Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Behandeln von eukaryotischen Zellen.

Ein beim Arbeiten mit eukaryotischen Zellen in Kultur oder in vivo häufig auftretendes Problem ist die Anwesenheit von Endotoxin.

Endotoxin (Lipopolysaccharid, LPS), eine Hauptkomponente der Zellwand gramnegativer Bakterien, ist z.B. häufig als Verunreinigung in Plasmid-DNA-Präparationen zu finden, weil bei den üblicherweise bei der Präparation von Plasmid-DNA angewandten Methoden bis zu 40 % des Oberflächen-LPS von E.coli frei werden. Aufgrund der negativen Ladungen verhält sich LPS auf Anionenaustausch-Chromatographieharzen ähnlich wie die DNA, andererseits benimmt sich LPS aufgrund der Größe, die es in seiner micellaren Form hat, auf Größenausschlußharzen wie ein großes DNA-Molekül. Die Dichte von LPS in CsCl ist ähnlich der von Plasmid/EtBr- Komplexen, sodaβ es leicht vorkommen kann, daß die DNA in CsCl-Banden verunreinigt ist. Bei der Transfektion mit DNA kommen somit die Zellen in Kontakt mit LPS.

Da das LPS-Molekül toxisch sowie ein starker Stimulator des Säugetierimmunsystems ist, ist seine Anwesenheit bei der Behandlung von Zellen unerwünscht. Daher gab es bereits zahlreiche Ansätze für den Nachweis von LPS sowie für Methoden, dieses Molekül oder gramnegative Bakterien zu beseitigen bzw. die dadurch bedingten störenden Effekte zu neutralisieren (Cordle et al., 1993; Eisbach und Weiss, 1993; Golenbock et al., 1993; Haziot et al., 1993a; Lynn et al., 1991; Perera et al., 1993; Rustici et al., 1993; Tobias et al., 1988; Tobias et al., 1989; Ziegler-Heitbrock und Ulevitch, 1993).

ERSÄΓZBLÄΓT (REGEL 26)

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die Toxizitätsprobleme im Zusammenhang mit der Gegenwart von LPS bei der Behandlung von eukaryotischen Zellen, wie sie insbesondere im Zusammenhang mit dem Import von Fremdmaterial, insbesondere DNA, in die Zelle auftreten, zu beseitigen.

Im Zuge der Experimente, die zur Lösung dieser Aufgabe durchgeführt wurden, wurde zunächst festgestellt, daß beim Transfer von Plasmid-DNA mittels Adenovirus- unterstützter Rezeptor-vermittelter Endozytose, die u.a. in der WO 93/07283 sowie von Wagner et al., 1992; Cotten et al., 1992; Curiel et al., 1991; Cotten et al., 1993; Cristiano et al., 1993a, und Cristiano et al., 1993b, beschrieben ist, in primäre humane Hautfibroblasten oder in primäre humane Melanomzellen Toxizitätsprobleme auftreten. Anhand von Versuchen mit LPS enthaltender DNA oder reinem LPS konnten diese Probleme auf die Gegenwart von LPS zurückgeführt werden. Die Toxizität trat bei Mengen von 100 ng/ml freiem LPS oder, bei Inkorporierung von LPS in die Polylysin/Adenovirus-Komplexe, bei 100 pg/ml auf.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde eine auf LPS zurückzuführende Toxizität auch bei Adenovirus- unabhängigen Gentransfermethoden festgestellt; außerdem wurde ausgeschlossen, daß die Toxizität in Zusammenhang mit Polylysin steht.

Ausgehend von den erhaltenen Befunden wurde zunächst eine Methode entwickelt, die die LPS-Verunreinigungen aus der DNA entfernt und somit die Toxizität beseitigt. Eine einfache und wirkungsvolle Methode zur Entfernung von LPS wendet das Detergens Triton X-114 an. Bei Temperaturen unterhalb von 20*C ist Triton X-114 mit

ERSAΓZBLAΓΓ (REGEL 26)

wäßrigen Lösungen mischbar, bei Temperaturen über 20'C trennt es sich in eine gesonderte Phase ab (Bordier, 1981). Dieses Phänomen kann ausgenutzt werden, um das lipophile LPS-Molekül aus wässerigen Proteinlösungen (Aida und Pabst, 1990) oder aus DNA-Präparationen (Manthorpe et al., 1993) zu extrahieren.

Eine alternative Methode zur LPS-Abtrennung verwendet Polymyxin B, ein zyklisches

Schimmelpilzpeptidantibiotikum (Storm et al., 1977), das mit hoher Affinität an die

Lipid A/Ketodeoxyoctolonsäure-Komponente von LPS bindet (K _a - 1.15 x 10 ⁷ M" ¹ ; Rustici et al., 1993; Lynn und Golenbock, 1992; Schindler und Osborn, 1979). Polymyxin wurde bisher zur Entfernung von LPS aus Proteinen eingesetzt; dazu wird Polymyxin in an ein Harz gebundener Form in Chromatographiesäulen eingesetzt.

Die Versuche mit gereinigter DNA haben gezeigt, daß die Entfernung von LPS aus den DNA-Präparationen eine Steigerung der Genexpression bewirkt.

LPS ist jedoch nicht nur ein unerwünschter Begleiter von DNA-Präparationen, sondern eine ubiquitäre Verunreinigung, die u.a. in den üblicherweise verwendeten Zellkulturmedien auftritt. Der LPS-Gehalt von Serumpräparaten kann in weiten Bereichen schwanken; wenn nicht besondere Maßnahmen getroffen werden, um verunreinigte Präparate auszuschließen, kann der Gehalt bis zu 10 bis 50 ng/ml betragen. Ein Problem tritt ferner im Zusammenhang mit den üblicherweise verwendeten Glasgeräten auf, die in Kontakt mit Bakterien gekommen sind. Da es sehr arbeitsaufwendig ist, den LPS-Gehalt aller Reagentien und Glasgefäße zu überwachen, wurde zur Lösung der gestellten Aufgabe nach einer Methode gesucht, die den mit der Gegenwart von LPS verbundenen

Problemen bei der Behandlung von eukaryotischen Zellen, insbesondere beim Transport von Fremdmaterial in die Zellen, von vornherein entgegenwirkt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von eukaryotischen Zellen, insbesondere für die Aufnahme von Fremdmaterial, wobei man die Zellen mit einer Substanz behandelt, die Lipopolysaccharid bindet und dessen Toxizität für die Zellen blockiert und/oder ein in die Zelle einzubringendes Fremdmaterial einsetzt, das vor dem Einbringen in die Zellen von LPS gereinigt wurde.

Substanzen mit dieser Eigenschaft werden im folgenden der Einfachheit halber "LPS bindende Substanzen" genannt; die Substanz kann als Einzelsubstanz oder als Mischung vorliegen.

Die Anwendung der Erfindung kann sich auf sämtliche Verfahren zum Einbringen von Fremdmaterial in die Zelle erstrecken, sofern die Gegenwart von LPS eine Toxizität hervorruft, die sich negativ auf die Effizienz des Verfahrens auswirkt. Dazu zählen u.a. Methoden zum Importieren von Arzneimitteln bzw. Arzneimittelkonjugaten oder von Toxinen in die Zelle.

Bevorzugt wird das Verfahren auf Transfektions- und Infektionsmethoden zum Einbringen von Fremd-DNA oder -RNA in die Zelle angewendet, z.B. die Calciumphosphat-, die Mikroinjektions- und die DEAE- Methode, Methoden, die mit Liposomen oder kationischen Lipiden arbeiten, sowie Methoden, die sich rekombinanter Viren bedienen; besonders bevorzugt wird das Verfahren im Zusammenhang mit Gentransfermethoden auf Basis der Rezeptor-vermittelten Endozytose angewendet. Eine Übersicht solcher Methoden wird z.B. von Cotten und

ERSAΓZBLÄΓT REGEL 26

Wagner, 1993, gegeben. Das Erfordernis für die Anwendung der vorliegenden Erfindung während der Transfektion der Zellen kann auf einfache Weise festgestellt werden, indem die Methode unter ansonsten identischen Bedingungen in Abwesenheit von LPS oder in Gegenwart von LPS durchgeführt und die erhaltenen Ergebnisse verglichen werden.

An die LPS bindenden Substanzen wird die Anforderung gestellt, daß sie sowohl LPS mit ausreichender Avidität binden als auch dessen Wechselwirkung mit Zellkomponenten, welche für die Toxizität verantwortlich ist, blockieren. (Im Unterschied zu Substanzen, die diese Anforderungen erfüllen, gibt es Proteine, z.B. das Lipopolysaccharid bindende Protein, ein Akutphasenprotein, die mit zwar mit hoher Affinität an LPS binden, jedoch die Antwort der Zelle auf die LPS- Toxizität aktivieren; ein solcher Effekt wäre im Rahmen der vorliegenden Erfindung unerwünscht).

Bei der Ausführungsform der Erfindung, bei der das in die Zelle zu importierende Fremdmaterial, insbesondere die DNA, von LPS gereinigt wird, erfolgt die Behandlung der DNA vorzugsweise mit Polymyxin, insbesondere mittels Chromatographie über ein Polymyxin-Harz, oder mittels Extraktion mit einem geeigneten Detergens, wie Triton X-114.

Für die Behandlung der Zellen bei der Transfektion werden die LPS bindenden Substanzen in Mengen eingesetzt, die das vorhandene LPS zumindest in einem Ausmaß absättigen, daß dessen Toxizität im Hinblick auf die vorgesehene Anwendung neutralisiert wird und in denen sie selbst nicht toxisch sind.

ERSATZBLAΓΓ REGEL 26

Um die Eignung einer Substanz und deren optimale Konzentration zu ermitteln, werden zweckmäßig Transfektionsversuche durchgeführt, z.B. im Hinblick auf eine konkret durchzuführende Transfektion mit dem jeweiligen Zelltyp. Mittels Titrationen wird die geeignete Konzentration festgestellt, in der die Substanz eine Steigerung der Genexpression bewirkt, ohne selbst eine schädigende Wirkung auf die Zellen auszuüben, in Ergänzung zum Transfektionssystem kann die Wirkung der LPS bindenden Substanz auf die Morphologie der Zellen mikroskopisch untersucht werden. Ferner können Assays eingesetzt werden, mit denen die Freisetzung zellulärer Komponenten als Maß für die als Reaktion auf die LPS-Toxizität eintretende Nekrose oder Apoptose gemessen wird. Beispiele dafür sind der kommerziell erhältliche, klinisch in großem Maßstab eingesetzte Lactatdehydrogenase-Assay oder die kürzlich beschriebene Epifluoreszenz-Methode nach Färbung mit Calcein-AM und Propidiumiodid (Lorenzo et al., 1994). Mit Hilfe solcher Methoden wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung im Fall von Polymyxin B festgestellt, daß das Medium vorzugsweise nicht mehr als 100 μg/ml enthalten sollte und die untere Grenze bei 3 μg/ml und darunter liegen kann. Die durch Polymyxin bewirkte Neutralisierung begann sich bei 1 μg/ml und darunter zu verschlechtern. Das entspricht einem Erfordernis von 250 ng Polymyxin zur Neutralisierung von 10 bis 100 ng LPS. Dabei ist zu beachten, daß das LPS in die Transfektionskomplexe eingebaut sein kann und daher nicht unbedingt für die Bindung an die LPS bindende Substanzen verfügbar sein muß. Es ist auch möglich, daß die Neutralisierung durch die LPS bindende Substanz intrazellulär abläuft, wenn die LPS enthaltenden Transfektionskomplexe ins Zytoplasma freigesetzt werden. Daher könnte der Überschuß an Antibiotikum im Medium erforderlich sein, um ausreichende intrazelluläre

Konzentrationen an LPS bindenden Substanzen für die Neutralisierung zu gewährleisten. Mittels Titrationen kann die für die Blockierung der Toxizität minimal erforderliche Konzentration ermittelt werden.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist die LPS bindende Substanz Polymyxin B.

In einer weiteren Ausführungsform ist die Substanz Polymyxin E (Storni et al., 1977), ein Derivat von Polymyxin B, das sich von diesem nur durch eine Aminosäure unterscheidet. Wie Polymyxin B kann es LPS binden, im Gegensatz zu Polymyxin B ist es aber nicht in der Lage, die Aktivierung von Proteinkinase C zu blockieren.

Weitere Beispiele für Substanzen von denen bekannt ist, daß sie LPS binden und neutralisieren, sind: HDLs und LDLs (Levine et al., 1993; Flegel et al., 1993; Roth et al., 1993), Apolipoprotein AI (Flegel et al., 1993), das Protein BPI ("Bactericidal/Permeability Increasing Protein") oder Fragmente davon (Dentener et al., 1993; Eisbach und Weiss, 1993), die die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erforderlichen Eigenschaften aufweisen, Limulus-Proteine (Roth und Tobias, 1993), Derivate von Polymyxin, die eine verminderte Zelltoxizität aufweisen, synthetische Peptide mit Affinität für LPS (Rustici et al., 1993), Antikörper gegen LPS oder Lipid A (Burd et al., 1992). Es können darüberhinaus geeignete Substanzen entworfen werden, indem z.B. von größeren Molekülen, deren LPS bindende Eigenschaft bekannt ist, die LPS bindende Domäne identifiziert und das Peptid, gegebenenfalls in modifizierter Form, eingesetzt wird. Alternativ kann, ähnlich wie von Rustici et al., 1993, für Polymyxin B vorgeschlagen, von der Struktur niedermolekularer

Moleküle mit bekannter LPS-Bindungseigenschaft ausgegangen werden, um neue Moleküle bereitzustellen, die im Hinblick auf Bindung und Entgiftung von LPS optimiert sind.

Die LPS bindenden Substanzen für die Behandlung der Zellen werden auf einfache Weise eingesetzt, indem sie vorzugsweise als Bestandteil des Transfektionsmediums vorliegen. Im allgemeinen ist die Anwesenheit der LPS bindenden Substanzen lediglich während der Transfektion erforderlich, weil der toxische Effekt von LPS sich vor allem bei der Transfektion manifestiert; es kann somit beim nach der Transfektion vorgenommenen Medienwechsel der Zusatz an dieser Substanz entfallen. Die Anwesenheit der Substanz kann jedoch auch über die Transfektion hinaus von Nutzen für das Wachstum der Zelle sein, wenn z.B. der verwendete Zelltyp empfindlich auf LPS ist; in diesem Fall enthält auch das nach der Transfektion bzw. Infektion auf die Zellen aufgebrachte frische Medium die LPS bindende Substanz.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen vor dem Aufbringen des Transfektionsmediums mit den LPS bindenden Substanzen vorbehandelt, um vorhandenes LPS zu binden und gegebenenfalls zu entfernen.

Die Behandlung von Zellen mit LPS bindenden Substanzen kann auch unabhängig von deren Behandlung mit in die Zelle zu importierendem Fremdmaterial von Vorteil sein, z.B. während der Kultur von Zellen, die in ihrem Wachstum sehr empfindlich auf LPS reagieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt Zusammensetzungen für die Behandlung von höheren eukaryotischen Zellen.

Im Falle von Zellkulturanwendungen ist diese Zusammensetzung ein Medium, das neben den üblichen Komponenten eine oder mehrere LPS bindende Substanzen enthält. Zu den üblichen Komponenten zählen Nährstoffe für die Zellen, PufferSubstanzen, etc. Für den Fall, daß die LPS bindende Substanz Bestandteil eines Transfektionsmediums ist, enthält dieses außerdem die Transfektionskomponenten, also das in die Zelle zu importierende Fremdmaterial und die Komponenten, die dessen Transport in die Zelle vermitteln (z.B. rekombinante Viren, kationische Lipide, Liposomen, sowie Komplexe für den Rezeptor-vermittelten Gentransfer, gegebenenfalls in Kombination mit endosomolytischen Mitteln, die die Gentransfereffizienz steigern; derartige Komplexe sind u.a. in der WO 93/07283 beschrieben). Bei der Herstellung eines solchen Transfektionsmediums wird die LPS bindende Substanz zweckmäßig vor den Transfektionskomponenten zugegeben.

Die vorliegende Erfindung kann sowohl bei der Behandlung von Zellen in Zellkultursystemen als auch für therapeutische Anwendungen in vivo oder ex vivo angewendet werden; in letzterem Fall hat das die LPS bindende Substanz enthaltende Medium die Funktion eines Arzneimittels.

Die Erfindung ist u.a. bei therapeutischen Anwendungen von Vorteil, bei denen durch die Anwesenheit von LPS Probleme auftreten. Ein Beispiel dafür im Rahmen der Gentherapie ist die therapeutische Anwendung von rekombinanten Adenovirusvektoren zwecks Verabreichung von intakten CFTR("Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator")-Genen an Patienten mit zystischer Fibröse (CF), bei denen diese Gene mutiert sind. Da die Lunge von CF-Patienten große Mengen von Pseudomonas-LPS

enthalten kann (Pseudomonas-Infektionen sind eine Begleiterscheinung der Erkrankung), könnte eine Beschränkung in der Anwendung dieser Methode, die entweder über das Nasenepithel oder durch Instillationen direkt in die Lunge erfolgt, in einer Toxizität für das Lungenepithel gelegen sein, welche durch den gemeinsamen Eintritt von rekombinantem Adenovirus und LPS verursacht wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden Versuche mit Atemwegsepithelzellen durchgeführt, in denen gezeigt wird, daß Polymyxin B den durch LPS verursachten starken Abfall in der Genexpression zu blockieren vermag. Ein Zusatz einer LPS bindenden Substanz zum Adenovirus enthaltenden Medium kann somit entscheidende Verbesserungen bei der therapeutischen Behandlung von Lungenepithelzellen bringen.

Ein weiteres Beispiel ist die Anwendung auf Endothelzellen, von denen bekannt ist, daß sie schwer zu transfizieren sind; eine mögliche Erklärung für diese Schwierigkeit dürfte in der Eigenschaft dieser Zellen gelegen sein, bereits auf sehr geringe Mengen von LPS anzusprechen (Arditi et al., 1993; Haziot et al., 1993b; Pugin et al., 1993), wobei die Sekretion verschiedener zellulärer Faktoren als Reaktion einer Zelle auf LPS auch andere Zellen, die selbst nicht direkt mit LPS in Berührung gekommen sind, beeinflußt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte anhand von Transfektionen von Nabelvenenendothelzellen gezeigt werden, daß sogar sehr geringe Mengen an LPS-Verunreinigungen eine Toxizität erzeugen; da LPS-gereinigte DNA verwendet wurde, rührten diese ausschließlich von Gewebekulturreagentien her. Auch diese durch geringe LPS-Mengen hervorgerufene Toxizität konnte durch Polymyxin neutralisiert werden.

Die vorliegende Erfindung kann ferner bei der Transfektion von Patientenzellen ex vivo von Vorteil sein, wenn die Zellpopulation mit geringen Mengen LPS verunreinigt ist. Ein Beispiel für eine solche Anwendung ist die Herstellung von Krebsvakzinen, bei der dem Patienten Tumorzellen entnommen, ex vivo mit einer für ein immunstimulierendes Polypeptid kodierenden DNA transformiert und dem Patienten als Impfung verabreicht werden.

Bei therapeutischen Anwendungen kann die LPS bindende Substanz als Bestandteil der Zusammensetzung vorliegen, die die Funktion des Transfektions- bzw. Infektionsmediums hat und somit zusammen mit den Transfektionskomponenten auf die Zellen aufgebracht werden. Sie kann auch als wirksame Komponente einer Arzneimittelzubereitung vorliegen, die dem Transfektionsmedium vor der Transfektion zugesetzt oder auch getrennt von der Transfektionszusammensetzung, z.B. vor der Transfektion, verabreicht wird. In ihrer einfachsten Form ist eine solche Zubereitung eine Lösung der LPS bindenden Substanz, wobei die Zubereitung außerdem übliche Zusatzstoffe enthalten kann; Methoden zur Formulierung pharmazeutischer Zubereitungen sind dem Fachmann bekannt. Sie können einschlägigen Handbüchern, z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980, entnommen werden.

Die Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend eine LPS bindende Substanz, für die Anwendung bei einer therapeutischen Behandlung, bei der Fremdmaterial in die Zelle eingebracht wird. Bevorzugt ist das Fremdmaterial eine Nukleinsäure, insbesondere DNA.

ERSATZBLÄΓT(REGEL26

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die Verwendung von LPS bindenden Substanzen für die Herstellung von Arzneimitteln zur Anwendung vor und/oder gleichzeitig und/oder nach der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Transfektion oder Infektion mit DNA oder RNA.

Diese therapeutischen Behandlungen umfassen neben viralen Gentransfermethoden bevorzugt gentherapeutische Maßnahmen, wie sie im Übersichtsartikel von Cotten und Wagner, 1993, beschrieben sind, einschließlich solcher Methoden, bei denen inhibierende Nukleinsäuremoleküle, wie Antisense-RNAs, Ribozyme oder dafür kodierende DNA- Moleküle angewendet werden, um Zellfunktion spezifisch zu inhibieren.

Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Behandlung von DNA für die Aufnahme in menschliche oder tierische Zellen, wobei man die DNA von LPS reinigt.

Figurenübersicht

Fig. 1: Einfluß des Endotoxingehaltes der DNA auf die

Expression von IL-2 in humanen Melanomzellen Fig. 2: Verringerung der Toxizität von LPS bei der

Transfektion von primären humanen Fibroblasten durch Polymyxin B Fig. 3: Wirkungsweise von Polymyxin B bei

Konzentrationen von 30 μg/ml bis 0.03 μg/ml Fig. 4: Wirkung von Polymyxin B während und nach der

Transfektion Fig. 5: Zusammenhang zwischen der Freisetzung von

Lactatdehydrogenase und Transfektionseffizienz in Gegenwart von Polymyxin B

ZBLAΪT REGEL 26

Fig. 6: Blockierung der durch natürliche LPS-

Verunreinigungen von Plasmid-DNA bedingten

Toxizität durch Polymyxin B Fig. 7: Blockierung der LPS-Toxizität in primären humanen Atemwegsepithelzellen durch Polymyxin B Fig. 8: Blockierung der durch LPS aus

Gewebekulturreagentien verursachten Toxizität durch Polymyxin B in Nabelvenenndothelzellen Fig. 9: Blockierung der durch LPS induzierten Toxizität durch Polymyxin E Fig.10: Einfluß von Polymyxin auf die Expression von DNA bei Anwendung verschiedener Gentransfermethoden

In den folgenden Beispielen, die die vorliegende Erfindung illustrieren, wurden, sofern nicht anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden angewendet:

a) Plasmid-Konstrukte

i) pCMVL

Die Konstruktion des Plasmids ist in der WO 93/07283 beschrieben.

ii) pGShIL-2tet

Für das Plasmid, das die für humanes IL-2 kodierende Sequenz enthält, wurde von dem Vektor pWS2 ausgegangen: Das Plasmid pHßAPr-1 (Gunning et al., 1987) wurde mit BamHI und EcoRI geschnitten. Mittels Agarosegel- Reinigung wurde ein 2.5 kb Fragment isoliert, das das Ampicillin-Restistenzgen und den Replikationsursprung von pBR322 sowie das SV40-Polyadenylsierungssignal enthält. Dieses Fragment wurde mit dem CMV-

Promotor/Enhancer ligiert, das als ein 0.7 kb PCR- Fragment vom Vektor pAD-CMVI (beschrieben in der EP-A 393 438) amplifiziert und EcoRI/BamHI verdaut worden war. Das erhaltene Plasmid wurde pWS genannt. Die für humanes IL-2 kodierende cDNA wurde als PCR-Fragment vom Plasmid pIL2-50A (Taniguchi et al., 1983), der die für humanes IL-2 kodierende cDNA enthält, erhalten. Das PCR-Fragment wurde in den mittels Sall/BamHI-Verdau geöffneten Vektor pWS ligiert und somit pWS2 erhalten.

Eine IL-2-Kassette, enthaltend den CMV- Enhancer/Promotor, die für IL-2 kodierende Sequenz und die SV40-PolyA-Sequenz, wurde mittels PCR unter Vorlage von pWS2 erhalten. Das PCR-Produkt wurde einem Restriktionsenzymverdau mit EcoRI unterworfen und in die EcoRI/Smal-Stelle des Plasmids pUC19 (Pharmacia) hineinkloniert. Das erhaltene Plasmid wurde pGShIL-2 genannt. Als Quelle für das Tetracyclin-Resistenz-Gen und Teile der "upstream" Region des ß-Lactanase-Gens (Ampicillin-Resistenz-Gen) diente das Plasmid pBR327 (Soberon et al., 1980), das mit Sspl und Aval verdaut worden war. Zusammen mit einem EcoRI/Aval-Adaptor wurde die isolierte tet-Sequenz in die EcoRI/Sspl-Stelle von pGShIL-2 kloniert. Die IL-2-Kassette des resultierenden Klons pGShIL-2tet/amp wurde sequenziert; daraufhin wurde die amp-Sequenz mit Eamll05I und Sspl herausgeschnitten und das Plasmid religiert. Das erhaltene Plasmid wurde mit pGShIL-2tet bezeichnet.

b) DNA-Präparation

Die Plasmide wurden zunächst im Bakterienstamm E.coli DH5α in Gegenwart von 100 μg/ml Ampicillin (pCMVL) bzw. Tetracyclin (pGShIL-2tet) in LB-Medium gezüchtet. Die Übernachtkultur wurde zentrifugiert und daraus die DNA wie folgt präpariert: Die CsCl-

ERSAΓZBLAΓT (REGEL 26)

Dichtegradientenzentrifugation wurde nach der von Cotten et al., 1993, beschriebenen Methode durchgeführt. Dazu wurde der Bakterienniederschlag von 1 1 Kultur in 10 ml 20 %iger (Gew./Vol.) Saccharose, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 7.5 (Lösung 1) auf Eis 10 min lang inkubiert. Anschließend wurden 2.2 ml Lysozym (10 mg/ml in Lösung 1) für weitere 10 min auf Eis beigegeben, dann wurden 5 ml 0.2 M EDTA, pH 7 hinzugefügt, die Probe 10 min auf Eis inkubiert und abschließend 10 ml 2 %iges (Vol./Vol.) Triton X-114, 60 mM EDTA und 40 mM Tris, pH 7.5 beigegeben, gefolgt von 15 min Inkubation auf Eis. Dieses Lysat wurde dann 30 min zentrifugiert (Sorvall SS34, 17K) und dem Überstand (26 ml Anfangsvolumen) 28.5 g CsCl und 400 μl Ethidiumbromid (10 μg/ml) beigegeben. Dieses Material wurde über 18 h in einem Beckman VTi50-Rotor bei 49.000 rpm, 20*C zentrifugiert. Die untere der beiden Ethidium-reichen Banden wurde gesammelt und nochmals, direkt in einem Beckman VT165- Rotor, über 4 h bei 63.000 rpm und 20'C zentrifugiert. Die Ethidium-reiche Bande wurde wieder geerntet, mit CsCl-gesättigtem Isopropanol extrahiert, bis die rosa Farbe verschwunden war, ausgiebig gegen TE (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.4), gemischt mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5, dialysiert und mit 3 Volumina Ethanol bei -20*C gefällt. Der gewonnene DNA- Niederschlag wurde weiter behandelt mit RNase A, Proteinase K, Phenol/Chloroform und Chloroform, noch einmal gefällt und das endgültige DNA-Pellet in TE aufgenommen und mittels optischer Absorption quantitativ bestimmt, wobei von der Annahme ausgegangen wurde, daß 0.05 mg/ml DNA bei 260 nm eine Absorption von 1 aufweist.

c) DNA-Reinigung von LPS

i) Triton X-114-Extraktion

ERSATZBLÄΓΓ (REGEL 26)

Um ein homogenes Präparat des Detergens zu erhalten, wurde Triton X-114 (Sigma) drei 0*C/30 ^# C- Temperaturzyklen, wie von Bordier, 1981, beschrieben, unterworfen. Die Extraktion der Lipopolysaccharide von der DNA-Probe wurde, in Abwandlung publizierter Methoden (Aida und Pabst, 1990; Manthorpe et al., 1993) wie folgt durchgeführt: Die DNA-Probe (0.5 - 1.5 mg/ml in 10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 (TE)) wurde auf 0.3 M Natriumacetat (pH 7.5) gebracht. Dann wurde 3 μl Triton X-114 pro 100 μl DNA-Lösung beigegeben, die Proben in einem Vortex kräftig gemischt und 10 min auf Eis inkubiert. Damit sich die beiden Phasen trennen können, wurden die Proben 5 min bei 30*C aufbewahrt, in einer vorgewärmten Eppendorf-Zentrifuge 2 min bei 2.000 rpm zentrifugiert und die wässerige Phase in ein frisches Eppendorf-Röhrchen gegeben. Diese Extraktion wurde noch zweimal durchgeführt und die schließlich erhaltene wässerige Phase mit 0.6 Volumina Isopropanol bei Raumtemperatur gefällt, das Präzipitat mittels Zentrifugation gewonnen, zweimal mit 80 % Ethanol gewaschen, luftgetrocknet, in TE wieder aufgenommen und die Menge bestimmt. Dazu wurde die Probe mit RNase A, Proteinase K, Phenol/Chloroform und Chloroform behandelt, wieder gefällt und das endgültige DNA-Pellet in TE suspendiert und die Absorption bei 260 nm bestimmt, wobei von der Annahme ausgegangen wurde, daß eine Konzentration von 0.05 mg/ml DNA den Absorptionswert 1 hat. (Diese Methode wurde für die in den Beispielen einsetzte DNA verwendet. )

ii) Polymyxin-Chromatographie

Ein Volumen Polymyxinharzschlamm (Affi-Prep-Polymyxin, Biorad), das dem Volumen der DNA-Probe entsprach, wurde kurz mit drei Volumina 0.1 N NaOH versetzt, anschließend

ERSATZBLÄTT(REGEL26)

wurde dreimal mit fünf Harzvolumina TE gewaschen. Das pelletierte Harz wurde mit den DNA-Proben (in TE 0.8 - 1.2 mg/ml) wieder aufgenommen und die Mischung über Nacht bei 4*C gerührt. Dann wurde die Probe auf eine mit 0.1 NaOH vorbehandelte Wegwerfsäule gegeben und mit TE gewaschen. Das Eluat wurde gesammelt, das Harz mit einem weiteren Volumen TE gewaschen und das Eluat mit der Waschflüssigkeit vereinigt. Die DNA dieser gepoolten Probe wurde mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5 und 2 Volumen Ethanol gefällt. Die Weiterbehandlung des Präzipitats und die DNA-Bestimmung wurden durchgeführt, wie oben beschrieben. (Diese Methode wurde im Vorversuch verwendet. )

d) LPS-Präparat

Es wurde ein kommerziell erhältliches LPS-Präparat aus Escherichia coli (0111:B4, Sigma) verwendet. Das Präparat wurde zu 10 mg/ml in LPS-freiem Wasser gelöst und vor der Herstellung von Serienverdünnungen in LPS- freiem Wasser 5 min lang sonikiert (SONOREX-Bad, 360 W). Die endgültigen Verdünnungen wurden vor der Verwendung 5 min lang sonikiert.

Die LPS-Assays wurden mit dem BioWhittaker-Assay durchgeführt (chromogener Limulus-Assay; Iwanaga, 1993), wobei festgestellt wurde, daß alle verwendeten Reagentien LPS-frei waren (<0.1 Endotoxineinheiten/50 μl Lösung).

e) Adenovirus-Präparation

Das E4-defiziente Adenovirus 5, dll014 (Bridge und Ketner, 1989) wurde in der komplementierenden Zellinie W162 (Weinberg und Ketner, 1983) gezüchtet. Pellets von infizierten Zellen wurden zu 2 ml/2 x 10 ⁷ Zellen in

ERSÄΓZBLAΓT (REGEL 26)

20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM PMSF

(Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert und drei Gefrier-/Auftauzyklen (flüssiger Stickstoff, 37*C) unterworfen. Die Suspension wurde dann mit einem gleichen Volumen Freon, im Vortex gemischt und 10 min lang bei 3.000 rpm (Heraeus Sepatech, 2705 Rotor) zentrifugiert. Die wäßrige (obere) Phase wurde aufgehoben, und die Freonphase wurde mit 1/5 Volumen 20 mM HEPES, pH 7.4 im Vortex behandelt und nochmals zentrifugiert. Die wäßrigen Phasen wurden vereinigt, in ein Beckman VT150 Zentrifugenröhrchen (15 ml/Röhrchen) überführt und mit 15 ml 1.2 g/cm ³ CsCl/20 mM HEPES, pH 7.4 und 7 ml 1.45 g/cm ³ CsCl, 20 mM HEPES pH 7.4 unterschichtet. Die Proben wurden 40 min lang bei 20*C in einem Beckman VT150 Rotor bei 49.000 rpm zentrifugiert. Die untere opaleszierende Bande von reifen Viruspartikeln bei 1.34 bis 1.35 g/cm ³ (gemessen mittels Brechungsindex) und die obere Bande (unreife Teilchen bei 1.31 bis 1.32 g/cm ³ ) wurden getrennt gesammelt und einer Gleichgewichtszentrifugation (mehr als 4 h) bei 63.000 rpm in einem VT165 Rotor unterworfen. Die opaleszenten Virusbanden (entweder 1.31 g/cm ³ unreife oder 1.34 g/cm ³ reife) wurden geerntet. Die Biotinylierung der erhaltenen Viruspartikel mit N-hydroxysuccinimid-Biotin (Pierce), die Inaktivierung mit 8-Methoxypsoralen/UVA und die Reinigung mittels Gelfiltration unter Verwendung einer Pharmacia PDIO-Säule, equilibriert mit HBS/40 % Glyzerin wurden durchgeführt, wie in der WO 93/07283 bzw. von Wagner et al., 1992, und Cotten et al., 1992, beschrieben. Die Virusproben wurden quantitativ über die Proteinkonzentration bestimmt (Biorad Bradford Assay mit BSA als Standard) analysiert, wobei die Beziehung 1 mg/ml Protein = 3.4 x 10*2 Adenoviruspartikel/ml (Lemay et al., 1980) verwendet wurde.

ERSATZBLAΓΓ (REGEL 26)

f ) Transfektionskomplexe

Die modifizierten Adenoviruspartikel (8 μl, l x lO ^r - ² Partikel/ml) wurden in 150 μl HBS verdünnt und mit 1 μg StrpL (Streptavidin-modifiziertes Polylysin, hergestellt wie in der WO 93/07283 beschrieben) in 150 μl HBS 30 min bei Raumtemperatur gemischt. Aliquots von 6 μg Plasmid- DNA wurden mit steigenden Mengen an LPS in 100 μl gemischt. Die DNA-Lösungen wurden daraufhin 30 min mit der Adenovirus/StrpL-Lösung bei Zimmertemperatur gemischt. Abschließend wurde ein 100 μl Aliquot HBS, enthaltend 5 μg TfpL, hergestellt wie in der WO 93/07283 beschrieben, jeder Probe beigegeben, gefolgt von 30 min bei Raumtemperatur. Von den so erhaltenen 500 μl Transfektionsmedium wurde je 1/10 pro Vertiefung einer Zellkulturplatte, enthaltend 20.000 Zellen, verwendet.

g) Zellkulturen

i) Humanfibroblasten

Nach der chirurgischen Entfernung wurden Hautbiopsien in 4*C DMEM, enthaltend 10 % FCS, 2 mM Glutamin und Gentamycin, gegeben. Die Biopsien wurden in einer Gewebekultureinrichtung ausgiebig mit Pinzette und chirurgischem Messer im laminaren Luftstrom in sterilen 6 cm Plastikschalen zerkleinert. Dann wurden 3 ml DMEM, enthaltend 20 % FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika beigegeben, und die Kultur in einen 37*C Brutschrank gegeben. Nach 10 Tagen wurde das Medium durch DMEM, enthaltend 10 % FCS, ausgetauscht. Dann wurde das Medium weiter 2 x wöchentlich gewechselt. 4 Wochen nach Beginn der Kultur wurden die Zellen, die aus den Gewebsfragmenten herausgewachsen waren, trypsinisiert und für die Transfektion in neue Kulturschalen ausplattiert. Es wurden primäre Kulturen aus Passage

ERSATZB π RE

5-10 verwendet. Die Fibroblasten wurden transfiziert, wie von Wagner et al., 1992, beschrieben.

ii) Humane Melanomzellen

Primäre humane Melanomzellen wurden isoliert und in RPMI 1640-Medium (Gibco/BRL), ergänzt mit 100 I.U./ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 1 % Natriumpyruvat und 10 % hitzeinaktiviertem FCS, kultiviert.

iii) Humane Atemwegsepithelzellen

Humane Atemwegsepithelzellen wurden, wie von Van Scott et al., 1986, beschrieben, aus Nasenpolypen isoliert. Die Zellen wurden auf Standardzellkulturplatten, überzogen mit humanem Plazentakollagen (Sigma, Kat. Nr. C 7521) in Bronchienepithelzell-Wachstumsmedium (BEGM, Promocell, Kat. Nr. C-2106) gezüchtet.

iv) Humane Nabelvenenendothelzellen

Humane Nabelvenenendothelzellen (HUVECs) wurden bezogen von CellSystems (Kirklandt, Washington) und auf 0.1 % Gelatine-überzogenen Zellkulturschalen gezüchtet.

h) Expressionsmessung

i) Luciferase-Assay

Die Herstellung von Zellextrakten, die Standardisierung des Proteingehalts sowie die Bestimmung der Luciferaseaktivität wurden durchgeführt, wie von Zenke et al., 1990, Cotten et al., 1990, bzw. in der EP 388 758 beschrieben.

ERSAΓZBLAΓΓ (REGEL 26)

ii ) IL-2 Assay

Die Expression von Interleukin-2 wurde mit Hilfe eines Bioassays bestimmt, wie von Karasuyama und Melchers, 1988, beschrieben. Zusätzlich wurde die IL-2 Produktion unter Verwendung des IL-2 ELISA-Kits von Becton Dickinson (Katalog Nr. 30032) nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt.

Beispiel 1

Einfluß des Endotoxingehaltes der DNA auf die Expression von IL-2 in primären humanen Melanomzellen

Primäre humane Melanomzellen (2 x 10^ Zellen/6 cm Kulturschale) wurden mit 6 μg des nach verschiedenen Methoden gereinigten Plasmids, entsprechend den Angaben in Fig. 1, transfiziert. Der Endotoxingehalt der Plasmidpräparation vor der Reinigung ist in der Fig. jeweils als dunkel schraffierter Balken dargestellt. Nach der Reinigung mittels Polymyxinharz oder Extraktion mit Triton X-114 enthielten alle Präparate weniger als 0.1 EU Lipopolysaccharid/6 μg DNA. Der IL-2-Gehalt wurde mittels ELISA im Zellüberstand gemessen, die in Fig. 1 angegebenen Werte bedeuten Einheiten/10^ Zellen und 24 h.

Beispiel 2

Verringerung der Toxizität von LPS bei der Transfektion von primären humanen Fibroblasten durch Polymyxin B

Zunächst wurde die Toxizität von LPS beim Gentransfer mittels Adenovirus-unterstützter Rezeptor-vermittelter

ERSATZBLAΓΓ (REGEL 26)

Endozytose in primäre Humanfibroblasten untersucht. Der Gehalt an LPS, bezogen auf 6 μg DNA, ist in Fig. 2 angegeben. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und die Luciferasemessung durchgeführt. Mit steigendem LPS-Gehalt der DNA sank die Genexpression um beinahe 2 Zehnerpotenzen ab. Die zerfetzte Morphologie der Zellen, die einem hohen LPS-Gehalt ausgesetzt waren, stand im Einklang mit den niedrigen Expressionswerten (Fig. 2, obere Tafel).

Als nächstes wurden die Zellen denselben DNA/Adenovirus/LPS-Komplexen in Gegenwart zunehmender Mengen Polymyxin B (Polymyxin B-Sulfat, Sigma, Kat. Nr. P 4932) ausgesetzt. Polymyxin war sowohl während als auch nach der Transfektion in den jeweils angegebenen Konzentrationen im Medium zugegen, d.h. daß das 3 h nach der Transfektion ausgetauschte frische Medium die jeweilige Konzentration an Polymyxin enthielt. Eine typische antibiotische Konzentration von Polymyxin B ist 1.000 Einheiten/ml. Bei einer spezifischen Aktivität von 7.500 Einheiten/mg entspricht dies einer Konzentration von 133 μg/ml Polymyxin B. Es zeigte sich, daß in Gegenwart von 3, 10 und 30 μg/ml Polymyxin B kaum Unterschiede in der Expression auftreten. Dies zeigt, daß das Antibiotikum von diesen Zellen toleriert wird. Polymyxin B erlaubt in allen drei verwendeten Konzentrationen erfolgreiche Transfektionen mit Virus/DNA-Komplexen, die LPS-Verunreinigungen aufweisen, wobei gegen 100 ng LPS/6 μg DNA vollständiger Schutz eintritt (vgl. die Proben 2, 5, 8 und 11) und die Schutzwirkung gegen 1.000 ng LPS/6 μg DNA beinahe vollständig ist (vgl. die Proben 3, 6, 9 und 12). (Die in der Fig. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von zwei Transfektionen. )

ERSATZBLAΓΓ (REGEL 26)

Beispiel 3

Analyse der Wirkungsweise von Polymyxin bei Konzentrationen von 30 μg/ml bis 0.03 μg/ml

Die minimale Konzentration von Polymyxin, die erforderlich ist, um die LPS-Toxizität zu neutralisieren, wurde mittels ähnlichen Titrationen wie in Beispiel 1 ermittelt. Es wurde festgestellt, daß eine vollständige Neutralisierung eines Gehalts von 100 oder 1.000 ng LPS/6 μg DNA in den DNA-Komplexen mit 10 μg/ml Polymyxin B erhalten wird. Mit 3 bis 0.3 μg/ml Polymyxin B wurde nur eine teilweise Neutralisierung der Toxizität erhalten, bei niedrigeren Konzentrationen wurde eine nur sehr geringe Neutralisierung beobachtet. Aus einem Gehalt an 0.6 μg DNA in den Transfektionsansätzen ergibt sich, daß DNA-Komplexe, die LPS in Konzentrationen von 100 oder 1.000 ng/6 μg DNA in einem Volumen von 0.25 ml 10 bis 100 ng LPS enthalten. Die durch Polymyxin bewirkte Neutralisierung begann sich bei 1 μg/ml und darunter zu verschlechtern. Das entspricht einem Erfordernis von 250 ng Polymyxin zur Neutralisierung von 10 bis 100 ng LPS. Der Überschuß an Antibiotikum im Medium dürfte erforderlich sein, um ausreichende intrazelluläre Polymyxinkonzentrationen für die Neutralisierung zu gewährleisten. Das Ergebnis der Titration ist in Fig. 3 dargestellt: wo in der Fig. angegeben, war Polymyxin B, und zwar sowohl während als auch nach den Transfektionen, anwesend. Es wurden jeweils Doppeltransfektionen vorgenommen. Die Luciferasewerte (Messung 24 h nach der Transfektion) sind für jede Polymyxinkonzentration ausgedrückt als Prozentsatz des Werts der Kontrollprobe.

Beispiel 4

Untersuchung der Wirkung von Polymyxin B während und nach der Transfektion

In den vorangegangenen Beispielen war Polymyxin sowohl während der Transfektion als auch danach, bis zur Zellernte für den Luciferaseassay, im Kulturmedium enthalten. Da aufgrund der Vorversuche angenommen wurde, daß das für die Toxizität von LPS verantwortliche Ereignis dessen mit dem Adenovirus gemeinsamer Eintritt in die Zelle ist, sollte die Schutzfunktion von Polymyxin B lediglich während des Kontaktes der Zellen mit den Transfektionskomplexen erforderlich sein. Um diese Annahme zu bestätigen, wurden primäre Fibroblastenkulturen den LPS-enthaltenden Transfektionskomplexen in Abwesenheit von Polymyxin (Proben 1-4) sowie in Gegenwart von Polymyxin B einerseits nur während der Transfektion (dazu wurden die Proben nach der Transfektion mit frischem Medium versetzt, das frei war von Polymyxin B; Proben 9-12) und andererseits zusätzlich nach der Inkubation (dazu wurden die Proben mit frischem Medium versetzt, das identische Mengen Polymyxin B enthielt wie das Transfektionsmedium; Proben 5-8) mit den Transfektionskomplexen ausgesetzt. Die erhaltene Luciferaseexpression wurde 24 h nach der Transfektion gemessen. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 4 dargestellt: Es zeigte sich, daß die Anwesenheit von 30 μg/ml Polymyxin B ausschließlich während der Transfektion nahezu dieselbe Schutzwirkung hat wie die fortgesetzte Gegenwart des Antibiotikums über den Zeitpunkt nach der Transfektion hinaus. (Die in der Fig. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von zwei Transfektionen. )

Beispiel 5

ERSATZBLÄFT(REGEL26)

Zusammenhang zwischen der Freisetzung von Lactatdehydrogenase und Transfektionseffizienz in Gegenwart von Polymyxin B

In den in Beispiel 1 durchgeführten Versuchen wurde festgestellt, daß die Morphologie von Zellen, die mit LPS-enthaltenden DNA-Komplexen transfiziert worden sind, mit der Zelltoxizität im Einklang steht, die die Abnahme der Genexpression hervorruft. Da das zytpplasmatische Enzym Lactatdehydrogenase (LDH) ins umgebende Medium freigesetzt wird, wenn Zellen eine Nekrose oder Apoptose durchmachen, ist die einfache Messung der LDH-Aktivltät im Zellmedium ein Indikator für die Zelltoxizität. Es wurde eine inverse Korrelation zwischen der Freisetzung von LDH ins Medium und dem erfolgreichen Transfer des Luciferasegens gefunden (Fig. 5, Proben 1-4), wobei Zunahmen von LDH im Medium mit einem beträchtlichen Abfall der Luciferasegenexpression zusammenfielen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Beispiele 1 und 2, blockierte die Gegenwart von 10 oder 30 μg/ml Polymyxin B (Polymyxin B war nur während der Transfektion im Medium enthalten) die durch LPS induzierte Abnahme des Gentransfers (Fig. 5, Proben 5-12). In Übereinstimmung der Blockierung der Toxizität durch Polymyxin blockiert die Gegenwart von Polymyxin die durch LPS induzierte Freisetzung von LDH (Fig. 5, Proben 5-12). (Die in der Fig. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von zwei Transfektionen. )

Der LDH-Assay wurde durchgeführt, indem Aliquots des Zellkulturmediums (5 bis 50 μl) zu den angegebenen Zeiten nach der Transfektion entfernt und mit 500 μl LD-L-Reagens (Sigma, Kat. Nr. 228-10) gemischt wurden. Die Proben wurden bei 37*C 45 min inkubiert und die

ERSATZBLAπ(REGEL26)

Absorption bei 340 nm gegen einen LD-L-Blindwert gemessen.

Beispiel 6

Blockierung der durch natürliche LPS-Verunreinigungen von Plasmid-DNA bedingten Toxizität durch Polymyxin B

In den vorangegangenen Beispielen wurde LPS-freie DNA, der absichtlich bekannte Mengen von definierten LPS- Präparaten zugesetzt worden waren, verwendet. In diesem Beispiel wurde untersucht, ob die Toxizität von LPS- Verunreinigungen, wie sie in DNA-Präparaten typischerweise gefunden werden, durch Polymyxin B blockiert werden kann. Zu diesem Zweck wurde LPS-freies Luciferaseplasmid mit einem Überschuß an DNA-Plasmid gemischt, das mittels Qiagen-Methode mit einem Plasmid- DNA-Harz (Diagen) ohne Behandlung zwecks Entfernung von LPS erhalten wurde. Diese DNA enthielt somit diejenige molekulare Form von LPS, wie sie in einer Plasmid-DNA- Präparation typischerweise gefunden wird. Die eingesetzte DNA-Probe enthielt ca. 16 ng LPS/6 μg DNA; das entspricht 6.4 ng/ml während der Transfektion. Wie aus Fig. 6 ersichtlich ist, wurde mit diesem Präparat nur ein schwacher DNA-Transport erhalten (Fig. 6, Probe 1), jedoch eine beinahe lOfache Erhöhung erreicht, wenn während der Transfektion 3 μg/ml Polymyxin B zugegen waren (Fig. 6, Probe 2). Bei höheren Antibiotikumkonzentrationen wurde keine weitere Verbesserung beobachtet. Die 3 μg/ml Polymyxin bedeuten einen beinahe 500fachen Massenüberschuß gegenüber der erhaltenen LPS-Konzentration während der Transfektion. (Die in der Fig. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von drei Transfektionen. )

ERSATZBLAπ(REGEL26)

Beispiel 7

Blockierung der LPS-Toxizität in primären humanen Atemwegsepithelzellen durch Polymyxin B

Primäre humane Atemwegsepithelzellen wurden mit LPS enthaltenden Transfektionskomplexen behandelt, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, und zwar einerseits in Abwesenheit, andererseits in Gegenwart von 10 μg/ml Polymyxin B während der Transfektion. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und die Luciferaseexpression gemessen. Es zeigte sich, daß die Gegenwart von LPS in den DNA-Komplexen einen scharfen Abfall in der Genexpression hervorruft (Fig. 7, Proben 1-4). Die durch die verwendeten LPS- Konzentrationen hervorgerufene Toxizität kann durch Polymyxin B weitgehend blockiert werden (Fig. 7, Proben 5-8). (Die in der Fig. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von drei Transfektionen. )

Beispiel 8

Blockierung der durch LPS aus Gewebekulturreagentien verursachten Toxizität durch Polymyxin B in Nabelvenenendotheizellen

Humane Nabelvenenendothelzellen wurden nach dem Standardprotokoll transfiziert. Es zeigte sich, daß diese Zellen empfindlich auf die Anwesenheit von LPS in den Komplexen sind; vgl. Fig. 8, Probe 1, in der der Komplex kein LPS enthielt, mit den Proben 2, 3 und 4, in denen LPS in Mengen von 10, 100 und 1.000 ng/6 μg DNA enthalten war. Die Transfektionseffizienz war jedoch sogar bei Verwendung von LPS-freier DNA gering. Um

ERSAΠ-BLAΠ (REGEL 26)

festzustellen, daß dies durch eine Toxizität verursacht wird, die von den Gewebekulturreagentien stammt, wurden die in der Fig. angegebenen Polymyxin B-Mengen eingesetzt, die im Medium sowohl während als auch nach der Transfektion zugegen waren. Es zeigte sich, daß die Gegenwart von 10 μg/ml Polymyxin B einen 5-6fachen Anstieg in der Genexpression bewirkt (vgl. die Proben 1 und 5). Höhere Konzentrationen von Polymyxin B waren weniger wirksam.

Beispiel 9

Blockierung der durch LPS induzierten Toxizität durch Polymyxin E

Die in diesem Beispiel durchgeführten Versuche wurden prinzipiell genauso durchgeführt wie die in Beispiel 2 beschriebenen, mit dem Unterschied, daß statt Polymyxin B Polymyxin E (Colistin-Methansulfonat, Sigma, Kat. Nr. C 1511) verwendet wurde und daß dieses nur während der Transfektion zugegen war. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 9 dargestellt. Es zeigte sich, daß Polymyxin E die Fähigkeit hat, LPS in einer Menge von 100 ng/6 μg DNA in ähnlicher Weise wie Polymyxin B zu blockieren. Im Gegensatz zu Polymyxin B konnte jedoch Polymyxin E eine LPS-Verunreinigung von 1.000 ng/6 μg DNA nicht neutralisieren (die scheinbare Stimulierung bei 30 μg Polymyxin E/ml (Proben 4-6) ist eher auf eine deutliche Inhibierung der Kontrollprobe (30 μg Polymyxin E/ml, kein LPS) als auf eine Stimulierung der Probe, die 100 ng LPS/6 μg DNA enthielt, zurückzuführen).

Beispiel 10

ERSATZBLÄTT(REGEL 26)

Einfluß von Polymyxin auf die Expression von DNA bei Anwendung verschiedener Gentransfermethoden

Die in diesem Beispiel durchgeführten Versuche dienten als Vergleich, mit dem festgestellt werden sollte, ob die beim Gentransfer mittels Adenovirus-unterstützter, Rezeptor-vermittelter Endozytose beobachtete Toxizität auf Komponenten der Transfektionskomplexe zurückzuführen ist.

a) Gentransfer mit rekombinantem Adenovirus

Diese Versuche sollten zeigen, ob die in Gegenwart von Adenovirus und LPS auftretende Toxizität auf Polylysin zurückzuführen ist. Zu diesem Zweck wurde ein rekombinantes Adenovirus, das ein genomisches ß- Galaktosidasegen trägt (Stratford-Perricaudet et al., 1992), als Gentransfervehikel verwendet. Das Adenovirus wurde auf die Zellen (2 x 10 ⁴ pro Vertiefung) in Gegenwart von LPS aufgebracht. Nach 24 h wurde die ß- Galaktosidaseexpression als Maß für das Überleben von Zellen, die die Adenoviruspartikel aufgenommen hatten, bestimmt. Diese Versuche sind in Fig. 10 dargestellt: Es zeigte sich eine LPS-dosisabhängige Abnahme der ß- Galaktosidaseaktivität (Fig. 10A). Die Messung der Freisetzung von LDH (vgl. Beispiel 5) ins Medium zeigte, daß Zelltod und Lyse für die Abnahme der ß- Galaktosidaseexpression verantwortlich sein könnten. Es ergibt sich somit, daß die Gegenwart von Polylysin für das Auftreten der toxischen Reaktion nicht erforderlich ist, was die einfache Erklärung stützt, daß die Toxizität eine Folge der Internalisierung von LPS ist. Dem durch LPS bewirkten toxischen Effekt konnte durch Zugabe von Polymyxin entgegengewirkt werden (Fig. 10A, Proben 5-8).

ERSATZBLArT(REGEL26)

b) Gentransfer mittels nicht-viralen Systemen

Als nächstes wurde untersucht, ob Adenovirus eine Rolle bei der Signalübertragung nach Eintritt von LPS spielen könnte. Falls Wechselwirkungen zwischen Adenovirus und der Zelle für die Toxizität eine Rolle spielen, dann sollte der Transport von DNA in die Zellen mit nicht- viralen Methoden keine LPS-induzierte Toxizität mit sich bringen. Als nicht-virale Gentransfermethoden wurden zu diesem Zweck einerseits Glyzerin und andererseits kationische Lipide eingesetzt.

i) Bei der Transfektion der Fibroblasten (0.4 μg pL bzw. StrpL in 75 μl HBS wurden mit 3 μg pCMVLuc in 75 μl HBS für 30 min inkubiert, dann wurden 3 μg TfpL oder 2 μg pL in 75 μl HBS zugegeben und weitere 30 min inkubiert. Nach Zugabe von Medium und 13 % Glyzerin zu den Komplexen wurde das Transfektionsmedium für 4 h auf die Zellen gegeben) wurde durch Zugabe von LPS in verschiedenen Konzentrationen (s. Fig. 10B, Proben 5-8) eine Abnahme der Luciferaseexpression beobachtet, die beinahe so stark war wie bei der Methode auf Grundlage der Adenovirus-unterstützten Endozytose.

ii) Bei der Transfektion mit dem kationischen Lipid Transfectam (DOGS; es wurde ein kommerziell erhältliches Präparat nach Standardvorschrift eingesetzt) wurde eine Abnahme der Luciferaseaktivitat als Funktion des LPS- Gehalts festgestellt (Fig. 10B, Proben 9-11). Die Gegenwart von 1000 ng LPS/6 μg DNA verringerte die Luciferaseexpression auf ca. 10 % des Kontrollwerts, der mit LPS-freier DNA erhalten wurde.

ERSATZBLÄΓT(REGEL26)

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