsmittelgemisch organischer und/oder wässriger Lösungsmittel (vgl. Fig. 6; 1-5). Die hier und nachfolgend verwendete Schreibweise von aufeinanderfolgenden Zahlen, die durch Strichen verbunden sind, bezeichnet eine Abfolge der im Schema mit den betreffenden Zahlen bezeichneten Schritte, bzw. den Syntheseweg. Alternativ - d.h. an Stelle des Waschens - erfolgt das Beschichten mit einer Silikatschale und gleichzeitigem (vgl. Fig. 6; 1-2) oder anschließendem (vgl. Fig. 6; 1-3-4) Funktionalisieren mit einem Alkoxysilan und/oder einem organischen Chlorsilan- oder Alkoxysilan-Derivat unmittelbar in der Polymerisationsmischung. Mit anderen Worten wird also direkt im Polymerisationsmedium, das ein Lösungsmittel- Wasser- Gemisch umfasst, die Silikat-Schale und oder die funktionalisierte Variante derselben aufgewachsen. Dieser Syntheseweg ist gemäß Schema in Fig. 6 durch die Abfolge 1-2 oder 1- 3-4 beschreibbar. Typischerweise werden nach vorbekannten Verfahren die Partikel zuerst gewaschen, bevor eine Beschichtung vorgenommen wird. Erfindungsgemäß wird auf zwischengeschaltete Waschschritte verzichtet. Damit werden die Synthesewege 1-2, 1-3-4 und erforderlichenfalls auch gemäß 1-5 (einfaches Waschen) umfasst. Vorteilhaft kann die Schale funktionelle Gruppen umfassen.

[0052] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass bereits wenige Syntheseschritte zur Darstellung hier beschriebener hybrider Mikropartikel führen. Die angegebenen Schritte sind unabhängig von einem Gesamt- Volumen des jeweils gewählten Reaktionsansatzes, sodass Mikropartikel in praktisch relevanten Mengen, also in Milligramm- bis Gramm-Maßstab, bereitgestellt werden können. Ebenso problemlos ist durch die Auswahl betreffender Monomere ein gezielter Zuschnitt der oberflächlich am Polymerkern

vorliegenden reaktiven Gruppen gewährleistet.

[0053] Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst der vorstehend genannte Schritt „Beschichten der Polymerkerne" (vgl. Fig. 6; 1-5-6 und 1-5-7) die Verwendung eines alkoholischen Lösungsmittel- Wasser-Gemisches, wobei der Wasseranteil des Alkohols wiederum wahlweise zwischen 0 Vol-% und bis zu 80 Vol-% beträgt. Eine zur Beschichtung verwendete Ausgangssubstanz ist ausgewählt unter einem Alkoxysilan (vgl. Fig. 6; 1-5-7) und/oder einem organischen Chlorsilan- oder Alkoxysilan-Derivat (vgl. Fig. 6; 1-5-6), wobei die Beschichtung in Gegenwart eines basischen, eines organischen oder eines anorganischen Katalysators erfolgt. Dieser Katalysator ist ausgewählt unter Ammoniak, Natriumhydroxid und/oder einem organischen Amin, und kann somit nur eine, zwei oder alle drei der genannten Verbindungen umfassen. Werden gemäß der vorstehenden„oder"- Verknüpfung von Alkoxysilan mit organischen Chlorsilan- oder Alkoxysilan-Derivat die Alkoxysilane und organischen Chlorsilan- oder Alkoxysilan-Derivate gleichzeitig im Beschichtungsschritt verwendet, so sind die funktionellen Gruppen dann statistisch in die Schale verteilt eingebunden und werden nicht nacheinander als aufeinanderfolgende Schichten

aufgewachsen. Das eröffnet Vorteile für die Steuerung der Spezifität und Sensitivität der Partikel für unterschiedliche Analyte nach Bindung von unterschiedlichen Liganden an die unterschiedlichen funktionellen Gruppen.

[0054] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass mit Hilfe der verschiedenen Wasseranteile der Sol-Gel-Prozess beeinflusst wird und dadurch

unterschiedlich große Silikat-Nanopartikel in verschiedenen Reaktionsgeschwindigkeiten ausgebildet werden, welche dann zur Silikatschale zusammenwachsen. Dadurch lassen sich Feinjustierungen der Struktur der Silikatschale entsprechend dem Zusammenwachsen verschieden großer, insgesamt aber einheitlich großer Silikat-Nanopartikel ermöglichen. Zusätzlich ist es durch Beimischung von Chlorsilan- oder Alkoxysilan-Derivaten (vgl. Fig. 6; 1-5-6) hier möglich, funktionelle Gruppen direkt mit in die Schale einzubauen. Alternativ wird durch Beimischung von Chlorsilan- oder Alkoxysilan-Derivaten im Anschluss an die Reaktion (vgl. Fig. 6; 1-5-7-8) eine funktionelle zweite Schicht auf die Partikel

aufgewachsen. Somit werden von dieser Ausführungsform die im Schema gezeigten

Synthesewege 1-5-6 und 1-5-7 mit ggf. daran anschließenden umfasst.

[0055] Unter dem Sol-Gel-Prozess ist eine anorganische Polymerisation im Ethanol- Wassergemisch umfassend ablaufende Hydrolyse- und Kondensationsreaktion der Ausgangssubstanzen und der entstehenden Kieselsäureintermediate und Silikat-Nanopartikel zu verstehen. Dabei werden zu Beginn niedrigkettige Oligomere ausgebildet, die im Verlaufe der Reaktion zu längeren Ketten anwachsen. Ab einem bestimmten Zeitpunkt, der vorgebbar ist durch die Reaktionsparameter (Lösungsmittel(-gemisch), Art und Konzentration des Katalysators und Ausgangssubstanz, ausgewählt unter Alkoxysilan, organischen Chlorsilan- oder Alkoxysilan-Derivaten und Gemischen selbiger) erfolgt eine Nukleation der

Silikatnanopartikel im Reaktionsmedium und/oder auf dem Polymerkern. Durch Anwachsen der Silikat-Nanopartikel auf dem Kern und/oder der Reaktionslösung werden u.a. die Silikatschalen ausgebildet.

[0056] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich dadurch, dass bei Polymerkernen, die mit PVP niedrigeren Molekulargewichts dargestellt werden, die Carbonsäure frei zur Wechselwirkung mit den Kieselsäureintermediaten und/oder den Silikat-Nanopartikeln zur Verfügung stehen. Dadurch wird die Verwachsung der Silikatschale unmittelbar auf der Polymerkernoberfläche bevorzugt, was schließlich in geschlossenen, glatten Schalen resultiert. Weiterhin findet die Adsorption von entstehenden Silikat-Nanopartikeln mit PVP- Polymeren statt, die sich auf der Oberfläche befinden. Dadurch werden bei mittleren PVP Molekulargewichten geschlossene, hügelige Silikatschalen ausgebildet, da die Silikat- Nanopartikel in zunehmender Entfernung zur Polymerkernoberfläche adsorbieren. Es ist hierbei von einer reduzierten Ausbildung direkt auf der Oberfläche auszugehen, da die Carbonsäuren durch die längeren PVP-Ketten abgeschirmt sind. Bei großen

Molekulargewichten werden Silikat-Nanopartikel schließlich in zunehmenden Abständen zur Polymerkernoberfläche adsorbiert, was zur Ausbildung von offenen, zerklüfteten Strukturen der Silikatschalen führt.

[0057] Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst der vorstehend genannte Schritt „Beschichten der Polymerkerne mit einer Silikatschale" ein Waschen der erhaltenen hybriden Mikropartikel mit einem organischen oder einem wässrigen Lösungsmittel oder mit einem Lösungsmittelgemisch organischer und/oder wässriger Lösungsmittel (vgl. Fig. 6; 1-5-7-9).

[0058] Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das Funktionalisieren ein Ausrüsten der äußeren Oberfläche der Siliziumdioxid-Schicht mit Aminogruppen mit Hilfe Aminogruppen-modifizierter organischer Chlorsilan- oder Alkoxysilan-Derivate (wie z.B. Aminopropyltriethoxysilan, APTES) ohne einen zusätzlichen Katalysator (vgl. Fig. 6; 1-5-7- 9-10) in neutralem Reaktionsmedium, ausgewählt unter einem organischen oder einem wässrigen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch organischer und/oder wässriger Lösungsmittel. Da das APTES als Katalysator funktioniert, sind auch Ko-Kondensationen anderer Silane auf der Oberfläche möglich, wenn z.B. das APTES die Reaktion anderer Silane in Lösung oder auf der Oberfläche katalysiert.

[0059] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass sich so leicht multifunktionale Oberflächen auf der Silikatschale ausbilden lassen. So können bspw. 2 (binär), 3 (tertiär) oder mehr Silane simultan auf die Oberfläche aufgebracht werden. Das Mischungsverhältnis und die Gesamtmenge obliegen dann der weiteren Optimierung. Hierfür werden z.B. APTES und ein Polyethylenglykol-modifiziertes Alkoxysilan im

Mischungsverhältnis l: lvorgeschlagen. Vorteilhaft wird die unspezifische Adsorption von Biomolekülen an den hybriden Partikeln stark herabgesetzt.

[0060] Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das Funktionalisieren ein Ausrüsten mit einer Aminogruppe oder zusätzlich einer anderen funktionellen Gruppe als einer Aminogruppe unter Verwendung eines basischen oder sauren Katalysators in einem Reaktionsmedium, ausgewählt unter einem organischen oder einem wässrigen Lösungsmittel oder mit einem Lösungsmittelgemisch organischer und/oder wässriger Lösungsmittel (vgl. Fig. 6; 1-5-7-9-11).

[0061] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass sich so

multifunktionale Oberflächen auf der Silikatschale ausbilden lassen. So können bspw. 2 (binär), 3 (tertiär) oder mehr Silane simultan auf die Oberfläche aufgebracht werden. Das Mischungsverhältnis und die Gesamtmenge obliegen dann der weiteren Optimierung. Hier werden z.B. APTES und ein PEG-Silan im Mischungsverhältnis L lvorgeschlagen, wodurch die unspezifische Adsorption von Biomolekülen an den hybriden Partikeln stark herabgesetzt werden kann. Vorteilhaft kann bei der Verwendung von APTES als Katalysator in reinem Ethanol, in wässrigen Medien oder Lösungsmittelgemischen gearbeitet werden ohne zusätzliche Base oder Säure.

[0062] Unter Verwendung eines zusätzlichen Katalysators in dieser Reaktion ist von einer zunehmend multilagigen Abscheidung der funktionellen Silane auszugehen.

[0063] Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das mittlere Molekulargewicht des verwendeten PVP ausgewählt unter einer monodispersen oder in Hinsicht auf das

Molekulargewicht im Wesentlichen homogenen Mischung von PVP-Molekülen identischen Molekulargewichts. Alternativ umfasst der Reaktionsansatz eine heterogene Mischung, von PVP-Molekülen mit definiertem, jedoch unterschiedlichem mittleren Molekulargewicht. Vorteilhaft sind kommerziell erhältliche Polyvinylpyrrolidone (dazu zählen u.a. auch

Produkte mit dem Handelsnamen Kollidon® und Luviskol®) mit jeweils definiertem mittleren Molekulargewicht (mittlerer Kettenlänge). Wie bereits beschrieben, wird erfindungsgemäß über die Auswahl des PVP in Hinsicht auf dessen Kettenlänge bzw.

Molekulargewicht die Struktur und Oberfläche der Siliziumdioxid-Schale, die zu

Vergleichszwecken mittels des wie beschriebenen bestimmten RF-Wertes definierbar ist, eingestellt.

[0064] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass entgegen der bisherigen Praxis, PVP einer bestimmten Charge mit beliebigem Molekulargewicht einzusetzen, ohne dessen Molekulargewicht dabei überhaupt in Betracht zu ziehen, erfindungsgemäß das Molekulargewicht des PVP speziell ausgewählt wird, um eine definierte Struktur der auf dem Polymerkern aufgebauten Silikatschale einzustellen.

[0065] Weitere Vorteile des bisher beschriebenen Verfahrens ergeben sich daraus, dass die Struktur (gemäß der Bedingung geschlossen und glatt mit RF- Werten zwischen 1 und 1,5; geschlossen und hügelig mit RF-Werten zwischen 1,51 und 3; oder offen und zerklüftet mit RF-Werten größer 3,01) unabhängig vom Durchmesser des jeweils genutzten Polymerkerns erzielt werden können.

[0066] Vorteilhaft wird mit dem beschriebenen Herstellungsverfahren so eine breite Palette an hybriden Mikropartikeln unterschiedlicher, aber stets einheitlicher Größe und unterschiedlicher, aber stets einheitlich einstellbarer (resultierender) Dichte und damit identischen Sedimentationsverhaltens zugänglich und unterschiedlicher, aber stets einheitlich einstellbarer (resultierender) Struktur und damit verbundene Oberfläche verfügbar.

[0067] Gemäß einer weiteren Ausführungsform weisen die hergestellten Mikropartikel eine funktionalisierte Oberfläche auf, bei der die funktionellen Gruppen entweder in die Silikatschale durch Quervernetzung eingebunden sind (vgl. Fig. 6; 1-2 oder 1-5-6) oder die funktionellen Gruppen zumindest abschnittsweise eine geschlossenen Monolage oder eine quervernetzter Multilage des organischen Chlorsilan- oder Alkoxysilan-Derivats auf der ersten Silikatschale umfassen (vgl. Fig. 6: 1-3-4, 1-5-7-8, 1-5-7-9-10 oder 1-5-7-9-11).

[0068] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass zusätzlich auf der Silikatschale eine zweite siliziumhaltige Schicht umfassend ein organisches Chlorsilan- oder Alkoxysilan-Derivat abgeschieden werden kann (vgl. Fig. 6: 1-3-4, 1-5-7-8, 1-5-7-9-10 oder 1-5-7-9-11). Diese zweite Schicht kann ggf. so dünn sein, dass sie nicht sichtbar oder nur mittels aufwendiger Messverfahren (z.B. über Messungen des Zeta-Potentials) nachweisbar ist. [0069] Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die eingeführten Aminogruppen beziehungsweise jegliche andere eingeführte funktionelle Gruppen kovalent und statistisch verteilt in die Silikatschale eingebunden (vgl. Fig. 7: 1-2 oder 1-5-6), insofern sie bei der Beschichtungsreaktion als Chlorsilan- oder Alkoxysilan-Derivat mit eingesetzt werden.

[0070] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass sich bereits in einem Zweistufen- oder Dreistufen-Prozess funktionelle Gruppen in die Schale mit einbauen lassen.

[0071] Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung der Mikropartikel weiter ein Ausbrennen des Polymerkerns bei einer Temperatur oberhalb von 200 °C, sodass die Silikatschale, umfassend Siliziumdioxid, als Hohlkugel verbleibt.

[0072] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass bei geeigneter Temperaturführung in einer Verbrennungsatmosphäre umfassend synthetische Luft, beispielsweise für eine Aufheizrate von 5 K/min ein zumindest 10 Minuten andauerndes, bevorzugt ein zumindest 20 Minuten andauerndes, insbesondere ein 30 Minuten andauerndes Verweilen bei 500 °C und ein anschließendes weiteres Steigern der Temperatur auf bis zu 800 °C mit einer Heizrate von 5 K/min die vollständige Verbrennung der Polymerkerne und ein freies Entweichen der bei Verbrennung der Polymerkerne gebildeten Gase ermöglicht. Im Ergebnis der vorgeschlagenen thermischen Behandlung liegen Silikat-Hohlsphären vor, wobei die Struktur der Oberfläche dieser Silikat-Hohlsphären jener der Silikatschale der nativen hybriden Mikropartikel entspricht. Insbesondere liegen nach der wie beschrieben durchgeführten thermischen Behandlung von Hybrid-Mikropartikeln gemäß den

Ausführungsbeispielen P2 und P3 vollkommen intakte Silikat-Hohlsphären vor.

[0073] Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Verwendung von

4,4'-Azobis(4-cyanopentansäure) als Initiator für eine radikalische Polymerisation von Styrol, Styrolderivaten und/oder Polystyrol-Derivaten vorgeschlagen.

[0074] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass der Polymerkern Carbonsäuregruppen auf der Oberfläche trägt, welche zum einen für zusätzliche

elektrostatische Stabilität der Partikel sorgen, weshalb auch mit niedrigeren PVP- Molekulargewichten (kleiner 25.000 Dalton) monodisperse Partikel erhalten werden können. Diese führen wiederum dazu, dass durch die elektrostatischen und Säure-Base- Wechselwirkungen zwischen den Carbonsäuren und den Kieselsäureintermediaten und/oder den Silikat-Nanopartikeln die Abscheidung und Verwachsung der Silikatschale unmittelbar auf der Oberfläche stattfindet und so geschossene, glatte Schalen ausgebildet werden können. [0075] Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird vorgeschlagen, die wie beschrieben erhaltenen Mikropartikeln zu verwenden als Trägermaterial für chromatographische

Verfahren, insbesondere für eine Permeationschromatographie oder eine

Affinitätschromatographie. Die vorgeschlagenen chromatographischen Materialien sind gekennzeichnet durch eine ausgeprägte Klassierung hinsichtlich: eines mittleren Durchmessers oder einem Bereich mittlerer Durchmesser; und/oder einer spezifischen Oberfläche oder einem Bereich spezifischer Oberflächen, wobei die spezifische Oberfläche ausgedrückt ist in einer Einheit, die konvertierbar ist m Ig; und/oder einer äußeren Struktur, die als RF-Wert wiedergegeben wird der Art einer an der Schale vorliegenden funktionellen Gruppe oder gemischten funktionellen Gruppen oder der Art eines oder mehrerer daran gebundener Liganden.

[0076] Hierbei wird unter einem mittleren Durchmesser ein arithmetisches Mittel des Durchmessers der betreffenden Partikel verstanden. Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass sich hierarchische Porendimensionen aufbauen lassen, da sich zum einen die Größe der Polymerkerne als erste Ordnung, als auch die Größe der die Silikatschale umfassenden Si0 ₂ Nanopartikel als zweite Ordnung steuern lassen. Zusätzlich ist durch die Funktionalisierung eine gezielte Modifizierung des hierarchisch aufgebauten

chromatographischen Materials möglich.

[0077] Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird vorgeschlagen, die wie beschrieben hergestellten hybriden Mikropartikel, umfassend einen Polymerkern und eine den

Polymerkern zumindest abschnittsweise umgebende Silikatschale, einzusetzen als

Trägerpartikel für einen partikelbasierten Assay. Der partikelbasierte Assay umfasst somit zumindest eines der beschriebenen hybriden Mikropartikel, das zumindest durch eines der nachfolgend aufgeführten Charakteristika gekennzeichnet ist: einen mittleren Durchmesser oder einen Bereich mittlerer Durchmesser, welcher oder welche als Identifizierung der Partikel an Hand der Größe genutzt werden kann; eine spezifische Oberfläche oder einen Bereich spezifischer Oberflächen; eine morphologische Struktur der äußeren Oberfläche, insbesondere der äußeren Oberfläche der den Polymerkern umgebenden Silikatschale, wobei der Struktur ein RF-Wert zuordenbar ist, und der RF-Wert in einem Bereich von 1 bis größer 3, bevorzugt zwischen 1 und 3, liegt und bestimmbar ist gemäß der hierin beschriebenen Methode; eine Dichte des hybriden Mikropartikels, die einstellbar ist zwischen dem Verhältnis der Dichte des den Polymerkern bildenden Polymers, die bei 1,05 + 0,1 g/mL für Polystyrol liegt, und dem Wert der Dichte der eine Siliziumdioxid-Schicht

umfassenden Schale (hier auch als Silikatschale bezeichnet), die 2,0 + 0,2 g/mL beträgt; der Art einer an der Silikatschale vorliegenden funktionellen Gruppe oder gemischten funktionellen Gruppen oder der Art eines oder mehrerer daran gebundener Liganden; ein analytisch auswertbares Signal das erfassbar ist im Ergebnis einer spezifischen Wechselwirkung eines artifiziellen oder biologischen Rezeptors, der am Trägerpartikel gebunden ist, mit dem durch den Assay nachzuweisenden Analyten, wobei ein analytisch auswertbares Signal des Assays eine Fluoreszenzeigenschaft umfasst.

[0078] Alternativ zur vorstehend beschriebenen Klassierung an Hand Struktur der hybriden Mikropartikel und in Analogie zu den beschriebenen Ausführungsbeispielen, kann die Klassierung eine Zuordnung der Mikropartikel zu einem RF-Wert in einem Bereich zwischen geschlossen mit RF-Werten von 1 und 1,5 (glatt), hügelig mit RF-Werten zwischen 1,51 und 3, sowie offen mit RF-Werten größer 3,01 (offen) liegen.

[0079] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass die Partikel über ihrer Größe kodiert werden können, d.h., mittels durchflusszytometerischer oder mikroskopischer Analysen an Hand der Größe unterscheidbar sind. Unterschiedlich große Partikeln können nebeneinander für den Nachweis unterschiedlicher Analyten verwendet werden. Ebenfalls kann je nach Anwendungsgebiet die jeweils bevorzugte Struktur und die damit verbundene Größe der spezifischen Oberfläche angepasst werden. So sind offene Schalen leichter für kleine Moleküle zugänglich, weshalb hier eine höhere Dichte pro Partikel erzielt werden kann, wohingegen bei geschlossenen glatten und hügeligen Schalen die sterische

Abschirmung gegenüber größeren Biomolekülen verringert ist und diese hierbei bessere Bindungs- und oder Adsorptionseigenschaften aufweisen. Zudem ist die Dichte des Partikels einstellbar, was zur Anpassung an die Handhabung und kolloidalen Eigenschaften vor, während und auch nach der Charakterisierung und/oder Anwendung genutzt werden kann. Weiterhin wird die Lichtstreuung der hybriden Mikropartikel maßgeblich durch den

Polymerkern bestimmt. Die Streueffizienz bestimmbar mittels Durchflusszytometrie ist dabei je nach Silikatschalen- Anteil mindestens genauso groß wie die des Polymerkerns, bzw. liegt darüber.

[0080] Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Verwendung eines solchen Trägerpartikels in einem fluoreszenzbasierten Messverfahren vorgeschlagen, wobei das Messverfahren ausgewählt ist unter einem Verfahren der Durchflusszytometrie oder der Fluoreszenzmikroskopie - also beispielsweise einem Verfahren, umfassend eine

fluoreszenzoptische Messung einer Fluoreszenzintensität, einer Fluoreszenzquantenausbeute, einer Fluoreszenzabklingzeit, einer Fluoreszenzlöschung, oder eines Fluoreszenzrecovery (einer Messung der Zeit einer Fluoreszenzzunahme, insbesondere bis zu einem

vorbestimmten Schwellwert, nach einer vorausgehenden Fluoreszenzlöschung). Darüber hinaus wird die Verwendung der hybriden Mikropartikel vorgeschlagen in Messverfahren, die eine miniaturisierte Variante der Durchflusszytometrie oder der Fluoreszenzmikroskopie in mikrofluidischen Aufbauten oder auf planaren Trägern (Chips) umfassen. Dabei können sowohl einzelne Partikel als auch Partikelensembles als Plattform für einzelne Assays verwertet werden.

[0081] Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass ein Fluoreszenzsignal beispielsweise über die Beladungsdichte des Mikropartikels (Trägerpartikels) mit analyt- sensitiven Molekülen vorgebbar ist, beispielsweise indem eine durch Zerklüftung vergrößerte äußere Oberfläche vorliegt, die für die kovalente Bindung von kleinen Analyt-Molekülen oder Fluorophoren verwendbar ist. In einem anderen Beispiel kann vorteilhaft eine Dichte der Trägerpartikel in glatten und hügeligen Hybrid-Mikropartikeln eingestellt werden, sodass die Partikel mittels Zentrifugation schnell vom Dispersionsmedium getrennt werden können. Dies ist für Waschschritte unumgänglich und ermöglicht zum Beispiel im Vergleich zu reinen Polymerpartikeln im Größenbereich von 0,5 - 3 μιη einer mindestens 10-fachen Einsparung der Zeit, die zur Zentrifugation notwendig ist. Gleichsam steht die Silikatschale mit entsprechend erhöhter Oberfläche (bis 50% bei glatten und 200% bei hügeligen

Silikatschalen) für eine weitere einfache Funktionalisierung zur Verfügung. Darüber hinaus sind diese Silikatschalen auch für größere Biomoleküle zugänglich.

[0082] Die beschriebenen Ausführungsformen können beliebig miteinander kombiniert werden.

[0083] Erfindungsgemäß ermöglichen die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen, über das Verhältnis von Masseanteilen der das hybride Mikropartikel ausbildenden Materialien des Polymerkerns und der Siliziumdioxidschale, eine effektive Dichte und ein effektives Lichtstreu verhalten, das in der Vorwärtsstreuung insgesamt mindestens dem des Polymerkerns entspricht, der erhaltenen hybriden Partikel einzustellen, die auf die jeweilige Anwendung zugeschnitten sind. Mit dem vorgeschlagenen Syntheseverfahren werden

Mikropartikel mit der jeweiligen Anwendung optimal angepassten Eigenschaften

bereitgestellt.

[0084] Die beiliegenden Zeichnungen veranschaulichen Ausführungsformen und dienen zusammen mit der Beschreibung der Erläuterung der Prinzipien der Erfindung.

Fig. 1 zeigt von oben nach unten SEM- Aufnahmen von mit dem vorgeschlagenen Verfahren synthetisierten Partikeln mit unterschiedlicher Oberflächenstruktur.

Fig. 2 zeigt Ergebnisse der thermogravimetrischen Analyse mit synthetischer Luft. Die

Partikel mit glatten und hügeligen Schalen zeigen eine erhöhte thermische Stabilität, die Partikel mit geschlossener und glatter Schale zeigen die höchste Stabilität.

Fig. 3 zeigt Stickstoffdesorptionsisothermen und Adsorptionsisothermen an Partikeln der Ausführungsbeispiele PI, P2 und P3;

Fig. 4 zeigt Aufnahmen der Oberfläche der Silikatschale typischer Partikel mittels

Rasterelektronenmikroskopie (SE-Detektor) ;

Fig. 5 zeigt von oben nach unten SEM-Aufnahmen thermisch behandelter Mikropartikel, glatt erscheinenden Partikeln gemäß dem Ausführungsbeispiel Pl-H, deren RF-Werte im nativen Zustand, d.h. vor einer thermischen Behandlung, bei ca. 1,3 lagen. Im mittleren Bild sind Partikel des Ausführungsbeispiels P2-H gezeigt. Die nativen Partikel (P2) sind mit PVP eines mittleren Molekulargewichts von 40.000 Dalton dargestellt, und wiesen vor der thermischen Behandlung eine hügelige Oberfläche mit einem mittleren RF-Wert von 1,7 auf. Im unteren Bild sind Partikel gemäß dem Ausführungsbeispiel P3-H dargestellt, die in nativem Zustand vor der thermischen Behandlung eine hier als offen und zerklüftet beschriebene Silikatschale und einen RF-Wert von etwa 4,8 auf. Die Partikel P3 wurden mit PVP eines mittleren

Molekulargewichts von 360.000 Dalton dargestellt und anschließend thermisch behandelt. Die für alle drei Partikel-Klassen identische thermische Behandlung umfasste eine schrittweise Verbrennung des Polymerkerns unter synthetischer Luft mit einer Aufheizrate von 5 K/min bis 800 °C und einer anschließenden konstanten Verbrennungsdauer von 1 Stunde bei 800°C. Fig. 6 zeigt ein Schema der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Synthesewege für die hier beschriebenen Kern-Schale-Partikel .

Fig. 7 zeigt Streulichtsignale (FSC) der Hybridpartikel im Vergleich zu den Streulichtsignalen (FSC) der korrespondierenden Polymerkerne, jeweils im Durchflusszytometer. Hierbei steht die Abkürzung MCI für die mittlere Kanal-Intensität /„Mean Channel Intensity".

[0085] Insbesondere zeigt Fig. 1 jeweils typische Partikel bei Abbildung mittels

Rasterelektronenmikroskopie unter Verwendung eines In-Lens Sekundärelektronen

Detektors. Das obere Bild zeigt glatt erscheinende Partikel (Ausführungsbeispiel PI), deren Silikatschale einen RF-Wert zwischen 1 und 1,5 hat, dargestellt mit PVP mit einem mittleren Molekulargewicht von 10.000 Dalton. Das mittlere Bild zeigt Mikropartikel deren

Silikatschale eine hügelige Struktur aufweist (Ausführungsbeispiel P2) und deren

Rauheitsfaktoren im Wesentlichen im Bereich zwischen 1,51 und 3 liegt. Derartige Partikel sind mit PVP eines mittleren Molekulargewichts von 40.000 Dalton hergestellt worden. Im unteren Bild sind Partikel mit offenen Silikatschalen (Ausführungsbeispiel P3) gezeigt, bei denen Meso- und Makroporen mittels der bildgebenden Verfahren sichtbar sind. Diese Partikel wurden - wie nachfolgend noch näher erläutert - dargestellt mit PVP eines mittleren Molekulargewichts von 360.000 Dalton. Die durch Koagulation von Silikat-Nanopartikeln unterschiedlicher Größe ausgebildete Silikatschale der Partikeln weist von oben nach unten eine sich deutlich verändernde Struktur auf. In den drei Aufnahmen sind ausschließlich native Partikel gezeigt, d.h. Partikel, die keiner, nachfolgend noch im Detail beschriebenen, zusätzlichen Wärmebehandlung ausgesetzt wurden.

[0086] Die thermogravimetrische Analyse gemäß Fig. 2 umfasst eine thermische

Exposition der Partikel gegenüber synthetischer Luft bei einer Aufheizrate 5 K/min. Es ist anzunehmen, dass sich PVP sowohl bei P2, als auch bei P3 zwischen den Silikat- Nanopartikeln, einlagert. Wird PVP thermisch entfernt, so können entsprechende Poren ausgebildet werden. An Hand der TGA-Kurve ist zu erkennen, dass die Kerne durch die Schale vor thermischer Zersetzung und Freilassung geschützt sind - derart, dass insbesondere bei PI ein Teil des Kerns erst ab einer Temperatur von 500°C messbar entweicht.

In Fig. 3 sind Adsorptions- und Desorptionsisothermen nach Brunauer-Emmet- Teller (BET) von Stickstoff bei 77 Kelvin, aufgenommen mit einem AS AP 2010 (Micro meritics Instrument Corp., Norcross, GA (USA)) gezeigt. Die Proben von mindestens 400 mg Einwaage wurden vor der Messung im Hochvakuum bei 60°C für 5 Stunden getrocknet. Die externen

Oberflächen der hybriden Mikropartikel werden mittels der t-Methode berechnet, wobei die dazu notwendige Umrechnung von (p/ρθ) in die adsorbierte Schichtdicke in Angström mit Hilfe der Harkins und Jura- Approximation t (ÄJ = / ^: — erfolgte (vgl.

^ 0.034 l°g( _po )

Harkins WD, Jura G, (1944). Die Adsorptionsdaten werden dann gegenüber der Schichtdicke aufgetragen. Die externen Oberflächen pro Gramm der Partikel PI, P2 und P3 wurden dann an Hand der Steigung der linearen Ausgleichgerade durch die Punkte aus der gewonnene

Adsorptionskurve zwischen 3,5 A und 5 A und der Gleichung A _extern =Steigung x 15.468 berechnet. Zur Ermittlung der Oberfläche pro Partikel, wird die Anzahl der Partikel in einem Gramm anhand der darin enthaltenen Masse der Polymerkerne (ermittelt aus mittels

Thermogravimetrie erhaltenen Werten), die eine mittleren Dichte von 1.05 g/mL haben unter Annahme einer idealen Kugel berechnet. Die erhaltene externe Oberfläche pro Gramm wird dann durch die Anzahl der hybriden Mikropartikel pro Gramm geteilt. Der erhaltene Wert wird abgekürzt als A _h y _brides Mikropartikel, extern bezeichnet.

[0087] Die Bestimmung derjenigen Oberfläche, die ausgehend von einem mittleren Durchmesser der hybriden Mikropartikel unter Annahme einer idealen Kugelform aller hybriden Mikropartikel berechenbar ist (nachfolgend als A _hyb ride _S Mikropartikel, ideal bezeichnet), erfolgt folgendermaßen: Eine Partikelprobe, die mehr als 100 hybride Mikropartikel umfasst, wird auf einem Kohlefilm-Probenträger für die Transmissionselektronenmikroskopie bei Raumtemperatur getrocknet. Danach wird der Probenträger mit der getrockneten

Partikelprobe mittels Rasterelektronenmikroskopie bei 15000x Vergrößerung mit 20 kV im Transmissionsmodus abgebildet. Die Probe braucht hierzu nicht besputtert zu werden, sodass die Größe der Mikropartikel nicht verfälscht wird. Gewissermaßen im Durchlicht-Modus erhaltene Aufnahmen einer Kohorte von >100 Partikeln werden unter Zuhilfenahme geeigneter Bildauswertesoftware, beispielsweise ImageJ, als Schwarz-Weiß-Aufnahmen (Bittiefe 1 bit) dargestellt und die Fläche der schwarz vor weißem Grund erscheinenden Partikel ermittelt. Aus der ermittelten Fläche der abgebildeten Partikel wird unter der

Annahme, dass alle Partikel ideale Kugeln sind, ein Partikeldurchmesser errechnet und ein arithmetischer Mittelwert des Durchmessers aus allen vermessenen Partikeln bestimmt.

Dieser arithmetische mittlere Partikeldurchmesser wird zur Berechnung der idealen

Oberfläche der hybriden Mikropartikel gemäß A _hy bride _S Mikropartikel, ideal =π-ά ² verwendet.

[0088] Dabei wurde wie oben erläutert schließlich ein RF-Wert von 1,33 für Partikel des Ausführungsbeispiels PI, ein RF-Wert von 1,72 für Partikel gemäß dem Ausführungsbeispiel P2, sowie ein RF-Wert von 4,84 für Partikel gemäß dem Ausführungsbeispiel P3 erhalten.

[0089] In Fig. 4 sind rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Oberfläche der Silikatschale typischer Partikel (SE-Detektor) gezeigt. [0090] In Fig. 5 sind von oben nach unten rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen thermisch behandelter Mikropartikel gezeigt. Das oberste Bild zeigt glatt erscheinende Partikel gemäß dem Ausführungsbeispiel Pl-H, deren RF- Werte im nativen Zustand, d.h. vor einer thermischen Behandlung, im Bereich von ca. 1,3 lagen. Im mittleren Bild sind Partikel des Ausführungsbeispiels P2-H gezeigt, so wie sie nach einer thermischen Behandlung nativer Partikel, welche gemäß Ausführungsbeispiel P2 mit PVP eines mittleren

Molekulargewichts von 40.000 Dalton dargestellt wurden, vorliegen. Vor der thermischen Behandlung wiesen sie eine hügelige Oberfläche mit einem mittleren RF-Wert von 1,7 auf. Im unteren Bild sind Partikel gemäß dem Ausführungsbeispiel P3-H dargestellt, die in nativem Zustand vor der thermischen Behandlung eine hier als offen und zerklüftet bezeichnete Silikatschale und einen RF-Wert von etwa 4,84 aufweisen. Die Partikel P3 wurden mit PVP K360 (PVP mit mittlerem Molekulargewicht von 360.000 Dalton) dargestellt und anschließend thermisch behandelt. Die für alle drei Partikel-Klassen identische thermische Behandlung umfasste eine schrittweise Verbrennung des Polymerkerns unter synthetischer Luft mit einer Aufheizrate von 5 K/min bis 800 °C und eine anschließenden konstant bei 800°C erfolgende Verbrennung über die Dauer von 1 Stunde.

[0091] In Fig. 7 sind Streulichtsignale vorwärts gestreuten Lichts (FSC) der

Mikropartikel (umfassend Polymerkern und Silikatschale) im Vergleich zu den jeweiligen Polymerkernen im Durchflusszytometer gezeigt. Beim Vergleich der Proben wird sichtbar, dass die Streulichtintensität bei gleichbleibender Verteilung zunimmt, also mindestens über der des reinen Polymerkerns liegt.

[0092] Aus den Druckschriften US 6,103,379 und Bamnolker, Nitzan et al. 1997 sind Hybridpartikel bekannt. Jedoch wird ausschließlich die Verwendung von langkettigem PVP (360.000 Dalton) beschrieben, die zur Ausbildung von hybriden Mikropartikeln mit einer offenen, zerklüfteten Struktur der Silikatschale führt. Aus den Angaben zur TGA, der mittleren Größe der Silikat- Nanopartikel und des Polymerkerns, das hier als Referenzwert zur Bestimmung der mittleren Oberfläche der hybriden Mikropartikel herangezogen wird, können RF- Werte von 3,66, 5,92 und 8,15 berechnet werden. Die Autoren Hong, Han et al. (2008) beschreiben die Verwendung von PVP eines mittleren Molekulargewichts von 40.000 Dalton zur direkten Beschichtung von Polymerkernen unter Verwendung des toxischen und umweltschädigenden AIBN. Kern-Schale-Partikel, die mit kurzkettigem PVP (Mw kleiner 40.000 Dalton) hergestellt wurden, sind nicht bekannt. Keine der vorgenannten

Druckschriften gibt irgendeinen Hinweis auf eine Beeinflussung der Struktur der Silikatschale durch das ausschließlich zur Stabilisierung der Kernpartikel verwendete PVP. Umso mehr gibt es keine Hinweise auf einen Einfluss des Molekulargewichts des eingesetzten PVPs auf die Feinstruktur der Schale. Vielmehr wird PVP lediglich als Stabilisator verwendet. Ein Effekt des Stabilisators auf die bei der Silikatbeschichtung ablaufenden Prozesse ist nicht vorbekannt.

[0093] Im Hinblick auf die Verwertung der erhaltenen hybriden Mikropartikel kommen bisher typischerweise Anwendungen für Oberflächenbeschichtungen oder die Erzeugung kolloidaler Kristalle in Betracht. Viel seltener wurden die hybriden Mikropartikel in

Einzelpartikelbasierten analytischen Anwendungen eingesetzt. Beispiele hierbei sind

Lanthanoid-gedopte Polymerbeads, die zur besseren Funktionalisierung mit einer

Silikatschale versehen sind (Abdelrahman 2011). Die Polymerkerne sind hier mit einem hydrophobem Initiator, PVP (MW ~ 54.000 Dalton) und zusätzlichem Ko-Stabilisator dargestellt, und zeigen Silikatschalen mit über ca. 150 nm Dicke. Andere Beispiele sind Quantum-Dot funktionalisierte Beads (Cao, Huang et al. 2006) oder Raman-kodierte Beads (Jun, Kim et al. 2007), die mit einer Silikatschale beschichtet und anschließend in

analytischen Assays verwendet werden. Hier wird kein PVP in der Polymerkern-Synthese verwendet und die Beschichtung erfolgt nach der Sulfonierung der Polymerkerne ohne Kontrolle über die Struktur, Dichte oder Lichtstreueigenschaft der hybriden Mikropartikel.

[0094] Die vorgenannten Ansätze bieten keine allgemeingültige Syntheseroute zur kontrollierten Darstellung von nativen hybriden Mikropartikeln mit einer einstellbaren Größe im relevanten Bereich zwischen 0,5 und 10 μιη und enger Größen Verteilung, Struktur, Dichte und Lichtstreueigenschaft zur Anwendung der hybriden Mikropartikel in

durchflusszytometrischen Verfahren oder verwandten miniaturisierten Varianten. Als Initiator für die radikalische Polymerisation der Polymerkerne kommt zumeist AIBN ((2,2'- azobisisobutyronitrile) zum Einsatz, das umweltbelastend und giftig ist. Zudem lassen sich hier keine monodispersen Partikel mit PVP (kleiner 25.000 Dalton) herstellen, das zur Darstellung von geschlossenen, glatten Oberflächen und damit zur Erschließung der gesamten Strukturpalette mit RF-Werten zwischen 1 und größer 3, beispielsweise zwischen 1 und 10, notwendig ist.

[0095] Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, über die Bereitstellung von hybriden Mikropartikeln, umfassend einen Polymerkern und eine den Polymerkern zumindest teilweise umgebende Siliziumdioxidschale (hier auch Silikatschale genannt), die Vorteile des organischen Polymers des Kerns und des Siliziumdioxids der Schale in einem

Materialverbund zu kombinieren, um:

(a) die Vorteile der Polymerkern-Synthese in einer radikalischen Polymerisation mit Hilfe von ACVA zur Darstellung von unterschiedlich großen Partikeln zwischen 0,5 und 10 μιη mit hinreichend enger Größenverteilung zu nutzen; (b) die effektive Dichte der hybriden Mikropartikel, die maßgeblich durch den Massenanteil des Polymerkerns und der Silikatschale bestimmt ist und zwischen 1,05 und 1,8, bevorzugt aber zwischen 1,09 und 1,53 liegt, zu kontrollieren;

(c) die Streulichtintensität der Partikel im Vergleich zu Polystyrol mindestens zu erhalten, darüber hinaus aber auch die Intensität durch das Aufwachsen einer Silikatschale entsprechend des Massenanteils zu erhöhen;

(d) die Struktur der Silikatschale in einem Bereich zwischen geschlossen glatt bis hügelig, entsprechend RF- Werten der Mikropartikel zwischen 1 und 3, bis hin zu offen und zerklüftet mit RF- Werten größer 3,01 an Hand der Auswahl des mittleren Molekulargewichts von PVP fließend einstellen zu können;

(e) die für einen potentiellen Analyten zugängliche äußere Oberfläche und die daran über einen Linker verankerten oder unmittelbar daran vorliegenden funktionellen Gruppen der hybriden Mikropartikel maßgeblich durch die Struktur und damit verbundenen Oberfläche der Silikatschale zu bestimmen. Das Wort„maßgeblich" beschreibt in diesem Zusammenhang auch die Option, dass neben einer den Kern zumindest teilweise bedeckenden Siliziumdioxidschale mit deren von außen zugänglicher Oberfläche zusätzlich auch Anteile der Oberfläche des Polymerkerns frei zugänglich sind. Die frei zugänglichen Anteile der Oberfläche des

Polymerkerns können gemäß den für das jeweilige Polymer bekannten Methoden chemisch modifiziert und je nach Bedarf mit zumindest einer Art oder mehreren Arten von Liganden oder einer Mischung solcher ausgerüstet werden. Unter Liganden verstehen sich u.a. biologische Rezeptoren (Antikörper,

Antikörperfragmente oder Peptide, reaktive Proteine, DNA oder DNA -basierte Biopolymere, (Poly-)Zucker, oder gemischte Konjugate solcher), analytselektive, analytsensitive oder -affine Gruppen, Fluoreszenz-Farbstoffe, molekulare Sonden, Atomcluster, Quantum-Dots, organische oder weitere anorganische Nanopartikel wie z.B. Metall-Nanopartikel oder metalloxidische Nanopartikel.

(f) die chemische und physikalische Stabilität der Partikel im Ergebnis der zumindest teilweisen Umhüllung mit der Siliziumdioxidschale gegenüber jener des reinen Polymerkerns zu steigern.

(g) die zugängliche äußere silikatische Oberfläche und die daran über einen Linker verankerten oder unmittelbar daran gebunden vorliegenden funktionellen Gruppen je nach Bedarf mit zumindest einer Art oder mehreren Arten von Liganden oder einer Mischung solcher auszurüsten. Unter Liganden verstehen sich u.a.

biologische Rezeptoren (Antikörper, Antikörperfragmente oder Peptide, reaktive Proteine, DNA oder DNA-basierte Biopolymere, (Poly-)Zucker, oder gemischte Konjugate solcher), analytselektive, analytsensitive oder -affine Gruppen, Fluoreszenz-Farbstoffe, molekulare Sonden, Atomcluster, Quantum-Dots, organische oder weitere anorganische Nanopartikel wie z.B. Quanten-Dots, Metall-Nanopartikel oder metalloxidische Nanopartikel. Darüber hinaus wird das Aufwachsen einer weiteren Polymerschicht auf der Silikatschale vorgeschlagen, zum Beispiel das Aufwachsen einer molekular geprägten Polymerschicht (MIP).

[0096] Mit dem vorgeschlagenen Verfahren werden sphärische hybride Mikropartikel bereitgestellt, deren Oberfläche auf Grund ihrer stofflichen Natur als Silikatoberfläche problemlos einer jeweils gewünschten chemischen Modifizierung mit organischen Chlorsilan- oder Alkoxysilan-Derivaten zugänglich ist, die einen hinreichend hohen Brechzahlunterschied gegenüber Wasser, eine optimierte Neigung zur Sedimentation in wässrigen Lösungen und eine enge Größenverteilung aufweisen.

[0097] Vorteilhaft ermöglicht das vorgeschlagene Konzept der hybriden Mikropartikel, die gemäß dem vorgeschlagenen Verfahren umfassend die Verwendung des Initiators ACVA eine leichter zu handhabende Synthese, da der Initiator im Vergleich zu AIBN weniger umweltbelastend und toxisch ist. Zudem entfallen beim Transport zusätzliche Kosten zur Übermittlung von Gefahrstoffgütern, die bei AIBN anfallen. Die hier vorgestellte Synthese erlaubt es, die Feinstruktur der Silikatschale exakt zu kontrollieren. Insbesondere kann eine Oberfläche der äußeren Partikeloberfläche von geschlossen und glatt (RF- Werte zwischen 1 und 1,5), über geschlossen und hügelig (RF-Werte zwischen 1,51 und 3) bis offen mit RF- Werten größer 3,01 eingestellt werden. Ebenso sind mit dem hier vorgeschlagenen

Herstellungsverfahren auch offene Strukturen mit niedrigeren RF- Werten kleiner 3 herstellbar, insofern eine unvollständige Monolage an Silikat-Nanopartikeln auf

Polymerkerne, die mit PVP eines mittleren Molekulargewichts von 10 .OOODa oder PVP eines mittleren Molekulargewichts von 40.000 Da hergestellt wurden, aufgebracht werden.

Andernfalls können die RF-Werte auch größer 3, maximal aber 4 betragen, wenn eine vollständige Monolage vorliegt. Das ist mit einer geringeren Menge an TEOS (Verhältnis TEOS zu eingesetzter Menge PS kleiner als 3 zu 1) möglich. Diese Strukturen sind jedoch für die analytische Anwendung eher ungeeignet, da nicht zu geschlossenen Schalen verwachsene Silikat-Nanopartikel dazu neigen, sich vom Kern zu lösen. Schließlich sind solche Monolagen auch nicht als glatt zu bezeichnen und würden analog zu P3 unter verminderter

Zugänglichkeit von großen Molekülen leiden. [0098] Gemäß praktischen Ausführungsbeispielen werden die Kernpartikel in einer Dispersionspolymerisation in EtOH (96%) hergestellt. Dazu wird zunächst 1,7 g das PVP (gleiche Mengen bei PVP mit unterschiedlichen Molekulargewichten) in 100 mL EtOH in einem 250 mL Dreihalskolben, der mit einem ovalen Magnetrührer ausgestattet ist, bei 75° unter Rühren bei 250 rpm gelöst. In einem 50 mL Becherglas werden gleichzeitig 5 mL Styrol (wahlweise andere Mengen Styrol zwischen 5 und 50 mL, entsprechend einem Volumenanteil von 4 - 42% im Vergleich zur Eingesetzten Menge an EtOH zur Darstellung größerer Partikel) und 95,4 mg ACVA (2.1 Gewichts-% zur eingesetzten Menge Styrol) in 20 mL EtOH gelöst. Beide Lösungen werden dann simultan mit Argon für 30 Minuten gespült.

Anschließend wird die ACVA-Styrol-Lösung zur vorgeheizten PVP-Lösung hinzugegeben. Die Polymerisation wird über 24 Stunden bei 75°C bei einer Rührgeschwindigkeit von 250 rpm durchgeführt. Anschließend lässt man das Reaktionsgemisch für 30 Minuten abkühlen und trennt dann die erhaltenen Partikel mittels Zentrifugieren vom Reaktionsmedium ab. Dabei wird die Reaktionsmischung auf 50 mL-Zentrifugengefäße verteilt und bei 4.000 RCF (Engl. Relative Centrifugation Force) für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und die Partikel in 30 mL Methanol in jedem Zentrifugengefäß redispergiert. Das Methanol wird anschließend jeweils 2 x getauscht, um die Partikel von Verunreinigungen zu trennen. Anschließend werden die Polymerkerne über 12 Stunden im Vakuumofen getrocknet.

[0099] Zur Darstellung von geschlossenen, glatten Hybrid-Partikeln wird in der

Polymerkern-Synthese PVP mit einem mittleren Molekulargewicht von 10.000 Dalton eingesetzt. Zur Darstellung von geschlossenen, hügeligen Hybrid-Partikeln wird in der Polymerkern-Synthese PVP mit einem mittleren Molekulargewicht von 40.000 Dalton eingesetzt. Zur Darstellung von offenen, zerklüfteten Hybride-Partikeln wird in der

Polymerkern-Synthese PVP mit einem mittleren Molekulargewicht von 360.000 Dalton eingesetzt.

[00100] Gemäß praktischen Ausführungsbeispielen werden die Kernpartikel in einem Sol- Gel-Prozess unter Stöber-ähnlichen Bedingungen (Ethanol- Wasser-Gemisch und Ammoniak als Katalysator) mit einer Silikatschale beschichtet. Dazu werden 50 mg Polymerkerne in 5 mL EtOH und 0,1 mL Wasser in einem 15 - 20 mL fassenden Becherglas dispergiert.

Anschließend gibt man 150 μΐ _^ (im Verhältnis 3 zu 1 zu eingesetzter Menge des Polymerkern) TEOS und 150 μΐ _^ Ammoniak (konzentriert, 32%) hinzu. Die Beschichtungsreaktion wird unter Rührern mit einem Magnetrührer bei 500 rpm durchgeführt. Nach 18 Stunden werden die erhaltenen hybriden Kernpartikel in ein 5 mL- Schnappdeckelgefäß (Eppendorf) überführt und mittels Zentrifugieren bei 4.000 RCF für 5 Minuten vom Reaktionsmedium getrennt. Die Partikel werden zweimal mit 3 mL Wasser und einmal mit 3 mL EtOH (96%) mittel Zentrifugieren (4.000 RCF, 5 Minuten) und Re-Dispergieren im Waschmedium gewaschen. Nach Zentrifugation und Trennung von EtOH werden die Partikel schließlich für 4 Stunden im Vakuumofen bei Raumtemperatur getrocknet.

[00101] Gemäß den vorstehend in Absatz [0042] beschriebenen praktischen

Ausführungsbeispielen PI, P2 und P3 werden, je nachdem welche Polymerkerne in der Beschichtungsreaktion eingesetzt wurden, hierbei unterschiedliche Partikel PI, P2 oder P3 erhalten.

[00102] Eine weiterhin detaillierte Kategorisierung der Mikropartikel kann gemäß der beobachteten und z.B. mittels Stickstoffadsorption nachgewiesenen Mikro-, Meso- und Makroporen vorgenommen werden (vgl. Tab. 2):

Tabelle 2

[00103] Der C-Wert wird mittels Stickstoffadsorption bestimmt und gibt Aufschluss über das Vorhandensein von Mikroporen, da nur bei Werten zwischen C = 50 und C = 150 von einer durch eine Adsorptionsisotherme gemäß B.E.T. verlässlich beschreibbare

Stickstoffadsorption und das Fehlen von Mikroporen ausgegangen werden kann (Rouquerol et al., 1999). [00104] Die für die Ausführungsbeispiele PI und P2 ermittelten Werte liegen knapp darüber. Es könnten also minimal Poren vorhanden sein, da der C-Wert hier jeweils etwas über 150 liegt (siehe Tabelle 2). Bis zu einem Wert von 200 werden daher geschlossene Partikel ohne Mikroporen definiert. P3 zeigt erhöhte Mikroporosität und außerdem

unabhängig hiervon mittels bildgebender Verfahren nachweisbare Meso-/Makroporen (vgl. Fig. 4-f), weshalb das Partikel als offen kategorisiert wird.

[00105] Mikroporen sind auch zugänglich für Stickstoff. Entscheidend hier ist, dass die Oberfläche sowohl mittels Stickstoffadsorption, dann aber mit der t-Methode zu Bestimmung des Anteils der externen Oberfläche, oder durch Beurteilung der Oberfläche mittels

Bildgebender Analysen charakterisiert wird. Hierbei ist zu unterschieden zwischen

geschlossenen Schalen, bei denen nur die Auswölbung der Silikat- Nanopartikel beurteilt wird, oder offenen Schalen bei denen sich die externe Oberfläche durch die Summierung der Oberflächen der einzelnen Silikat-Nanopartikel ergibt. Wie nachfolgend noch erläutert, werden hier vergleichbare Ergebnisse erzielt. Eine objektive Beurteilung und Kategorisierung ist so auch für die in anderen Patenten und Veröffentlichungen genannten Partikel möglich.

[00106] Anhand der Desorptionsisotherme (vgl. Fig. 3) sind jedoch keine Mesoporen als solche Messbar, da sonst eine Typ-IV-Isotherme zu erwarten wäre. Dennoch sind

Porengrößen von unter 50 nm mittels bildgebender Verfahren sichtbar (vgl. Fig. 4-f). Es ist daher von einem offenen Verbund von Silikat-Nanopartikel auszugehen, die die Silikatschale umfassen.

[00107] Wie in Fig. 3 gezeigt, weisen die hybriden Partikel eine erhöhte messbare spezifische Oberfläche auf. Die Oberflächen wurden hierbei an Hand der T-Methode bestimmt, die externe Oberflächen von Mikroporen-bedingten Oberflächen unterscheidet. Dazu werden mit der Harkins-Jura- Approximation die relativen Drücke in Schichtdicken der adsorbierten Stickstoffmoleküle umgerechnet. Die mittels Stickstoff-Adsorption erhaltenen Daten werden dann gegenüber den berechneten Schichtdicken aufgetragen. Anhand der

Steigung, die mittels linearer Regression der Datenpunkte zwischen 3.5 A und 5 A, das dem Bereich zwischen der Ausbildung einer Monolage und einsetzender Kapillarkondensation entspricht, erhalten wird, wird die externe Oberfläche berechnet. Zur Ermittlung der

Oberfläche pro Partikel, werden die Anzahl der Partikel in 1 Gramm an Hand der darin enthaltenen Masse an Polymerkern (ermittelt über die TGA- Werte) und Annahme einer idealen Kugel berechnet. Die erhaltene externe Oberfläche pro Gramm wird dann durch die Anzahl der hybriden Mikropartikel pro Gramm geteilt, sodass die externe Oberfläche pro Partikel erhalten wird. [00108] Die hier als geschlossen und glatt bezeichneten hybriden Mikropartikel nach PI haben gegenüber den reinen Polymerkernen eine 33% vergrößerte Oberfläche (gemäß einem RF-Wert von 1,33), die geschlossenen hügeligen hybriden Mikropartikel nach P2 haben eine etwa 72% vergrößerte Oberfläche (gemäß einem RF-Wert von 1,72). Bei einer idealen Belegung der Polymerkerne mit zu einer geschlossenen, hügeligen Silikatschale

verwachsenen Silikat-Nanopartikeln, die bis zur Hälfte ihres Durchmessers aufgewölbt sind, ist ein maximaler RF-Wert von 2 zu erwarten. RF- Werte einer geschlossenen hügeligen Struktur der Silikatschale, die über 2 und unter 3 liegen werden erhalten, wenn an der geschlossenen Schale vereinzelt Silikat-Nanopartikel mit mehr als der Hälfte des

Durchmessers aus der Schale herausragen.

[00109] Offene, zerklüftete Strukturen nach P3 haben gegenüber reinen Polymerkernen eine um 384% vergrößerte Oberfläche (gemäß des RF- Wertes von 4,84). Die mittels

Stickstoffadsorption unter Verwendung der t-Methode bestimmte Oberfläche entspricht hierbei in etwa der Summe der Oberflächen des Kerns und einer Anlagerung von ca. 3520 Silikat-Nanopartikeln mit einer Größe von ca. 35 nm. Die Anzahl der Silikat-Nanopartikel wurde an Hand des mit TGA gemessenen Silikat- Anteils auf einem Partikel in Höhe von 28,7% mit dem mittleren Durchmesser von 893,5 nm berechnet. Die Bestimmung des RF- Wertes anhand der T-Methode oder mittels bildgebender Verfahren führen somit zu vergleichbaren Ergebnissen, was eine objektive Kategorisierung von hybriden Kern-Schale- Partikeln unter Verwendung von Stickstoffadsorptionsdaten oder Bildanalysen ermöglicht.

[00110] Die jeweils einstellbar vergrößerte Oberfläche kann für analytische Zwecke ausgenutzt werden, indem beispielsweise kleine und größere als Fänger und/oder Rezeptor nutzbare Moleküle oder eine weitere Polymerschicht mit einer hohen Dichte/Mikropartikel bzw. mit einer definierten Flächendichte kovalent verankert werden können.

[00111] Weiterhin kann aber auch die spezifisch eingestellte Partikeldichte genutzt werden, um Partikel mit jeweils an eine spezielle analytische Aufgabenstellung angepassten Eigenschaften bereitzustellen. So werden Partikel mit einer Dichte von größer 1.05 in Wasser schneller sedimentieren, bzw. weisen bei Zentrifugieren ein deutlich schnelleres

Sedimentationsverhalten auf, was insbesondre für Waschschritte während der Herstellung, Funktionalisierung und Anwendung erhebliche Zeiteinsparungen bedeuten kann.

[00112] Schließlich zeichnen sich die hybriden Partikel dadurch aus, dass deren

Lichtstreueigenschaften maßgeblich durch den Polystyrol-Kern beeinflusst sind, die

Lichtstreuintensität also mindestens der des Polystyrol-Kerns entspricht. Das kann an Hand der mittels Durchflusszytometrie gemessenen Verteilung der Streulichtintensität bestätigt werden kann (Fig. 7). Es wird dabei jeweils ein Zuwachs an Streulichtintensität unter Erhalt der Streueigenschaften und der Streulichtverteilung gemessen. Es ist davon auszugehen, dass der Massenanteil an Silikat im hybriden Mikropartikel mit dem Zuwachs der

Streulichtintensität korreliert.

[00113] Erfindungsgemäß wird der Polymerkern in Gegenwart von Polyvinylpyrrolidon (PVP) durch radikalische Polymerisation in alkoholischem Lösungsmittel mit möglichem Wasseranteil von 0 - 80% ausgehend von Styrol und/oder einer Mischung aus Styrol und anderen polymerisierbaren Co-Monomeren hergestellt. Als Initiator der radikalischen

Polymerisation bei 75°C wird ein homolytisch spaltbarer Initiator, bevorzugt ACVA

(ACVA=4,4'-Azobis(4-cyanovaleriansäure), bzw. 4,4'-Azobis(4-cyanopentansäure)) verwendet. Vorteilhaft ist ACVA weniger toxisch für Mensch und Umwelt und stattet den Polymerkern darüber hinaus mit Carbonsäuregruppen aus, die für eine zusätzliche

Stabilisierung während der Polymerisation sorgen, weshalb auch Polymerkerne mit PVP niedrigeren Molekulargewichts kleiner 25.000 Da in engen Größen Verteilungen hergestellt werden können. Die Beschichtung mit Siliziumdioxid erfolgt nach einem Waschen der Kernpartikel mit organischem oder wässrigem Lösungsmittel in einem Sol-Gel-Prozess in Alkohol/W asser-Gemischen mit Alkoxysilanen in Reinform oder einer Mischung dieser als Ausgangssubstanzen und alkalischen Initiatoren wie Ammoniak, Natriumhydroxid oder organischen Aminen.

[00114] Überraschend erwies sich, dass das Molekulargewicht des während der

Polymerisation als Stabilisator verwendeten Polyvinylpyrrolidons maßgeblich die Struktur der Silikatschale beeinflusst. Insbesondere kann in Abhängigkeit vom mittelern

Molekulargewicht des PVP die Oberfläche der Silikatschale wahlweise von geschlossen glatt oder hügelig bis offenen gestaltet werden, wobei kurze Ketten (mittleres Molekulargewicht 10.000 Dalton) zu einer geschlossenen glatten, mittlere Kettenlängen (mittleres

Molekulargewicht 40.000 Dalton) zu einer geschlossenen hügeligen und lange Ketten

(mittleres Molekulargewicht 360.000 Dalton) zu einer offenen zerklüfteten Schalenstruktur führen (vgl. Fign. 1-a bis 1-c, bzw. Fig. 4-a,d oder Fig. 4-b,e und Fig. 4-c,f).

[00115] Aus wissenschaftlicher und technischer Sicht stellen die vorgeschlagenen hybriden Mikropartikel mit einstellbarer Größe bei engen Größenverteilungen, exakt kontrollierbaren Dichten, geeigneten Lichtstreueigenschaften, sowie Struktur und Oberfläche der Silikatschalen eine neuartige und verbesserte sphärische Plattform insbesondre für partikelbasierten analytischen Anwendungen dar. [00116] Mittels der Größe der Polymerkerne können die Partikel für eine Multiplex - Anwendung kodiert werden. Durch Verwendung von fluoreszierenden Ko-Monomeren kann ebenso eine Leuchteigenschaft zur Kodierung eingesetzt werden.

[00117] Fluoreszierende Moleküle oder fluoreszierende organische und/oder anorganische Nanopartikel können ebenso zur Färb Stoffkodierung statistisch und nicht kovalent, zum Beispiel über Quellmethoden, in den Kern integriert werden. Dadurch ergeben sich

Möglichkeiten der Po st- Kodierung nach der Kernpartikelsynthese.

[00118] Die gezielte Anpassung der Dichten ermöglicht es, das Sedimentationsverhalten der Partikel je nach analytischer Anwendung zur erhöhten kolloidalen Stabilität bei niedrigeren Dichten (z.B. zwischen 1,05 und 1,25) oder zur schnelleren Trennung der Partikel mittels Zentrifugation bei erhöhten Dichten (z.B. zwischen 1,1 und 1,5), zu kontrollieren.

[00119] Die Streulichtintensität in durchflusszytometrischen Anwendungen der hybriden Mikropartikel gleicht mindestens der von reinem Polystyrol, liegt aber je nach Massenanteil der aufgewachsenen Schale darüber. Im Vergleich zu reinen Silikat- Mikropartikeln liefern die hybriden Mikropartikel also höhere Streulichtintensitäten bei gleicher Größe.

[00120] Dabei liefern die hybriden Mikropartikel eine silikatische Oberfläche, die anhand der in-situ oder post-Modifizierung funktionalisiert werden kann. Dadurch können sowohl einzelne funktionelle Gruppen, aber auch gezielte Mischoberflächen auf der hybriden

Mikropartikeloberfläche erzeugt werden, die jeweils vorteilhaft für die analytische

Fragestellung optimiert werden können.

[00121] Die Struktur der Silikat-Schale kann schließlich gezielt über die Auswahl der Polymerkerne, stabilisiert durch PVP mit unterschiedlichen Molekulargewichten eingestellt werden. Geschlossene, glatte und geschlossene, hügelige Strukturen sind hierbei zugänglicher für größere Moleküle bei Oberflächenzuwachs bis zu 200%. Offene und zerklüftete

Silikatschalen hingegen sind weniger zugänglich für große Moleküle, zeigen jedoch die größten Oberflächenzuwächse, weshalb die Adaption von kleinen Molekülen hier vorteilhaft ist.

[00122] Die vorliegende Erfindung wurde anhand von Ausführungsbeispielen erläutert. Diese Ausführungsbeispiele sollten keinesfalls als einschränkend für die vorliegende

Erfindung verstanden werden. Die nachfolgenden Ansprüche stellen einen ersten, nicht bindenden Versuch dar, die Erfindung allgemein zu definieren. Referenzen

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