Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Deiignifizierung und/oder Bleiche von lignoceilulosehaJtigem Material zum enzrmatischen Deinken von Altpapier und zur Behandlung von Abwässern, insbesondere von Papierfabrikations - oder Zellstoff abrikationsabwässern.

I. Stand der Technik chemischer Verfahren zur

Zellstoffherstellung. Einsatz lignolytischer Enzyme: Biopuiping. andere .Anwendungen

A. Chemische Verfahren zur Zeiistoffhersteliung und Erzeugung von Holzstoffen

Ais heute hauptsächlich zur Zeiistoffherstεliung verwendete Verfahren sind das Sulfat- und das Sulfitverfahren zu nennen. Mit beiden Verfahren wird unter Kochung und unter Druck Zeilstoff ej-zeug: Das Sulfat-Verfahren arbeitet mit den wirksamen Chemikalien aOH und Na _ _. S. das Sulfit-Verfahren mit Ca(HSO ^ ) _a - SO^ .

Daneben existieren einige umweltfreundlichere Kochverfahren mit Hilfe von organischen Lösungsmitteln.

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Alle Verfahren haben ein Hauptziel: Die Entfernung des Lignins aus dem verwendeten Pflanzenmaterial. Holz oder Einjahrespflanzen. Das Lignin. das mit der Celluiose und der Hemicellulose den Hauptbestandteil des Pflanzenmaterials (Stengel oder Stamm) ausmacht, muß entfernt werden, da es sonst nicht möglich ist. nicht vergilbende und hochbelastbare Papiere herzustellen.

Die Holzstofferzeugungsverfahren arbeiten mit Steinschleifen (Holzschliff) oder mit Refinern (TMP). die das Holz nach entsprechender Vorbehandlung (chemisch, thermisch oder chemisch¬ thermisch) durch entsprechende Mahlung defibriliieren.

Diese Holzstoffe besitzen noch einen Großteil des Lignins und werden v.a. zum Zeitungspapierdruck oder zum Druck von Illustrierten oder Reklame, hier allgemein als gestrichene Papiere, eingesetzt.

B. Biopulping

Lignoiytische Systeme sind erst seit wenigen Jahren in ihrem Wirkmechanismus erforscht, als es gelang, durch geeignete Anzuchtbedingungen und Induktorzusätze bei dem Weißfäuiepilze Phanerochaete chrysosporium zu ausreichenden Enzymmengen zu kommen. Es wurden bei diesem Pilz Enzymspezies gefunden: Ligninperoxidasen und Manganperoxidasen. die in dieser Form vorher unbekannt waren. Da dieser Pilz in-vivo ein hoch effektiver Ligninabbauer ist. wurde zunächst geschlossen, daß es auch beim pilzfreien Enzymeinsatz zum Lign nabbau kommen würde. Diese Vorstellung stellte - sich als falsch heraus, da die Enzyme unter anderem zu einer Repolymerisation des Lignins führen und nicht zu dessen Abbau.

Ähnliches gilt auch für andere lignolytische Peroxidasen und für andere lignolytische Enzymspezies wie Laccasen, die das Lignin anstelle von H^ O a mit Hilfe von O^ oxidativ abbauen. In allen Fällen kommt es beim Abbau zu ähnlichen Prozessen, nämlich zu einer Radikalbildung, die, wenn diese Radikale nicht in irgendeiner Form abgefangen werden, wieder selbst miteinander reagieren und so repolymerisieren. So war man gezwungen, beim Biopulping auf in-vivo-Systeme zurückzugreifen.

Man brachte Pilz und z.B. Holzschnitzel zusammen, um so zu einer Teildelignifizierung zu kommen, die zumindest die Bleichbarkeit erhöhte und die erforderliche Energie bei dem mechanischen Nachbehandlung (Defibrillierung) herabsetzte. Unter einem Biopulping versteht man allgemein die mittels biologisch, enzymatischer Prozesse durchgeführte Herstellung von Zellstoff oder zellstoffähnlichen Stoffen oder Vorstufen. Bei Biopulping wird also vor allem versucht. Stämme zu züchten, die keine Cellulase bilden, sogenannte Cellulase-less-Mutanten. da nur die lignolytischen Enzyme erwünscht sind, die Weißfäulepilze aber in Gegenwart von Lignoceilulose auch Cellulasen bilden. Die Cellulasen würden zu unerwünschten Ausbeuteverlusten durch Celluloseabbau beim Zellstoff führen.

Eine weitere Schwierigkeit ist, daß die Weißfäuiepilze das Lignin nicht als Kohlenstoffqueile benutzen können, und so auf die

Cellulose bzw. Hemicellulose als Kohlenstoffquelle angewiesen sind. Diese

Schwierigkeiten werden zur Zeit umgangen, indem das Substrat mit einer zusätzlichen Kohlenstoffqueile z.B. Glucose unter anderem imprägniert wird, um so den Cellulase-less-Mutanten überhaupt ein

Wachstum zu ermöglichen.

Dabei ist die Hauptschwierigkeit die sehr langsame Abbaugeschwindigkeit des Lignins (Tage bis Wochen), so daß man bei dem in-vivo- Verfahren: Holzhackschnitzel + Cellulase-less - Mutanten (Phanerochaete chrysosporium) u.a. am Screening neuer

besserer Wildstämme arbeitet. Als Endziel will man so zu schnellerem und effektiverem Ligninabbau kommen, um so den oben bereits erwähnten Ansatz.- Herabsetzung der Mahienergie und verbesserte Bleichbarkeit zu verbessern.

Man würde so. wenn es gelingt die Cellulose- und Hemicellulose- Verluste gering zu halten, zu Hochausbeutestoff kommen, der aber im Gegensatz zu den bisher durch Mahlung hergestellten Holzschliffen u.a. wesentlich energieärmer hergestellt werden könnte, leichter bleichbar wäre und bessere mechanische Eigenschaften zeigen würden.

Wie erwähnt bleiben die Hauptnachteile:

1. der sehr langsame Ligninabbau

2. der nur sehr begrenzte Ligninabbau (wenige %)

3. wahrscheinlich unumgängliche Zudosage von zusätzlicher

C-Quelle

4. Schwierigkeiten durch die Prozeßführung wie großes Ansatzvolumen wegen der langsamen Wachstums- und Abbauzeiten, durch spezielle Belüftung, pH-Konstant¬ haltung und erforderliche Kontaminationsfreiheit.

Es existieren auch Ansätze mit zellfreien Enzymsystemen bei Phanerochaete chrysosporium.

Hier liegt aber die Anwendung 1) bei der Bleiche von "Kraftpuip"

(das ist die teilweise delignifizierte Pulpe, die nach der

Sulfatkochung mit ca. 5-8 % Restligningehalt anfällt ). 2) bei der Verbesserung der mechanischen Eigenschaften von mechanischen Pulpen, d.h.

Pulpen, die bei der mechanisch-thermischen oder chemo-mechanischen oder chemo-thermo-mechanischen Behandlung von Holzstoffen entstehen, wie TMP (thermo-mechanical Pulp), CMP (chemo- mechanical Pulp) und CTMP (chemo-thermo-mechanical Pulp) und 3) bei der Entfärbung von El - Abwässern (dies sind solche, die nach der 1. Bleichstufe von Kraftpuip anfallen).

Hier ist die Anwendung auf den Abbau von Lignin - Prozentbruch- teiien bei ("Kraftpuip") bis wenigen Prozenten (Holzschliff) innerhalb von 12 bis 48 Stunden beschränkt. Die Bleiche ist ebenfalls unbefriedigend.

In neuerer Zeit gibt es einige Versuche, zu besseren Bleichergebnissen zu kommen mit Hilfe von Hämverbindungen, wie z.B. auch Hämoglobin, die quasi die aktive Hämkomponente in den Ligninperoxidasen nachstellen. Dabei sind die Verbindungen im allgemeinen für einen industriellen Einsatz zu teuer und zeigen auch z.T. unerwünschte Begleiteffekte, wie Abbau der Zellulose.

Auch Spezies einer anderen Enzymgruppe ., die Hemizellulasen. hier u.a. die Xylanasen. werden als Bleichenzyme eingesetzt, da man hier einen Effekt auf die Bindungen zwischen Hemizellulosen (Xyianen) und dem Lignin vermutet.

Hier sind ebenfalls lange Wirkzεiten des Enzyms bei relativ geringer Bleichwirkung und fehlender L igninentfernung von erheblichem Nachteil.

Weitere Anwendungen der lignolytischen Enzyme sind Entfärbung und Entgiftung von Zeilstoffabrikationsabwässern und die Oxidation und damit Entgiftung von chlorierten Aromaten und anderen Verbindungen. Auch auf diesem Gebiet gibt es zur Zeit keine befriedigenden Problemlösungen, da bei Enfärbungs- bzw. Ent giftung s versuchen bisher in in-vivo Pilzsystemen entweder mit freien oder immobilisierten Pilzen gearbeitet wurde. Es wurden nur in längeren Zeiten (Tagen) Resultate mit befriedigenden Abbau¬ bzw. Oxidationswerten erreicht.

Die vorliegende Erfindung hat sich nunmehr die Aufgabe gestellt. Verfahren zum Abbau von Lignin aus lignocellulosehaltigem Material und/oder Bleiche von lignocellulosehaltigem Material und zum enzymatischen Dei ken von Altpapier und zur Behandlung von Papierfabrikations- und Zeilstoffabrikations ^¬ abwässern zur Verfügung zu stellen, welches die zuvor genannten Nachteile nicht aufweist.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß aus Coriolus versicolor und anderen Laccasebildnern gewonnene Laccasen unter gleichzeitiger Zugabe und/oder Zudosage von nicht-aromatischen

Reduktions- und Oxidationsmitteln sowie solchen phenolischen Verbindungen und/oder nicht phenolischen Aromaten eingesetzt werden, die entweder die phenolischen und nicht phenolischen Strukturen des Lignins direkt durch die Wirkung dieser phenolischen und/oder nicht-phenolischen Aromaten oxidieren oder mitteis durch diese Verbindungen vermittelter Oxidation weiterer phenolischer und/oder nicht phenoiischer Verbindungen das

Lignin oxidieren.

Die deutschen Patentanmeldungen DE 3636208 (WO 88/03190). P 408893.6. P 408894.4 beschreiben zwar den £insatz von lignolytischen Enzymen unter gleichzeitigen Zudosierangen von Reduktions- und Oxidationsmitteln und anderen Red/Ox Stoffen (Salzen etc.). Der Hauptunterschied zu diesen Dokumenten ist aber der erweiterte Einsatz von Laccasen, d.h. Laccasen die durch den Zusatz bestimmter Substanzen {phenolische Aromaten. nicht-phenolische Aromaten) in ihrer Wirksamkeit erheblich erweitert sind und so das gesamte Ligninmolekül angreifen können und wie eine Ligninperoxidase wirken.

Erfindungs gemäß wird demnach Laccase v.a. von Coriolus versicoior benutzt. Diese Laccase wird zusammen mit Laccasesubstraten (phenoiische Verbindungen bzw. nicht-phenolischen Aromaten) und/oder Phenoiverbindungen und/oder nicht-phenolische Aromaten eingesetzt, wobei diese Verbindungen oxidiert werden, dann ihrerseits direkt Lignin als Red-/Ox-Meditatoren oxidieren oder durch zwischengeschaltete weitere Red-/Oχ-Meditatoren (phenolische Verbindungen oder nicht-phenolischen Aromaten, wie z.B. Veratrylalkohol) die Oxidation bewirken. Hiermit wird also bewirkt, daß Laccase. welche nur die phenolischen Bestandteile des Lignins angreift (diese umfassen nur ca. 1/3 der

Substrukturen). auch die nicht-phenolischen Substrukturen angreifen kann und so theoretisch zu einem vollständigen Abbau des gesamten Ligninmoleküls fähig ist. also ebenso wirkt wie eine Ligninperoxidase. Dabei müssen diese Red/Ox Systeme so zueinander "passen", daß wie in der Atmungskette der oxidierte Stoff als Oxidationsmittel für den nächsten Stoff wirkt und von diesem reduziert wird. Abb. 1 zeigt den Wirkmechanismus der Laccasen auf der a*u **+

Ebene der prosthetischen Gruppe (Cu _,-j Cu).

Abb. 1

2(Cu ^: " ^* ) Laccase + Phenol

2(Cu ⁺ ) Laccase + Radikal (I) + 2H

2(Cu ⁺ ) Laccase + 1/2 Qa+ H*-

2(Cu ^Sl ) Laccase + H _a O

Die Laccase catalvsiert die Bildung eines mesomeren Aryloxy-Radicais aus Phenol.

Ein Hauptvorteil im Gegensatz zu den in den obengenannten Patenten beschriebenen Verfahren für den Einsatz von Laccase ist die wesentlich vereinfachte Anzucht von Coriolus versicolor im Gegensatz zu den schwerer in größeren Fermentationsgefäßen anziehbaren Ligninpero.xidasenbildern v.a. Phanerochaete chrysosporium. Die eigenen Ausbeuten liegen mit einem speziellen Induktor bei ca. 20 Mill HI/1. Durch die Erweiterung der Laccasewirkung auf die Quasispezifität einer Ligninperoxidase

wird eine wirkliche großtechnische Nutzung dieser Enzyme erst möglich, stellt also einen erheblichen Vorteil dar. Ligninabbau- versuche mit Laccase alieine (d.h. ohne das oben beschriebene System mit Laccasen und zwischen Lignin und Enzym geschaltenen Red-/Ox-Meditatoren phenolischer oder nicht-phenolischer Art) mit Fichten/Holzschliff als Substrat mit einem Anfangs iigningehait ca. 27 % zeigen eine Delignifizierung bis maximal 22 % Restligningehalt, also um ca. 19 % Abbauversuche mit dem neuen System zeigen z.Z. einen Ligninabbau bis zu 16 % Restligningehalt. also um 41 %, d.h. um mehr als das Doppelte.

Durch Zusatz von Reduktions- und/oder Oxidationsmitteln. Salzen und/oder phenolischen Verbindungen wird erfindungs gemäß ein Redoxpotential von 200-600 mV eingestellt. Es kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mittels einer Red-Ox-Elektrode ermit¬ telt und mittels eines Reglers und Stellgliedes während der gesamten Reaktionszeit durch die Zugabe von Oxidations- und Reduktionsmitteln, Salzen und phenolischen Verbindungen konstant gehalten werden.

Als Oxidationsmittel werden vorzugsweise Luft, O _a oder Wasserstoffperoxyd eingesetzt. Als Reduktionsmittel kommen Natrium-Bisulfit. Ascorbinsäure. Dithionit und Thiolverbindungen in Frage.

Als Salze werden Metallsalze vorzugsweise eingesetzt. Hier kommen insbesondere FeSO^ . FeCl-^ . MnSO . . TiO _Ä , CuSO^ und Mn ₃ -Acetat in Betracht. Außerdem sei darauf hingewiesen, daß der Zusatz von Komplexbildne rn erfindungsgemäß bevorzugt wird. Als solche kommen beispielsweise Ethylendiamin-tetraessigsäure (EDTA) oder Diethylentriamin-penta-essigsäure (DTPA) zum Einsatz.

Zusätzlich zu den genannten Stoffen können der wässrigen zellstoffhaltigen Lösung weitere Substanzen zugesetzt werden. Als solche kommen NaOCl. Detergenzien und Polysaccharide in Frage. Hierzu zählen unter anderem nicht-ionische, ionische, anionische, kathionische und ampholytische Tenside sowie Glukane und Xanthane. Ferner ist es möglich, zusätzlich zu den lignolytischen Enzymen auch Hemizellulasen und/oder Pektinasen und/oder Lipasen zu verwenden.

Der Hauptunterschied zu der in der Arbeit "Oxidation of non phenolic Substrates" (FEBS 267, 1990. S.99-102) von R. Bourbonnais und M.G. Paice besteht u.a. in der völlig anderen Verfahrens führung durch die gleichzeitige Zudosage von Reduktions- und Oxidationsmitteln zur Bevorzugung der Depolymerisation des Lignins durch "Radikalabfangen" und Unterdrückung der Repolymerisation bei gleichzeitiger

Aufrechterhaltung der Reaktion durch Oxidationsmittel-Zuführung. Es ist bekannt, daß Laccasen auch mit H _a O _a wirken und daß bei bestimmten Substraten die Oxidationswirkung der Laccase durch Peroxid verstärkt ist (R. Blaich, Analytische Elektrophoreseverfahren. Thieme- Verlag 1978. S. 59).

Das erfindungs emäße System wird entweder mittels Laccase alleine oder mit Ligninperoxidasen und/oder Manganperoxidasen von z.B. Phanerochaete chrysosporium oder anderen Weißfäulepilzen zusammen eingesetzt. Bei dem letzteren. Ligninperoxidase (Manganperoxidasen) + Laccase. wird bei einem pH-Wert um 4-5 gearbeitet, bei dem beide Enzymspezies noch aktiv sind. Der eigentliche Ligninabbau. die Bleiche (mit Ligninabbau) oder der Quellvorgang beim enzymatischen Deinken. wird durch gleichzeitige Zudosage von Reduktions- und Oxidationsmitteln. d.h. durch Abfangen von beim Ligninabbau entstehenden Radikaien bewirkt. Oft ist ein gleichzeitiges Vorhandensein von bestimmten Metallsalzen wie Fe" ^1" ^ , Fe ^'•" .Cu , Ti ^3>+ von NaOCl ect.. wichtig ., die zu bestimmten Radikalen führen wie zum OH-Radikal (Fe ⁺ ~ ^" und/oder Ti ⁺ⁱ + H^C-^ ) , wie zum ° O -_H-Radikal (Ti ^und O _ώ ) oder zun Singulettsauerstoff (NaOCl + H _Ä O _Ä = NaCl + H _Ä O + O^ ) . die ihrerseits den Ligninabbau beschleunigen können. Auch das Vorhandensein von Polysacchariden, die z.T. vom Pilz selbst erzeugt werden oder aus Hefezellwänden stammen, die bei Mischkulturen zwischen Weißfäulepilz und Hefen anfallen und das Vorhandensein von bestimmten Detergenzien. die bei der Deiignifizierung und/oder Bleiche eine bessere Penetration des Enzyms zwischen die Fasern erlauben und beim Deinken für die Schäum- und Sammlerwirkung der

Druckfarbenteilchen unerlässlich sind, sind wichtige Hiifsstoffe. Beim Deinken kann ebenfalls ein zusätzliches Bleichsystem wie Formamidin- sulfinsäure (FAS)/NaOH wichtig sein, um die im chemischen System vorhandene Bleichwirkung von NaOH/H O zu kompensieren, und ebenfalls als Sammler der Zusatz von Seifen alleine oder in Kombination mit Detergenzien.

Beim enzymatischen Behandeln von Holzstoffabwässern (TMP/Holzschliff etc.) wird Laccase + Phenol oder nicht-phenolische Aromate eingesetzt. Hier ist durch den gezielten Einsatz von bestimmten Phenolen oder nicht-phenolischen Aromaten ohne Zusatz von Reduktionsmitteln, aber unter kontinuierlichen Zuführung von Oxidationsmitteln oder Luftsauerstoff) eine nahezu vollständige Polymerisation von im Abwasser enthaltenen Ligninen möglich, die weit (20-50 %) über die beim alleinigen Einsatz von Laccasen erreichbaren Werte hinausgehen. Hierdurch ist es möglich 70-90 % des Lignins durch Unlöslich-Werden und damit Auflocken, Sedimentieren, Filtrieren. Mikroflotieren etc. aus dem Abwasser zu entfernen und so den CSB drastisch bis zu 60-70 % zu senken.

A. Beispiel 1)

Beispiel: enzymatische Bleiche von Sulfatzellstoff

50 g atro Zellstoff (Sulfatzellstoff) werden in einem Rührgefäß bei 1 % Stoffdichte bei ca. 500 rpm und 40 ° C gerührt. Der pH-Wert wird mit 1 n HC1 auf pH 5 eingestellt. Es werden 0.1 - 1.5 % H^ O^ auf atro Stoff bezogen, ca. 0,1 % ETDA oder DTPA. 0.01 - 0,5 % KupferdDsulfat bezogen auf atro Stoff zugesetzt. Nach Zugabe von 500 - 8000 IU (1 IU •= Umsatz 1 μm Syringaladazin / min / ml Enzym) Laccase von Coriolus versicolor werden ca. 2 x 10 -3 % - 1 x 10 -1 % Veratrylalkohol und 0.01 - 0,1 % Naphtol pro atro Stoff zugegeben und der Bleichprozeß durch gleichzeitige Dosierung von H^O^ und Natrium-Bisulfit- Lösung in Gang gesetzt. Hierbei wird das Redoxpotential von ca. 400 mV ^" aufrechterhalten. Nachdem der Prozeß eingeleitet ist. wird dieser für 2-4 Stunden fortgesetzt. Die Steuerung und Regelung des Prozesses wird mittels einer Redox-Elektrode und einer Pumpen¬ steuerung durchgeführt.

C . Beispiel 2)

Delignifizierung von Holzstoffen (TMP)

1 g atro TMP (l%ig) in 100 ml Wasser wird mit 1 m HC1 auf pH 5 eingestellt. Es werden 8 lmoi Veratrylalkohol. 400 μmol H aQ-_ und 0.01 - 0,1 % Naphtol pro atro Stoff zugegeben. Als Zudosage (1 ml/Std.) werden gleichzeitig als Lösungen (je 9,80 mmolar) Natriumbisulfit und H ^O-^ zugegeben. Die Reaktion wird durch Zugabe von ca. 100 000 IU Enzym (Laccase von Coriolus versicolor) gestartet. Die Reaktionszeit beträgt 4 Stunden bei 40 ° C unter ca. 500 rpm Rührung.

D. Beispiel 3)

Beispiel: Enzymatisches Deinken mit Vorbehandlung

100 g atro Altpapier (50 % Zeitung/ 50 % Illustrierte) werden in 1 x 3 cm große Stücke zerrissen. Daraufhin werden 2 1 Wasser zugegeben (ca. 45 C) und der pH mit Alaun auf pH 7 - 7.5 eingestellt. Dann werden 80-8000 IU Laccasen (1 IU = Umsatz von 1 μmol Syringaldazin / min / ml Enzym, 8 μmol Veratrylalkohol und 0.05-0.6 % Detergenz als Sammler und 0.2-2 μl Na-Hydrogen- sulfitlösung (38-40 %) jeweils auf g atro Altpapierstoff bezogen zugegeben. Daraufhin wird 15 min. bei 3000 rpm im Desintegrator aufgeschlagen. Der Altpapierstoff wird dann bei ca. 45 ° C für 75 min. stehen gelassen oder sofort für 10-20 min. in einer kommerziellen 20 1 Flotationszelle flotiert.

Beispiel 4)

Enzymatische Behandlung von Holzstoffabwässern (TMP. Holzschliff u.a.)^? Polymerisation des vorhandenen Lignins.

250 ml ungefiltertes TMP- Abwasser wird mit 10-200000 IU Laccase pro I + 0.01 x 10 - 0.1 %Naphtol versetzt und unter Rühren und unter Zuführen von Luftsauerstoff 1-4 Stunden bei 20-50 °C inkubiert. Es tritt eine zum alleinigen Einsatz von Laccase erheblich gesteigerte Polymerisation des vorhandenen Lignins ein. welches unlöslich wird und durch Zugabe von geeigneten Flockungsmitteln wie Polyethyleniminen ect. entfernt oder durch Mikrofiltration. Zentrifugation oder Filtration entfernt werden kann.