PRODRUGS OF CYTOTOXIC ACTIVE AGENTS HAVING ENZYMATICALLY CLEAVABLE GROUPS

Title:

PRODRUGS OF CYTOTOXIC ACTIVE AGENTS HAVING ENZYMATICALLY CLEAVABLE GROUPS

Document Type and Number:

WIPO Patent Application WO/2018/114798

Kind Code:

Abstract:

The invention relates to prodrugs or conjugates of a new type, of general formula (Ia), in which formula La, n, R, and D have the meanings indicated in the description, said prodrugs or conjugates having a structural pattern reduced to an asparagine derivative as a cleaving site for tumor-associated proteases such as legumain, wherein cytotoxic active agents such as kinesin spindle protein inhibitors are released by legumain cleavage. The invention further relates to the use of said prodrugs or conjugates to treat and/or prevent diseases and to the use of said prodrugs or conjugates to produce drugs for treating and/or preventing diseases, in particular hyperproliferative and/or angiogenic diseases such as cancer diseases. By means of the reduction of the legumain-cleavable substrate peptide sequence to an asparagine derivative as a structural pattern, an increase in stability in the lysosomes of healthy organs is achieved together with high anti-tumor activity.

Inventors:

LERCHEN HANS-GEORG (DE)
REBSTOCK ANNE-SOPHIE (FR)
MARX LEO (FR)
WAGNER SARAH (DE)
STELTE-LUDWIG BEATRIX (DE)
DIETZ LISA (DE)
JOERISSEN HANNAH (DE)
MAHLERT CHRISTOPH (DE)
GREVEN SIMONE (DE)
SOMMER ANETTE (DE)

Application Number:

PCT/EP2017/083305

Publication Date:

June 28, 2018

Filing Date:

December 18, 2017

Export Citation:

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Assignee:

BAYER AG (DE)
BAYER PHARMA AG (DE)

International Classes:

A61K47/65; A61P35/00

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Attorney, Agent or Firm:

BIP PATENTS (DE)

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Claims:

Patentansprüche

Verbindungen der Formeln

in der

La für einen self-immolative linker steht, n 0 oder 1 ist;

D für -Di-(Lb)₀-(LIG)_P steht,

Di für ein cytotoxisches Agens steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht, o und p jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1 sind,

R für LIG-(L_c)e- steht, LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor auf einer Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lc für einen Linker steht und e 0 oder 1 ist oder

R für Zr(C=0)q- steht, q 0 oder 1 ist,

Zi für eine Ci-10-Alkyl-, C₅-io-Aryl-, Ce-io-Aryl-Ci-e-alkyl-, C3-10-

Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy-, C6-io-Aryl- Ci-6-alkoxy-, Cs-io-Heteroalkoxy-, C1-10- Alkyl-0-C6-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocyclo-alkoxy-Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -IM H2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)₂, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -S(=0)₃-H, -S(=0)₂-NH₂, -S(=0)₂-N(Alkyl)₂, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH₂, -C(=0)-N(Alkyl)₂ oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH₂)₀-i-O_x-(CH₂CH₂O)_v-R¹ oder

-O_x-(CH₂CH₂0)_v-R¹ steht,

0 oder 1 ist eine Zahl von 1 bis 20 ist und für -H, -Alkyl, -CH₂-COOH, -CH₂-CH₂-COOH oder

-CH₂-CH₂-NH₂ steht.

2. Verbindungen der allgemeinen Formel (III')

(ΙΝ'), in der n, e, LIG, La, Lc, und Di die in der allgemeinen Formel (la) angegeb Bedeutungen haben.

Verbindungen der allgemeinen Formel (IV)

(iv), in der n, o, LIG, La, Lb und Di die in der allgemeinen Formel (la) angegebenen Bedeutungen haben und

R für Zr(C=0)q- steht, q 0 oder 1 ist,

Zi für eine Ci-10-Alkyl-, Cs-io-Aryl-, C6-io-Aryl-Ci-6-alkyl-, C3-io-Heteroalkyl-, Ci- io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Cs-io-Heteroaryl- Ci-6-alkyl-, Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy-, C6-io-Aryl- Ci-6-alkoxy-, Cs-io-Heteroalkoxy-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryloxy-, C5-10- Heterocyclo-alkoxy-Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH₂, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)₂, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)- C(=0)-Alkyl, -S(=0)₃-H, -S(=0)₂-NH₂, -S(=0)₂-N(Alkyl)₂, -COOH, -C(=0)-, C(=0)NH₂, -C(=0)-N(Alkyl)₂ oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH₂)₀-i-O_x-(CH₂CH₂O)_v-R¹ oder -O_x-(CH₂CH₂0)_v-R¹ steht, x 0 oder 1 ist v eine Zahl von 1 bis 20 ist und H, -Alkyl, -CH₂-COOH, -CH₂-CH₂-COOH, oder

-CH2-NH2 steht.

4. Verbindungen der allgemeine Formel (la), gemäß Anspruch 1 , in der La für einen self-immolative linker steht, n 0 oder 1 ist;

D für -Di-(Lb)₀-(LIG)_P steht, o und p 0 sind,

Di für ein cytotoxisches Agens steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht,

R für LIG-(Lc)_e- steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor auf einer Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lc für einen Linker steht und e 0 oder 1 ist.

5. Verbindungen der allgemeine Formel (la), gemäß Anspruch 1 , in der La für einen self-immolative linker steht, n 0 oder 1 ist; D für -Di-(Lb)₀-(LIG)_P steht, o 0 oder 1 p 1 ist,

Di für ein cytotoxisches Agens steht, LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht,

R für Zr(C=0)q- steht, q 0 oder 1 ist,

Zi für eine Ci-10-Alkyl-, C₅-io-Aryl-, Ce-io-Aryl-Ci-e-alkyl-, C3-10-

Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, C5-io-Heteroaryl-Ci-6-alkyl-, Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy-, Ce-io-Aryl-Ci-e-alkoxy-, C5-10- Heteroalkoxy-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocyclo-alkoxy-

Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -IMH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)₂, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -S(=0)₃-H, -S(=0)₂-NH₂, -S(=0)₂-N(Alkyl)₂, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH₂, -C(=0)-N(Alkyl)₂ oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH₂)₀-i-O_x-(CH₂CH₂O)_v-R¹ oder

-O_x-(CH₂CH₂0)_v-R¹ steht, x 0 oder 1 ist v eine Zahl von 1 bis 20 ist und

R¹ für -H, -Alkyl, -CH₂-COOH, -CH₂-CH₂-COOH, oder

-CH₂-CH₂-NH₂ steht.

6. Verbindungen der allgemeinen Formel (la), gemäß den Ansprüchen 1 und 5, wobei q für 1 steht.

7. Verbindungen der allgemeinen Formel (la), gemäß den Ansprüchen 1 und 5, wobei Zi für eine Ci-10-Alkyl-, C6-io-Aryl-Ci-6-alkyl-, C5-io-Heteroaryl-Ci-6-alkyl-, C6-io-Aryl-Ci- 6-alkoxy- oder Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-Gruppe dar, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH₂, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)₂, -NH-C(=0)- Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -S(=0)₃-H, -S(=0)₂-NH₂, -S(=0)₂-N(Alkyl)₂, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH₂, -C(=0)-N(Alkyl)₂ oder -OH substituiert sein kann.

8. Verbindungen der allgemeinen Formel (la), gemäß den Ansprüchen 1 und 5, wobei Zi für eine Ci-3-Alkyl-, C6-7-Aryl-Ci-6-alkyl-, C5-6-Heteroaryl-Ci-3-alkyl-, oder C6-7-Aryl-Ci-6-alkoxy-Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -COOH, -C(=0)- oder -OH substituiert sein kann.

9. Verbindungen gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Linker -Lb- bzw. -Lc- an eine Cystein-Seitenkette bzw. einen

Cysteinrest des Binders gebunden ist und die allgemeinen Grundstrukturen (i) und

(i) -(C=0)_m -(L1 )n-(L2)_n- und

-(C=0)_m -L1 -SG-L2 aufweist, in denen

m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,

SG eine chemisch oder enzymatisch in vivo spaltbare Gruppe

(insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; oder eine mit Legumain, Cathepsin oder Plasmin spaltbare 2-8- Oligopeptidgruppe) ist,

L2 für eine Einfachbindung oder für die Gruppe

steht, wobei

#¹ die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, #² die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, L1 für -(NR¹ °)_n-(G1 )o-G2- steht, R^{1 0} für -H oder Ci-C₃-Alkyl steht,

G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH₂)o-₃-C(=0)-NH- steht, n 0 oder 1 ist, o 0 oder 1 ist,

G2 für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte

Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2, NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH₂-C(=0)-NH₂), -Nme-, -NHNH-, - S(=0)₂-NHNH-, -NH- C(=0)-, -C(=0)-NH-, -C(=0)-NHNH-, einen 5 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, - NH2, -NH-CNIMH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen

darstellt, wobei

Rx für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht.

10. Verbindungen gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Linker -Lb- bzw. -Lc- an eine Lysin-Seitenkette bzw. einen Lysinrest des Binders gebunden ist und die allgemeine Grundstrukturen (i) und (ii)

(i) -(C=0)_m -(L1 )_n-(L4)_n-(C=0)-§§

und

(ii) -(C=0)_m -L1 -SG-L4-(C=0)-§§ aufweist, in denen

m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,

SG eine chemisch oder enzymatisch in vivo spaltbare Gruppe

(insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; oder eine mit Legumain, Cathepsin oder Plasmin spaltbare 2-8- Oligopeptidgruppe) ist,

L1 für -(NR¹ °)_n-(G1 )o-G2- steht,

R^{1 0} für -H oder Ci-C₃-Alkyl steht,

G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH₂)o-₃-C(=0)-NH- steht, n 0 oder 1 ist, o 0 oder 1 ist, für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte

Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, - S(=0)-, -S(=0)₂, -NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH₂-C(=0)- NH₂), -N Me-, -S(=0)₂-NHNH-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, - C(=0)-NHNH-, einen 5 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)₂-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, -NH-CNNH₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen

darstellt, wobei

für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht, für eine Einfachbindung oder eine Gruppe

steht,

0 oder 1 ist und

-C(=0)-NHNH-, -CH(COOH)- und einen 5 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, S(=0) oder S(=0)₂ unterbrochen sein kann, wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)- NH2, -COOH, -OH, -NH-CN-NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können

die Verknüpfungsstelle mit dem Stickstoffatom eines Lysinrestes des Binders ist.

Verbindungen der allgemeinen Formel (la), gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei L1 für eine in der folgenden Tabelle aufgeführte Gruppe steht, wobei r eine Zahl von 0 bis 20, vorzugsweise von 0 bis 15, insbesondere bevorzugt von 0 bis 10 ist:

/-CH₂-C(=0)-/

12. Verbindungen der allgemeinen Formel (la), gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei L2 folgende Strukturen

aufweist, in denen

#¹ die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers

kennzeichnet,

#² die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und

-COOH, -C(=0)-OR, -C(=0)R, -C(=0)-NHR oder -C(=0)N(R)₂ steht und

R für Ci-s-Alkyl- steht.

13. Verbindungen der allgemeinen Formel (la), gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der self-immolative linker La für eine der folgenden Gruppen steht, und wobei

#1 für die Bindung zur Carbonylgruppe in der Formel (la) steht und

#2 für die Bindung zur Hydroxyl- bzw. Aminogruppe von Di des cytotoxischen Agens steht.

14. Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das cytotoxische Agens Di einen Wirkstoff darstellt, der ausgewählt ist aus Mitomycin, Doxorubicin, Aminopterin, Actinomycin, Bleomycin, 9-Amino- Camptothecin, n8-Acetyl-spermidin, 1 -(2-Chloroethyl)-1 ,2-dimethansulfonyl- hydrazid, Tallysomycin, Cytarabin, Etoposid, Camptothecin, Taxol, Esperamicin, Podophyllotoxin, Anguidin, Vincristin, Vinblastin, Morpholin-doxorubicin, n-(5,5- diacetoxy-pentyl)-doxorubicin, Duocarmycin, Auristatin, Monomethylauristatin, Dolastatin, Tubulysin, Maytansinoid, Cryptophycin, Amanitine,

Indolinobenzodiazepine, Pyrrolobenzodiazepin-Derivate, Calicheamicin,

Daunorubicin, Camptophecin DX8951 (Exatecan) oder einen Kinesin Spindel Protein-Inhibitor (KSP-lnhibitor), wobei der Wirkstoff über seine Hydroxyl- oder Aminogruppe an La (bei n=1 ) oder die Carbonylgruppe (bei n=0) gemäß Formel (la) gebunden ist.

15. Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das cytotoxische Agens Di als Wirkstoff ein KSP-lnhibitor ist.

16. Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der KSP-lnhibitor eine Verbindung der folgenden Formel (IIa)

(IIa) ist, in der

x₂ für N und

Xs für C steht,

oder

x₂ für C und

Xs für N steht,

oder

x₂ für C und

Xs für N steht,

oder

X₂ für C und

Xs für C steht,

oder

x₂ für N und

Xs für C steht.

A für -C(=0)-, -S(=0), -S(=0)₂-, oder -S(=0)₂-NH- steht, für -H, -L-#1 , -MOD oder -(CH₂)o-₃Z steht,

für -H, -NHY³, -OY³, -SY³, Halogen, -C(=0)-NY¹Y², oder

-C(=0)-OY³ steht,

unabhängig voneinander für -H, -IMH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z' oder -CH(CH₂W)Z' stehen,

für -H oder -(CH₂)o-3Z' steht,

für -H, -IMH2, -S(=0)₃H, -COOH,

-NH-C(=0)-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH oder

-(C(=0)-NH-CHY⁴)i_-3COOH steht,

für -H oder -OH steht,

für lineares oder verzweigtes Ci-6 Alkyl steht, das gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2 substituiert ist, oder für Aryl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls mit -IMH2 substituiert ist, für -H, -L-#1 , -MOD, -C(=0)-CHY⁴-NHY⁵ oder -(CH₂)o-₃Z steht, für -H, Halogen, -OY³, -SY³, -NHY³, -C(=0)-NY¹Y², oder

-C(=0)-OY³ steht,

unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H oder -(CH₂)o-3Z' steht,

für -H, -S(=0)₃H, -IMH2 oder -COOH steht,

für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht, das gegebenenfalls mit -NHC(=0)-NH2 substituiert ist, oder für Aryl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls mit -IMH2 substituiertes ist,

für-H oder -C(=0)-CHY⁶-NH₂ steht,

für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht,

für -MOD, -L-#1 , oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-,

Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl-

Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei

Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten

Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH-

Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl

Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei

-NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl-

Gruppen, ein bis drei -S(=0)_n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei

-S(=0)₂-NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können, n 0, 1 oder 2 ist, Z für -H, Halogen, -OY³, -SY³, -NHY³, -C(=0)-NY¹Y² oder -C(=0)-OY³ steht,

Y¹ und Y² unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,

Y³ für -H, -(CH₂)o-3-CH(N HC(=0)CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH₂)Z' oder

-(CH₂)o-₃Z' steht,

Z' für -H, -S(=0)₃H, -NH₂ oder -COOH steht,

R⁴ für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la') steht, R⁵ für -H, -IMH2, -NO2, Halogen, -CN, CF₃, -OCF₃, -CH₂F, -CH₂F, -SH oder -(CH₂)o-3Z steht,

Z für -H, -OY³, -SY³, Halogen, -NHY³, -C(=0)-NY¹Y², oder -C(=0)- OY³ steht,

Y¹ und Y² unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,

Y³ für -H oder -(CH₂)o-3Z' steht,

Z' für -H, -S(=0)₃H, -NH₂ oder -COOH steht,

R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,

C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2-10- Alkinyl-, Hydroxy-, -NO2, -NH2, -COOH oder Halogen stehen, R⁸ für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,

C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-10- Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl-, Fluor-C4-io-Cycloalkyl- oder -(CH₂)o-₂-(HZ²) steht,

HZ² für einen 4 bis 7-gliedrigen Heterocyclus mit bis zu zwei

Heteroatome, ausgewählt aus N , O und S steht, der mit -OH, -COOH, -NH2 oder -L-#1 substituiert sein kann, R⁹ für -H, -F, -CH₃, -CF₃, -CH₂F oder -CHF₂ steht, -L-#1 für -(Lb)₀-(LIG)_P steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht,

o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen,

-MOD für -(NR¹⁰)_n-(G1 )₀-G2-G3 steht,

R¹⁰ für -H oder Ci-C₃-Alkyl- steht,

G1 für -NH-C-(=0)- , -C(=0)-NH- oder \ /^{N CO} _steht, n 0 oder 1 ist;

o 0 oder 1 ist und

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach durch

-O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)₂-, -NRY-, -NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-,

-NRYNRY-, -S(=0)₂-NRYNRY-, -C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-,

-CR^x=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2,

-COOH, -OH, -NH₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

R^y für -H, Phenyl-, C-| -C-|o-Alkyl-, C2-C-| 0"Alkenyl- oder C2-C-| Q-

Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, -NH₂,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,

Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,

G3 für -H oder -COOH steht und

-MOD mindestens eine, vorzugsweise zwei -COOH Gruppen aufweist und eine Aminogruppe in -MOD mit der Legumain-spaltbaren Gruppe der Formel (la') acyliert sein kann, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.

17. Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), gemäß Anspruch 16, in der

X₃ für N steht,

A für -C(=0)- steht,

R¹ für -L-#1 , -H, oder -MO D steht

-L-#1 für -(Lb)₀-(LIG)_P steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht, o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen,

-MOD für die Gruppe -(NR¹⁰)_n-(G1 )₀-G2-G3 steht,

R¹⁰ für -H oder Ci-C₃-Alkyl- steht, n 0 oder 1 ist,

G1 für -NH-C-(=0)- oder -C(=0)-NH- steht, o 0 oder 1 ist und

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)₂-, -NRY-,

-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)₂-NRYNRY-, -C(=0)-NR^vNRy-, -C(=0)-, -CR^x=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,

-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, -NH₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsaure substituiert sein kann,

R^y für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-10-

Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, -NH₂,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsaure substituiert sein können,

Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,

G3 für -H oder -COOH steht

R² für -H,

R³ für -MOD, -L-#1 , oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-,

Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei

Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH-

Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -S(=0)_n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei

-S(=0)₂-NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei

-N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können, n 0, 1 oder 2 ist,

Z für -H, Halogen, -OY³, -SY³, -NHY³, -C(=0)-NY¹Y² oder -C(=0)-OY³ steht,

Y¹ und Y² unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,

Y³ für -H, -(CH₂)o-3-CH(N HC(=0)CH3)Z>(CH2)o-3-CH(NH₂)Z' oder -(CH₂)o-₃Z' steht,

Z' für -H, -S(=0)₃H, -IMH2 oder -C(=0)-OH steht,

R⁴ für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la')

steht,

R⁵ für -H steht, R⁶ und R⁷ für Fluor stehen,

R⁸ für t-Butyl steht,

R⁹ für -H steht,

-L-#1 für -(Lb)₀-(LIG)_P steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht,

o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.

Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), gemäß den Ansprüch

und 17, in der

X₂ für C und

X₃ für N steht,

A für -C(=0)- steht, R¹ für -L-#1 , -H, oder -MO D steht für -(Lb)₀-(LIG)_P steht, für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird, für einen Linker steht, unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, für die Gruppe -(NR¹⁰)_n-(G1 )₀-G2-G3 steht, für -H oder Ci-C₃-Alkyl- steht,

für -C(=0)-NH- steht, 1 ist und für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -NRY- oder -C(=0)- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte

Kohlenwasserstoff kette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -C(=0)-NH2, -COOH, substituiert sein kann,

für -H oder C-| -C ₀-Alkyl- steht, das mit -NH-C(=0)-NH₂, -COOH,

-OH, -IMH2, substituiert sein kann, für -COOH steht für -H, für-L-#1 steht, R⁴ für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la')

steht,

R⁵ für -H steht,

R⁶ und R⁷ für Fluor stehen,

R⁸ für t-Butyl steht,

R⁹ für -H steht,

-L-#1 für -(Lb)₀-(LIG)_P steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht,

o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.

19. Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa')

(IIa'),

in der

Xi für N, für N und

für C steht, für N,

für C und

für N steht, für CH oder CF,

für C und

für N steht, für NH,

für C und

für C steht, für CH,

für N und

für C steht. für die Gruppe *-C(=0)-(CH₂)_x-S-CH₂-CH(COOH)-NH-^** steht, für 1 oder 2 steht, für die Bindung an das Wirkstoffmolekül steht, für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la') steht, für -MOD steht, für die Gruppe -(NR¹⁰)_n-(G1 )₀-G2-G3 steht, für -H oder Ci-Cs-Alkyl- steht, 0 ist, für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist,

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)₂-, -NRY-,

-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)₂-NRYNRY-,

-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CR^x=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,

-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, -NH₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

R^y für -H, Phenyl-, C-| -C-|o-Alkyl-, C2-C-| 0"Alkenyl- oder C2-C-| Q-

Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, -NH₂,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,

Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,

G3 für -H oder -COOH steht

R² für -H steht,

R³ für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la')

steht,

R⁴ für -H steht,

R⁵ für -H, -NH₂, -N0₂, Halogen, -CN, CF₃, -OCF₃, -CH₂F, -CH₂F, -SH oder -(CH₂)₀-₃Z steht,

Z für -H, -OY³, -SY³, Halogen, -NHY³, -C(=0)-NY¹Y², oder -C(=0)-

OY³ steht,

Y¹ und Y² unabhängig voneinander für -H, -NH₂, oder -(CH₂)o-3Z' stehen,

Y³ für -H oder -(CH₂)o-₃Z' steht,

Z' für -H, -S(=0)₃H, -NH₂ oder -COOH steht, unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl, C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2-10- Alkinyl-, Hydroxy-, -NO2, -N H2, -COOH oder Halogen stehen,

R⁸ für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,

C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-10-

Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl- oder Fluor-C4-io-Cycloalkyl- steht,

R⁹ für -H, -F, -CH₃, -CF₃, -CH₂F oder -CHF₂ steht, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.

20. Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa'), gemäß Anspruch 19, in der

X₃ für N steht,

A für die Gruppe ^*-C(=0)-(CH₂)x-S-CH₂-CH(COOH)-NH-^** steht, x für 1 oder 2 steht,

^* für die Bindung an das Wirkstoffmolekül steht,

^** für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der

Formeln (la') steht,

R¹ für -MOD steht,

-MOD für die Gruppe -(NR¹⁰)_n-(G1 )₀-G2-G3 steht,

R¹⁰ für -H oder Ci-C₃-Alkyl- steht, n 0 ist, G1 für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist, für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)₂-, -NRY-,

-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)₂-NRYNRY-,

-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CR^X=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,

-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, -NH₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

für-H, Phenyl-, C-|-C-|o-Alkyl-, C2-C-|0"Alkenyl- oder C2-C-|Q-

Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, -NH₂,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,

für -H, C-|-C3-Alkyl- oder Phenyl- steht, für-H oder -COOH steht für-H steht, für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la) steht, für-H steht, für-H steht, für Fluor stehen, für t-Butyl steht und für -H steht, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate. Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa")

la"),

in der

x₂ für N und

Xs für C steht,

oder

x₂ für C und

Xs für N steht,

oder

x₂ für C und

Xs für N steht,

oder

X₂ für C und

Xs für C steht,

oder

x₂ für N und

Xs für C steht.

A für -C(=0)-, -S(=0), -S(=0)₂-, oder -S(=0)₂-NH- steht, für die Gruppe ^* - (G1 )₀-G2-NH- ^** steht,

^* für die Bindungsstelle an das Wirkstoffmolekül (cytotoxisches

Agens) steht,

^** für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der

Formeln la' steht, G1 für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist,

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)₂-, -NRY-,

-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)₂-NRYNRY-,

-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CR^x=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,

-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, -NH₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

R^y für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-| Q-

Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, -NH₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,

Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,

R² für -H steht, R³ für eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-,

Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl-Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH- Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei - NH-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)_n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)₂-NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei Nh -Gruppen oder ein bis drei (CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können,

0, 1 oder 2 ist, für -H, Halogen, -OY³, -SY³, -NHY³, -C(=0)-NY¹Y² oder -C(=0)-OY³ steht,

unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H, -(CH₂)o-3-CH(N HC(=0)CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH₂)Z' oder -(CH₂)o-₃Z' steht,

für -H, -S(=0)₃H, -NH₂ oder -COOH steht,

R⁴ für -H steht,

R⁵ für -H, -IMH2, -NO2, Halogen, -CN, CF₃, -OCF₃, -CH₂F, -CH₂F, -SH oder -(CH₂)o-3Z steht,

Z für -H, -OY³, -SY³, Halogen, -NHY³, -C(=0)-NY¹Y², oder -C(=0)-

OY³ steht,

Y¹ und Y² unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,

Y³ für -H oder -(CH₂)o-₃Z' steht,

Z' für -H, -S(=0)₃H, -NH₂ oder -COOH steht,

R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,

C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2-10-

Alkinyl-, Hydroxy-, -NO2, -NH2, -COOH oder Halogen stehen,

R⁸ für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,

C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-10- Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl- oder Fluor-C4-io-Cycloalkyl- steht,

R⁹ für -H, -F, -CH₃, -CF₃, -CH₂F oder -CHF₂ steht, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.

22. Verbindungen der allgemeinen Formel (II"), gemäß Anspruch 21 , in der

X₃ für N steht,

A für -C(=0)- steht, für die Gruppe ^* - (G1 )₀-G2-NH- ^** steht, für die Bindungsstelle an das Wirkstoffmolekül (cytotoxisches Agens) steht,

^** für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der

Formeln (la') steht,

G1 für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist,

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)₂-, -NRY-,

-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0)₂-NRYNRY-,

-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CR^x=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,

-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, -NH₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

R^y für -H, Phenyl-, C-| -C-|o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-10-

Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, -NH₂,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,

Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht, R² für -H steht, R³ für -CH₂-OH steht,

R⁴ für -H steht,

R⁵ für -H steht,

R⁶ und R⁷ für Fluor stehen,

R⁸ für t-Butyl steht und

R⁹ für -H steht,

sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.

Verbindungen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Linker Lb bzw. Lc an eine Cystein-Seitenkette bzw. einen Cysteinrest des Binders gebunden ist und die folgende Formel aufweist: wobei

m 0 oder 1 ist,

n 0 oder 1 ist

§ für die Bindung an das Wirkstoffmolekül bzw. die Legumain spaltbare Gruppe der Formel (la') steht und

§§ für die Bindung an den Binder steht,

-L2 für die Gruppe

oder für eine Bindung steht, wobei

G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH₂)o-3-C(=0)-NH- steht, n 0 oder 1 ist, o 0 oder 1 ist,

G2 für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte

Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, - S(=0)₂, -NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH₂-C(=0)-NH₂), -Nme-, - NHNH-, -S(=0)₂-NHNH-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -C(=0)-NHNH-, einen 5 bis l Ogliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)₂-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, - NH₂, -NH-CNNH₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen darstellt, wobei

Rx für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht.

24. Verbindungen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Linker Lb und/oder Lc an eine Lysin-Seitenkette bzw. einen Lysinrest des Binders gebunden ist und die folgende Formel

§-(C=0)_m-L1 -(L4)_n-C=0-§§

aufweist, in der m 0 oder 1 ist,

n 0 oder 1 ist,

§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül bzw. die Legumain spaltbare

Gruppe der Formel (la') steht und

§§ die Bindung an ein Stickstoffatom des Binders darstellt,

L1 für -(NR¹ °)_n-(G1 )o-G2- steht,

R^{1 0} für -H oder Ci-C₃-Alkyl steht,

G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH₂)o-₃-C(=0)-NH- steht, n 0 oder 1 ist, o 0 oder 1 ist, für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte

Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, - S(=0)-, -S(=0)₂, -NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH₂-C(=0)- NH₂), -NMe-, -S(=0)₂-NHNH-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, - C(=0)-NHNH-, einen 5 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)₂-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, -NH-CNNH₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen

darstellt, wobei

für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht,

für eine Einfachbindung oder eine Gruppe

steht,

0 oder 1 ist und

für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)₂-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -S(=0)₂-NHNH-, -C(=0)-NHNH-, - CH(COOH)- und einen 5 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, S(=0) oder S(=0)₂ unterbrochen sein kann, wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH₂, -COOH, -OH, -NH-CN-NH₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können.

Verbindungen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei L2 für eine oder beide der folgenden Formeln

steht, wobei

#¹ für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binder steht, #² für die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 steht, R22 für -COOH steht und die Bindungen an das Schwefelatom des Binder zu über 80 %, (bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Binder) in einer dieser beiden Formeln vorliegen.

26. Verbindungen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Binder ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment ist und wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment über einen Cystein-Rest (AK1), einen Lysin-Rest (AK2) oder einen Glutamin-Rest (AK3) gebunden ist. 409

412

413

414

415

416

417

418

419

und

in denen

AKi und AK2 für einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment steht, und

n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 20, besonders

bevorzugt 2 bis 8 und insbesondere 2 bis 6 steht.

Verbindung oder Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindendes Antikörperfragment an ein extrazelluläres Krebs-Zielmolekül bindet.

Verbindung oder Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindendes Antikörperfragment nach Bindung an sein extrazelluläres Zielmolekül auf der Zielzelle durch die Bindung von der Zielzelle internalisiert.

30. Verbindung oder Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Antikörper ein anti-HER2-Antikörper, ein anti-EGFR- Antikörper, anti-B7H3-Antikörper, ein anti-TWEAKR-Antikörper, oder ein Antigen- bindendes Antikörperfragment von diesen ist.

Verbindung oder Konjugat nach Anspruch 30 wobei der anti-TWEAKR-Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP-7006, TPP-7007 und TPP-10337, der anti-B7H3-Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und der anti- HER2-Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trastuzumab und TPP-1015 ist.

Verbindung oder Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Antikörper (AK, AK1 , AK2, AK3)

(i) für einen anti-EGFR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 3 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 - Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 7 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 8,

(ii) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 13 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 14, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 - Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 16, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 17 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 18,

(iii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 23 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 28,

(iv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 32, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 33 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 34, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 36, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 37 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 38,

(v) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 42, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 43 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 44, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 46, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 47 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 48,

(vi) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 52, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 53 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 54, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 56, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 57 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 58,

(vii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 62, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 63 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 64, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 66, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 67 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 68,

(viii) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 72, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 73 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 74, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 - Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 76, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 77 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 78, (ix) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 82, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 83 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 84, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 - Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 86, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 87 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 88,

(x) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 92, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 93 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 94, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 - Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 96, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 97 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 98,

(xi) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 102, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 103 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 104, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 - Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 106, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 107 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 108,

(xii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 13 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 14, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 16, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 17 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L- CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 18,

(xiii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 122, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 123 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 124, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 126, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 127 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L- CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 128,

(xiv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 132, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 133 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 134, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 136, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 137 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L- CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 138,

(xv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 142, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 143 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 144, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 146, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 147 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L- CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 148, oder

(xvi) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 152, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 153 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 154, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 156, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 157 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L- CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 158 steht, oder für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen Antikörpern steht.

33. Verbindung oder Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden

Ansprüche, wobei der Antikörper (AK, AK1 , AK2, AK3)

(i) für einen anti-EGFR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 5,

(ii) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 15,

(iii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 21 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 25,

(iv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 31 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 35, (v) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 41 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 45,

(vi) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 51 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 55,

(vii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 61 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 65,

(viii) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 71 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 75,

(ix) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 81 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 85,

(x) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 91 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 95,

(xi) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 101 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 105,

(xii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 1 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 15,

(xiii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 121 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 125, (xiv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 131 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 135,

(xv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 141 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 145, oder

(xvi) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 151 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 155 steht, oder für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen Antikörpern steht.

34. Verbindung oder Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden

Ansprüche, wobei der Antikörper (AK, AK1 , AK2, AK3)

(i) für einen anti-EGFR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 9 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 10,

(ii) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 20,

(iii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 29 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 30,

(iv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 39 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 40,

(v) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 49 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 50, (vi) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 59 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 60,

(vii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 69 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 70,

(viii) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 79 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 80,

(ix) für einen anti-HER2 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 89 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 90,

(x) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 99 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 100,

(xi) für einen anti-B7H3 Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 109 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 10,

(xii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 19 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 120,

(xiii) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 129 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 130,

(xiv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 139 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 140, (xv) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 149 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 150, oder

(xvi) für einen anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 159 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 160 steht, oder für ein Antigen-bindendes Fragment von diesen Antikörpern steht.

Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in Kombination mit einem inerten, nicht-toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff.

36. Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur

Verwendung in einem Verfahren Behandlung und/oder Prophylaxe von

Krankheiten.

37. Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur

Verwendung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von

hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen.

38. Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur

Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Krebs und Tumoren.

39. Verbindung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur

Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Krebs und Tumoren in Kombination mit einem oder mehreren therapeutischer Ansätzen zur Krebs- Immuntherapie oder mit einem oder mehreren Wirkstoffen gerichtet gegen ein molekulares Target aus der Krebs-Immuntherapie.

Description:

Prodrugs von cytotoxischen Wirkstoffen mit enzymatisch spaltbaren Gruppen Einleitung und Stand der Technik

Die Erfindung betrifft neuartige Prodrugs, bei denen cytotoxische Wirkstoffe wie z.B. Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren mit Gruppen konjugiert werden, die selektiv von

Tumor-assoziierten Proteasen abgespalten werden und so den Wirkstoff freisetzen, sowie die Verwendung dieser Prodrugs bzw. Konjugate zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten sowie die Verwendung dieser Prodrugs zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyper- proliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie beispielsweise Krebserkrankungen. Solche Behandlungen können als Monotherapie oder auch in Kombination mit anderen Arzneimitteln oder weiteren therapeutischen Maßnahmen erfolgen.

Krebszellen exprimieren häufig bestimmte Proteasen in stärkerem Maße als normale Zellen. Dies hat zu Ansätzen zur Erhöhung der Selektivität von cytotoxischen Wirkstoffen für Krebszellen geführt, bei denen die Wirkstoffe mit Gruppen verbunden werden, die von solchen Proteasen abgespalten werden, wodurch der Wirkstoff freigesetzt wird.

Eine solche Tumor-assoziierte Protease ist Legumain. Legumain ist eine Asparaginyl- Endopeptidase (S. Ishii, Methods Enzymol. 1994, 244, 604; J. M. Chen et al. J. Biol. Chem. 1997, 272, 8090) und wurde zur Prozessierung von Prodrugs von kleinen cytotoxischen Molekülen wie zum Beispiel unter anderem von Doxorubicin und Etoposid Derivaten genutzt (W. Wu et al. Cancer Res. 2006, 66, 970; L.Stern et al; Bioconjugate Chem. 2009, 20, 500; K.M. Bajjuri et al. ChemMedChem 201 1 , 6, 54).

In der US 2015-0343083 A1 werden Legumain-spaltbare Peptid-Wirkstoff-Konjugate der Formel R-Y-Z-Asn-Linker-D beschrieben, in der Linker für p-Aminobenyzyl carbamoyl oder p-Aminobenzyl carbonat steht, R ein aus unterschiedlichen chemischen Gruppen ausgewählter Rest ist, D ein cytotoxischer Wirkstoff ist, Asn die Aminosäure Asparagin ist, Y eine Aminosäure ausgewählt aus Ala, Thr, Ser, Leu, Arg, Pro, Val, Tyr und Phe ist und Z eine Aminosäure ausgewählt aus Ala, Thr, Asn und Pro ist, wobei diese

Aminosäuren stets in der natürlichen L-Konfiguration vorliegen.

Alle bisher beschriebenen Legumain-spaltbaren Prodrugs enthalten als Legumain- Substrat eine Oligopeptidsequenz. Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Tumorselektivität von cytotoxischen Wirkstoffen noch weiter zu verbessern. Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die Erfindung Prodrugs von cytotoxischen Wirkstoffmolekülen bereit. Hierbei ist an das Wirkstoffmolekül eine durch das Enyzm Legumain spaltbare Gruppe konjugiert, wobei der Wirkstoff und die durch Legumain spaltbare Gruppe entweder direkt über eine kovalente Bindung oder über einen self-immolative linker verbunden sind. Diese Prodrugs enthalten vorzugsweise einen Binder, der nach Bindung an einen Rezeptor einer Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär (vorzugsweise lysosomal) prozessiert wird. Dieser Binder kann entweder mit dem mit der Legumain-spaltbaren Gruppe modifizierten

Wirkstoffmolekül gegebenenfalls über einen Linker verbunden sein, so daß zur Bildung eines aktiven Metaboliten beide Gruppen (Legumain spaltbare Gruppe und Binder) unabhängig voneinander prozessiert werden müssen, oder der Binder kann mit der durch das Enyzm Legumain spaltbaren Gruppe gegebenenfalls über einen Linker verbunden sein (so dass nach Spaltung der Legumain-spaltbaren Gruppe der Wirkstoff getrennt von dem Binder bzw. einem Derivat hiervon vorliegt). Als Wirkstoffmolekül wird ein Kinesin Spindel Protein-Inhibitor (KSP-lnhibitor) bevorzugt. Als Binder, der nach Bindung an einen Rezeptor auf einer Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär

(vorzugsweise lysosomal) prozessiert wird, wird ein Antikörper bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs), wobei Antikörper und Wirkstoff über einen Linker, der eine Legumain spaltbare Gruppe aufweist, miteinander verbunden sind. Zudem sind bevorzugt Konjugate von Prodrugs mit Antikörpern (APDCs), wobei der Antikörper mit einem Prodrug des Wirkstoffs über einen Linker verbunden ist und wobei die Wirkung des Wirkstoffs durch eine Legumain spaltbare Gruppe maskiert ist. Die erfindungsgemäß verwendetet^ Legumain spaltbare Gruppe, die mit dem Wirkstoff verbunden ist, weist ein auf die Aminosäure Asparagin reduziertes Strukturmotif auf. Durch diese Reduktion wird bedingt durch eine verlangsamte Spaltung durch Legumain eine Erhöhung der Stabilität in den Lysosomen von gesunden Organen erreicht ohne dass jedoch die hohe anti-Tumorwirkung beeinträchtigt wird, (siehe Kapitel C-1 c infra). Wie anhand von repräsentativen Vergleichen mit geeigneten Referenzbeispielen, die ein Tripeptid als Legumain spaltbare Gruppe enthalten, gezeigt wurde (siehe Kapitel C-1 a infra), zeigen die erfindunsgemäßen ADCs und APDCs mit nur noch einer Aminosäure (Asparagin) als enzymatischer Spaltstelle im Linker eine hohe anti-Tumorwirkung, die den Analoga mit klassischen Tripeptidsubstraten (drei Aminosäuren) im Linker

(Referenzbeispiele R1 und R6) überraschenderweise nicht oder kaum nachsteht (s. Kapitel C-1 a). Die Protease-spaltbare Linkersequenz kann damit auf nur einen

Aminosäurebaustein (eine Aminosäure) reduziert werden. Selbst für nah verwandte Konjugate mit Aminosäuren wie Glutamin oder Leucin statt Asparagin (siehe

Modellverbindung C RM-C infra) konnte im enzymatischen Assay keine Spaltung durch Legumain gezeigt werden. Entsprechend zeigten verwandte ADCs zu den Beispielen 1 mit Glutamin statt Asparagin-Resten im Prodrugrest der Payload keine cytotoxische Wirkung. Das gleiche gilt für analoge ADCs zu Beispiel 6, die einen Leucinrest an Stelle von Asparagin im Linker tragen; auch sie zeigen im Gegensatz zu den ADCs in Beispiel 6 praktisch keine cytotoxische Wirkung. Während Oligopeptid-Linker auch durch

verschiedene Proteasen gespalten werden können, zeigen die erfindungsgemäßen ADCs eine hohe Präferenz für die Spaltung durch eine tumor-assoziierte Asparagin-spaltende Protease wie Legumain.

Die erfindungsgemäßen Prodrugs weisen die folgende allgemeine Formel

in der

La für einen self-immolative linker steht, n 0 oder 1 ist;

D -(Lb) ₀-(LIG)p steht, Di für ein cytotoxisches Agens steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht, o und p jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, R für LIG-(L _c)e- steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor auf einer Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lc für einen Linker steht und e 0 oder 1 ist oder

R für Zr(C=0)q- steht, q 0 oder 1 ist, für eine Ci-10-Alkyl-, C ₅-io-Aryl-, Ce-io-Aryl-Ci-e-alkyl-, C3-10-

Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy-, C6-io-Aryl- Ci-6-alkoxy-, Cs-io-Heteroalkoxy-, C1-10- Alkyl-0-C6-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocyclo-alkoxy-Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -IMH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl) ₂, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -S(=0) ₃-H, -S(=0) ₂-NH ₂, -S(=0) ₂-N(Alkyl) ₂, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH ₂, -C(=0)-N(Alkyl) ₂ oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH ₂) ₀-i-O _x-(CH ₂CH ₂O) _v-R ¹ oder

-O _x-(CH ₂CH ₂0) _v-R ¹ steht, x 0 oder 1 ist v eine Zahl von 1 bis 20 ist und für -H, -Alkyl, -CH ₂-COOH, -CH ₂-CH ₂-COOH oder

-CH2-CH2-NH2 steht. Hierbei steht R ¹ in der Bedeutung von Alkyl vorzugsweise für Ci-12-Alkyl.

Vorzugsweise ist der Binder (LIG) ein Antikörper oder eine Antigen-bindendes Fragment hiervon. Der Antikörper ist vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon, insbesondere ein anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR-Antikörper, ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2 -Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment von diesen. Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAKR-Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP-10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2-Antikörper Trastuzumab und TPP-1015 oder eine Antigen- bindendes Fragment von diesen.

Hierbei kommen vorzugsweise zwei Ausführungsformen in Betracht.

Der Binder kann entweder mit der durch das Enyzm Legumain spaltbaren Gruppe gegebenenfalls über einen Linker verbunden sein, so dass nach Spaltung der Legumain- spaltbaren Gruppe der Wirkstoff getrennt von dem Binder bzw. einem Derivat hiervon vorliegt. Die Verbindungen der Ausführungsform A weisen somit vorzugsweise die folgende allgemeine Formel III' auf:

Ml' wobei n, e, LIG, La, Lc, und Di die in der allgemeinen Formel (la) angegebenen

Bedeutungen haben.

In diesem Fall stellt -D in der allgemeinen Formel (la) -D-| dar und -R in der allgemeinen Formel (la) stellt LIG-(L _c) _e- dar (Ausführungsform A).

Somit betrifft die vorliegende Erfindung vorzugsweise Verbindungen der allgemeinen Formel (la), in der

La für einen self-immolative linker steht, n 0 oder 1 ist;

D -(Lb) ₀-(LIG)p steht, o und p 0 sind, für ein cytotoxisches Agens steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht,

R für LIG-(Lc) _e- steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor auf einer Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lc für einen Linker steht und e 0 oder 1 ist. Oder der Binder kann mit dem Wirkstoffmolekül gegebenenfalls über einen Linker verbunden sein, so dass nach Spaltung der Legumain-spaltbaren Gruppe der Wirkstoff zusammen mit dem Binder bzw. einem Derivat hiervon vorliegt.

In diesem Fall stellt -D in der allgemeinen Formel (la) -Di-(L| ₃) ₀-LIG dar und R- in der allgemeinen Formel (la) stellt Zi-(C(=0))q- dar (Ausführungsform B).

Die Verbindungen der Ausführungsform B weisen somit vorzugsweise die folgend allgemeine Formel (IV) auf:

wobei n, o, LIG, La, Lb und Di die in der allgemeinen Formel (la) angegebenen

Bedeutungen haben und R für Zi-(C=0)q- steht, wobei q 0 oder 1 ist und Zi für eine Ci-10-Alkyl-, C ₅-io-Aryl-, C ₆-io-Aryl-Ci-6-alkyl-, C ₃-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C ₆-io-Aryl-, Cö-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, C5-io-Heteroaryl-Ci-6-alkyl-, Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy-, C6-io-Aryl-Ci-6-alkoxy-, Cs-io-Heteroalkoxy-, Ci-io-Alkyl-0-C6- 10-Aryloxy-, Cs-io-Heterocyclo-alkoxy-Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH ₂, -NH-Alkyl, -N(Alkyl) ₂, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, - S(=0) ₃-H, -S(=0) ₂-NH ₂, -S(=0) ₂-N(Alkyl) ₂, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH ₂, -C(=0)-N(Alkyl) oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH ₂) ₀-i-O _x-(CH ₂CH ₂O) _v-R ¹ oder -O _x-(CH ₂CH ₂0) _v-R ¹ steht, X 0 oder 1 ist eine Zahl von 1 bis 20 ist und für -H, -Alkyl, -CH ₂-COOH, -CH ₂-CH ₂-COOH, oder

-CH2-CH2-NH2 steht.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung vorzugsweise Verbindungen der allgemeinen Formel (la), in der

La für einen self-immolative linker steht, n 0 oder 1 ist;

D für -Di-(Lb) ₀-(LIG) _p steht, o 0 oder 1 p 1 ist, Di für ein cytotoxisches Agens steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht, R für Zr(C=0)q- steht, q 0 oder 1 ist,

Zi für eine Ci-10-Alkyl-, C ₅-io-Aryl-, C ₆-io-Aryl-Ci- ₆-alkyl-, C3-10-

Heteroalkyl-, d-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl-, C ₅-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, C ₅-io-Heteroaryl-Ci-6-alkyl-, C ₅-io-Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy-, Ce-io-Aryl-Ci-e-alkoxy-, C5-10-

Heteroalkoxy-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, C ₅-io-Heterocyclo-alkoxy- Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl) ₂, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -S(=0) ₃-H, -S(=0) ₂-NH ₂, -S(=0) ₂-N(Alkyl) ₂, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH ₂, -C(=0)-N(Alkyl) ₂ oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH ₂) ₀-i-O _x-(CH ₂CH ₂O) _v-R ¹ oder

-O _x-(CH ₂CH ₂0) _v-R ¹ steht,

0 oder 1 ist eine Zahl von 1 bis 20 ist und für -H, -Alkyl, -CH ₂-COOH, -CH ₂-CH ₂-COOH, oder

-CH ₂-CH ₂-NH ₂ steht.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt die Strategie der Transglutaminase-katalysierten

konjugationsstellenspezifischen Funktionalisierung aglykosylierter Antikörper.

Fig. 2 zeigt annotierte Sequenzen von bevorzugten Antikörpern für Binder-Wirkstoff-

Konjugate. Gezeigt sind die Proteinsequenzen der schweren und leichten Ketten der IgGs, sowie die VH und VL Regionen dieser Antikörper. Unterhalb der Sequenzen werden wichtige Regionen annotiert (VH und VL Regionen in IgGs, und die CDR Regionen (H-CDR1 , H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2, L- CDR3)).

Fig. 3 zeigt das Sequenzlisting von Sequenzen der bevorzugten Antikörper für Binder- Wirkstoff-Konjugate und von Sequenzen der Zielproteine.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Im Folgenden werden zunächst erfindungsgemäß verwendbare Legumain spaltbare Gruppen sowie die cytotoxischen Wirkstoffe D, die gegebenenfalls über einen seif- immolative linker miteinander verbunden sind, beschrieben. Anschließend wird der erfindungsgemäß bevorzugte Binder LIG, der nach Bindung an einen Rezeptor einer Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär (vorzugsweise lysosomal) prozessiert wird, beschrieben. Die verschiedenen Elemente der erfindungsgemäßen Verbindungen können ohne Einschränkung in beliebiger Kombination verwendet werden. Insbesondere können die jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Wirkstoffe D in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Binder LIG, ggf. in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw.

besonders bevorzugt dargestellten Linkern verwendet werden.

Durch Legumain spaltbare Gruppe

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (la) weisen eine durch Legumain spaltbare Gruppe der Formel (la') auf

(la'),

in der

La für einen self-immolative linker steht, n 0 oder 1 ist,

#1 für die Bindung an den cytotoxischen Wirkstoff (cytotoxisches Agens) steht,

R für LIG-(L _c)e- steht, LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lc für einen Linker steht und e 0 oder 1 ist, oder

R für Zr(C=0)q- steht, q 0 oder 1 ist,

Zi für eine Ci-10-Alkyl-, C ₅-io-Aryl-, Ce-io-Aryl-Ci-e-alkyl-, C3-10-

Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, C5-io-Heteroaryl-Ci-6-alkyl-, Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-,

Ci-10-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy-, C6-io-Aryl- Ci-6-alkoxy-, Cs-io-Heteroalkoxy-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocyclo-alkoxy-Gruppe steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -IMH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -S(=0) ₃-H , -S(=0) ₂-NH ₂, -S(=0) ₂- N(Alkyl) ₂, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH ₂, -C(=0)-N(Alkyl) ₂ oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH ₂) ₀-i-O _x-(CH ₂CH ₂O) _v-R ¹ oder

-O _x-(CH ₂CH ₂0) _v-R ¹ steht, x 0 oder 1 ist v eine Zahl von 1 bis 20 ist und

R ¹ für -H, -Alkyl, -CH ₂-COOH, -CH ₂-CH ₂-COOH, oder -CH ₂-CH ₂-NH ₂ steht. Hierbei steht R ¹ in der Bedeutung von Alkyl vorzugsweise für Ci-12-Alkyl.

Wenn R für LIG-(L _c) _e- steht, wird die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formel la' auch als durch Legumain spaltbarer Linker bezeichnet (Ausführungsform A).

Wenn R für Zi-(C=0)q- steht, wird die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formel la' auch als durch Legumain spaltbare Schutzgruppe bezeichnet (Ausführungsform B).

Wenn die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formel la' eine durch Legumain spaltbare Schutzgruppe bezeichnet, ist q vorzugsweise 1 .

Zi stellt vorzugsweise eine Ci-10-Alkyl-, C6-io-Aryl-Ci-6-alkyl-, C5-io-Heteroaryl-Ci-6-alkyl-, C6-io-Aryl-Ci-6-alkoxy- oder Cs-io-Heteroaryl-alkoxy-Gruppe dar die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH ₂, -NH-Alkyl, -N(Alkyl) ₂, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)- Alkyl, -S(=0) ₃-H, -S(=0) ₂-NH ₂, -S(=0) ₂-N(Alkyl) ₂, -COOH, -C(=0)-, -C(=0)NH ₂, -C(=0)- N(Alkyl) ₂ oder -OH substituiert sein kann.

Zi stellt besonders bevorzugt eine Ci-3-Alkyl-, C6-7-Aryl-Ci-6-alkyl-, C5-6-Heteroaryl-Ci-3- alkyl-, oder C6-7-Aryl-Ci-6-alkoxy-Gruppe dar, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -COOH, -C(=0)- oder -OH substituiert sein kann.

Self-immolative linker L _a

Um eine effiziente Freisetzung des freien Wirkstoffs zu gewährleisten, können

gegebenenfalls auch sogenannte self-immolative Linkerelemente (L _a) zwischen enzymatischer Spaltstelle und Wirkstoff eingebaut werden (Anticancer Agents in

Medicinal Chemistry, 2008, 8, 618-637). Die Freisetzung des Wirkstoffs kann dabei nach verschiedenen Mechanismen erfolgen, beispielsweise nach initialer enzymatischer Freisetzung einer nukleophilen Gruppe durch anschließende Elimierung über eine elektronische Kaskade (Bioorg. Med. Chem., 1999, 7, 1597; J. Med. Chem., 2002, 45, 937; Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 71 ) oder durch Cyclisierung des entsprechenden Linkerelements (Bioorg. Med. Chem., 2003, 1 1 , 2277; Bioorg. Med. Chem., 2007, 15, 4973; Bioorg. Med. Chem. Lett, 2007, 17, 2241 ) oder durch eine Kombination aus beidem (Angew. Chem. Inter. Ed., 2005, 44, 4378). Beispiele für solche Linkerelemente sind in der Abbildung dargestellt:

Der in den allgemeinen Formeln (la) und (la') unter La genannte self-immolative linker steht hier beispielsweise für eine der folgenden Gruppen:

wobei #1 die Bindung zur Carbonylgruppe und #2 die Bindung zur Hydroxyl- bzw.

Aminogruppe von D1 darstellt. Cytotoxische Wirkstoffe den erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel la stellt D die Gruppe

(LIG)p dar, wobei ein cytotoxischer Wirkstoff (cytotoxisches Agens) ist,

LIG einen Binder darstellt, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle vorzugsweise von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb einen Linker darstellt und o und p unabhängig voneinander 0 oder 1 sind.

Als cytotoxischer Wirkstoff wird vorzugsweise Mitomycin, Doxorubicin, Aminopterin, Actinomycin, Bleomycin, 9-Amino-Camptothecin, n8-Acetyl-spermidin, 1 -(2-Chloroethyl)- 1 ,2-dimethansulfonyl-hydrazid, Tallysomycin, Cytarabin, Etoposid, Camptothecin, Taxol, Esperamicin, Podophyllotoxin, Anguidin, Vincristin, Vinblastin, Morpholin-doxorubicin, n- (5,5-diacetoxy-pentyl)-doxorubicin, Duocarmycin, Auristatin, Monomethylauristatin, Dolastatin, Tubulysin, Maytansinoid, Cryptophycin, Amanitine, Pyrrolobenzodiazepin- Derivate, Indolinobenzodiazepine, Calicheamicin, Daunorubicin, Camptophecin DX8951 (Exatecan) oder ein Kinesin Spindel Protein-Inhibitor (KSP-lnhibitor) verwendet, wobei der Wirkstoff über seine Hydroxyl- oder Aminogruppe an La (bei n=1 ) oder die

Carbonylgruppe (bei n=0) gemäß der allgemeinen Formel (la) gebunden ist. Eine entsprechende Derivatisierung dieser Wirkstoffe kann auf Grundlage bekannter Methoden erfolgen (siehe z.B. Synthesis, 1999, 1505 bzgl. Duocarmycin, Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 337, Journal of Med. Chem., 2010, 53(3), 1043 bzgl. Camptothecin, ChemMedChem,. 201 1 , 6(1 ), 54 bzgl. Auristatin, Mol. Cancer. Thier., 2005, 4, 751 bzgl. Doxorubicin und J. Biol. Chem, 2008, 283, 9318 bzgl. Pyrrolobenzodiazepin-Derivate (PBD-Derivate); s.a. J. Med. Chem 2013, 56, 7564 und weitere Referenzen in der Einleitung, J. Med. Chem. 2001 , 44, 1341 , Oncology Reports 201 1 , 26, 629)).

Insbesondere können auch als ADC-Payloads bereits etablierte Wirkstoffklassen, wie sie im Review von A. Beck et al. (Nature Rev. Drug Discovery; 2017, 16, 315) zusammengefasst wurden, über die hier beschriebenen Linker-Chemien mit Antikörpern verknüpft werden. Bevorzugt können die spaltbaren Linker in den beschriebenen ADCs durch die hier beschriebenen Linker ersetzt werden. Besonders bevorzugt werden solche cytotoxischen Wirkstoffe, die eine für ihre

Wirksamkeit essentielle freie Hydroxyl- oder Aminogruppe aufweisen, insbesondere solche, die eine für ihre Wirksamkeit essentielle freie Aminogruppe aufweisen. Durch die Kopplung der Legumain spaltbaren Gruppe an eine solche Gruppe kann die Wirksamkeit des cytotoxischen Wirkstoffs maskiert werden. Zu dieser Gruppe der Wirkstoffe gehört z.B. Doxorubicin, welches die folgende Formel aufweist:

Durch Konjugation der Legumain spaltbaren Gruppe an die freie Aminogruppe des Doxorubicins kann dessen Wirksamkeit maskiert werden. Insbesondere bevorzugt sind Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren als cytotoxische

Wirkstoffe (cytotoxische Agenzien), wie sie z.B. in der internationalen Patentanmeldung WO2015/096982 offenbart sind.

Als cytotoxische Wirkstoffe sind hierbei insbesondere solche Kinesin Spindel Protein- Inhibitoren der folgenden Formel (II)

bevorzugt, in der

X ₃ für C steht,

oder

X ₃ für N steht,

oder

X ₃ für N steht,

oder

X ₃ für C steht,

oder

X ₃ für C steht.

A für -C(=0)-, -S(=0), -S(=0) ₂-, oder -S(=0) ₂-NH- steht,

R ¹ für -H, -L-#1 , -MOD oder -(CH ₂)o- ₃Z steht,

Z für -H, -NHY ³, -OY ³, -SY ³, Halogen, -C(=0)-NY ¹Y ², oder

-C(=0)-OY ³ steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z' oder -CH(CH ₂W)Z' stehen,

für -H oder -(CH ₂)o-3Z' steht,

für -H, -IMH2, -S(=0) ₃H, -COOH,

-NH-C(=0)-CH ₂-CH ₂-CH(NH ₂)COOH oder

-(C(=0)-NH-CHY ⁴)i _-3COOH steht,

für -H oder -OH steht,

für lineares oder verzweigtes Ci-6 Alkyl steht, das gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2 substituiert ist, oder für Aryl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls mit -IMH2 substituiert ist, für -H, -L-#1 , -MOD, -C(=0)-CHY ⁴-NHY ⁵ oder -(CH ₂)o- ₃Z steht, für -H, Halogen, -OY ³, -SY ³, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ², oder

-C(=0)-OY ³ steht,

unabhängig voneinander für -H, -NH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H oder -(CH ₂)o-3Z' steht,

für -H, -S(=0) ₃H, -IMH2 oder -COOH steht,

für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht, das gegebenenfalls mit -NHC(=0)-NH2 substituiert ist, oder für Aryl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls mit -IMH2 substituiert ist,

für-H oder -C(=0)-CHY ⁶-NH ₂ steht,

für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht,

für -MOD, -L-#1 , oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-,

Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl-

Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei

Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten

Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH-

Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl

Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei

-NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl-

Gruppen, ein bis drei -S(=0) _n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei

-S(=0) ₂-NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei

-N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei

-(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können,

0, 1 oder 2 ist, Z für -H, Halogen, -OY ³, -SY ³, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ² oder -C(=0)-OY ³ steht,

Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,

Y ³ für -H, -(CH ₂)o-3-CH(N HC(=0)CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH ₂)Z' oder

-(CH ₂)o- ₃Z' steht,

Z' für -H, -S(=0) ₃H, -NH ₂ oder -COOH steht,

R ⁵ für -H, -IMH2, -NO2, Halogen, -CN, CF ₃, -OCF ₃, -CH ₂F, -CH ₂F, -SH oder -(CH ₂)o-3Z steht,

Z für -H, -OY ³, -SY ³, Halogen, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ², oder -C(=0)- OY ³ steht,

Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,

Y ³ für -H oder -(CH ₂)o- ₃Z' steht,

Z' für -H, -S(=0) ₃H, -NH ₂ oder -COOH steht, R ⁶ und R ⁷ unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,

C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2-10- Alkinyl-, Hydroxy-, -NO2, -NH2, -COOH oder Halogen stehen,

R ⁸ für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,

C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-10-

Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl-, Fluor-C4-io-Cycloalkyl- oder -(CH ₂)o- ₂-(HZ ²) steht,

HZ ² für einen 4 bis 7-gliedrigen Heterocyclus mit bis zu zwei

Heteroatome, ausgewählt aus N, O und S steht, der mit -OH, -COOH, -NH2 oder -L-#1 substituiert sein kann,

R ⁹ für -H, -F, -CH ₃, -CF ₃, -CH ₂F oder -CHF ₂ steht,

-L-#1 für -(Lb) ₀-(LIG) _P steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht,

o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, -MOD für -(N R ¹⁰) _n-(G1 ) ₀-G2-G3 steht,

R ¹⁰ für -H oder Ci-C ₃-Alkyl- steht,

G1 für -NH-C-(=0)- , -C(=0)-NH- oder \ / ^{N CO} _steht, n 0 oder 1 ist;

o 0 oder 1 ist und

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0) ₂-, -NRY-, -NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0) ₂-NRYNRY-, -C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CR ^x=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit -NH-C(=0)-NH2,

-COOH, -OH, -NH ₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder

Sulfonsaure substituiert sein kann,

R ^y für -H, Phenyl-, C-| -C-|o-Alkyl-, C2-C-| 0"Alkenyl- oder C2-C-| Q-

Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsaure substituiert sein können,

Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,

G3 für -H oder -COOH steht und

-MOD mindestens eine, vorzugsweise zwei -COOH Gruppen aufweist, und eine Aminogruppe in -MOD mit der Legumain-spaltbaren Gruppe der Formel (la') acyliert sein kann, sowie deren Salze, Solvate und Salze der Solvate.

Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen, in denen

R ³ für— L-#1 oder eine Ci-10-Alkyl-, C6-io-Aryl- oder C6-io-Aralkyl-, C5-10-

Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-

C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0) _n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)2-NH-Alkyl- Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei Nh -Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können,

n 0, 1 oder 2 ist, für -H, Halogen, -OY ³, -SY ³, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ² oder -C(=0)-OY ³ steht,

unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H, -(CH2)o-3-CH(N HC(=0)CH3)Z ^,,-(CH2)o-3-CH(NH2)Z ^, oder -(CH ₂)o-3Z' steht und

für -H, -S(=0) ₃H, -NH ₂ oder -COOH steht.

Bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeine Formel (II), in denen

X ₃ für N steht.

Durch Konjugation der Legumain spaltbaren Gruppe an die freie Aminogruppe der Verbindungen der Formel II kann dessen Wirksamkeit maskiert werden.

Diese erfindungsgemäß verwendeten Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren besitzen eine für die Wirkung essentielle Aminogruppe. Durch Modifizierung dieser Aminogruppe mit Peptidderivaten oder Asparaginderivaten wird die Wirkung gegenüber dem Kinesin- Spindelprotein blockiert und damit auch die Entfaltung einer cytotoxischen Wirkung inhibiert. Kann dieser Peptidrest jedoch durch Tumor-assoziierte Enzyme wie Legumain freigesetzt werden, so lässt sich die Wirkung gezielt im Tumorgewebe wieder herstellen. Definitionen

Der Begriff„substituiert" bedeutet, dass ein oder mehrere Wasserstoffe an dem bezeichneten Atom bzw. der bezeichneten Gruppe durch eine Auswahl aus der angegebenen Gruppe ersetzt ist/sind, mit der Maßgabe, dass die normale Wertigkeit des bezeichneten Atoms unter den vorliegenden Umständen nicht überschritten wird.

Kombinationen von Substituenten und/oder Variablen sind zulässig.

Der Begriff„gegebenenfalls substituiert" bedeutet, dass die Anzahl an Substituenten gleich oder verschieden von Null sein kann. Wenn nicht anders angegeben, können gegebenenfalls substituierte Gruppen durch so viele fakultative Substituenten substituiert sein, wie sich durch Ersetzen eines Wasserstoffatoms durch einen Nicht-Wasserstoff- Substituenten an einem beliebigen verfügbaren Kohlenstoff- oder Stickstoff- oder Schwefelatom unterbringen lassen. Normalerweise kann die Anzahl an fakultativen Substituenten (falls vorhanden) 1 , 2, 3, 4 oder 5, insbesondere von 1 , 2 oder 3 sein. So, wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "ein- oder mehrfach", zum Beispiel in der Definition der Substituenten der Verbindungen der allgemeinen Formeln der vorliegenden Erfindung, "1 , 2, 3, 4 oder 5, bevorzugt 1 , 2, 3 oder 4, besonders bevorzugt 1 , 2 oder 3, ganz besonders bevorzugt 1 oder 2".

Sind Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen substituiert, so können die Reste, wenn nicht anders angegeben, ein- oder mehrfach substituiert sein. Im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung sind die Bedeutungen aller Reste, die mehrfach auftreten, unabhängig voneinander. Eine Substitution durch einen, zwei oder drei gleiche oder verschiedene Substituenten ist bevorzugt. Die Substitution durch einen Substituenten ist besonders bevorzugt.

Alkyl

Alkyl steht für einen linearen oder verzweigten, gesättigten, monovalenten

Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (Ci-Cio-Alkyl), in der Regel 1 bis 6 (Ci-C6-Alkyl), bevorzugt 1 bis 4 (Ci-C4-Alkyl), und besonders bevorzugt 1 bis 3

Kohlenstoffatomen (Ci-C ₃-Alkyl).

Beispielhaft und bevorzugt seien genannt:

Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, iso-Propyl-, iso-Butyl-, sec-Butyl, tert-Butyl-, iso-Pentyl-, 2-Methylbutyl-, 1 -Methylbutyl-, 1 -Ethylpropyl-, 1 ,2-Dimethylpropyl, neo-Pentyl-, 1 ,1 -Dimethylpropyl-, 4-Methylpentyl-, 3-Methylpentyl-, 2-Methylpentyl-, 1 - Methylpentyl-, 2-Ethylbutyl-, 1 -Ethylbutyl-, 3,3-Dimethylbutyl-, 2,2-Dimethylbutyl-, 1 ,1 - Dimethylbutyl-, 2,3-Dimethylbutyl-, 1 ,3-Dimethylbutyl- und 1 ,2-Dimethylbutyk

Besonders bevorzugt ist ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl- und tert-Butylrest.

Heteroalkyl

Heteroalkyl steht für eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der

Gruppen -O-, -S-, -C(=0)-, -S(=0)-, -S(=0) ₂-, -NRY-, -NRYC(=0)-, -C(=0)-NRY-,

-NRYNRY-, -S(=0) ₂-NRYNRY-, -C(=0)-NRYNRY-, -CR ^x=N-0- unterbrochen sein kann, und wobei die Kohlenwasserstoff kette einschließlich der Seitenketten (verzweigte

Kohlenwasserstoffkette), sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂,

-NH-C(=NNH2)-, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, Hierbei steht R ^y jeweils für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C10- Alkinyl-, die wiederum jeweils mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂, -NH-C(=NNH ₂)-, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.

Hierbei steht R ^x für -H, Ci -Cß-Alkyl- oder Phenyl-.

Alkenyl

Alkenyl steht für eine geradkettige oder verzweigte einwertige Kohlenwasserstoff kette mit einer oder zwei Doppelbindungen und 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Kohlenstoffatomen (C ₂-Cio-Alkenyl), insbesondere 2 oder 3 Kohlenstoffatomen (C ₂-C3-Alkenyl), wobei es sich versteht, dass, wenn die Alkenylgruppe mehr als eine Doppelbindung enthält, die

Doppelbindungen isoliert voneinander oder miteinander konjugiert sein können. Bei der Alkenylgruppe handelt es sich zum Beispiel um eine Ethenyl- (bzw. Vinyl-),

Prop-2-en-1 -yl- (bzw.„Allyl-"), Prop-1 -en-1 -yl-, But-3-enyl-, But-2-enyl-, But-1 -enyl-, Pent-4-enyl-, Pent-3-enyl-, Pent-2-enyl-, Pent-1 -enyl-, Hex-5-enyl-, Hex-4-enyl-,

Hex-3-enyl-, Hex-2-enyl-, Hex-1 -enyl-, Prop-1 -en-2-yl- (bzw.„Isopropenyl-"), 2- Methylprop-2-enyl-, 1 -Methylprop-2-enyl-, 2-Methylprop-1 -enyl-, 1 -Methylprop-1 -enyl-,

3- Methylbut-3-enyl-, 2-Methylbut-3-enyl-, "l -Methylbut-3-enyl-, 3-Methylbut-2-enyl-,

2- Methylbut-2-enyl-, 1 -Methylbut-2-enyl-, 3-Methylbut-1 -enyl-, 2-Methylbut-1 -enyl-, 1 -Methylbut-1 -enyl-, 1 -,1 -Dimethylprop-2-enyl-, 1 -Ethylprop-1 -enyl-, 1 -Propylvinyl-, 1 -lsopropylvinyl-, 4-Methylpent-4-enyl-, 3-Methylpent-4-enyl-, 2-Methylpent-4-enyl-, 1 -Methylpent-4-enyl-, 4-Methylpent-3-enyl-, 3-Methylpent-3-enyl-, 2-Methylpent-3-enyl-, 1 -Methylpent-3-enyl-, 4-Methylpent-2-enyl-, 3-Methylpent-2-enyl-, 2-Methylpent-2-enyl-, 1 -Methylpent-2-enyl-, 4-Methylpent-1 -enyl-, 3-Methylpent-1 -enyl-, 2-Methylpent-1 -enyl-,

1 - Methylpent-l -enyl-, 3-Ethylbut-3-enyl-, 2-Ethylbut-3-enyl-, 1 -Ethylbut-3-enyl-,

3- Ethylbut-2-enyl-, 2-Ethylbut-2-enyl-, 1 -Ethylbut-2-enyl-, 3-Ethylbut-1 -enyl-,

2- Ethylbut-1 -enyl-, 1 -Ethylbut-1 -enyl-, 2-Propylprop-2-enyl-, 1 -Propylprop-2-enyl-, 2-lsopropylprop-2-enyl-, 1 -lsopropylprop-2-enyl-, 2-Propylprop-1 -enyl-,

1 -Propylprop-1 -enyl-, 2-lsopropylprop-1 -enyl-, 1 -lsopropylprop-1 -enyl-,

3,3-Dimethylprop-1 -enyl-, 1 -(1 , 1 -Dimethylethyl)ethenyl-, Buta-1 ,3-dienyl-,

Penta-1 ,4-dienyl- oder Hexa-1 -5-dienylgruppe. Insbesondere handelt es sich bei der Gruppe um Vinyl oder Allyl.

Alkinyl

Alkinyl steht für eine geradkettige oder verzweigte einwertige Kohlenwasserstoff kette mit einer Dreifachbindung und mit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Kohlenstoffatomen (C2-C10- Alkinyl), insbesondere 2 oder 3 Kohlenstoffatomen (C2-C3-Alkinyl). Bei der

C2-C6-Alkinylgruppe handelt es sich zum Beispiel um eine Ethinyl-, Prop-1 -inyl-,

Prop-2-inyl- (bzw. Propargyl-), But-1 -inyl-, But-2-inyl-, But-3-inyl-, Pent-1 -inyl-, Pent-2-inyl- , Pent-3-inyl-, Pent-4-inyl-, Hex-1 -inyl-, Hex-2-inyl-, Hex-3-inyl-, Hex-4-inyl-, Hex-5-inyl-, 1 -Methylprop-2-inyl-, 2-Methylbut-3-inyl-, 1 -Methylbut-3-inyl-, 1 -Methylbut-2-inyl-,

3-Methylbut-1 -inyl-, 1 -Ethylprop-2-inyl-, 3-Methylpent-4-inyl-, 2-Methylpent-4-inyl-, 1 -Methylpent-4-inyl-, 2-Methylpent-3-inyl-, 1 -Methylpent-3-inyl-, 4-Methylpent-2-inyl-, 1 -Methylpent-2-inyl-, 4-Methylpent-1 -inyl-, 3-Methylpent-1 -inyl-, 2-Ethylbut-3-inyl-, 1 -Ethylbut-3-inyl-, 1 -Ethylbut-2-inyl-, 1 -Propylprop-2-inyl-, 1 -lsopropylprop-2-inyl-,

2.2- Dimethylbut-3-inyl-, 1 , 1 -Dimethylbut-3-inyl-, 1 , 1 -Dimethylbut-2-inyl- oder

3.3- Dimethylbut-1 -inylgruppe. Insbesondere handelt es sich bei der Alkinylgruppe um Ethinyl, Prop-1 -inyl oder Prop-2-inyl. Cvcloalkyl

Cycloalkyl steht für einen gesättigten einwertigen mono- oder bicyclischen

Kohlenwasserstoff rest mit 3-12 Kohlenstoffatomen (C3-Ci2-Cycloalkyl).

Hierbei steht ein monocyclischer Kohlenwasserstoffrest für einen monovalenten

Kohlenwasserstoff rest mit in der Regel 3 bis 10 (C3-Cio-Cycloalkyl), bevorzugt 3 bis 8 (Cs-Cs-Cycloalkyl), und besonders bevorzugt 3 bis 7 (C3-C7-Cycloalkyl)

Kohlenstoffatomen.

Beispielhaft und bevorzugt für einen monocyclischen Kohlenwasserstoffrest seien genannt: Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Cycloheptyl- und Cyclooctyk Besonders bevorzugt ist ein Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cylopentyl-, Cyclohexyl- und Cycloheptyl-.

Hierbei steht ein bicyclischer Kohlenwasserstoff rest für einen Kohlenwasserstoffrest mit in der Regel 3 bis 12 Kohlenstoffatomen (C3-Ci2-Cycloalkyl), wobei hierbei eine Fusion aus zwei gesättigten Ringsystemen zu verstehen ist, die sich gemeinsam zwei direkt benachbarte Atome teilen. Beispielhaft und bevorzugt für einen bicyclischen

Kohlenwasserstoff rest seien genannt: Bicyclo[2.2.0]hexyl-, Bicyclo[3.3.0]octyl-,

Bicyclo[4.4.0]decyl-, Bicyclo[5.4.0]undecyl-, Bicyclo[3.2.0]heptyl-, Bicyclo[4.2.0]octyl-, Bicyclo[5.2.0]nonyl-, Bicyclo[6.2.0]decyl-, Bicyclo[4.3.0]nonyl-, Bicyclo[5.3.0]decyl-, Bicyclo[6.3.0]undecyl- und Bicyclo[5.4.0]undecyl-,

Heterocycloalkyl

Heterocycloalkyl steht für ein nicht aromatisches mono- oder bicyclisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatomen, die gleich oder verschieden sein können. Als Heteroatome können Stickstoffatome, Sauerstoffatome oder Schwefelatome vorkommen.

Ein monocyclisches Ringsystem gemäß der vorliegenden Erfindung kann 3 bis 8, bevorzugt 4 bis 7, besonders bevorzugt 5 oder 6 Ringatome aufweisen.

Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 3 Ringatomen seien genannt: Aziridinyk

Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 4 Ringatomen seien genannt: Azetidinyl-, Oxetanyk

Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 5 Ringatomen seien genannt: Pyrrolidinyl-, Imidazolidinyl- , Pyrazolidinyl-, Pyrrolinyl-, Dioxolanyl- und Tetrahydro- furanyk

Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 6 Ringatomen seien genannt: Piperidinyl-, Piperazinyl-, Morpholinyl-, Dioxanyl-, Tetrahydropyranyl- und

Thiomorpholinyk

Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 7 Ringatomen seien genannt: Azepanyl-, Oxepanyl-, 1 ,3-Diazepanyl-, 1 ,4-Diazepanyk

Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 8 Ringatomen seien genannt: Oxocanyl-, Azocanyk

Unter monocyclischem Heterocycloalkyl sind 4 bis 7-glied rige, gesättigte

Heterocyclylreste mit bis zu zwei Heteroatomen aus der Reihe O, N und S bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Morpholinyl-, Piperidinyl-, Pyrrolidinyl- und Tetrahydrofuranyk

Ein bicyclisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatomen, die gleich oder verschieden sein können, können gemäß der vorliegenden Erfindung 6 bis 12, bevorzugt 6 bis 10 Ringatome aufweisen, wobei ein, zwei, drei oder vier Kohlenstoffatome gegen gleiche oder verschiedene Heteroatome aus der Reihe O, N und S ausgetauscht sein können.

Beispielhaft seien genannt: Azabicyclo[3.3.0]octyl-, Azabicyclo[4.3.0]nonyl-,

Diazabicyclo[4.3.0]nonyl-, Oxazabicyclo[4.3.0]nonyl-, Thiazabicyclo[4.3.0]nonyl- oder Azabicyclo[4.4.0]decyl- sowie aus weiteren möglichen Kombinationen gemäß Definition abgeleitete Reste.

Besonders bevorzugt ist Perhydrocyclopenta[c]pyrrolyl-, Perhydrofuro[3,2-c]pyridinyl-, Perhydropyrrolo[1 ,2-a]pyrazinyl-, Perhydropyrrolo[3,4-c]pyrrolyl- und 3,4- Methylenedioxyphenyl. Heterocycloalkoxy

Heterocycloalkoxy steht für Heterocycloalkyl, welches über eine -O- Gruppe mit dem Rest des Moleküls verbunden ist.

Alkoxy

Alkoxy steht für einen linearen oder verzweigten, gesättigten Alkyletherrest der Formel -O- Alkyl mit in der Regel 1 bis 6 (Ci-C6-Alkoxy), bevorzugt 1 bis 4 (Ci-C4-Alkoxy), und besonders bevorzugt 1 bis 3 (Ci-C3-Alkoxy) Kohlenstoffatomen.

Beispielhaft und bevorzugt seien genannt:

Methoxy-, Ethoxy-, n-Propoxy-, Isopropoxy-, ierf-Butoxy-, n-Pentyloxy- und n-Hexyloxy-. Aryl

Aryl bedeutet ein monovalentes, mono- oder bicyclisches, aus Kohlenstoffatomen bestehendes aromatisches Ringsystem. Beispiele sind Naphthyl- und Phenyl-; bevorzugt ist Phenyl- beziehungsweise ein Phenylrest.

C6-Cio-Aralkyl bzw. Arylalkyl

Unter C6-Cio-Aralkyl bzw. Arylalkyljst ein linearer oder verzweigter, gesättigter,

monovalenter Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (Ci-Cio-Alkyl), zu verstehen, an dem ein Arylrest gemäß obiger Definition gebunden ist. Darunter zu verstehen ist z.B. eine Gruppe C6-io-Aryl-Ci-6-alkyl-, Benzyl.

Heteroaryl

Heteroaryl bedeutet ein einwertiges monocyclisches, bicyclisches oder tricyclisches aromatisches Ringsystem mit 5, 6, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13 oder 14 Ringatomen (eine„5- bis 14- gliedrige Heteroaryl"gruppe), insbesondere 5, 6, 9 oder 10 Ringatomen, zu verstehen, das mindestens ein Ringheteroatom und gegebenenfalls ein, zwei oder drei weitere Ringheteroatome aus der Gruppe N, O und S enthält und das über ein Ringkohlenstoffatom oder gegebenenfalls (wenn es die Wertigkeit erlaubt) über ein Ringstickstoffatom gebunden ist. Bei der Heteroarylgruppe kann es sich um eine 5-glied rige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, Oxadiazolyl, Triazolyl, Thiadiazolyl oder Tetrazolyl; oder eine 6-gliedrige Heteroarylgrupoe wie zum Beispiel Pyridinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl oder Triazinyl; oder eine tricyclische Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Carbazolyl, Acridinyl oder Phenazinyl; oder eine 9-glied rige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Benzofuranyl, Benzothienyl, Benzoxazolyl, Benzisoxazolyl, Benzimidazolyl, Benzothiazolyl,

Benzotriazolyl, Indazolyl, Indolyl, Isoindolyl, Indolizinyl oder Purinyl; oder eine 10-gliedrige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Chinolinyl, Chinazolinyl, Isochinolinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, Chinoxalinyl oder Pteridinyl handeln.

Im Allgemeinen, und wenn nicht anders erwähnt, schließen die Heteroarylreste alle möglichen isomeren Formen davon ein, z. B. Tautomere und Positionsisomere in Bezug auf den Anbindungspunkt zum Rest des Moleküls. Somit schließt, als erläuterndes, nicht einschließendes Beispiel, der Begriff Pyridinyl Pyridin-2-yl, Pyridin-3-yl und Pyridin-4-yl ein; oder der Begriff Thienyl schließt Thien-2-yl und Thien-3-yl ein.

C5-Cio-Heteroaryl

C5-io-Heteroaryl steht im Rahmen der Erfindung für ein mono-oder bicyclisches, aromatisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatome, die gleich oder verschieden sein können. Als Heteroatome können vorkommen: N, O, S, S(=0) und/ oder S(=0)2. Die Bindungsvalenz kann sich an einem beliebigen aromatischen

Kohlenstoffatom oder an einem Stickstoffatom befinden.

Ein monocyclischer Heteroarylrest gemäß der vorliegenden Erfindung hat 5 oder 6 Ringatome.

Bevorzugt sind solche Heteroarylreste mit ein oder zwei Heteroatomen. Besonders bevorzugt sind hierbei ein oder zwei Stickstoffatome.

Heteroarylreste mit 5 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:

Thienyl, Thiazolyl, Furyl, Pyrrolyl, Oxazolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl,

Oxadiazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl und Thiadiazolyl.

Heteroarylreste mit 6 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe: Pyridinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl und Triazinyl.

Ein bicyclischer Heteroarylrest gemäß der vorliegenden Erfindung hat 9 oder 10

Ringatome.

Heteroarylreste mit 9 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:

Phthalidyl, Thiophthalidyl, Indolyl, Isoindolyl, Indazolyl, Benzothiazolyl, Benzofuryl, Benzothienyl, Benzimidazolyl, Benzoxazolyl, Azocinyl, Indolizinyl, Purinyl, Indolinyl.

Heteroarylreste mit 10 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:

Isochinolinyl, Chinolinyl, Chinolizinyl, Chinazolinyl, Chinoxalinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl,

1 ,7- und 1 ,8-Naphthyridinyl, Pteridinyl, Chromanyl.

Heteroaryl-alkyl

Unter Heteroaryl-alkyl ist ein linearer oder verzweigter, gesättigter, monovalenter Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (Ci-Cio-Alkyl), zu verstehen, an dem ein Heteroarylrest gemäß obiger Definition gebunden ist. Darunter zu verstehen ist z.B. eine Gruppe C5-io-Heteroaryl-Ci-6-alkyk

Aralkoxy bzw. Arylalkoxy

Unter Aralkoxy bzw. Arylalkoxy ist ein linearer oder verzweigter, gesättigter, monovalenter Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (Ci-Cio-Alkyl), zu verstehen, an dem ein Arylrest gemäß obiger Definition gebunden ist. Darunter zu verstehen ist z.B. eine Gruppe C6-io-Aryl- Ci-6-alkoxy-.

Aryloxy

Aryloxy steht für einen Arylrest, der Formel Aryl-O-.

Beispielhaft und bevorzugt seien genannt: Phenoxy- und Naphthyloxy- Heteroalkoxy

Heteroalkoxy steht für eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die über -O- an den Rest des Moleküls gebunden ist und die weiterhin einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -C(=0)-, -

S(=0)-, -S(=0) ₂-, -NRY-,

-NRYC(=0)-, -C(=0)-NRY-, -NRYNRY-, -S(=0) ₂-NRYNRY-, -C(=0)-NRYNRY-, -CR ^x=N-0- unterbrochen sein kann, und wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der

Seitenketten (verzweigte Kohlenwasserstoffkette), sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)- NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂, -NH-C(=NNH ₂)-, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

Hierbei steht R ^y jeweils für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-| Q- Alkinyl-, die wiederum jeweils mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂, -NH-C(=NNH ₂)-, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.

Hierbei steht R ^x für -H, Ci -Cß-Alkyl- oder Phenyl-.

Halogen beziehungsweise Halogenatom steht im Rahmen der Erfindung für Fluor (-F), Chlor (-CI), Brom (-Br), oder lod (-1).

Bevorzugt ist Fluor (-F), Chlor (-CI) und Brom (-Br).

Die erfindungsgemäßen Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren (cytotoxisches Agens) weisen vorzugsweise die folgende Formel (IIa) auf:

in der

X ₁ für ,

X ₂ für N und

Xs für C steht,

oder

x ₂ für C und

Xs für N steht,

oder

X ₂ für C und

X ₃ für N steht,

oder

X ₂ für C und

Xs für C steht,

oder

X ₂ für N und

Xs für C steht. A für -C(=0)-, -S(=0)-, -S(=0) ₂-, oder -S(=0) ₂-NH- steht

R ¹ für -H, -L-#1 , -MOD oder -(CH ₂) ₀- ₃Z steht,

Z für -H, -NHY ³, -OY ³, -SY ³, Halogen, -C(=0)-NY ¹Y ², oder -C(=0)-OY ³ steht,

Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander für -H, -NH ₂, -(ΟΗ ₂ΟΗ ₂0)ο-3-(ΟΗ ₂)ο-3Ζ'

oder -CH(CH ₂W)Z' stehen, γ ₃ für -Η oder -(CH ₂)o-3Z' steht,

Ζ' fÜr -H, -NH ₂, -S(=0) ₃H, -COOH, -NH-C(=0)-CH ₂-CH ₂-CH(NH ₂)COOH oder -(C(=0)-NH-CHY ⁴)i _-3COOH steht,

w für -H oder -OH steht,

γ4 für lineares oder verzweigtes Ci-6 Alkyl steht, das gegebenenfalls mit

-NH-C(=0)-NH ₂ substituiert ist, oder für Aryl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiert ist, für -H, -L-#1 , -MOD, -C(=0)-CHY ⁴-NHY ⁵ oder -(CH ₂) ₀- ₃Z steht, für -H, Halogen, -OY ³, -SY ³, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ², oder -C(=0)-OY ³ steht,

Υ ¹ und Υ ² unabhängig voneinander für -H, -NH ₂, oder -(CH ₂)o-3Z' stehen,

γ ₃ für -H oder -(CH ₂)o- ₃Z' steht,

Ζ' für -H, -S(=0) ₃H, -NH ₂ oder -COOH steht,

γ4 für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht, das gegebenenfalls mit

-NHC(=0)-NH ₂ substituiert ist, oder für Aryl oder Benzyl steht, das gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiert ist,

γ ₅ für-H oder -C(=0)-CHY ⁶-NH ₂ steht,

γ6 für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht, für -MOD, -L-#1 , oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-,

Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH- Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0) _n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0) ₂- NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl) ₂- Gruppen, ein bis drei NH ₂-Gruppen oder ein bis drei -(CH ₂)o-3Z-Gruppen substituiert sein können, η 0, 1 oder 2 ist, für -H, Halogen, -OY ³, -SY ³, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ² oder -C(=0)-OY ³ steht, Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander für -H, -NH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,

Y ³ für -H, -(CH ₂)o-3-CH(NHC(=0)CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH ₂)Z' oder -(CH ₂) ₀- ₃Z' steht,

Z' für -H, -S(=0) ₃H, -NH ₂ oder -C(=0)-OH steht,

für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formel la' steht, für -H, -NH ₂, -N0 ₂, Halogen, -CN, CF ₃, -OCF ₃, -CH ₂F, -CH ₂F, -SH oder -(CH ₂) ₀- ₃Z steht,

für -H, -OY ³, -SY ³, Halogen, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ², oder -C(=0)-OY ³ steht,

unabhängig voneinander für -H, -NH ₂, oder -(CH ₂)o-3Z' stehen, für -H oder -(CH ₂)o- ₃Z' steht,

für -H, -S(=0) ₃H, -NH ₂ oder -COOH steht, unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl, C _2-io-Alkenyl-, Fluor- C _2-io-Alkenyl-, C _2-io-Alkinyl-, Fluor- C _2-io-Alkinyl-, Hydroxy-, -N0 ₂, -NH ₂, -COOH oder Halogen stehen, für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl, C _2-io- Alkenyl-, Fluor- C _2-io-Alkenyl-, C _2-io-Alkinyl- oder Fluor- C _2-io-Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl-, Fluor-C4-io-Cycloalkyl- oder -(CH ₂)o- ₂-(HZ ²) steht, für einen 4 bis 7-gliedrigen Heterocyclus mit bis zu zwei Heteroatome, ausgewählt aus N, O und S steht, der mit -OH, -COOH, -NH ₂ oder -L-#1 substituiert sein kann,

R ⁹ für -H, -F, -CH ₃, -CF ₃, -CH ₂F oder -CHF ₂ steht,

-L-#1 für -(Lb) ₀-(LIG) _P steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht, o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen,

-MOD für -(NR ¹⁰) _n-(G1 ) ₀-G2-G3 steht,

R ¹⁰ für -H oder Ci-C ₃-Alkyl- steht, G1 für -NH-C-(=0)- , -C(=0)-NH- oder \ / ^{N co} _stehti

n 0 oder 1 ist;

o 0 oder 1 ist und

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 10

Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach durch -O-, -S-, -S(=0)-,

-S(=0) ₂-, -NRY-, -NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0) ₂-NRYNRY-, -C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CR ^x=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit -NH-C(=0)-NH2,

-COOH, -OH, -IM H2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

R ^y für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-| 0"Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂, Sulfonamid, Sulfon,

Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,

Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,

G3 für -H oder -COOH steht und

-MOD mindestens eine, vorzugsweise zwei -COOH Gruppen aufweist und

eine Aminogruppe in -MOD mit der Legumain-spaltbaren Gruppe der Formel (la') acyliert sein kann,

sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.

Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen bei denen

R ³ für— L-#1 oder eine Ci-10-Alkyl-, C6-io-Aryl- oder C6-io-Aralkyl-, C5-10-

Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl-Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppe, ein bis drei -O-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -S(=0) _n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0) ₂-NH-Alkyl- Gruppen, 1 -3-NH-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei NH ₂-Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können, wobei n und Z die oben angegebenen Bedeutungen haben.

Der Rest -(C(=0)-NH-CHY ⁴)i _-3-COOH bedeutet, dass ein Rest -C(=0)-NH-CHY ⁴-COOH vorliegt, oder zwei Reste -(C(=0)-NH-CHY ⁴) aneinander gebunden sein können, gemäß -C(=0)-NH-CHY ⁴-C(=0)-NH-CHY ⁴-COOH, oder drei Reste aneinander gebunden sein können, gemäß

-C(=0)-NH-CHY ⁴-C(=0)-NH-CHY ⁴-C(=0)-NH-CHY ⁴-COOH.

Besonders bevorzugt sind die Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), in denen

Xi für N steht,

x ₂ für N steht und

Xs für C steht,

oder

Xi für CH oder CF steht,

x ₂ für C steht und

Xs für N steht,

oder

Xi für NH steht,

x ₂ für C steht und

Xs für C steht,

oder

Xi für H steht,

X ₂ für N steht und

Xs für C steht.

Insbesondere sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa) bevorzugt, in denen X ₁ für N steht, X ₂ für N steht und

Xs für C steht,

oder

Xi für CH steht,

x ₂ für C steht und

Xs für N steht.

Ganz besonders bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), in denen

Xi für CH steht,

X2 für C steht und

X ₃ für N steht. Bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), in denen A für - C(=0)- steht.

Weiterhin bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), in denen R ¹ für -L-#1 , -MOD, -H, -COOH, -C(=0)-NH-NH ₂, -(CH ₂)i- ₃NH ₂, -C(=0)-NZ"(CH ₂)i _-3 NH ₂ und -C(=0)-NZ"CH ₂COOH steht und

Z" für -H oder -NH ₂ steht.

Falls in der allgemeinen Formel (IIa) R4 für -L-#1 steht, dann steht R ¹ vorzugsweise für - MOD.

Insbesondere steht in der allgemeinen Formel (IIa) R ⁴ für -L-#1 und R ¹ für -MOD falls R ³ nicht für -MOD steht.

In der allgemeinen Formel (IIa) steht R ² vorzugsweise für -H.

In der allgemeinen Formel (IIa) steht R ³ bevorzugt für

-L-#1 oder -MOD, oder für Ci-10-Alkyl-, das gegebenenfalls mit -OH, -O-Alkyl, -SH, -S- Alkyl, -0-C(=0)-Alkyl, -0-C(=0)-NH-Alkyl, -NH-C(=0)-Alkyl, -NH-C(=0)-NH-Alkyl, -S(=0) _n-Alkyl, -S(=0) ₂-NH-Alkyl, -NH-Alkyl, -N(Alkyl) ₂, oder -NH ₂ substituiert sein kann. Alkyl bedeutet hier vorzugsweise Ci-3Alkyk In der allgemeinen Formel (IIa) steht R ⁵ ist bevorzugt für -H oder -F.

In der allgemeinen Formel (IIa) steht bevorzugt R ⁶ und R ⁷ unabhängig voneinander für -H, Ci-io-Alkyl, Fluor- Ci-io-Alkyl, C ₂-io-Alkenyl-, Fluor- C ₂-io-Alkenyl-, C ₂-io-Alkinyl-, Fluor- C _2- io-Alkinyl-, Hydroxy- oder Halogen-.

In der allgemeinen Formel (IIa) steht bevorzugt R ⁸ für eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe, insbesondere für eine Gruppe -C(CH3)2-(CH2)o-2-R _y, wobei R _y für -H, -OH, -C(=0)2H, oder -IMH2 steht.

Besonders bevorzugt steht R ⁸ für die Gruppe-C(CHs)2-(CH2) -R _y , wobei R _y für -H steht.

In der allgemeinen Formel (IIa) steht R ⁹ bevorzugt für -H oder -F. In der allgemeinen Formel (IIa) steht -MOD bevorzugt für die Gruppe

QOC-(CHX) _x-AM-CH ₂-CH ₂-NH-C(=0)-,

wobei

x eine Zahl von 2 bis 6 ist,

Q für -OH oder -NH ₂ steht

X in den -(CHX)x- Gruppen unabhängig voneinander für -H, -IMH2, COOH oder -

CONH2 steht, und

AM für -C(=0)-NH- oder -NH-C(=0)- steht. In der allgemeinen Formel (IIa) steht -MOD besonders bevorzugt für die Gruppe

QOC-CH2-CH2-CH(COQ)-NH-C(=0)-CH2-CH ₂-NH-C(=0)-,

HOOC-CH(NH ₂)-CH2-CH2-C(=0)-NH-CH2-CH ₂-NH-C(=0)- und

HOOC-CH(NH ₂)-(CH ₂)4-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)-. wobei Q für -OH oder -IMH2 steht

Bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), in der

Xi für CH, für C und

für N steht, für -C(=0)- steht, für -L-#1 , -H, oder -MO D steht für -(Lb) ₀-(LIG) _p steht, für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird, für einen Linker steht, unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, für die Gruppe -(NR ¹⁰) _n-(G1 ) ₀-G2-G3 steht, für -H oder Ci-C ₃-Alkyl- steht, 0 oder 1 ist,

für -NH-C-(=0)- oder -C(=0)-NH- steht, 0 oder 1 ist und für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0) ₂-, -NRY-,

-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0) ₂-NRYNRY-,

-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CR ^x=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2, -C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsaure substituiert sein kann,

für -H, Phenyl-, C-| -C-|o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-10-

Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsaure substituiert sein können,

für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht, für -H oder -COOH steht für -H, für -MOD, -L-#1 , oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei

Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH- Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -S(=0) _n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei

-S(=0) ₂-NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können,

0, 1 oder 2 ist, für -H, Halogen, -OY ³, -SY ³, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ² oder -C(=0)-OY ³ steht,

unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H, -(CH2)o-3-CH(N HC(=0)CH ₃)Z>(CH2)o-3-CH(NH ₂)Z' oder -(CH ₂)o- ₃Z' steht,

für -H, -S(=0) ₃H, -IMH2 oder -C(=0)-OH steht, R ⁴ für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la')

steht,

R ⁵ für -H steht,

R ⁶ und R ⁷ für Fluor stehen,

R ⁸ für t-Butyl steht,

R ⁹ für -H steht,

-L-#1 für -(Lb) ₀-(LIG) _P steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht,

o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.

Hierbei ist Ci-3-Alkyl besonders bevorzugt.

Weiterhin bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (I Ia), in der

X ₃ für N steht,

A für -C(=0)- steht,

R ¹ für -L-#1 , -H, oder -MO D steht

-L-#1 für -(Lb) ₀-(LIG) _P steht, LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht, o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen, -MOD für die Gruppe -(NR ¹⁰) _n-(G1 ) ₀-G2-G3 steht,

R ¹⁰ für -H oder Ci-C ₃-Alkyl- steht, n 0,

G1 für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist und

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -NRY- oder -C(=0)- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte

Kohlenwasserstoff kette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -C(=0)-NH2, -COOH, substituiert sein kann,

R ^y für -H oder C-| -C ₀-Alkyl- steht, das mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH,

-OH, -IMH2, substituiert sein kann, G3 für -COOH steht

R ² für -H, für-L-#1 steht, R ⁴ für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la')

steht,

R ⁵ für -H steht,

R ⁶ und R ⁷ für Fluor stehen,

R ⁸ für t-Butyl steht,

R ⁹ für -H steht,

-L-#1 für -(Lb) ₀-(LIG) _P steht,

LIG für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär und vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird,

Lb für einen Linker steht,

o und p unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen,

sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.

Auch sind Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa')

(IIa')

bevorzugt, in der

X2 für N und X ₃ für C steht,

oder

X ₂ für C und

X ₃ für N steht,

oder

X ₂ für C und

X ₃ für N steht,

oder

X ₂ für C und

X ₃ für C steht,

oder

X ₂ für N und

X ₃ für C steht.

A für die Gruppe *-C(=0)-(CH ₂) _x-S-CH ₂-CH(COOH)-NH- ^** steht, x für 1 oder 2 steht,

* für die Bindung an das Wirkstoffmolekül steht, für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la') steht,

R ¹ für -MOD steht,

-MOD für die Gruppe -(NR ¹⁰) _n-(G1 ) ₀-G2-G3 steht,

>10 für -H oder Ci-C ₃-Alkyl- steht, n 0 ist, G1 für -C(=0)-NH- steht, o für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0) ₂-, -NRY-,

-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0) ₂-NRYNRY-,

-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CR ^x=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,

-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

R ^y für -H, Phenyl-, C-| -C-|o-Alkyl-, C2-C-| 0"Alkenyl- oder C2-C-| Q-

Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,

Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,

G3 für -H oder -COOH steht

R ² für -H steht,

R ³ für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la')

steht,

R ⁴ für -H steht,

R ⁵ für -H, -NH ₂, -N0 ₂, Halogen, -CN, CF ₃, -OCF ₃, -CH ₂F, -CH ₂F, -SH oder -(CH ₂) ₀- ₃Z steht,

Z für -H, -OY ³, -SY ³, Halogen, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ², oder -C(=0)-

OY ³ steht,

Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander für -H, -NH ₂, oder -(CH ₂)o-3Z' stehen,

Y ³ für -H oder -(CH ₂)o- ₃Z' steht,

Z' für -H, -S(=0) ₃H, -NH ₂ oder -COOH steht,

R ⁶ und R ⁷ unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,

C _2-io-Alkenyl-, Fluor- C _2-io-Alkenyl-, C _2-io-Alkinyl-, Fluor- C _2-io- Alkinyl-, Hydroxy-, -N0 ₂, -NH ₂, -COOH oder Halogen stehen, für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl, C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-1 Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl- oder Fluor-C4-io-Cycloalkyl- steht,

für -H, -F, -CH ₃, -CF ₃, -CH ₂F oder -CHF ₂ steht, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.

Davon besonders bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemein Formel (IIa'), in der

X ₃ für N steht,

A für die Gruppe *-C(=0)-(CH ₂)x-S-CH ₂-CH(COOH)-NH-** steht, x für 1 oder 2 steht,

^* für die Bindung an das Wirkstoffmolekül steht,

^** für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der

Formeln (la') steht,

R ¹ für -MOD steht,

-MOD für die Gruppe -(NR ¹⁰) _n-(G1 ) ₀-G2-G3 steht,

R ¹⁰ für -H oder Ci-C ₃-Alkyl- steht, n 0 ist,

G1 für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist,

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0) ₂-, -NRY-, -NR ^vC(=0)-, -C(=0)NRy-, -NRYNRY-, -S(=0) ₂-NRyNRy-,

-C(=0)-NRyNRy-, -C(=0)-, -CR ^x=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,

-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder

Sulfonsaure substituiert sein kann,

für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| 0"Alkenyl- oder C2-C-10-

Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsaure substituiert sein können,

für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht, für -H oder -COOH steht

für -H steht,

für die durch Legumain spaltbare Gruppe der Formeln (la) steht, für -H steht, für -H steht, für Fluor stehen, für t-Butyl steht und für -H steht, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.

Weiterhin bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa")

(Ha")

X ₂ für N und

X ₃ für C steht,

oder

X ₂ für C und

X ₃ für N steht,

oder

X _! für CH oder CF,

X ₂ für C und

X ₃ für N steht,

oder

Xi für NH,

X ₂ für C und

X ₃ für C steht,

oder

Xi für CH,

X ₂ für N und

X ₃ für C steht.

A für -C(=0)-, -S(=0), -S(=0) ₂-, oder -S(=0) ₂-NH- steht, für die Gruppe ^* - (G1 ) ₀-G2-NH- ^** steht,

^* für die Bindungsstelle an das Wirkstoffmolekül (cytotoxisches

Agens) steht,

^** für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der

Formeln la' steht,

G1 für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist,

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0) ₂-, -NRY-,

-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0) ₂-NRYNRY-,

-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CR ^x=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,

-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder

Sulfonsäure substituiert sein kann,

R ^y für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-10-

Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,

Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,

R ² für -H steht,

R ³ für eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-,

Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl-Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppen, ein bis drei -O-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH- Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei - NH-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0) _n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0) ₂-NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei Nh -Gruppen oder ein bis drei (CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können, n 0, 1 oder 2 ist,

Z für -H, Halogen, -OY ³, -SY ³, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ² oder -C(=0)-OY ³ steht,

Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, Y ³ für -H, -(CH ₂)o-3-CH(N HC(=0)CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH ₂)Z' oder

-(CH ₂)o-3Z' steht,

Z' für -H, -S(=0) ₃H, -NH ₂ oder -COOH steht,

R ⁴ für -H steht, R ⁵ für -H, -IMH2, -NO2, Halogen, -CN, CF ₃, -OCF ₃, -CH ₂F, -CH ₂F, -SH oder -(CH ₂)o-3Z steht,

Z für -H, -OY ³, -SY ³, Halogen, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ², oder -C(=0)-

OY ³ steht,

Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, Y ³ für -H oder -(CH ₂)o- ₃Z' steht,

Z' für -H, -S(=0) ₃H, -NH ₂ oder -COOH steht,

R ⁶ und R ⁷ unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,

C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2-10- Alkinyl-, Hydroxy-, -NO2, -NH ₂, -COOH oder Halogen stehen,

R ⁸ für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,

C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-10- Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl- oder Fluor-C4-io-Cycloalkyl- steht,

R ⁹ für -H, -F, -CH ₃, -CF ₃, -CH ₂F oder -CHF ₂ steht, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate. Davon besonders bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (II"), in der

X ₃ für N steht,

A für -C(=0)- steht,

R ¹ für die Gruppe ^* - (G1 ) ₀-G2-NH- ^** steht,

^* für die Bindungsstelle an das Wirkstoffmolekül (cytotoxisches

Agens) steht,

^** für die Bindung an die durch Legumain spaltbare Gruppe der

Formeln (la') steht,

G1 für -C(=0)-NH- steht, o 1 ist,

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0) ₂-, -NRY-,

-NRYC(=0)-, -C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0) ₂-NRYNRY-,

-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CR ^x=N-0- unterbrochen sein kann und die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette ein oder mehrfach, gleich oder verschieden mit -NH-C(=0)-NH2,

-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

R ^y für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| o-Alkenyl- oder C2-C-10-

Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,

Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht, R ² für -H steht, R ³ für -CH2-OH steht,

R ⁴ für -H steht, R ⁵ für -H steht,

R ⁶ und R ⁷ für Fluor stehen,

R ⁸ für t-Butyl steht und

R ⁹ für -H steht,

sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.

Weiterhin sind die Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa) bevorzugt bei denen

R ¹ für -H, -L-#1 , -COOH,

QOC-CH2-CH ₂-CH(COQ)-NH-C(=0)-CH2-CH ₂-NH-C(=0)-;

HOOC-CH(NH ₂)-CH2-CH2-C(=0)-NH-CH2-CH ₂-NH-C(=0)- oder HOOC-CH(NH ₂)-(CH ₂)4-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)- steht,

R ² für -H steht,

A für -C(=0)- steht,

Q für -OH oder -NH ₂ steht

R ³ für -(CH ₂)OH, -CH(CH ₃)OH, -CH ₂-S-CH ₂CH-(COOH)-NH-C(=0)-CH ₃,

-CH(CH3)OCH3, eine Phenylgruppe, die mit ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei Aminogruppen, ein bis drei Alkylgruppen oder ein bis drei Halogenalkylgruppen, substituiert sein kann,

HOOC-CH2-CH ₂-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH2-CH ₂-NH-C(=0)-;

HOOC-CH(NH ₂)-CH2-CH2-C(=0)-NH-CH2-CH ₂-NH-C(=0)-;

HOOC-CH(NH ₂)-(CH ₂)4-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)- oder

-CH ₂-Sx-(CH ₂) ₀-4-CHY ⁵-COOH steht,

x 0 oder 1 ist,

Y ⁵ für -H oder -NHY ⁶ steht,

Y ⁶ für -H, -C(=0)-CH ₃ oder -L-#1 steht, R ⁵ für -H steht,

R ⁶ und R ⁷ unabhängig voneinander für -H, Ci-3-Alkyl- oder Halogen- stehen,

R ⁸ für Ci-4-Alkyl- steht und

R ⁹ für -H steht.

Hierbei bevorzugt sind insbesondere dolche Verbindungen bei denen

R ⁶ und R ⁷ unabhängig voneinander für Wasserstoff oder Fluor stehen und

R ⁸ für tert-Butyl steht.

Weiterhin sind solche Verbindungen bevorzugt, bei denen

R ¹ für -H, -COOH,

QOC-CH2-CH ₂-CH(COQ)-NH-C(=0)-CH2-CH ₂-NH-C(=0)-,

HOOC-CH(NH ₂)-CH2-CH2-C(=0)-NH-CH2-CH ₂-NH-C(=0)- oder HOOC-CH(NH ₂)-(CH ₂)4-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)- steht,

R ² für -H steht,

A für -C(=0)- steht,

R ³ für -(CH ₂)OH, -CH(CH ₃)OH, -CH ₂-S-CH ₂CH(COOH)NH-C(=0)-CH ₃,

-CH(CH ₃)OCH ₃,

HOOC-CH2-CH ₂-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH2-CH ₂-NH-C(=0)-,

HOOC-CH(NH ₂)-CH2-CH2-C(=0)-NH-CH2-CH ₂-NH-C(=0)-,

HOOC-CH(NH ₂)-(CH ₂)4-NH-C(=0)-CH2-CH2-NH-C(=0)-, -CH ₂-S _x-(CH ₂)o-4-CHY ⁵-COOH oder für eine Phenylgruppe steht, die mit 1 -3 Halogenatomen, ein bis drei Aminogruppen, ein bis drei Alkylgruppen oder ein bis drei Haloalkylgruppen substituert sein kann, x 0 oder 1 ist,

Y ⁵ für -H oder -NHY ⁶ steht,

Y ⁶ für -H, -C(=0)-CH ₃ oder -L-#1 steht, R ⁵ für -H steht,

R ⁶ und R ⁷ unabhängig voneinander für -H, Ci-3-Alkyl- oder Halogen- stehen,

R ⁸ für Ci-4-Alkyl steht und

R ⁹ für -H steht,

wobei einer der Substituenten R ¹ oder R ³für -L-#1 steht.

Hierbei sind insbesondere solche Verbindungen bevorzugt bei denen

R ⁶ und R ⁷ für -F steht und

R ⁸ für tert-Butyl steht.

Weiterhin sind Verbindungen der allgemeinen Formel (IIb)

bevorzugt, in der

Xi, X2,X3, R ¹, R ², R ⁴, R ⁵, R ⁶,

R ⁷, R ⁸ und R ⁹ die in der allgemeinen Formel (IIa) angegebenen Bedeutungen haben und

A für -C(=0)- steht,

B für eine Einfachbindung, -O-CH2- oder -CH2-O- steht,

R ²⁰ für -NH ₂, -F, -CF ₃, oder -CH ₃ steht und

n 0, 1 , oder 2 ist.

Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIb), in der Xi für CH steht,

X2 für C steht und

X ₃ für N steht.

Auch sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (llc)

bevorzugt, in der

Xi, X ₂, X ₃ A, R ¹, R ³, R ⁴, R ⁶, R ⁷, R ⁸ und R ⁹ die in der allgemeinen Formel (IIa)

angegebenen Bedeutungen aufweisen.

Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (llc), in der Xi für CH steht,

X ₂ für C steht, X ₃ für N steht,

A für -C(=0)- steht und

R ³ für -CH2OH, -CH ₂OCH ₃, -CH(CH ₃)OH oder -CH(CH ₃)OCH ₃ steht.

Ferner sind auch solche Verbindungen der allgemeinen Formel (l ld):

bevorzugt, in der

Χι , X2, X3, A, R ³, R ⁴, R ⁶, R ⁷, R ⁸ und R ⁹ die in der allgemeinen Formel (I Ia) angegebenen Bedeutungen haben. Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (l ld), in der

Xi für CH steht,

X ₂ für C steht,

X ₃ für N steht,

A für -C(=0)- steht,

R ³ für -CH ₂-S _x-(CH ₂)o-4-CHY ⁵-COOH steht,

x für 0 oder 1 steht,

Y ⁵ für -H oder -NHY ⁶ steht und

Y ⁶ für -H oder -C(=0)CH ₃ steht.

Weiterhin bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formeln (I Ia), (IIb), (l lc) und (lld), bei denen • Z für -Cl oder -Br steht;

• R ¹ für -(CH ₂)o- ₃Z steht,

Z für -C(=0)-NY ¹Y ² steht,

Y ¹ für -H, -NH ₂, oder -(CH ₂CH ₂0)o-3-(CH2)o-3Z'steht;

Y ² für -(CH ₂CH ₂0)o-3-(CH ₂) ₀-3Z' steht und

Z' für -C(=0)-OH steht;

• Y für -H steht,

Y ² für -(CH ₂CH ₂0) ₃-CH ₂CH ₂Z' steht und

Z' für -C(=0)-OH steht;

• Y ¹ für -H steht,

Y ² für -CH ₂CH ₂Z' steht,

Z' für -(C(=0)NHCHY ⁴) ₂-COOH steht und

Y ⁴ die in der allgemeinen Formel (I Ia) angegebene Bedeutung hat;

• Y ¹ für -H steht,

Y ² für -CH ₂CH ₂Z' steht,

Z für -(C(=0)-NHCHY ⁴) ₂-COOH steht und

Y ⁴ für /-Propyl- oder -(CH ₂) ₃-NH-C(=0)-N H ₂ steht;

• Y ¹ für -H steht,

Y ² für -CH ₂CH ₂Z' steht,

Z' für -(C(=0)-NHCHY ⁴) ₂-COOH steht und

Y ⁴ für -CH ₃ oder -(CH ₂) ₃-NH-C(=0)-N H ₂ steht;

• Y ⁴ für lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH ₂ substituiertes C1-6 Alkyl steht; · Y ⁴ für / ^'-Propyl- oder -CH ₃ steht;

• Y ¹ für -H steht,

Y ² für -CH ₂CH ₂Z' steht,

Z' für -C(=0)-NHCHY ⁴-COOH steht und

Y ⁴ für gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryl- oder Benzyl- steht; Y ⁴ für Aminobenzyl- steht;

R ² für -(CH ₂)o- ₃Z steht,

Z für -SY ³ steht und

Y ³ die oben angegebene Bedeutung hat;

R ⁴ für -C(=0)-CHY ⁴-NHY ⁵ steht,

Y4 die oben angegebene Bedeutung hat und

Y ⁵ für -H steht;

R ⁴ für -C(=0)-CHY ⁴-NHY ⁵ steht,

Y ⁵ für -C(=0)-CHY ⁶-NH ₂ steht und

Y ⁴ undY ⁶ die oben angegebene Bedeutungen haben; · Y ⁴ für lineares oder verzweigtes Ci-6 Alkyl steht, das gegebenenfalls mit

-NH-C(=0)-NH2 substituiert sein kann.

Weiterhin bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formel (IIa), in der R ¹ , R ² oder R ³ für -MOD steht.

Besonders bevorzugt sind solche Verbindungen bei denen R ³ für -MOD und R ¹ für— L-#1 steht,

wobei

-MOD für -(NR ¹⁰) _n-(G )o- ^G2- ^G3 steht,

R ¹⁰ für -H oder Ci-C ₃-Alkyl- steht;

G1 für -NH-C(=0)- , -C(=0)-NH- oder \ / ^{N CO} _steht, n 0 oder 1 ist,

o 0 oder 1 ist,

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 20

Kohlenstoffatomen steht, die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch

-O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0) ₂-, -NR ^y-, -NR ^yC(=0)-, -C(=0)-NR ^y, -NR ^yNR ^y-, -S(=0) ₂-NR ^yNR ^y-, -C(=0)-NR ^yNR ^y-, -C(=0)-, -CR ^x=N-0- unterbrochen sein kann,

wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

R ^y für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| o-Alkenyl-, oder C2-C-| o-Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂, Sulfonamid,

Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können, Rx für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht,

G3 für -H oder -COOH steht und

wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine oder bevorzugt zwei -COOH Gruppen aufweist und eine Aminogruppe in -MOD mit der Legumain-spaltbaren Gruppe der Formel (la') acyliert sein kann.

Besonders bevorzugt weist die Gruppe -MOD mindestens eine -COOH-Gruppe auf, z.B. in einer Betaingruppe.

Vorzugsweise ist diese -COOH-Gruppe terminal ständig.

Weiterhin besonders bevorzugt ist die Gruppe -MOD die Gruppe

-CH ₂-Sx-(CH ₂) ₀-4-CHY ⁵-COOH, in der

x 0 oder 1 ist,

Y ⁵ für -H oder -NHY ⁶ steht und

Y6 für -H oder -C(=0)CH ₃ steht.

Weiterhin bevorzugt sind die Verbindungen der allgemeinen Formeln (IIa), (IIb), (llc) und

(lld), in denen

Xi für N steht,

X ₂ für N steht und X ₃ für C steht,

oder

Xi für N steht,

X2 für C steht und

X ₃ für N steht,

oder

Xi für CH oder CF steht,

X2 für C steht und

X ₃ für N steht,

oder

Xi für NH steht,

X2 für C steht und

X ₃ für C steht,

oder

Xi für CH oder CF steht,

X2 für N steht und

X ₃ für C steht, für -H, -L-#1 , -MOD oder -(CH ₂)o- ₃Z steht,

für -H, -NHY ³, -OY ³, -SY ³, Halogen, -C(=0)-NY ¹Y ² oder -C(=0)-OY ³ steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, -(CH2CH20)o- ₃-(CH2)o- ₃Z' oder -CH(CH ₂W)Z' stehen,

für -H oder -(CH ₂)o- ₃Z' steht,

für -H, -IMH2, -S(=0) ₃H, -COOH, -NH-C(=0)-CH ₂-CH ₂-CH(NH ₂)-COOH oder -(C(=0)-NH-CHY ⁴)i _-3COOH steht,

für -H oder -OH steht,

für lineares oder verzweigtes Ci-β Alkyl- steht, das gegebenenfalls mit -NHC(=0)-NH2 substituiert ist, oder für Aryl- oder Benzyl- steht, die gegebenenfalls mit -IMH2 substituiert sind, für -H, -C(=0)-CHY ⁴-NHY ⁵ oder -(CH ₂)o- ₃Z steht,

für -H, Halogen, -OY ³, -SY ³, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ², oder -C(=0)-OY ³ steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o- ₃Z' stehen, für -H oder -(CH ₂)o- ₃Z' steht,

für - H, -S(=0) ₃H, -IMH2 oder -COOH steht;

für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht, das gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2 substituiert ist oder für Aryl- oder Benzyl- steht, die gegebenenfalls mit -IMH2 substituiert sind,

für -H oder -C(=0)-CHY ⁶-NH ₂ steht,

für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl steht, für -C(=0)-, -S(=0)-, -S(=0) ₂- oder -S(=0) ₂-NH- steht, für— L-#1 , -MOD oder eine Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-,

Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe steht, die gegebenenfalls mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkyl-Gruppen, ein bis drei -O-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)- Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(0) _n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)2-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei

-NH((CH2CH20)i-2oH)-Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können,

für -H, Halogen, -OY ³, -SY ³, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ² oder -C(=0)-OY ³ steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H, -(CH ₂)o-3-CH(NH-C(=0)-CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH ₂)Z', oder -(CH ₂)o- ₃Z' steht,

für -H, -S(=0) ₃H, -IMH2 oder -COOH steht, für -H, -MOD, -NH ₂, -NO2, Halogen, -CN, -CF ₃, -OCF ₃, -CH ₂F, -CH ₂F, -SH -(CH ₂)o- ₃Z steht,

für -H, -OY ³, -SY ³, Halogen, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ², oder -C(=0)-OY ³ steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H oder -(CH2)o-3Z' steht und

für -H, -S(=0) ₃H, -NH ₂ oder -C(=0)-OH steht,

R ⁶ und R ⁷ unabhängig voneinander für -H, -CN, Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl,

C2-io-Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-, C2-io-Alkinyl-, Fluor- C2-io-Alkinyl-, Hydroxy, -NO2, -NH2, -COOH oder Halogen stehen, R ⁸ für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl, Fluor- Ci-10-Alkyl, C2-10-

Alkenyl-, Fluor- C2-io-Alkenyl-,C2-io-Alkinyl- oder Fluor- C2-io-Alkinyl-, oder für C4-io-Cycloalkyl- oder Fluor- C4-io-Cycloalkyl- steht, R ⁹ für -H, -F, -CH3, -CF ₃, -CH ₂F oder -CHF ₂ steht,

-MOD für die Gruppe -(NR ¹⁰) _n-(G1 ) ₀-G2-G3 steht,

R ¹⁰ für -H oder Ci-C ₃-Alkyl- steht,

G1 für -NH-C(=0)- , -C(=0)-NH- oder \ / ^{N CO} _steht,

n 0 oder 1 ist,

o 0 oder 1 ist,

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 10

Kohlenstoffatomen steht, die ein- oder mehrfach durch -O-, -S-, -S(=0)-,

-S(=0) ₂-, -NRY-, -NRYC(=0)-, -C(=0)-NRY-, -NRYNRY-, -S(=0) ₂-NRYNRY-, -C(=0)-NRYNRY- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH,

-IM H2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, R ^y für -H, -C(=0)-, -CR ^x=N-0- oder für gegebenenfalls mit NH-C(=0)-NH ₂,

-COOH, -OH, -IM H2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiertes Phenyl-, C-i -C-i Q-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-10-

Alkinyl- steht,

R ^x für -H, C-| -C ₃-Alkyl- oder Phenyl- steht,

G3 für -H oder -COOH steht und wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist und wobei R ¹ und R ³ nicht gleichzeitig für— L-#1 stehen,

sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate.

Hierbei besonders bevorzugt sind die Verbindungen der allgemeinen Formeln (I Ia), (I Ib), (l lc) und (l ld), in denen

Xi für CH steht,

X2 für C steht und

X ₃ für N steht. Hierbei weiterhin besonders bevorzugt sind die Verbindungen der allgemeinen Formeln (I Ia), (I Ib), (l lc) und (lld), in denen für eine Ci-10-Alkyl-, C6-io-Aryl-, C6-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-,

Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl-Gruppe steht, die gegebenenfalls mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkyl-Gruppen, ein bis drei -O- Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -S(0) _n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)2-NH-Alkyl- Gruppen, ein bis drei -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei -NH((CH2CH20)i-2oH)-Gruppen, ein bis drei NH2-Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können,

für -H, -S(=0) ₃H, -NH ₂ oder -COOH steht.

Weiterhin bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formeln (I Ia), (I Ib), (l lc) und (lld) sind die , in denen Xi für N steht,

X2 für N steht und

X ₃ für C steht,

oder

Xi für N steht,

X ₂ für C steht und

X ₃ für N steht,

oder

Xi für CH oder CF steht,

X2 für C steht und

X ₃ für N steht,

oder Xi für NH steht,

X2 für C steht und

X ₃ für C steht,

oder

Xi für CH oder CF steht,

X2 für N steht und

X ₃ für C steht, für -H, -L-#1 , -MOD oder -(CH ₂)o- ₃Z steht,

für -H, -NHY ³, -OY ³, -SY ³, Halogen, -C(=0)-NY ¹Y ² oder -C(=0)-OY ³ steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z' oder -CH(CH ₂W)Z' steht,

für -H oder -(CH ₂)o- ₃Z' steht,

für -H, -IMH2, -S(=0) ₃H, -COOH, -NH-C(=0)-CH ₂-CH ₂-CH(NH ₂)COOH oder -(C(=0)-NH-CHY ⁴)i _-3COOH steht,

für -H oder -OH steht,

für lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2 substituiertes Ci-β Alkyl- steht oder für gegebenenfalls mit -IMH2

substituiertes Aryl- oder Benzyl- steht, für -H, -C(=0)-CHY ⁴-NHY ⁵ oder -(CH ₂)o- ₃Z steht,

für -H, Halogen, -OY ³, -SY ³, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ² oder -C(=0)-OY ³ steht, unabhängig voneinander für -H, -NH2, oder -(CH2)o- ₃Z' stehen, für -H oder -(CH ₂)o- ₃Z' steht,

für -H, -S(=0) ₃H, -IMH2 oder -COOH steht,

für lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2 substituiertes C1-6 Alkyl- steht oder für gegebenenfalls mit -IMH2 substituiertes Aryl- oder Benzyl- steht,

für -H oder -C(=0)-CHY ⁶-NH ₂ steht,

für lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl- steht,

A für -C(=0)-, -S(=0)-, -S(=0) ₂- oder -S(=0) ₂-NH- steht,

R ³ für— L-#1 , -MOD oder eine Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-,

für -H, -S(=0) ₃H, -IMH2 oder -COOH steht, für -H, -MOD, -NH ₂, -NO2, Halogen, -CN, -CF ₃, -OCF ₃, -CH ₂F, -CH ₂F, SH oder -(CH ₂)o-3Z steht,

für -H, -OY ³, -SY ³, Halogen, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ², oder -C(=0)-OY ³ steht, unabhängig voneinander für -H, -IMH2, oder -(CH2)o-3Z' stehen, für -H oder -(CH ₂)o-3Z' steht,

für -H, -S(=0) ₃H, -IMH2 oder -COOH steht, unabhängig voneinander für -H oder Halogen stehen, für geradkettiges oder verzweigtes Ci-10-Alkyl- oder Fluor- Ci-10-Alkyl- steht, für -H, -F, -CH ₃, -CF ₃, -CH ₂F oder -CHF ₂ steht, für die Gruppe -(Lb) ₀-(LIG) _P steht, für einen Binder steht, der nach Bindung an einen Rezeptor einer

Tumorzelle von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird, für einen Linker steht, o und p jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, -MOD für -CH ₂-Sx-(CH ₂)o-4-CHY ⁵-COOH steht,

x 0 oder 1 ist,

Y ⁵ für -H oder -NHY ⁶ steht,

Y ⁶ für -H oder -C(=0)-CH ₃ steht und

wobei R ¹ und R ³ nicht gleichzeitig für— L-#1 stehen, sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate. Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formeln (IIa), (IIb), (llc) und (lld), in denen

Xi für CH steht,

X2 für C steht und

X ₃ für N steht.

Hierbei weiterhin bevorzugt sind solche Verbindungen der allgemeinen Formeln (IIa), (IIb), (llc) und (lld) in denen R ³ für eine Ci-10-Alkyl-, C6-io-Aryl- oder C6-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-,

Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl-Gruppe steht, die mit ein bis drei OH-Gruppen, ein bis drei Halogenatomen, ein bis drei mono-, di- oder tri-halogenierten Alkylgruppe, ein bis drei -O-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -SH-Gruppen, ein bis drei -S-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -0-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -NH-C(=0)-NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0) _n-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -S(=0)2-NH-Alkyl-Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl-Gruppen, ein bis drei -N(Alkyl)2-Gruppen, ein bis drei IM H2- Gruppen oder ein bis drei -(CH2)o-3Z-Gruppen substituiert sein können, Z für -H, Halogen, -OY ³, -SY ³, -NHY ³, -C(=0)-NY ¹Y ² oder -C(=0)-OY ³ steht,

Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander für -H, -IM H2, oder -(CH2)o-3Z' stehen,

Y ³ für -H , -(CH ₂)o-3-CH(N H-C(=0)-CH3)Z',-(CH2)o-3-CH(N H ₂)Z', oder -(CH ₂)o- ₃Z' steht und -H, -S(=0) ₃H, -IMH2 oder -COOH steht.

Sofern der Begriff „Alkyl" nicht weiter definiert ist, steht Alkyl vorzugsweise für C1-C10- Alkyl.

Sofern der Begriff„Halogen" nicht weiter definiert ist, steht Halogen für Fluor( -F), Chlor (-CI) und Brom (-Br).

Besonders bevorzugt sind die folgenden Verbindungen der allgemeinen Formeln (V), (VI) und (VII), in denen R ¹, R ², R ³, R ⁴ und R ⁵ die in der allgemeinen Formel (IIa) angegebenen Bedeutungen haben:

Formel (VI) und

Formel (VII)

Besonders bevorzugt sind die Verbindungen der allgemeinen Formeln (V), (VI) und (VII), in denen

R ¹, R ² und R ⁵ für -H stehen und R ⁴ die in der allgemeinen Formel (IIa) angegebenen Bedeutungen hat.

Insbesondere bevorzugt sind hierbei die Verbindungen der allgemeinen Formel (VI).

Binder, der an einen Rezeptor einer Tumorzelle bindet Der Begriff„Binder" wird im breitesten Sinne als ein Molekül verstanden, welches an ein Zielmolekül, das auf einer bestimmten, mit dem Binder-Wirkstoffkonjugat zu

adressierenden Zielzellen-Population vorhanden ist, bindet. Der Begriff Binder ist in seiner breitesten Auslegung zu verstehen und umfasst z.B. auch Lektine, Proteine die bestimmte Zuckerketten binden können, oder Phospholipid-bindende Proteine. Solche Binder umfassen beispielsweise hochmolekulare Proteine (Bindeproteine), Polypeptide oder

Peptide (Bindepeptide), nicht-peptidische (z.B. Aptamere (US5,270,163) Übersichtsartikel von Keefe AD., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2010; 9:537-550), oder Vitamine) und alle anderen zellbindenden Moleküle oder Substanzen. Bindeproteine sind z.B. Antikörper und Antikörperfragmente oder Antikörpermimetika wie z.B. Affibodies, Adnectins, Anticalins, DARPins, Avimers, Nanobodies (Übersichtsartikel von Gebauer M. et al., Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13:245-255; Nuttall S.D. et al., Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8:608-617). Bindepeptide sind z.B. Liganden eines Liganden-Rezeptorspaares, wie z.B. VEGF des Liganden-Rezeptorpaares VEGF/KDR, wie Transferrin des Liganden- Rezeptorpaares Transferrin/Transferrin-Rezeptor oder Cytokine/Cytokin-Rezeptor, wie TNFalpha des Liganden-Rezeptorpaares TNFalpha/TNFalpha Rezeptor.

Die erfindungsgemäßen Prodrugs enthalten vorzugsweise einen Binder, der an einen Rezeptor einer Tumorzelle binden kann und in der Regel nach Bindung an den Rezeptor von der Tumorzelle internalisiert und intrazellulär, vorzugsweise lysosomal, prozessiert wird. Dieser Binder kann entweder mit der durch das Enyzm Legumain spaltbaren Gruppe gegebenenfalls über einen Linker verbunden sein, so dass nach Spaltung der Legumain- spaltbaren Gruppe der Wirkstoff getrennt von dem Binder bzw. einem Derivat hiervon vorliegt. In diesem Fall stellt -D in der allgemeinen Formel (la) -D-| dar und -R in der allgemeinen Formel (la) stellt (L _c) _r-LIG dar (Ausführungsform A). Ferner kann der Binder mit dem Wirkstoffmolekül gegebenenfalls über einen Linker verbunden sein, so dass nach Spaltung der Legumain-spaltbaren Gruppe der Wirkstoff zusammen mit dem Binder bzw. einem Derivat hiervon vorliegt. In diesem Fall stellt -D in der allgemeinen Formel (la) -Dr (Lb) ₀-LIG dar und R- in der allgemeinen Formel (la) stellt Zi-(C(=0))q- dar

(Ausführungsform B).

Die Verbindungen der Ausführungsform A weisen vorzugsweise die folgende allgemeine Formel (III') auf:

(Ι Ν'),

wobei n, r, LIG, La, Lc, und Di die in der allgemeinen Formel (la) angegebenen

Bedeutungen haben.

Die Verbindungen der Ausführungsform B weisen vorzugsweise die folgende allgemeine Formel (IV) auf:

wobei n, o, R, LIG, La, Lb und Di die in der allgemeinen Formel (la) angegebenen Bedeutungen haben.

Der Binder LIG ist in der Regel ein Peptid, Protein oder Derivat hiervon.

Entsprechende Peptide sind aus der Literatur bekannt (einen Überblick geben D.Böhme und A. Beck-Sickinger, J.Pept.Sci. 2015-21.186; siehe auch B. Forner et al., Specialty Chemicals Magazine, May 2012; V. Ahrens et al., Future Med. Chem. 2012, 4, 1567; W.Tai et al., Mol. Pharmaceutics 201 1 , 8, 901 ; R.Soudy et al.,

J. Med. Chem.2013, 56, 7564 und weitere Referenzen in der Einleitung von R.Soudy et al., M. Langer et al., J. Med. Chem. 2001 , 44, 1341 ; C.Gruendker et al., Oncology Reports 201 1 , 26, 629). Das Peptid bzw. Derivat hiervon wird vorzugsweise ausgewählt aus Octreotid, GnRH-lll, [D-Tyr ⁶, ß-Ala ¹¹, Phe ¹³, Nle ¹⁴]BN(6-14), NT(8-13), c(RGDfK), HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH2 (SEQ ID NO: 161 ),

NAPamide, [Phe ⁷, Pro ³⁴]NPY, HER2-targeting peptide, ATEPRKQYATPRVFWTDAPG (SEQ ID NO: 162) oder LQWRRDDNVHNFGVWARYRL (SEQ ID NO: 163) [die Peptidsequenzen sind hier im geläufigen 1 -Buchstaben-Code für Aminosäuren angegeben]. Es ist möglich, weitere Peptidsequenzen mit Hilfe eines Screening- Verfahrens zu ermitteln, wie in Umlauf et al, Bioconj.Chem. 2014, Oct. 15; 25(10): 1829-37 beschrieben.

Im Falle der Ausführungsform A kann das Peptid direkt (z.B. mit seinem C-Terminus) an den N-Terminus der Legumain-spaltbaren Gruppe durch eine Peptidbindung gebunden sein. Es ist auch möglich, dass das Peptid über einen Linker Lc an den N- Terminus der Legumain-spaltbaren Gruppe gebunden ist, wobei der Linker

vorzugsweise an den C- oder N-Terminus des Peptids oder an eine Lysin- oder Cystein-Seitenkette des Peptids gebunden wird.

Im Falle der Ausführungsform B kann das Peptid direkt an das Wirkstoffmolekül gebunden sein. Es ist jedoch bevorzugt, dass das Peptid über einen Linker Lb an das Wirkstoffmolekül gebunden ist, wobei der Linker vorzugsweise an den C- oder N- Terminus des Peptids oder an eine Lysin- oder Cystein-Seitenkette des Peptids gebunden wird. Die Bindung von Lb bzw. des Peptids erfolgt in der Regel durch Substitution eines H-Atoms im Wirkstoffmolekül.

So können im Falle der Verbindungen der allgemeinen Formeln (IIa), (IIb), (llc), (lld), (V), (VI) oder (VII) durch Substitution eines H-Atoms an R ¹, R ², R ³, R ⁵ oder R ⁸ in einer dem Durchschnittsfachmann bekannten Weise Konjugate erhalten werden, wobei einer der Substituenten R ¹, R ², R ³, R ⁵, oder R ⁸ -(L ) ₀-LIG darstellt.

Besonders bevorzugt wird als Binder LIG ein Antikörper bzw. ein Antigen-bindendes Fragment oder Derivat hiervon, der bzw. das an ein extrazelluläres Zielmolekül einer Tumorzelle bindet. Besonders bevorzugt ist LIG ein Antikörper bzw. Fragment hiervon, an den bzw. an das ein oder mehrere cytotoxische Wirkstoffmoleküle gebunden sind. Im Falle der Ausführungsform A sind die erfindungsgemäßen Verbindungen also Antikörper-Drug-Konjugate (ADCs) der folgenden allgemeinen Formel (lila'):

(lila'), wobei n, r, La, Lc und Di die in der allgemeinen Formel (la) angegebenen Bedeutungen haben, AB einen Antikörper darstellt, und s eine Zahl von 1 bis 20, vorzugsweise 2 bis 8, besonders bevorzugt 2 bis 6 wie z.B. 4 darstellt.

Hierbei ist Di vorzugsweise eine Verbindung der allgemeinen Formel (IIa), (IIb), (llc), (lld), (V), (VI) oder (VII), wobei ein Substituent ausgewählt aus R ¹, R ², R ³, R ⁴, R ⁸ nicht die oben unter den allgemeinen Formeln (IIa), (IIb), (llc), (lld), (V), (VI) und (VII) angegebenen Bedeutungen aufweist, sondern für eine Bindung an La, also den self-immolative linker bzw. eine Bindung an eine Carbonylgruppe steht.

Im Falle der Ausführungsform B sind die erfindungsgemäßen Verbindungen Antikörper- Prodrug-Konjugate (APDCs) der folgenden allgemeinen Formel (IVa'):

(IVa'),

in der n, o, R, La und Lb die in der allgemeinen Formel (la) angegebenen Bedeutungen haben und AB einen Antikörper darstellt, und s eine Zahl von 1 bis 20, vorzugsweise 2 bis 8, besonders bevorzugt 2 bis 6 wie z.B. 4 darstellt. Hierbei ist Di vorzugsweise eine Verbindung gemäß den allgemeinen Formeln (IIa), (IIb), (llc), (lld), (V), (VI) oder (VII), wobei ein Substituent R ⁴ nicht die oben unter den allgemeinen Formenl (IIa), (IIb), (llc), (lld), (V), (VI) oder (VII) angegebene Bedeutung aufweist, sondern die Bindung an La bzw. eine Carbonylgruppe darstellt.

Der Antikörper (wie z.B. AB in obigen allgemeinen Formeln (lila) und (IVa) ist

vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon, insbesondere ein anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR-Antikörper, ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2 -Antikörper oder eine Antigen-bindendes Fragment von diesen. Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAKR- Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP-10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2-Antikörper Trastuzumab und TPP-1015 oder eine Antigen-bindendes Fragment von diesen.

Aus der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Antikörper bekannt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Konjugation an den Antikörper über ein oder mehrere Schwefelatome von Cystein-Resten des Antikörpers und/oder über ein oder mehrere NH-Gruppen von Lysin-Resten des Antikörpers. Es ist jedoch auch möglich, das organische Molekül an den Antikörper über freie Carboxylgruppen oder über Zuckerreste des Antikörpers zu binden.

Der Antikörper bindet an ein extrazelluläres Zielmolekül der Tumorzelle. Ein„Zielmolekül" wird im breitesten Sinne als ein Molekül verstanden, welches in der Zielzellenpopulation vorhanden ist, und kann ein Protein (z.B. ein Rezeptor eines Wachstumsfaktors) oder ein nicht-peptidisches Molekül sein (z.B. ein Zucker oder Phospholipid). Bevorzugt ist es ein Rezeptor oder ein Antigen.

Der Begriff„extrazelluläres" Zielmolekül beschreibt ein an die Zelle gebundenes

Zielmolekül, welches sich auf der Außenseite einer Zelle befindet oder den Teil eines Zielmoleküls, welcher sich auf der Außenseite einer Zelle befindet, d.h. ein Antikörper kann an einer intakten Zelle an sein extrazelluläres Zielmolekül binden. Ein extrazelluläres Zielmolekül kann in der Zellmembran verankert sein oder Bestandteil der Zellmembran sein. Der Fachmann kennt Verfahren, um extrazelluläre Zielmoleküle zu identifizieren. Für Proteine kann dies über eine Bestimmung der Transmembrandomäne(n) und die

Orientierung des Proteins in der Membran geschehen. Diese Angaben sind in der Regel in Proteindatenbanken (z.B. SwissProt) hinterlegt.

Der Begriff„Krebs-Zielmolekül" beschreibt ein Zielmolekül, welches auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus vermehrt vorhanden ist. Bevorzugt ist das Krebs-Zielmolekül auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus selektiv vorhanden, wobei selektiv eine mindestens zweifache Anreicherung auf Krebszellen im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus beschreibt (ein„selektives Krebs-Zielmolekül"). Die Verwendung von Krebs-Zielmolekülen erlaubt die selektive Therapie von Krebszellen mit den erfindungsgemäßen Konjugaten.

Unter dem Begriff "Binder" wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Binderpeptid, ein Derivat eines Binderpeptids, ein Binderprotein oder ein Derivat eines Binderproteins verstanden. Der Binder ist über eine Bindung mit dem Linker verknüpft. Die Verknüpfung des Binders kann mittels eines Heteroatoms des Binders erfolgen. Erfindungsgemäße Heteroatome des Binders, die zur Verknüpfung verwendet werden können, sind:

Schwefel, über eine Sulfhydrylgruppe des Binders, Sauerstoff , über eine Carboxylgruppe oder Hydroxylgruppe des Binders und

Stickstoff, über eine primäre oder sekundäre Amingruppe.

Insbesondere wird gemäß der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff„Binder" ein Antikörper verstanden.

Die oben aufgeführten Heteroatome können im natürlichen Antikörper vorhanden sein oder durch chemische oder molekularbiologische Methoden eingeführt werden.

Erfindungsgemäß hat die Verknüpfung des Antikörpers mit dem organischen Rest in Formel (I) nur einen geringen Einfluß auf die Bindeaktivität des Antikörpers zum

Zielmolekül.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Verknüpfung keinen Einfluß auf die Bindeaktivität des Binders zum Zielmolekül.

Der Begriff "Antikörper" wird gemäß der vorliegenden Erfindung in seinem breitesten Sinne verstanden und umfasst Immunglobulinmoleküle, beispielsweise intakte oder modifizierte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper oder multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper). Ein Immunglobulinmolekül umfasst bevorzugt ein Molekül mit vier Polypeptidketten, zwei schwere Ketten (H Ketten) und zwei leichte Ketten (L Ketten), welche typischerweise durch Disulfidbrücken verknüpft sind. Jede schwere Kette umfasst eine variable Domäne der schweren Kette (abgekürzt VH) und konstante Domäne der schweren Kette. Die konstante Domäne der schweren Kette kann beispielsweise drei Domänen CH1 , CH2 und CH3 umfassen. Jede leichte Kette umfasst eine variable Domäne (abgekürzt VL) und eine konstante Domäne. Die konstante Domäne der leichten Kette umfasst eine Domäne (abgekürzt CL). Die VH und VL Domänen können weiter unterteilt werden in Regionen mit Hypervariabilität, auch Komplementaritäts-bestimmende Regionen genannt („complementarity determining region", abgekürzt CDR) und Regionen mit geringerer Sequenzvariabilität („framework region", abgekürzt FR). Jede VH und VL Region setzt sich typischerweise aus drei CDRs und bis zu vier FRs zusammen. Beispielsweise vom Aminoterminus zum

Carboxyterminus in der folgenden Reihenfolge FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Ein Antikörper kann aus jeder dafür geeeigneten Spezies erhalten werden z.B. Kaninchen, Lama, Kamel, Maus, oder Ratte. In einer Ausführungsform ist der Antikörper humanen oder murinen Ursprungs. Ein Antikörper kann z.B. human, humanisiert oder chimär sein.

Der Begriff„monoklonaler" Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einer Population substantiell homogener Antikörper erhalten wurde, d.h. individuelle Antikörper der Population sind bis auf natürlich auftretende Mutationen, welche in geringfügiger Anzahl auftreten können, identisch. Monoklonale Antikörper erkennen mit hoher Spezifität eine einzige antigene Bindestelle. Der Begriff monoklonaler Antikörper bezieht sich nicht auf ein bestimmtes Herstellungsverfahren.

Der Begriff„intakter" Antikörper bezieht sich auf Antikörper, die sowohl eine Antigen- bindende Domäne als auch die konstante Domäne der leichten und schweren Kette umfassen. Die konstante Domäne kann eine natürlich vorkommende Domäne sein, oder eine Variante davon, bei der mehrere Aminosäurepositionen verändert wurden.

Der Begriff „modifizierter intakter" Antikörper bezieht sich auf intakte Antikörper, die mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Aminoterminus oder Carboxyterminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüpfung) fusioniert wurden. Des Weiteren können Antikörper dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug;26(8):925-32).

Der Begriff„humaner" Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einem Menschen erhalten werden können oder synthetische humane Antikörper sind. Ein„synthetischer" humaner Antikörper ist ein Antikörper, der in Teilen oder schweren als ganzes von synthetischen Sequenzen in silico erhältlich ist, die auf der Analyse humaner

Antikörpersequenzen basieren. Ein humaner Antikörper kann z.B. durch eine

Nukleinsäure kodiert sein, die aus einer Bibliothek von Antikörpersequenzen, die humanen Ursprungs sind, isoliert wurde. Ein Beispiel solcher Antikörper ist in Söderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856 zu finden.

Der Begriff„humanisierter" oder„chimärer" Antikörper beschreibt Antikörper, die aus einem nicht-humanen und einem humanen Sequenzanteil bestehen. Bei diesen

Antikörpern wird ein Teil der Sequenzen des humanen Immunoglobulins (Rezipient) durch Sequenzanteile eines nicht-humanen Immunoglobulins (Donor) ersetzt. Der Donor ist in vielen Fällen ein murines Immunoglobulin. Bei humanisierten Antikörpern werden

Aminosäuren der CDR des Rezipienten durch Aminosäuren des Donors ersetzt.

Manchmal werden auch noch Aminosäuren des Frameworks durch korrespondierende Aminosäuren des Donors ersetzt. In machen Fällen enthält der humanisierte Antikörper Aminosäuren, die weder im Rezipient noch im Donor enthalten waren und die während der Optimierung des Antikörpers eingefügt wurden. Bei Chimären Antikörpern werden die variablen Domänen des Donor-Immunoglobulins mit den konstanten Regionen eines humanen Antikörpers fusioniert. Der Begriff Komplementaritäts-bestimmende Region (CDR) wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf diejenigen Aminosäuren einer variablen Antikörperdomäne, die für die Bindung an das Antigen notwendig sind. Jede variable Region hat typischerweise drei CDR Regionen, welche als CDR1 , CDR2 und CDR3 bezeichnet werden. Jede CDR Region kann Aminosäuren nach der Definition von Kabat und/oder Aminosäuren eines Hypervariablen Loops definiert nach Chotia umfassen. Die Definition nach Kabat umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 24 - 34 (CDR1 ), 50 - 56 (CDR2) und 89 - 97 (CDR3) der variablen leichten Kette und 31 - 35 (CDR1 ), 50 - 65 (CDR2) und 95 - 102 (CDR3) der variablen schweren Kette (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991 )). Die Definition nach Chotia umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 26 - 32 (CDR1 ), 50 - 52 (CDR2) und 91 -96 (CDR3) der variablen leichetn Kette und 26 - 32 (CDR1 ), 53 - 55 (CDR2) und 96 - 101 (CDR3) der variablen schweren Kette Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901 -917 (1987)). In manchen Fällen kann eine CDR Aminosäuren aus einer CDR Region definiert nach Kabat und Chotia umfassen.

Abhängig von der Aminosäure-Sequenz der konstanten Domäne der schweren Kette können Antikörper in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Es gibt fünf Hauptklassen von intakten Antikörpern: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, wobei mehrere davon in weitere Unterklassen aufgegliedert werden können. (Isotypen), z.B. lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 und lgA2. Die konstante Domäne der schweren Kette, die zu den unterschiedlichen Klassen korrespondieren, werden als [alpha/a], [delta/δ], [epsilon/ε], [gamma/γ] und [my/μ] bezeichnet. Sowohl die dreidimensionale Struktur als auch die Untereinheitenstruktur von Antikörpern sind bekannt. Der Begriff„funktionales Fragment" oder„antigen-bindendes Antikörperfragment" eines Antikorpers/Immunoglobulins ist definiert als ein Fragment eines

Antikorpers/Immunoglobulins (z.B. die variable Domänen eines IgG), welches die Antigen- Bindedomänen des Antikorpers/Immunoglobulins noch umfasst. Die„Antigen- Bindedomäne" eines Antikörpers umfasst typischerweise eine oder mehrere

Hypervariable Regionen eines Antikörpers, z.B. die CDR, CDR2 und/oder CDR3 Region. Allerdings kann auch die„Framework" oder die„Gerüst" Region eines Antikörpers zur Bindung des Antikörpers an das Antigen eine Rolle spielen. Die Framework Region bildet das Gerüst für die CDRs. Vorzugsweise umfasst die Antigen-Bindedomäne mindestens die Aminosäuren 4 bis 103 der variablen leichten Kette und Aminosäure 5 bis 109 der variablen schweren Kette, bevorzugter die Aminosäure 3 bis 107 der variablen leichten Kette und 4 bis 1 1 1 der variablen schweren Kette, besonders bevorzugt sind die kompletten variablen leichten und schweren Ketten , also Aminosäure 1 - 109 der VL und 1 bis 1 13 der VH (Nummerierung nach WO97/08320).

„Funktionale Fragmente" oder„antigen-bindende Antikörperfragmente" der Erfindung umfassen nicht abschliessend Fab, Fab', F(ab')2 und Fv Fragmente, Diabodies, Single Domain Antibodies (DAbs), linerae Antikörper, Einzelketten Antikörper (single-chain Fv, abgekürzt scFv); und multispezifische, wie z.B. bi- und tri-spezifische, Antikörper, gebildet aus Antikörperfragmenten C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S.

Duebel, editors (2001 ) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Andere Antikörper als„multi-spezifische" oder„multi-funktionale" sind solche mit identischen Bindestellen. Multispezifische Antikörper können spezifisch für

unterschiedliche Epitope eines Antigens sein oder spezifisch für Epitope von mehr als einem Antigen sein (siehe z.B. WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO

92/05793; Tutt, et al., 1991 , J. Immunol. 147:60 69; U. S. Pat. Nos. 4,474,893; 4,7 14,68 1 ; 4,925,648; 5,573,920; 5,601 ,8 19; oder Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553). Ein F(ab')2 oder Fab Molekül kann so konstruiert werden, dass die Zahl der intermolekularen Disulfidinteraktionen, die zwischen den Chi und den CL Domänen stattfindet, reduziert oder oder komplett verhindert werden kann. „Epitope" bezeichnen Proteindeterminanten, die eine spezifische Bindung mit einem Immunglobulin oder T-Zell-Rezeptoren eingehen können. Epitopische Determinanten bestehen normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, oder Kombinationen hiervon, und weisen normalerweise spezifische 3-dimensionale Struktureigenschaften wie auch spezifische Ladungseigenschaften auf.

„Funktionale Fragmente" oder„antigen-bindende Antikörperfragmente" können mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Aminoterminus oder Carboxyterminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüpfung) fusioniert werden. Des Weiteren können Antikörper und antigen- bindende Fragmente dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32).

Polyklonale Antikörper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden. Monoklonale Antiköper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Humane bzw. humanisierte monoklonale Antiköper können durch für den

Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Olsson et al., Meth Enzymol. 92, 3-16 bzw. Cabilly et al US 4,816,567 oder Boss et al US 4,816,397). Der Durchschnittsfachmann kennt vielfältige Methoden, um humane Antikörper und deren Fragmente herzustellen, wie beispielsweise mittels transgener Mäuse (N Lonberg und D Huszar, Int Rev Immunol. 1995; 13(1 ):65-93) oder Phage Display Technologien (Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8). Antikörper der Erfindung können aus rekombinanten Antikörperbibliotheken erhalten werden, die z.B. auf den

Aminosäuresequenzen einer Vielzahl von Antikörpern besteht, die aus einer großen Anzahl gesunder Freiwilliger erstellt wurden. Antikörper können auch mittels bekannter rekombinanter DNS-Technologien hergestellt werden. Die Nukleinsäuresequenz eines Antikörpers kann durch Routinesequenzierung erhalten werden, oder ist aus öffentlich zugänglichen Datenbanken erhältlich. Ein„isolierter" Antikörper oder Binder wurde von anderen Bestandteilen der Zelle gereinigt. Kontaminierende Bestandteile einer Zelle, welche mit einer diagnostischen oder therapeutischen Verwendung interferieren können, sind z.B. Enzyme, Hormone, oder andere peptidische- oder nicht-peptidische Bestandteile einer Zelle. Bevorzugt ist ein Antikörper oder Binder, der zu mehr als 95 Gew-% bezogen auf den Antikörper bzw. Binder aufgereinigt wurde (bestimmt durch z.B. Lowry Verfahren, UV-Vis Spektroskopie oder durch SDS-Kapillargelelektrophorese). Ausserdem ein Antikörper, der soweit aufgereinigt wurde, dass mindestens 15 Aminosäuren des Aminoterminus oder einer internen Aminosäuresequenz bestimmt werden können, oder zur Homogenität aufgereinigt wurde, wobei die Homogenität bestimmt wird durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen (die Detektion kann mittels Coomassie Blau Anfärbung oder bevorzugt durch Silberfärbung bestimmt werden).

Jedoch wird ein Antikörper normalerweise durch einen oder mehrere Reinigungsschritte hergestellt. Der Begriff„spezifische Bindung" oder„bindet spezifisch" bezieht sich auf einen

Antikörper oder Binder, der an ein vorbestimmtes Antigen/Zielmolekül bindet. Spezifische Bindung eines Antikörpers oder Binders beschreibt typischerweise einen Antikörper bzw. Binder mit einer Affinität von mindestens 10 ^"7 M_(als Kd-Wert; also vorzugsweise solche mit kleineren Kd-Werten als 10 ^"^ M), wobei der Antikörper bzw. Binder eine mindestens zweifach höhere Affinität zum vorbestimmten Antigen/Zielmolekül als zu einem nichtspezifischen Antigen/Zielmolekül hat (z.B. Rinder Serumalbumin, oder Casein), welches nicht das vorbestimmte Antigen/Zielmolekül oder ein eng verwandtes Antigen/Zielmolekül ist. Spezifische Bindung eines Antikörpers oder Binders schließt nicht aus, dass der Antikörper oder Binder an mehrere Antigene/Zielmoleküle bindet (z.B. Orthologe aus verschiedenen Spezies). Die Antikörper weisen vorzugsweise eine Affinität von mindestens 10 ^"^ M (als Kd-Wert; also vorzugsweise solche mit kleineren Kd-Werten als 10 ^~7 M), vorzugsweise von mindestens 10 ^"8 M, besonders bevorzugt in dem Bereich von 10 ^-9 M bis KT M auf. Die Kd-Werte können durch z.B.

Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie bestimmt werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper-Wirkstoff-Konjugate weisen ebenfalls Affinitäten in diesen Bereichen auf. Durch die Konjugation der Wirkstoffe wird die Affinität vorzugsweise nicht wesentlich beeinflusst (in der Regel wird die Affinität weniger als eine

Größenordnung verringert, also z.B. maximal von 10 ^"8 M auf 10 ^"^ M).

Die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper zeichnen sich weiterhin vorzugsweise durch eine hohe Selektivität aus. Eine hohe Selektivität liegt vor, wenn der

erfindungsgemäße Antikörper eine mindestens um den Faktor 2, bevorzugt Faktor 5 oder insbesondere bevorzugt Faktor 10 bessere Affinität am Zielprotein aufweisst als an einem unabhängigen anderen Antigen, z.B. humanem Serumalbumin (die Affinität kann z.B. durch Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestimmt werden). Zudem sind die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper vorzugsweise kreuzreaktiv. Um präklinische Studien, z.B. toxikologische oder Wirksamkeitsstudien (z.B. in Xenograft- Mäusen), zu erleichtern und besser interpretieren zu können, ist es von Vorteil, wenn der erfindungsgemäß verwendete Antikörper nicht nur das humane Zielprotein bindet, sondern auch in der für die Studien verwendeten Spezies das Spezies-Zielprotein bindet. In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies. Für toxikologische und Wirksamkeitsstudien werden bevorzugt Spezien der Familien Nager, Hunde und nicht-humane Primaten, verwendet. Bevorzugte Nager Spezien sind Maus und Ratte. Bevorzugte nicht-humane Primaten sind Rhesusaffen, Schimpansen und Langschwanzmakaken.

In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies ausgewählt aus der Gruppe von Spezien bestehend aus Maus, Ratte und

Langschwanzmakak (Macaca fascicularis). Insbesondere bevorzugt sind

erfindungsgemäß verwendete Antikörper, die zusätzlich zum humanen Zielprotein mindestens kreuzreaktiv zum Maus-Zielprotein sind. Bevorzugt sind kreuzreaktive Antikörper, deren Affinität zum Zielprotein der weiteren nicht-humanen Spezies sich nicht um mehr als den Faktor 50, insbesondere nicht mehr als den Faktor zehn von der Affinität zum humanen Zielprotein unterscheidet.

Gegen ein Krebs-Zielmolekül gerichtete Antikörper

Bevorzugt ist das Zielmolekül, gegen das der Binder, z.B. ein Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon, gerichtet ist, ein Krebs-Zielmolekül. Der Begriff„Krebs- Zielmolekül" beschreibt ein Zielmolekül, welches auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus vermehrt vorhanden ist. Bevorzugt ist das Krebs-Zielmolekül auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus selektiv vorhanden, wobei selektiv eine mindestens zweifache Anreicherung auf Krebszellen im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus beschreibt (ein„selektives Krebs-Zielmolekül"). Die

Verwendung von Krebs-Zielmolekülen erlaubt die selektive Therapie von Krebszellen mit den erfindungsgemäßen Konjugaten. Antikörper, welche spezifisch gegen ein Antigen, wie z.B. ein Krebszell-Antigen, gerichtet sind, können vom Durchschnittsfachmann mittels ihm bekannter Verfahren hergestellt werden (wie z.B. rekombinante Expression) oder kommerziell erworben werden (wie z.B. von Merck KGaA, Deustchland). Beispiele bekannter kommerziell erhältlicher Antikörper in der Krebstherapie sind Erbitux® (Cetuximab, Merck KGaA), Avastin® (Bevacizumab, Roche) und Herceptin® (Trastuzumab, Genentech). Trastuzumab ist ein rekombinanter humanisierter monokloaler Antikörper vom IgGl kappa Typ, welcher mit hoher Affinität in einem Zell-basierten Assay (Kd = 5 nM) die extrazelluläre Domäne des humanen epidermalen Wachstumsrezeptors bindet. Der Antikörper wird rekombinant in CHO-Zellen hergestellt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Zielmolekül ein selektives Krebs- Zielmolekül.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Zielmolekül ein Protein.

In einer Ausführungsform ist das Zielmolekül ein extrazelluläres Zielmolekül. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das extrazelluläre Zielmolekül ein Protein.

Krebs-Zielmoleküle sind dem Fachmann bekannt. Beispiele hierfür sind im Folgenden aufgeführt.

Beispiele für Krebs-Zielmoleküle sind:

(1 ) EGFR (EGF-Rezeptor, NCBI-Referenzsequenz NP_005219.2, NCBI-Gene ID: 1956) (2) Mesothelin (SwissProt-Referenz Q13421 -3), wobei Mesothelin von den Aminosäuren 296-598 kodiert wird. Aminosäuren 37-286 kodieren für "megakaryocyte-potentiating factor". Mesothelin ist durch einen GPI-Anker in der Zellmembran verankert und ist extrazellulär lokalisiert.

(3) Carboanhydrase IX (CA9, SwissProt-Referenz Q16790), NCBI-Gene ID: 768) (4) C4.4a (NCBI -Referenzsequenz NP_055215.2; Synonym LYPD3, NCBI-Gene ID: 27076)

(5) CD52 (NCBI-Referenzsequenz NP_001794.2)

(6) HER2 (ERBB2; NCBI-Referenzsequenz NP_004439.2; NCBI-Gene ID: 2064) (7) CD20 (NCBI-Referenzsequenz NP_068769.2)

(8) das Lymphozyten Aktivierungsantigen CD30 (SwissProt ID P28908)

(9) das Lymphozyten Adhesionsmolekül CD22 (SwissProt ID P20273; NCBI-Gene ID: 933) (10) das Myloidzellen Oberflächenantigen CD33 (SwissProt ID P20138; NCBI-Gene ID: 945)

(1 1 ) das Transmembran Glykoprotein NMB (GPNMB, SwissProt ID Q14956, NCBI-Gene ID: 10457)

(12) das Adhesionsmolekül CD56 (SwissProt ID P13591 ) (13) das Oberflächenmolekül CD70 (SwissProt ID P32970, NCBI-Gene ID: 970)

(14) das Oberflächenmolekül CD74 (SwissProt ID P04233, NCBI-Gene ID: 972)

(15) das B-Lymphozyten Antigen CD19 (SwissProt ID P15391 , NCBI-Gene ID: 930)

(16) das Oberflächenprotein Mucin-1 (MUC1 , SwissProt ID P15941 , NCBI-Gene ID: 4582)

(17) das Oberflächenprotein CD138 (SwissProt ID P18827) (18) das Integrin alphaV (NCBI -Referenzsequenz: NP_002201.1 , NCBI-Gene ID: 3685)

(19) das teratocarcinoma-derived growth factor 1 Protein TDGF1 (NCBI - Referenzsequenz: NP_003203.1 , NCBI-Gene ID: 6997)

(20) das Prostata spezifische Membranantigen PSMA (Swiss Prot ID: Q04609; NCBI- Gene ID: 2346) (21 ) die Tyrosin-Proteinkinase EPHA2 (Swiss Prot ID: P29317, NCBI-Gene ID: 1969)

(22) das Oberflächenprotein SLC44A4 (NCBI -Referenzsequenz: NP_001 171515.1 , NCBI-Gene ID: 80736)

(23) das Oberflächenprotein BMPR1 B (SwissProt: 000238)

(24) das Transportprotein SLC7A5 (SwissProt: Q01650) (25) das epitheliale Psostataantigen STEAP1 (SwissProt: Q9UHE8, Gene ID: 26872)

(26) das Ovarkarzinomantigen MUC16 (SwissProt: Q8WXI7, Gene ID: 94025)

(27) das Transportprotein SLC34A2 (SwissProt: 095436, Gene ID: 10568)

(28) das Oberflächenprotein SEMA5b (SwissProt: Q9P283)

(29) das Oberflächenprotein LYPD1 (SwissProt: Q8N2G4)

(30) der Endothelin Rezeptor Typ B EDNRB (SwissProt: P24530, NCBI-Gene ID: 1910)

(31 ) das Ringfingerprotein RNF43 (SwissProt: Q68DV7)

(32) das Prostatakarzinom-assoziierte Protein STEAP2 (SwissProt: Q8NFT2)

(33) der Kationenkanal TRPM4 (SwissProt: Q8TD43)

(34) der Komplementrezeptor CD21 (SwissProt: P20023)

(35) das B-Zell Antigen Rezeptorkomplex-assoziierte Protein CD79b (SwissProt: P40259, NCBI-Gene ID: 974)

(36) das Zelladhäsionsantigen CEACAM6 (SwissProt: P40199)

(37) die Dipeptidase DPEP1 (SwissProt: P16444)

(38) der Interleukinrezeptor IL20Ralpha (SwissProt: Q9UHF4, NCBI-Gene ID: 3559)

(39) das Proteoglykan BCAN (SwissProt: Q96GW7)

(40) der Ephrin Rezeptor EPHB2 (SwissProt: P29323)

(41 ) das Prostatastammzellen-assoziierte Protein PSCA (NCBI -Referenzsequenz:

NP_005663.2 )

(42) das Oberflächenprotein LHFPL3 (SwissProt: Q86UP9)

(43) das Rezeptorprotein TNFRSF13C (SwissProt: Q96RJ3)

(44) das B-Zell Antigen Rezeptorkomplex-assoziierte Protein CD79a (SwissProt: P1 1912) (45) das Rezeptorprotein CXCR5 (CD185; SwissProt: P32302; NCBI-Gene ID 643, NCBI -Referenzsequenz: NP_001707.1 )

(46) der lonenkanal P2X5 (SwissProt: Q93086)

(47) das Lymphozytenantigen CD180 (SwissProt: Q99467) (48) das Rezeptorprotein FCRL1 (SwissProt: Q96LA6)

(49) das Rezeptorprotein FCRL5 (SwissProt: Q96RD9)

(50) das MHC Klasse II Molekül la Antigen HLA-DOB (NCBI -Referenzsequenz:

NP_0021 1 1 .1 )

(51 ) das T-Zell Protein VTCN1 (SwissProt: Q7Z7D3) (52) TWEAKR (FN14, TNFRSF12A, NCBI -Referenzsequenz: NP_057723.1 , NCBI-Gene ID: 51330)

(53) das Lymphozytenantigen CD37 (Swiss Prot: P1 1049, NCBI-Gene ID: 951 )

(54) Der FGF Rezeptor 2; FGFR2 (NCBI-Gene ID: 2263; Official Symbol: FGFR2). Der FGFR2 Rezeptor kommt in verschiedenen Spleißvarianten vor (alpha, beta, lllb, lllc). Alle Spleißevarianten können als Zielmolekül fungieren.

(55) das transmembrane Glycoprotein B7H3 (CD276; NCBI-Gene ID: 80381 NCBI - Referenzsequenz: NP_001019907.1 , Swiss Prot: Q5ZPR3-1 )

(56) der B Zell Rezeptor BAFFR (CD268; NCBI-Gene ID: 1 15650)

(57) das Rezeptorprotein ROR 1 (NCBI-Gene ID: 4919) (58) der Oberflächenrezeptor CD123 (IL3RA; NCBI-Gene ID: 3563; NCBI - Referenzsequenz: NP_002174.1 ; Swiss-Prot: P26951 )

(59) das Rezeptorprotein Syncytin ( NCBI-Gene ID 30816)

(60) die Aspartat beta Hydroxylase (ASPH; NCBI-Gene ID 444)

(61 ) das Zelloberflächen Glycoprotein CD44 (NCBI-Gene ID: 960) (62) CDH15 (Cadherin 15, NCBI-Gene ID: 1013)

(63) das Zelloberflächen Glycoprotein CEACAM5 (NCBI-Gene ID: 1048)

(64) das Zelladhäsionsmolekül L1 -Iike (CHL1 , NCBI-Gene ID: 10752)

(65) die Rezeptortyrosin-Kinase c-Met (NCBI-Gene ID: 4233) (66) der Notch Ligand DLL3 (NCBI-Gene ID: 10683)

(67) das Ephrin A4 (EFNA4, NCBI-Gene ID: 1945)

(68) die Ectonucleotid-Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 3 (ENPP3, NCBI-Gene ID: 5169)

(69) der Koagulationsfaktor III (F3, NCBI-Gene ID: 2152) (70) der FGF Rezeptor 3 (FGFR3, NCBI-Gene ID: 2261 )

(71 ) die Folatehydrolase FOLH1 (NCBI-Gene ID: 2346)

(72) der Folaterezeptor 1 (FOLR1 ; NCBI-Gene ID: 2348)

(73) die Guanylatzyklase 2C (GUCY2C, NCBI-Gene ID: 2984)

(74) die KIT proto-Oncogen Receptortyrosinkinase (NCBI-Gene ID: 3815) (75) das lysosomal-assoziierte Membranprotein 1 (LAMP1 , NCBI-Gene ID: 3916)

(76) der Lymphocytenantigen 6 Complex, locus E (LY6E, NCBI-Gene ID: 4061 )

(77) das Protein NOTCH3 (NCBI-Gene ID: 4854)

(78) die Proteintyrosinkinase 7 (PTK7, NCBI-Gene ID: 5754)

(79) das Nectin Zelladhäsionsmolekül 4 (PVRL4, NECTIN4, NCBI-Gene ID: 81607) (80) das Transmembranprotein Syndecan 1 (SDC1 , NCBI-Gene ID: 6382)

(81 ) das SLAM Familienmitglied 7 (SLAMF7, NCBI-Gene ID: 57823)

(82) das Transportprotein SLC39A6 (NCBI-Gene ID: 25800) (83) das SLIT und NTRK artige Familienmitglied 6 (SLITRK6, NCBI-Gene ID: 84189)

(84) der Zelloberflächenrezeptor TACSTD2 (NCBI-Gene ID: 4070)

(85) das Rezeptorprotein TNFRSF8 (NCBI-Gene ID: 943)

(86) das Rezeptorprotein TNFSF13B (NCBI-Gene ID: 10673) (87) das Glykoprotein TPBG (NCBI-Gene ID: 7162)

(88) der Zelloberflächenrezeptor TROP2 (TACSTD2, NCBI-Gene ID: 4070)

(89) der Galanin-like G Protein-gekoppelte Rezeptor KISS1 R (GPR54, NCBI-Gene ID: 84634)

(90) das Transportprotein SLAMF6 (NCBI-Gene ID: 1 14836) In einem bevorzugten Gegenstand der Erfindung ist das Krebs-Zielmolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Krebs-Zielmolekülen (1 ) - (90), insbesondere

TWEAKR, B7H3, EGFR und HER2.

In einem weiteren besonders bevorzugten Gegenstand der Erfindung bindet der Binder an ein extrazelluläres Krebs-Zielmolekül, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus aus den Krebs-Zielmolekülen (1 ) - (90), insbesondere TWEAKR, B7H3, EGFR und HER2.

In einem weiteren besonders bevorzugten Gegenstand der Erfindung bindet der Binder spezifisch an ein extrazelluläres Krebs-Zielmolekül, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus aus den Krebs-Zielmolekülen (1 ) - (90), insbesondere TWEAKR, B7H3, EGFR und HER2. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Binder nach Bindung an sein extrazelluläres Zielmolekül auf der Zielzelle durch die Bindung von der Zielzelle internalisiert. Dies bewirkt, dass das Binder-Wirkstoffkonjugat, welches ein Immunokonjugat oder ein ADC sein kann, von der Zielzelle aufgenommen wird.

Anschliessend wird der Binder vorzugsweise intrazellulär, bevorzugt lysosomal, prozessiert.

In einer Ausführungsform ist der Binder ein Bindeprotein. In einer bevorzugten

Ausführungsform ist der Binder ein Antikörper, ein antigen-bindendes Antikörperfragment, ein multispezifischer Antikörper oder ein Antikörpermimetikum. Bevorzugte Antikörpermimetika sind Affibodies, Adnectins, Anticalins, DARPins, Avimers, oder Nanobodies. Bevorzugte multispezifischer Antikörper sind bispezifische und trispezifische Antikörper.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Binder ein Antikörper oder ein antigen- bindendes Antikörperfragment, weiter bevorzugt ist ein isolierter Antikörper oder ein isoliertes antigen-bindendes Antikörperfragment.

Bevorzugte antigen-bindende Antikörperfragmente sind Fab, Fab', F(ab')2 und Fv

Fragmente, Diabodies, DAbs, lineare Antikörper und scFv. Besonders bevorzugt sind Fab, Diabodies und scFv. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Binder ein Antikörper. Besonders bevorzugt sind monoklonale Antikörper oder antigen-bindende Antikörperfragmente davon. Weiter besonders bevorzugt sind humane, humanisierte oder chimäre Antikörper oder antigen-bindende Antikörperfragmente davon.

Antikörper oder antigen-bindende Antikörperfragmente, die Krebs-Zielmoleküle binden, können vom Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. chemische Synthese oder rekombinante Expression. Binder für Krebs-Zielmoleküle können kommerziell erworben werden oder können durch den Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. chemische Synthese oder

rekombinante Expression. Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder antigen-bindenden Antikörperfragmenten sind in WO 2007/070538 beschrieben (siehe Seite 22„Antibodies"). Der Fachmann kennt Verfahren wie sogenannte Phage-Display Bibliotheken (z.B. Morphosys HuCAL Gold) erstellt und zur Auffindung von Antikörpern oder antigen-bindenden Antikörperfragmenten verwendet werden können (siehe WO 2007/070538, Seite 24 ff und AK-Beispiel 1 auf Seite 70, AK-Beispiel 2 auf Seite 72). Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörper, die DNA Bibliotheken aus B-Zellen verwenden, sind zum Beispiel auf Seite 26 (WO 2007/070538) beschrieben. Verfahren zur Humanisierung von Antikörpern sind auf Seite 30-32 von WO2007070538 und im Detail in Queen, et al.,. Pros. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-10033,1989 oder in WO 90/0786 beschrieben. Des Weiteren sind dem Fachmann Verfahren zur rekombinanten Expression von Proteinen im allgemeinen und im speziellen von Antikörpern bekannt (siehe z.B. in Berger and Kimrnel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vo1 . 152, Academic Press, Inc.); Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1 -3); Current Protocols in Molecular Biolony, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.); Harlow et al., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

Laboratory Press (19881 , Paul [Ed.]); Fundamental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); and Harlow, et al., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). Der Fachmann kennt die entsprechenden Vektoren, Promotoren und Signalpeptide die zur Expression eines Proteins/Antikörpers notwendig sind. Gebräuchliche Verfahren sind auch in WO 2007/070538 auf den Seiten 41 - 45 beschrieben. Verfahren zur Herstellung eines lgG1 -Antikörpers sind z.B. in WO

2007/070538 in Beispiel 6 auf Seite 74 ff beschrieben. Verfahren, mit denen die

Internalisierung eines Antikörpers nach Bindung an sein Antigen bestimmt werden kann, sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. in WO 2007/070538 auf Seite 80 beschrieben. Der Fachmann kann die in WO 2007/070538 beschriebenen Verfahren, die zur

Herstellung von Carboanhydrase IX (Mn)-Antikörpern verwendet wurden, anlog zur Herstellung für Antikörper mit anderer Zielmolekülspezifität verwenden.

Bakterielle Expression

Dem Fachmann ist bekannt, auf welche Weise Antikörper, antigenbindenden Fragmente von diesen, oder Varianten von diesen mit Hilfe bakterieller Expression hergestellt werden können.

Geeignete Expressionsvektoren zur bakteriellen Expression gewünschter Proteine werden durch Insertion einer DNA Sequenz, welche das gewünschte Protein kodiert, im funktionellen Leserahmen zusammen mit geeigneten Translationsinitiations- und

Translationsterminationssignalen und mit einem funktionellen Promotor konstruiert. Der Vektor umfasst ein oder mehrere phänotypisch selektierbare Marker und einen

Replikationsursprung, um die Erhaltung des Vektors und, falls erwünscht, die

Amplifikation desselben innerhalb des Wirtes zu ermöglichen. Geeignete prokaryotische Wirte zur Transformation umfassen, sind aber nicht limitiert auf, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies aus dem Genus Pseudomonas,

Streptomyces, und Staphylococcus. Bakterielle Vektoren können zum Beispiel basieren auf Bakteriophagen, Plasmiden, oder Phagemiden. Diese Vektoren können selektierbare Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung enthalten, welche aus kommerziell erhältlichen Plasmiden abgeleitet sind. Viele kommerziell erhältlichen Plasmide enthalten typischerweise Elemente des gut bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017). In bakteriellen Systemen können eine Anzahl von vorteilhaften Expressionsvektoren auf Basis der beabsichtigten Verwendung des zu exprimierenden Proteins ausgewählt werden.

Nach Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und Wachstum des Wirtsstammes zu einer angemessenen Zelldichte wird der ausgewählte Promotor durch geeignete Mittel (z. B. Temperaturveränderung oder chemische Induktion) de-reprimiert / induziert, und die Zellen werden für eine zusätzliche Periode kultiviert. Die Zellen werden üblicherweise durch Zentrifugation geerntet, falls nötig auf physikalische Weise oder mit chemischen Mitteln aufgeschlossen, und der resultierende Rohextrakt wird zur weiteren Reinigung zurückgehalten.

Daher ist eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein

Expressionsvektor, welcher eine Nukleinsäure umfasst, welche einen neuen Antikörper der vorliegenden Erfindung kodiert.

Antikörper der vorliegenden Erfindung oder antigenbindende Fragmente von diesen beinhalten natürlich gereinigte Produkte, Produkte, die aus chemischen Synthesen stammen, und Produkte, die durch rekombinante Technologien in prokaryotischen Wirten, wie zum Beispiel £ coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene

Spezies aus dem Genus Pseudomonas, Streptomyces, und Staphylococcus, bevorzugt £. coli, produziert werden.

Säugerzellexpression Dem Fachmann ist bekannt, auf weiche Weise Antikörper, antigenbindenden Fragmente von diesen, oder Varianten von diesen mit Hilfe von Säugerzellexpression hergestellt werden können.

Bevorzugte regulatorische Sequenzen zur Expression in Säugerzellwirten umfassen virale Elemente, die zu einer hohen Expression in Säugerzellen führen, wie Promotoren und/oder Expressionsverstärker, welche vom Cytomegalovirus (CMV) (wie dem CMV Promotor/Enhancer), Simian Virus 40 (SV40) (wie dem SV40 Promotor/Enhancer), vom Adenovirus, (z.B. der Adenovirus major late promoter (AdMLP)) und vom Polyoma abgeleitet sind. Die Expression der Antikörper kann konstitutiv oder reguliert erfolgen (z.B. induziert durch Zugabe oder Entfernen von Kleinmolekül Induktoren wie Tetracyclin in Kombination mit dem Tet-System).

Zur weiteren Beschreibung viraler regulatorischer Elemente und Sequenzen von diesen sei verwiesen auf z.B. U.S. 5,168,062 von Stinski, U.S. 4,510,245 von Bell et al. und U.S. 4,968,615 von Schaffner et al.. Die rekombinanten Expressionsvektoren können ebenfalls einen Replikationsursprung und selektierbare Marker beinhalten (siehe z.B. U.S.

4,399,216, 4,634,665 und U.S. 5,179,017). Geeignete selektierbare Marker umfassen Gene, die Resistenz gegenüber Substanzen wie G418, Puromycin, Hygromycin,

Blasticidin, Zeocin/Bleomycin, oder Methotrexate verleihen, oder selektierbare Marker, welche zur Auxotrophie einer Wirtszelle führen, wie Glutamine Synthetase (Bebbington et al., Biotechnology (N Y). 1992 Feb;10(2): 169-75), wenn der Vektor in die Zelle

eingebracht wurde.

Zum Beispiel vermittelt das Dihydrofolate-Reductase (DHFR) Gen Resistenz gegenüber Methotrexate, das neo Gen vermittelt Resistenz gegenüber G418, das bsd Gen aus Aspergillus terreus vermittelt Resistenz gegenüber Blasticidin, Puromycin N-acetyl- transferase vermittelt Resistenz gegenüber Puromycin, das Sh ble Genprodukt vermittelt Resistenz gegenüber Zeocin, und Resistenz gegenüber Hygromycin wird vermittelt durch das E. coli Hygromycin-Resistenzgen (hyg or hph). Selektierbare Marker wie DHFR oder Glutamine-Synthetase sind auch hilfreich für Amplifikationstechniken in Verbindung mit MTX und MSX.

Die Transfektion eines Expressionsvektors in eine Wirtszelle kann mit Hilfe von

Standardtechniken ausgeführt werden, unter anderem mit Elektroporation, Nucleofection, Calcium-Phosphate-Präzipitation, Lipofection, Polykation-basierter Transfektion wie Polyethlylenimine (PEI)-basierter Transfektion und DEAE-Dextran Transfection.

Geeignete Säugerwirtszellen für die Expression von Antikörpern, antigenbindenden Fragmenten von diesen, oder Varianten von diesen umfassen Chinese Hamster Ovary (CHO Zellen) wie CHO-K1 , CHO-S, CHO-K1 SV [inbegriffen DHFR-CHO Zellen, beschrieben in Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220 und Urlaub et al., Cell. 1983 Jun;33(2):405-12, verwendet mit einem DHFR selektierbaren Marker, wie beschrieben in R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601 -621 , sowie andere Knockout-Zellen, wie ausgeführt in Fan et al., Biotechnol Bioeng. 2012 Apr;109(4):1007-15), NSO myeloma Zellen, COS Zellen, HEK293 Zellen, HKB1 1 Zellen, BHK21 Zellen, CAP Zellen, EB66 Zellen, und SP2 Zellen. Die Expression von Antikörpern, antigenbindenden Fragmenten von diesen, oder Varianten von diesen kann auch transient oder semi-stabil in Expressionssystemen erfolgen, wie HEK293, HEK293T, HEK293-EBNA, HEK293E, HEK293-6E, HEK293- Freestyle, HKB1 1 , Expi293F, 293EBNALT75, CHO Freestyle, CHO-S, CHO-K1 , CHO- K1 SV, CHOEBNALT85, CHOS-XE, CHO-3E7 oder CAP-T Zellen (beispielsweise wie Durocher et al., Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9)

In einigen Ausführungsformen ist der Expressionsvektor in jener Weise konstruiert, dass das zu exprimierende Protein in das Zellkulturmedium, in welchem die Wirtszellen wachsen, sekretiert wird. Die Antikörper, die antigenbindenden Fragmente von diesen, oder die Varianten von diesen können aus dem Zellkulturmedium mit Hilfe dem

Fachmann bekannten Proteinreinigungsmethoden gewonnen werden.

Reinigung

Die Antikörper, die antigenbindenden Fragmente von diesen, oder die Varianten von diesen können aus rekombinanten Zellkulturen mit Hilfe gut bekannter Methoden gewonnen und gereinigt werden, umfassend beispielsweise Ammoniumsulfat- oder Ethanol- Präzipitation, Säureextraktion, Protein A Chromatographie, Protein G

Chromatographie, Anion- oder Kationenaustauschchromatographie, Phospho-Cellulose Chromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC),

Affinitätschromatographie, Hydroxylapatite Chromatographie and Lectin

Chromatographie. High Performance Flüssigchromatographie ("HPLC") kann ebenfalls zur Reinigung angewendet werden. Siehe, beispielsweise, Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001 ), e.g., Chapters 1 , 4, 6, 8, 9, 10.

Antikörper der vorliegenden Erfindung oder antigenbindenden Fragmente von diesen, oder die Varianten von diesen umfassen natürlich gereinigte Produkte, Produkte aus chemischen Syntheseverfahren und Produkte, welche mit Hilfe rekombinanter Techniken in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen hergestellt werden. Eukaryotische Wirte umfassen beispielsweise Hefezellen, höhere Pflanzenzellen, Insektenzellen und Säugerzellen. Abhängig von der für die rekombinanten Expression gewählten Wirtszelle kann das exprimierte Protein glykosyliert oder nicht-glykosyliert vorliegen. In einer bevorzugen Ausführungsform wird der Antikörper gereinigt (1 ) zu mehr als 95 Gew.-% gemessen beispielsweise mit der Lowry-Methode, mit UV-Vis Spektroskopie oder mit der SDS-Kapillargelelektrophorese (zum Beispiel mit einem Caliper LabChip GXII, GX 90 oder Biorad Bioanalyzer Gerät), und in mehr bevorzugten

Ausführungsformen mehr als 99 Gew.-%, (2) zu einem Grade geeignet zur Bestimmung von mindestens 15 Resten der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz, oder (3) zur Homogenität bestimmt durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht- reduzierenden Bedingungen mit Hilfe von Coomassie-Blau oder bevorzugt Silber- Färbung.

Gewöhnlich wird ein isolierter Antikörper mit Hilfe wenigstens eines

Proteinreinigungsschrittes gewonnen.

Vorzugsweise ist das antigenbindende Fragment gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen oder das antigenbindende Fragment eines Antikörpers gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen ein scFv-, Fab-, Fab ' -Fragment oder ein F(ab ^-Fragment. Vorzugsweise ist der Antikörper oder das antigenbindende Fragment gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen ein monoklonaler Antikörper oder ein

antigenbindendes Fragment davon.

Vorzugsweise ist der Antikörper oder das antigenbindende Fragment gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen ein humaner, humanisierter oder chimärer Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment.

anti-TWEAKR-Antikörper

Erfindungsgemäß können anti-TWEAKR Antikörper verwendet werden. Der Begriff„anti-TWEAKR Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an TWEAKR bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül TWEAKR (NCBI - Referenzsequenz: NP_057723.1 ; SEQ ID NO: 164) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper TWEAKR mit einer

Dissotiationskonstante (K _D) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, £ 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.

Beispiele für Antikörper, die an TWEAKR binden, sind zum Beispiel in

WO2009/020933(A2), WO2009/140177 (A2), WO 2014/198817 (A1 ) and WO

2015/189143 (A1 ) offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

ITEM-4 ist ein anti-TWEAKR-Antikörper, der von Nakayama et al. beschrieben wurde (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819-825). Humanisierte Varianten dieses Antikörpers basierend auf CDR-Umsetzung („CDR grafting") werden von Zhou et al. (Zhou et al., 2013, J Invest Dermatol. 133(4): 1052-62) sowie in WO

2009/020933 beschrieben. Humanisierte Varianten des ITEM-4 sind TPP-7006, TPP- 7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336 und TPP-10337 Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

Bevorzugt sind im Rahmen dieser Erfindung die anti-TWEAKR Antikörper TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP- 10336 und TPP-10337. Mehr bevorzugt sind die anti-TWEAKR Antikörper TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336 und TPP-10337. Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAKR Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP-10337.

anti-B7H3 Antikörper

Erfindungsgemäß können anti-B7H3 Antikörper verwendet werden.

Der Begriff„anti-B7H3 Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an B7H3 bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül B7H3 (NCBI - Referenzsequenz: NP_001019907.1 ; SEQ ID NO: 165) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper B7H3 mit einer

Dissotiationskonstante (K _D) von < "Ι μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, £ 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.

Beispiele für Antikörper und antigen-bindene Fragmente die an B7H3 binden, sind dem Fachmann bekannt und sind z.B in WO201 109400, EP1773884 und WO2014061277 beschrieben. EP2121008 beschreibt den anti-B7H3 Antikörper 8H9 sowie seine CDR Sequenzen.

Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. Eine bevorzugte Ausführungsform der ant-B7H3 Antikörper wurden durch Screening einer Antikörper-Phagen-Display-Bibliothek auf rekombinant B7H3 aus der Maus (Maus CD276; Gene ID: 102657) und humanes B7H3 (human CD276; Gene ID: 80381 ) exprimierenden Zellen erhalten. Die gewonnenen Antikörper wurden in das humane lgG1 Format überführt. Der anti-B7H3 Antikörper TPP-8382 ist ein bevorzugtes Beispiel. Bevorzugt sind im Rahmen dieser Erfindung die anti-B7H3 Antikörper TPP-8382 und TPP-8567.

anti-HER2 -Antikörper:

Erfindungsgemäß können anti-HER2 Antikörper verwendet werden. Der Begriff„anti- HER2Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an HER2 bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül HER2 (NCBI - Referenzsequenz: NP_004439.2; SEQ ID NO: 166) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In

bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper HER2 mit einer

Dissotiationskonstante (K _D) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.

Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmoleküle HER2 bindet, ist

Trastuzumab (Genentech). Trastuzumab ist ein humanisierter Antikörper, der zur unter anderem Behandlung von Brustkrebs eingesetzt wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der anti-Her2 Antikörper TPP-1015 (analog Trastuzumab).

Weitere Beispiele für Antikörper, die an HER2 binden, sind neben Trastuzumab (INN 7637, CAS NR: RN: 180288-69-1 ) und Pertuzumab (Cas NR: 380610-27-5), auch Antikörper, wie offenbart in WO 2009/123894-A2, WO 200/8140603-A2, oder in WO 201 1/044368-A2. Beispiel für ein anti-HER2 Konjugat ist Trastuzumab-Emtansine (INN- Nr. 9295). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

Besonders bevorzugt ist im Rahmen dieser Erfindung der anti-HER2Antikörper

Trastuzumab und TPP-1015.

anti-EGFR-Antikörper

Erfindungsgemäß können anti- EGFR Antikörper verwendet werden.

Der Begriff„anti-EGFR Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an EGFR bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül EGFR (NCBI -

Referenzsequenz: NP_005219.2; SEQ ID NO: 167) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität bindet. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper EGFR mit einer

Dissotiationskonstante (K _D) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, £ 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die anti-EGFR Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TPP-981 (Cetuximab), Panitumumab, Nimotuzumab. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der anti-EGFR Antikörper TPP-981

(Cetuximab). Weitere Ausführungsformen für EGFR-Antikörper sind:

• Zalutumumab / 2F8 / HuMax-EGFR, Firma Genmab A/S (WO 02/100348, WO 2004/056847, INN-Nummer 8605) Necitumumab / 1 1 F8, ImClone / IMC-1 1 F8, Firma ImClone Systems Inc [Eli Lilly & Co] (WO 2005/090407 (EP 01735348-A1 , US 2007/0264253-A1 , US 7,598,350, WO 2005/090407-A1 ), INN- Nummer 9083)

Matuzumab / anti-EGFR MAb, Merck KGaA / anti-EGFR MAb, Takeda / EMD 72000 / EMD-6200 / EMD-72000 und EMD-55900 / MAb 425 / monoclonal antibody 425, Firma Merck KGaA / Takeda ( WO 92/15683, INN-Nummer 8103 (Matuzumab))

RG-7160 / GA-201 / GA201 / R-7160 / R7160 / RG7160 / RO-4858696 / RO- 5083945 / R04858696 / RO5083945, Firma Glycart Biotechnology AG (Roche Holding AG) (WO 2010/1 12413-A1 , WO 2010/1 15554)

GT-MAB 5.2-GEX / CetuGEX, Firma Glycotope GmbH (WO 2008/028686-A2 (EP 01900750-A1 , EP 0191 1766-A1 , EP 02073842-A2, US 2010/0028947-A1 )

ISU-101 , Firma Isu Abxis Inc (ISU Chemical Co Ltd) / Scancell (WO 2008/004834- A1 )

ABT-806 / mAb-806 / ch-806 / anti-EGFR monoclonal antibody 806, Firma Ludwig Institute for Cancer Research / Abbott / Life Science Pharmaceuticals (WO 02/092771 , WO 2005/081854 und WO 2009/023265)

SYM-004 (consists of two chimeric lgG1 antibodies (992 and 1024)), Firma Symphogen A/S (WO 2010/022736-A2)

MR1 -1 /MR1 -1 KDEL, Firma IVAX Corp (Teva Pharmaceutical Industries Ltd) (Duke University), (Patent: WO2001/062931 -A2)

Antikörper gegen die Deletionsmutante, EGFRvlll, Firma Amgen/Abgenix (WO 2005/010151 , US 7,628,986)

SC-100, Firma Scancell Ltd (WO 01/088138-A1 )

MDX-447 / EMD 82633 / BAB-447 / H 447 / MAb, EGFR, Medarex/Merck KgaA, Firma Bristol-Myers Squibb (US) / Merck KGaA (DE) / Takeda (JP), (WO

91/05871 , WO 92/15683) • anti-EGFR-Mab, Firma Xencor (WO 2005/056606)

• DXL-1218 / anti-EGFR monoclonal antibody (cancer), InNexus, Firma InNexus Biotechnology Inc, Pharmaprojects PH048638

anti-Carboanhydrase IX Antikörper

Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmoleküle Carboanhydrase IX binden, sind in WO 2007/070538-A2 (z.B. Anspüche 1 - 16) beschrieben.

anti-CD123 Antikörper Der Begriff„anti- CD123 Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an CD123 bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül CD123 (NCBI - Referenzsequenz: NP_002174.1 ; Swiss-Prot: P26951 ) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In

bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper CD123 mit einer

Dissotiationskonstante (K _D) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, £ 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.

Die Generierung und Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers 7G3, welcher die N- terminale Domäne von IL-3Ra, CD123, bindet, werden von Sun et al. beschrieben (Sun et al., 1996, Blood 87(1 ):83-92). US Patent Nummer 6,177,078 (Lopez) bezieht sich auf den anti-CD123-Antikörper 7G3. Eine chimäre Variante dieses Antikörpers (CSL360) ist in WO 2009/070844 sowie eine humanisierte Version (CSL362) in WO 2012/021934

beschrieben. Die Sequenz des 7G3 Antikörpers ist in EP2426148 offenbart worden. Diese Sequenz stellt den Ausgangspunkt für humanisierten Antikörper dar, die durch CDR- Umsetzung („CDR grafting") erhalten werden Einen Antikörper, der besonders gut nach Zelloberflächenantigenbindung internalisiert, ist der anti-CD123 Antikörper 12F1 , der von Kuo et al. offenbart wurde (Kuo et a., 2009, Bioconjug Chem. 20(10):1975-82). Der Antikörper 12F1 bindet mit einer höheren Affinität an CD123 als der Antikörper 7G3 und internalisiert nach Zelloberflächenantigenbindung deutlich schneller als 7G3. Bispezifische scFv Immunofusionsproteine basierend auf 12F1 werden in WO 2013/173820 offenbart. Antikörper TPP-6013 ist eine chimäre Variante des 12F1 .

Humanisierte Varianten dieser murinen Antikörpern wurden basierend auf CDR- Umsetzung („CDR grafting") in germline Sequenzen und Optimierung generiert. anti-CXCR5 Antikörper

Der Begriff„anti-CXCR5 Antikörper" oder„ein Antikörper, der spezifisch an CXCR5 bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül CXCR5 (NCBI - Referenzsequenz: NP_001707.1 ) bindet, bevorzugt mit einer für diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper CXCR5 mit einer Dissotiationskonstante (KD) von < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, oder < 0.001 nM.

Beispiele für Antikörper und antigen-bindene Fragmente die an CXCR5 binden, sind dem Fachmann bekannt und z.B in EP2195023 beschrieben

Die Hybridomzellen für den Rattenantikörpers RF8B2 (ACC2153) wurden von DSMZ bezogen und die Sequenz des Antikörpers nach Standardmethoden identifiziert. Diese Sequenz stellt den Ausgangspunkt der humanisierten Antikörper dar, die durch CDR- Umsetzung („CDR grafting") erhalten werden

Humanisierte Varianten dieses Antikörpers werden basierend auf CDR-Umsetzung („CDR grafting") in germline Sequenzen generiert.

anti-C4.4a Antikörper:

Beispiele für C4.4a Antikörper und antigen-bindende Fragmente sind in WO 2012/143499 A2 beschrieben. Die Sequenzen der Antikörper sind in Tabelle 1 der WO 2012/143499 A2 angegeben, wobei jede Zeile die jeweiligen CDR Aminosäuresequenzen der variablen leichten Kette bzw. der variablen Schweren Kette des in Spalte 1 aufgeführten Antikörpers wiedergibt. anti-CD20-Antikörper:

Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmoleküle CD20 bindet, ist Rituximab (Genentech). Rituximab (CAS-Nummer: 174722-31 -7) ist ein chimärer Antikörper, der zur Behandlung von Non-Hodgkin-Lymphom verwendet wird. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

anti-CD52 -Antikörper:

Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmoleküle CD52 bindet, ist

Alemtuzumab (Genzyme). Alemtuzumab (CAS-Nummer: 216503-57-0) ist ein

humanisierter Antikörper, der zur Behandlung von chronischer lymphatischer Leukämie eingesetzt wird. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

anti-Mesothelin-Antikörper:

Beispiele für anti-Mesothelin -Antikörper sind z.B. WO2009/068204 beschrieben. Alle in WO2009/068204 offenbarten Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen der hierin offenbarten Erfindung verwendet werden können. Besonders bevorzugt ist der in WO2009/068204 offenbarte Antikörper MF-T.

anti-CD30-Antikörper

Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD30 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Hodgkin-Lymphoma verwendet werden können, sind Brentuximab,

Iratumumab und Antikörper, wie in WO 2008/0921 17, WO 2008/036688 oder WO 2006/089232 offenbart. Beispiele für ein anti- CD30 Konjugat ist Brentuximab Vedotin (INN-Nr. 9144). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-CD22-Antikörper

Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD22 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Lymphoma verwendet werden können, sind Inotuzumab oder Epratuzumab. Beispiele für anti- CD22 Konjugate sind Inotuzumab Ozagamycin (INN-Nr. 8574), oder anti-CD22-MMAE und anti-CD22-MC-MMAE (CAS RN: 139504-50-0 bzw. 474645-27-7). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

anti-CD33-Antikörper

Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD33 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Leukämie verwendet werden können, sind Gemtuzumab oder Lintuzumab (INN 7580). Ein Beispiel für ein anti-CD33 Konjugat ist Gemtuzumab-Ozagamycin. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

anti-NMB-Antikörper

Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül NMB bindet und zur

Behandlung von Krebs z.B. Melanom oder Brustkrebs verwendet werden kann, ist Glembatumumab (INN 9199). Ein Beispiel für ein anti-NMB Konjugat ist Glembatumumab Vedotin (CAS RN: 474645-27-7). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

anti-CD56-Antikörper

Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül CD56 bindet und zur Behandlung von Krebs z.B. Multiples Myelom, Kleinzelliges Lungenkarzinom, MCC oder Ovarialkarzinom verwendet werden kann, ist Lorvotuzumab. Ein Beispiel für ein anti-CD56 Konjugat ist Lorvotuzumab Mertansine (CAS RN: 139504-50-0). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-CD70-Antikörper

Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD70 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Non-Hodgkin-Lymphom oder Nierenzellkrebs verwendet werden können, sind in WO 2007/038637-A2 oder WO 2008/070593-A2 offenbart. Ein Beispiel für ein anti- CD70 Konjugat ist SGN-75 (CD70 MMAF). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

anti-CD74-Antikörper

Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül CD74 bindet und zur

Behandlung von Krebs z.B. Multiplem Myelom verwendet werden kann, ist Milatuzumab. Ein Beispiel für ein anti-CD74 Konjugat ist Milatuzumab-Doxorubicin (CAS RN: 23214-92- 8). Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser

Erfindung verwendet werden.

anti-CD19-Antikörper

Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül CD19 bindet und zur

Behandlung von Krebs z.B. Non-Hodgkin-Lymphom verwendet werden kann, ist in WO 2008/031056-A2 offenbart. Weitere Antikörper und Beispiele für ein anti-CD19 Konjugat (SAR3419) sind in WO 2008/047242-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

anti-Mucin-Antikörper

Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül Mucin-1 binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Non-Hodkin-Lymphom verwendet werden können, sind Clivatuzumab oder die in WO 2003/106495-A2, WO 2008/028686-A2 offenbarten Antikörper. Beispiele für anti-Mucin Konjugate sind in WO 2005/009369-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-CD138-Antikörper

Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül CD138 binden und Konjugate davon, die zur Behandlung von Krebs z.B. Multiples Myelom verwendet werden können, sind WO 2009/080829-A1 , WO 2009/080830-A1 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

anti-Integrin-alphaV -Antikörper

Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül Integrin alphaV binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Melanoma, Sarcoma oder Carcinoma verwendet werden können, sind Intetumumab (Cas RN: 725735-28-4), Abciximab (Cas-RN: 143653-53-6), Etaracizumab (Cas-RN: 892553-42-3) oder die in US 7,465,449, EP 719859-A1 , WO 2002/012501 -A1 oder WO2006/062779-A2 offenbarten Antikörper. Beispiele für anti- Integrin AlphaV Konjugate sind lntetumumab-DM4 und weitere in WO 2007/024536-A2 offenbarte ADCs. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

anti-TDGF1 -Antikörper

Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül TDGF1 binden und zur Behandlung von Krebs verwendet werden können, sind die in WO 02/077033-A1 , US 7,318,924, WO 2003/083041 -A2 und WO 2002/088170-A2 offenbarten Antikörper. Beispiele für anti- TDGF1 Konjugate sind in WO 2002/088170-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

anti-PSMA-Antikörper

Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül PSMA binden und zur Behandlung von Krebs z.B. Prostatakarzinom verwendet werden können, sind die in WO 97/35616-A1 , WO 99/47554-A1 , WO 01/009192-A1 und WO2003/034903 offenbarten Antikörper.

Beispiele für anti-PSMA Konjugate sind in WO 2009/026274-A1 und WO 2007/002222 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-EPHA2-Antikörper

Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül EPHA2 binden, zur Herstellung eines Konjugats und zur Behandlung von Krebs verwendet werden können, sind in WO

2004/091375-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

anti-SLC44A4-Antikörper

Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül SLC44A4 binden, zur Herstellung eines Konjugats und zur Behandlung von Krebs, z.B. Pankreas- oder Prostatakarzinom verwendet werden können, sind in WO2009/033094-A2 und US2009/0175796-A1 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

anti-HLA-DOB-Antikörper

Ein Beispiel für einen Antikörper, der das Krebs-Zielmolekül HLA-DOB bindet, ist der Antikörper Lym-1 (Cas-RN: 301344-99-0), der zur Behandlung von Krebs, z.B. Non- Hodgkin-Lymphom verwendet werden kann. Beispiele für anti-HLA-DOB Konjugate sind z.B. in WO 2005/08171 1 -A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

a n ti -VTC N 1 -An ti kö rpe r

Beispiele für Antikörper, die das Krebs-Zielmolekül VTCN1 binden, zur Herstellung eines Konjugats und zur Behandlung von Krebs, z.B. Ovarialkarzinom, Pankreas-, Lungen-, oder Brustkrebs verwendet werden können, sind in WO 2006/074418-A2 offenbart. Diese Antikörper und antigenbindende Fragmente davon können im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. anti-FGFR2-Antikörper

Beispiele für anti-FGFR2 Antikörper und antigen-bindende Fragmente sind in

WO2013076186 beschrieben. Die Sequenzen der Antikörper sind in Tabelle 9 und Tabelle 10 der WO2013076186 angegeben. Bevorzugt sind Antikörper, Antigen-bindende Fragmente und Varianten der Antikörper, die sich von den als M048-D01 und M047-D08 bezeichneten Antikörpern ableiten.

Bevorzugte Antikörper und Antigen-bindende Antikörperfragmente für

erfindungsgemäße Binder-Wirkstoff-Konjugate In dieser Anmeldung wird bei den Binder-Wirkstoff-Konjugaten auf die folgenden bevorzugten Antikörper Bezug genommen, wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt: TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP- 10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP-751 1 , TPP-8382 und TPP- 8567.

Tabelle: Proteinsequenzen der Antikörper:

TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP- 10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP-751 1 , TPP-8382 und TPP- 8567 sind Antikörper umfassend eine oder mehrere der in obiger Tabelle angegebenen CDR-Sequenzen (H-CDR1 , H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1 , L-CDR2, L-CDR3) der variable Region der schwere Kette (VH) oder der variable Region der leichte Kette (VL). Vorzugsweise umfassen die Antikörper die angegebene variable Region der schwere Kette (VH) und/oder die variable Region der leichte Kette (VL). Vorzugsweise umfassen die Antikörper die angegebene Region der schweren Kette (IgG Schwere Kette) und/oder die angegebene Region der leichten Kette (IgG Leichte Kette).

TPP-981 ist ein anti-EGFR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 3 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 7 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 8.

TPP-1015 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 13 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 14, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 16, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 17 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 18.

TPP-2090 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 23 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 28. TPP-2658 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 32, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 33 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 34, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 36, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 37 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 38. TPP-5442 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 42, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 43 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 44, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 46, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 47 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 48. TPP-7006 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 52, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 53 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 54, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 56, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 57 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 58.

TPP-7007 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 62, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 63 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 64, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 66, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 67 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 68.

TPP-7510 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 72, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 73 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 74, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 76, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 77 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 78.

TPP-751 1 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 82, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 83 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 84, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 86, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 87 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 88.

TPP-8382 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 92, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 93 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 94, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 96, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 97 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 98.

TPP-8567 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 102, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 103 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 104, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 106, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 107 und die variable CDR3- Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 108.

TPP-8825 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 13 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 14, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 16, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 17 und die variable CDR3- Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 18.

TPP-10334 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 122, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 123 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 124, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 126, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 127 und die variable CDR3- Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 128.

TPP-10335 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 132, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 133 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 134, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 136, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 137 und die variable CDR3- Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 138.

TPP-10336 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 142, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 143 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 144, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 146, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 147 und die variable CDR3- Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 148.

TPP-10337 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend eine variable Region der schwere Kette (VH) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette (H-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 152, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette (H- CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 153 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette (H-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 154, sowie eine variable Region der leichte Kette (VL) umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette (L-CDR1 ), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 156, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette (L-CDR2), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 157 und die variable CDR3- Sequenz der leichten Kette (L-CDR3), wie dargestellt durch SEQ ID NO: 158.

TPP-981 ist ein anti-EGFR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 5.

TPP-1015 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 15.

TPP-2090 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 21 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 25.

TPP-2658 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 31 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 35. TPP-5442 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 41 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 45.

TPP-7006 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 51 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 55. TPP-7007 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 61 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 65.

TPP-7510 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 71 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 75.

TPP-751 1 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 81 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 85. TPP-8382 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 91 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 95.

TPP-8567 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 101 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 105.

TPP-8825 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 1 1 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 15.

TPP-10334 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 121 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 125.

TPP-10335 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 131 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 135. TPP-10336 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 141 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 145. TPP-10337 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine variable Region der schweren Kette (VH) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 151 sowie eine variable Region der leichten Kette (VL) wie dargestellt durch SEQ ID NO: 155.

TPP-981 ist ein anti-EGFR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 9 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 10.

TPP-1015 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 20.

TPP-2090 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 29 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 30.

TPP-2658 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 39 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 40.

TPP-5442 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 49 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 50. TPP-7006 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 59 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 60.

TPP-7007 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 69 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 70.

TPP-7510 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 79 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 80. TPP-751 1 ist ein anti-HER2 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 89 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 90.

TPP-8382 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 99 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 100.

TPP-8567 ist ein anti-B7H3 Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 109 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 10. TPP-8825 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 19 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 120.

TPP-10334 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 129 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 130.

TPP-10335 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 139 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 140.

TPP-10336 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 149 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 150.

TPP-10337 ist ein anti-TWEAKR Antikörper umfassend vorzugsweise eine Region der schweren Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 159 sowie eine Region der leichten Kette wie dargestellt durch SEQ ID NO: 160.

Linker für den Binder LIG (Lb und Lc)

Aus der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Peptide oder Proteine wie Antikörper bekannt (siehe z.B. K. Lang and J. W. Chin. Chem. Rev. 2014, 114, 4764-4806, M. Rashidian et al. Bioconjugate Chem. 2013, 24, 1277-1294). Erfindungsgemäß bevorzugt ist die

Konjugation des organischen Rests an einen Antikörper über ein oder mehrere

Schwefelatome von Cystein-Resten des Antikörpers, die entweder als freie Thiole bereits vorliegen oder durch Reduktion von Disulfidbrücken generiert werden, und/oder über eine oder mehrere NH-Gruppen von Lysin-Resten des Antikörpers. Es ist jedoch auch möglich, den KSP-lnhibitor bzw. Prodrug an den Antikörper über Tyrosinreste, über

Glutaminreste, über Reste unnatürlicher Aminosäuren, über freie Carboxylgruppen oder über Zuckerreste des Antikörpers zu binden.

Es ist erfindungsgemäß auch möglich, die Wirkstoffmoleküle an spezifische

Konjugationsstellen des Binders zu konjugieren, wodurch die Produkthomogenität verbessert wird. Die Literatur beschreibt verschiedene Methoden zur

konjugationsstellenspezifischen Konjugation (Agarwal et al., Bioconjug. Chem. 26, 176- 192 (2015); Cal et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl.53, 10585-10587 (2014); Behrens et al., MAbs 6_, 46-53 (2014); Panowski et al., MAbs 6, 34-45 (2014)). Diese Methoden enthalten insbesondere auch enzymatische Konjugationsmethoden, die beispielsweise Transglutaminasen (TGases), Glykosyltransferasen oder das Formylglycin generierende Enzym ((Sochaj et al., Biotech nology Advances 33, 775-784, (2015)) verwenden.

Erfindungsgemäß können konjugationsstellenspezifische Binder-Konjugate des Kinesin- Spindel-Protein-Inhibitors, in welchen die Kinesin-Spindel-Protein-Inhibitoren an Glutamin- Seitenketten der Binder konjugiert sind, bereitgestellt werden.

Wenn der Binder ein Antikörper ist, beinhaltet er ein Akzeptor-Glutamin, bevorzugt in der konstanten Region. Solche Akzeptor-Glutamine können durch Mutation von geeigneten Positionen zu Glutamin eingeführt werden (zum Beispiel die Mutation N297Q der schweren Kette, Kabat EU Nummerierung) oder durch Generierung von deglycosylierten oder aglycosylierten Antikörpern (zum Beispiel durch enzymatische Deglykosylierung durch PNGase F oder durch Mutation N297X der schweren Kette, Kabat EU

Nummerierung (X kann hier jede Aminosäure außer N sein)). Im letzteren Fall eines deglykosylierten oder aglykosylierten Antikörpers wird der Glutaminrest Q295 (Kabat EU Nummerierung) der schweren Kette ein Akzeptor-Glutamin. Besonders bevorzugt ist ein Antikörper, der die Mutation N297A oder N297Q (Kabat EU Nummerierung) enthält.

Daher beinhalten alle in dieser Erfindung beschriebenen Antikörper ebenso agiykosylierte Varianten dieser Antikörper, die entweder durch Deglykosylierung durch PNGase F oder durch Mutation von N297 (Kabat EU Nummerierung) (Kabat numbering System of antibodies, see Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991 )) der schweren Kette zu jeder anderen Aminosäure außer N hergestellt werden. Desweiteren enthalten alle hier beschriebenen Antikörper ebenso Varianten der beschriebenen Antikörper, die durch ein Engineering ein oder mehrere Akzeptor-Glutamin-Reste für Transglutaminase- katalysierte Reaktionen enthalten.

Ein Weg für solche konjugationsstellenspezifischen Konjugationen sind

literaturbeschriebene Ansätze, die sich mit konjugationsstellenspezifischer Konjugation von Bindern mittels Transglutaminase befassen. Transglutaminasen (TGases), die auch die bakterielle Transglutaminase (BTG) (EC 2.3.2.13) beinhalten, sind eine Familie von Enzymen, die die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der v-Carbonyl-Amid- Gruppe von Glutaminen und der primären Amin-Gruppe von Lysinen katalysieren. Da solche Transglutaminasen auch andere Substrate als Lysin als Amin-Donor akzeptieren, wurden sie verwendet, um Proteine einschließlich Antikörper an geeigneten Akzeptor- Glutaminen zu modifizieren (Jeger et al., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995- 9997 (2010); Josten et al., J. Immunol. Methods 240, 47-54 (2000); Mindt et al.,

Bioconjugate Chem. 19, 271 -278 (2008); Dennler et al., in Antibody Drug Conjuagtes (Ducry, L, Ed.), pp 205-215, Humana Press. (2013)). Auf der einen Seite wurden

Transglutaminasen für die Konjugation von Wirkstoffen an Antikörper verwendet, welche artifizielle Glutamin-Tags enthalten, welche Akzeptorglutamin-Reste sind, welche durch genetisches Engineering in den Antikörper eingefügt wurden ((Strop et al., Chem. Biol. 20, 161 -167 (2013)). Auf der anderen Seite wurde beschrieben, dass der konservierte

Glutamin-Rest Q295 (Kabat EU Nummerierung) der konstanten Region der schweren Kette von Antikörpern der einzige γ-Carbonyl-Amid-Donor für die bakterielle

Transglutaminase (EC 2.3.2.13) im Rückgrat von agiykosylierten lgG1 -Molekülen ist, und somit ein Akzeptor-Glutamin darstellt, während kein Akzeptor-Glutamin im Rückgrat des lgG1 vorhanden ist, wenn der Antikörper an Position N297 (Kabat EU Nummerierung) der schweren Kette glykosyliert ist (Jeger et al., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995- 9997 (2010)). Zusammenfassend kann die bakterielle Transglutaminase für die

Konjugation eines Amin-Donor-Substrats, zum Beispiel eines Wirkstoff-Linker-Konstrukts, an einen Akzeptor-Glutamin-Rest eines Antikörpers verwendet werden. Solche Akzeptor- Glutamine können durch Engineering des Antikörpers durch Mutationen oder durch die Generierung aglykosylierter Antikörper eingeführt werden. Solche agiykosylierten

Antikörper können durch Deglykosylierung unter Verwendung von N-glycosidase F (PNGase F) oder durch Mutation von N297 der Glykosylierungsstelle der schweren Kette (Kabat EU Nummerierung) zu jeder anderen Aminosäure außer N eingeführt werden. Die enzymatische Konjugation solcher aglykosylierter Antikörper unter Verwendung von bakterieller Transglutaminase wurde für aglykosylierte Antikörpervarianten beschrieben, die die Mutationen N297D, N297Q (Jeger et al., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010)) oder N297S (siehe Patentanmeldungen WO2013092998A1 und WO2013092983A2) enthalten. Die enzymatische Konjugation solcher aglykosylierter Antikörperm mittels Transglutaminase liefert generell ADCs mit einer DAR von 2, in welchen beide schweren Ketten spezifisch an Position Q295 (Kabat EU Nummerierung) funktionalisiert sind. Nur die Mutation N297Q der schweren Kette liefert eine zusätzliche Konjugationsstelle pro schwerer Kette. Die Konjugation solcher Varianten führt zu ADCs mit einer DAR von 4, in welchen beide schweren spezifisch an den Positionen Q295 und Q297 funktionalisiert sind. Antikörpervarianten, in welchen die schweren Ketten die Mutationen Q295N und N297Q tragen, weisen pro schwerer Kette nur einen Akzeptor- Glutamin-Rest an Position Q297 (Kabat Nummerierung) auf (Simone Jeger, Site specific conjugation of tumour targeting antibodies using transglutaminase, Dissertation at ETH Zürich (2009)). In der Literatur existieren mehrere Beispiele, die die

konjugationsstellenspezifische Konjugation von aglykosylierten Antikörpern unter

Verwendung von bakterieller Transglutaminase beschreiben (zum Beispiel Dennler et al., Bioconjugate Chemistry 1_9, 569-578 (2014); Lhospice et al., Molecular Pharmaceutics 12, 1863-1871 (2015)). Die Strategie der Transglutaminase-katalysierten

konjugationsstellenspezifischen Funktionalsisierung aglykosylierter Antikörper ist in Abbildung 1 zusammengefasst.

Zur Kopplung - sowohl konjugationsstellenspezifisch als auch

konjugationsstellenunspezifisch - werden sogenannte Linker verwendet. Linker lassen sich in die Gruppe der in vivo spaltbaren Linker und in die Gruppe der in vivo stabilen Linker unterteilen (siehe L. Ducry und B. Stump, Bioconjugate Chem. 21_, 5-13 (2010)). Die in vivo spaltbaren Linker weisen eine in vivo spaltbare Gruppe auf, wobei wiederum zwischen chemisch in vivo spaltbaren und enzymatisch in vivo spaltbaren Gruppen unterschieden werden kann.„Chemisch in vivo spaltbar" bzw.„enzymatisch in vivo spaltbar" bedeutet, dass die Linker bzw. Gruppen im Blutkreislauf stabil sind und erst an bzw. in der Zielzelle durch die dort veränderte chemische bzw. enzymatische Umgebung (niedrigerer pH-Wert; erhöhte Glutathion-Konzentration; Vorliegen lysosomaler Enzyme wie Cathepsin oder Plasmin, oder Glyosidasen wie beispielsweise ß-Glucuronidasen) sich spalten, um so den niedermolekularen KSP-lnhibitor oder ein Derivat davon freizusetzen. Die chemisch in vivo spaltbaren Gruppen sind insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; die enzymatisch in vivo spaltbaren Gruppen sind insbesondere 2-8- Oligopeptidgruppe, insbesondere eine Dipeptidgruppe oder Glycoside. Peptidspaltstellen sind in Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, sowie Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341 -3346 sowie Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626 offenbart. Hierzu gehören z.B. Alanin-Alanin-Asparagin, Valin-Alanin, Valin-Lysin, Valin-Citrullin, Alanin- Lysin und Phenylalanin-Lysin (ggf. mit zusätzlicher Amidgruppe).

Um eine effiziente Freisetzung des freien Wirkstoffs zu gewährleisten, können

gegebenenfalls auch sogenannte self-immolative Linkerelemente (SIG) zwischen enzymatischer Spaltstelle und Wirkstoff eingebaut werden (Anticancer Agents in

Medicinal Chemistry, 2008, 8, 618-637). Die Freisetzung des Wirkstoffs kann dabei nach verschiedenen Mechanismen erfolgen, beispielsweise nach initialer enzymatischer Freisetzung einer nukleophilen Gruppe durch anschließende Elimierung über eine elektronische Kaskade (Bioorg. Med. Chem., 1999, 7, 1597; J. Med. Chem., 2002, 45, 937; Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 71 ) oder durch Cyklisierung des entsprechenden Linkerelements (Bioorg. Med. Chem., 2003, 1 1 , 2277; Bioorg. Med. Chem., 2007, 15, 4973; Bioorg. Med. Chem. Lett, 2007, 17, 2241 ) oder durch eine Kombination aus beidem (Angew. Chem. Inter. Ed., 2005, 44, 4378). Beispiele für solche Linkerelemente sind in der Abbildung dargestellt:

Elimination linker Cyclisation linker Elongated linker

Beispiele für nacheinander geschaltete enzymatische Schritte zur Wirkstofffreisetzung z.B. durch Histone Deacetylase und Cathepsin L sind in Nat. Commun., 2013, 4, 2735 beschrieben und sind in Abbildung 2 veranschaulicht.

Die in vivo stabilen Linker zeichnen sich durch eine hohe Stabilität aus (weniger als 5 % Metabolite nach 24 Stunden in Plasma) und weisen die oben genannten chemisch oder enzymatisch in vivo spaltbaren Gruppen nicht auf. Der Linker -U- bzw. -L _c- weist vorzugsweise eine der folgenden Grundstrukturen (i) und (ii) auf:

-(C=0) _m -L1 -SG-L2- wobei

m und n 0 oder 1 ist

SG eine (chemisch oder enzymatisch) in vivo spaltbare Gruppe (insbesondere

Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; oder eine mit Legumain, Cathepsin oder Plasmin spaltbare 2-8-Oligopeptidgruppe) ist,

L1 für eine in vivo stabile organische Gruppen steht und

L2 für eine Kopplungsgruppe an den Binder oder eine Einfachbindung steht.

Die Kopplung erfolgt hierbei vorzugsweise an einen Cysteinrest oder einen Lysinrest des Antikörpers. Alternativ kann die Kopplung an einen Tyrosinrest, Glutaminrest oder an eine unnatürliche Aminosäure des Antikörpers erfolgen. Die unnatürlichen Aminosäuren können beispielsweise Aldehyd- oder Ketogruppen (wie z.B. Formylglycin) oder Azid- oder Alkingruppen enthalten (siehe hierzu Lan& Chin, Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins, Chem.Rev. 2014, 1 14, 4764-4806).

Erfindungsgemäß bevorzugt ist insbesondere die Linker-Grundstruktur (i). Die

Verabreichung eines erfindungsgemäßen Konjugats der Ausführungsform B mit einer Linker-Grundstruktur (i) und Kopplung des Linkers an einen Cystein- oder Lysinrest des Antikörpers führt durch Metabolisierung zu Cystein- bzw. Lysinderivaten der folgenden Formeln:

wobei L1 jeweils an den cytotoxischen Wirkstoff wie z.B. den niedermolekularen KSP- Inhibitor gebunden ist, z.B. einer Verbindung der Formel (IIa), (IIb), (llc), (lld), (V), (VI) oder (VII). Verabreichung eines erfindungsgemäßen Konjugats mit einer Linker-Grundstruktur (i) in der Ausführungsform A führt nach dem Metabolismus zu einem KSP-lnhibitor der vorzugsweise die Struktur einer Verbindung der allgemeinen Formel (IIa), (IIa'), (IIa"), (IIb), (llc), (lld), (V), (VI) oder (VII) aufweist.

Erfindungsgemäß bevorzugt sind auch die Linker-Grundstrukturen (ii) , insbesondere bei Anbindung an die Position in einer Verbindung der Formel (IIa), (IIb), (llc), (lld), oder (V), insbesondere wenn Li eine der folgenden Strukturen aufweist: (a) -NH-(CH ₂)o-4-(CHCH ₃)o-4-CHY ⁵-C(=0)-Y ⁷ , in der

Y ⁵ für -H oder -NHY ⁶ steht,

Y ⁶ für -H oder -C(=0)-CH ₃ steht und

Y ⁷ für eine Einfachbindung oder -NH -(CH ₂)o-4-CHNH ₂-C(=0)- steht, so dass nach der Spaltung der Ausführungsform B die entsprechende Struktur -NH-(CH ₂)o-4-(CHCH ₃)o-4-CHY ⁵-COOH bzw.

-NH-(CH ₂) ₀-4-(CHCH ₃)o-4-CHY ⁵-C(=0)-NH -(CH ₂)o- ₄ -CHNH ₂-COOH erhalten wird.

x 0 oder 1 ist,

Y ⁵ für -H oder -NHY ⁶ steht und

Y ⁶ für -H oder -C(=0)-CH ₃ steht,

so dass nach der Spaltung der Ausführungsform B die entsprechende Struktur -CH ₂-Sx-(CH ₂) ₀-4-CHY ⁵-COOH

erhalten wird.

Verabreichung eines erfindungsgemäßen Konjugats mit einer Linker-Grundstruktur (ii) in der Ausführungsform A führt nach dem Metabolismus zu einem KSP-lnhibitor mit der Struktur der allgemeinen Formel (II).

Wenn der Linker an eine Cystein-Seitenkette bzw. einen Cysteinrest gebunden ist, leitet sich L2 vorzugsweise von einer mit der Sulfhydryl-Gruppe des Cysteins reaktiven Gruppe ab. Hierzu zählen Haloacetyle, Maleimide, Aziridine, Acryloyle, Arylierende Verbindungen, Vinylsulfone, Pyridyldisulfide, TNB-thiole and Disulfid-reduzierende Mittel. Diese Gruppen reagieren in der Regel elektrophil mit der Sulfhydryl-Bindung unter Bildung einer Sulfid (z.B. Thioether)- oder Disulfid-Brücke. Bevorzugt sind stabile Sulfidbrücken.

L2 weist vorzugsweise folgende Strukturen auf:

in denen

# ¹ die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet,

# ² die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe kennzeichnet, und

R22 für -COOH, -C(=0)-OR, -C(=0)R, -C(=0)-NHR oder -C(=0)N(R) ₂ steht und für Ci-3-Alkyl- steht.

Hierbei bevorzugt ist, wenn R22 für -COOH steht.

Besonders bevorzugt sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in denen L2 die folgenden Formeln A3 und A4 aufweist:

Formel A3,

Formel A4, in denen

# ¹ für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht, # ² für die Verknüpfungsstelle mit dem Wirkstoffmolekül steht,

x 1 oder 2 ist und

R ²² für -COOH, -C(=0)-OR, -C(=0)-R, -C(=0)-NR ₂, -C(=0)-NHR oder -C(=0)-NH ₂ steht und

R für Ci-s-Alkyl- steht. Vorzugsweise steht hierbei R ²² für -COOH und insbesondere steht hierbei R ²² für - COOH, falls x für 1 steht. Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen kann der Linker Lb bzw. Lc an eine Cystein- Seitenkette bzw. einen Cysteinrest des Binders gebunden sein und weist dann die folgenden Formeln auf:

(I) -(C=0)m -(L1 )n-(L2) _n- und

-(C=0) _m -L1 -SG-L2 in denen

m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,

SG eine chemisch oder enzymatisch in vivo spaltbare Gruppe

(insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; oder eine mit Legumain, Cathepsin oder Plasmin spaltbare 2-8- Oligopeptidgruppe) ist,

L2 für eine Einfachbindung oder für die Gruppe

steht, wobei

# ¹ die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, # ² die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, L1 für -(NR ¹ °)n-(G1 )o-G2- steht,

R ^{1 0} für -H oder Ci-C ₃-Alkyl steht,

G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH ₂)o- ₃-C(=0)-NH- steht, n 0 oder 1 ist, o 0 oder 1 ist,

G2 für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte

Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2, - NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH ₂-C(=0)-NH ₂), -Nme-, -NHNH-, - S(=0) ₂-NHNH-, -NH- C(=0)-, -C(=0)-NH-, -C(=0)-NHNH-, einen 5 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, - NH ₂, -NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen

darstellt, wobei

für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht.

Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen, bei denen der Linker Lb bzw. Lc an eine Cystein-Seitenkette bzw. einen Cysteinrest des Binders gebunden ist und die folgende Formel aufweist:

§-(C=0)m-L1 -(L2) _n-§§ 0 oder 1 ist,

0 oder 1 ist, für die Bindung an das Wirkstoffmolekül bzw. die Legumain spaltbare Gruppe der Formel (la') steht und für die Bindung an den Binder steht, für die Gruppe

oder für eine Bindung steht, wobei

# ¹ die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet,

# ² die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet,

L1 für -(NR ¹ °) _n-(G1 )o-G2- steht,

R ^{1 0} für -H oder d-C ₃-Alkyl steht,

G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH ₂)o- ₃-C(=0)-NH- steht, n 0 oder 1 ist, o 0 oder 1 ist, für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2, NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH ₂-C(=0)-NH ₂), -Nme-, -NHNH-, - S(=0) ₂-NHNH-, -NH- C(=0)-, -C(=0)-NH-, -C(=0)-NHNH-, einen 5 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, - NH ₂, -NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen

darstellt, wobei

Rx für -H, C<| -C3-Alkyl oder Phenyl steht.

Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen kann der Linker Lb bzw. Lc auch an eine Lysin-Seitenkette bzw. einen Lysinrest des Binders gebunden sein und weist dann die allgemeinen Grundstrukturen (i) und (ii)

(i) -(C=0) _m -(L1 ) _n-(L4) _n-(C=0)-§§

und

(ii) -(C=0) _m -L1 -SG-L4-(C=0)-§§ auf, in denen

m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,

SG eine chemisch oder enzymatisch in vivo spaltbare Gruppe

(insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; oder eine mit Legumain, Cathepsin oder Plasmin spaltbare 2-8- Oligopeptidgruppe) ist,

L1 für -(NR ^{1 0}) _n-(G1 )o-G2- steht,

_R10 für -H oder Ci-C ₃-Alkyl steht,

G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH ₂)o- ₃-C(=0)-NH- steht, 0 oder 1 ist, 0 oder 1 ist,

G2 für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte

Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, - S(=0)-, -S(=0) ₂, -NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH ₂-C(=0)- NH ₂), -NMe-, -S(=0) ₂-NHNH-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, - C(=0)-NHNH-, einen 5 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0) ₂-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH-CNNH ₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen

darstellt, wobei

Rx für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht,

L4 für eine Einfachbindung oder eine Gruppe

-(C=0)y-G4- steht,

0 oder 1 ist und

-C(=0)-NHNH-, -CH(COOH)- und einen 5 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, S(=0) oder

S(=0)2 unterbrochen sein kann, wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)- NH ₂, -COOH, -OH, -NH-CN-Nh , Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können

die Verknüpfungsstelle mit dem Stickstoffatom eines Lysinrestes des Binders ist.

Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen, bei denen der Linker Lb bzw. Lc auch an eine Lysin-Seitenkette bzw. einen Lysinrest des Binders gebunden sein kann und dann die folgende Formel

§-(C=0) _m-L1 -(L4) _n-C(=0)-§§

aufweist, in der

0 oder 1 ist,

0 oder 1 ist, die Bindung an das Wirkstoffmolekül bzw. die Legumain spaltb; Gruppe der Formel (la') steht und

§§ die Bindung an ein Stickstoffatom des Binders darstellt, L1 für -(NR ¹ °)n-(G1 )o-G2- steht,

R ^{1 0} für -H oder Ci-C ₃-Alkyl steht,

G1 für -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH- oder -(CH ₂)o- ₃-C(=0)-NH- steht, n 0 oder 1 ist, o 0 oder 1 ist,

G2 für eine Bindung oder eine geradkettige oder verzweigte

Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, - S(=0)-, -S(=0) ₂, -NH-, -C(=0)-, -CH(COOH)-, -CH(CH ₂-C(=0)- NH ₂), -NMe-, -S(=0) ₂-NHNH-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, - C(=0)-NHNH-, einen 5 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0) ₂-, unterbrochen sein kann und wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH-CNNH ₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können, oder eine der folgenden Gruppen

darstellt, wobei

für -H, C-| -C3-Alkyl oder Phenyl steht,

für eine Einfachbindung oder eine Gruppe

steht,

0 oder 1 ist und G4 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0) ₂-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -S(=0) ₂-NHNH-, -C(=0)-NHNH-, - CH(COOH)- und einen 5 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, S(=0) oder S(=0)2 unterbrochen sein kann, wobei die Seitenketten der verzweigten Kohlenstoffkette, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH-CN-NH ₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können.

Besonders bevorzugt weist der Linker L2 eine oder beide der folgenden Formeln

auf, wobei

# ¹ für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binder steht, # ² für die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 steht, R ²² für -COOH steht und die Bindungen an das Schwefelatom des Bindesr zu über 80 %, (bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Binder) in einer dieser beiden Formeln vorliegen. In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A3 oder A4 vor. Hierbei liegen die Strukturen der Formel A3 oder A4 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur

vor, in der # ¹ für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht und # ² für die Verknüpfungsstelle zu L1 mit dem Wirkstoffmolekül steht,

L4 weist vorzugsweise folgende Strukturen auf: wobei die Kette durch 1 -4 Sauerstoffatome unterbrochen sein kann und

# ¹ für die Verknüpfungsstelle mit dem Stickstoffatom eines Lysins des Antikörpers steht und

# ² für die Verknüpfungsstelle zu L1 mit dem Wirkstoffmolekül steht,

Erfindungsgemäß wird L1 vorzugsweise durch die Formel -(NR ¹⁰) _n-(G1 ) _o-(G2>

dargestellt, in der

# ¹ für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht und # ² für die Verknüpfungsstelle mit dem Wirkstoffmolekül oder mit der Legumain- spaltbaren Gruppe steht,

R ¹⁰ für -H, -NH ₂ oder Ci-C ₃-Alkyl- steht,

n 0 oder 1 ist,

o 0 oder 1 ist,

w' 0 oder 1 ist

G1 für -NH-C(=0)- , -C(=0)-NH- oder \ / ^{N co} _{steht und}

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100

Kohlenstoffatomen steht, die aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen besteht, die ein- oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2, -NRY-, -

CH(COOH)-, -CH(CH ₂-C(=0)-NH ₂),

-NRYC(=0)-, -C(NH)NRY-, -C(=0)-NRY-, -NRYNRY-, -S(=0) ₂-NRYNRY-,

-C(=0)-NRYNRY-, -C(=0)-, -CR ^x=N-0- und/oder einen 3 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S(=0)2- unterbrochen sein kann und wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette zusätzlich mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder

Sulfonsäure substituiert sein kann, R ^y für -H, Phenyl-, C-| -C-| o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl oder C2-C-| 0"Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können und

-H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht.

N N CO

Hierbei steht G1 vorzugsweise für \ / und R ^1U steht vorzugsweie nicht für

-NH ₂, falls G1 für -NH-C(=0)- oder \ / ^{N C}° steht. Bevorzugt steht G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten 5 und/oder cyclischen Alkylengruppen, die ein- oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0) ₂, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=0) ₂-NHNH-, -C(=0)-NHNH- und einen 5 bis 10gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, oder -S(=0)- unterbrochen sein kann

— N N-CO—

Besonders bevorzugt steht G1 für \ / , und wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette zusätzlich mit -NH-C(=0)-NH2 substituiert sein kann. steht ferner vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte

Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -S(=0)- , -S(=0) ₂-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -CH(COOH)-, -CH(CH ₂-C(=0)- NH ₂), -NMe-, -NHNH-, -S(=0) ₂-NHNH-, -C(=0)-NHNH-, -CR ^x=N-0- und einen 3 bis 10-gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus =N-, -O- und -S-, -S(=0)- oder -S(=0) ₂- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte

Kohlenwasserstoff kette zusätzlich mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann und für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht.

— N N-CO—

Hierbei steht G2 vorzugsweise für \ /

Vorzugsweise steht G2 für die unterbrechenden Gruppen der Strukturen

in denen

Rx für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht, #1 für die Bindung zum KSP-lnhibitor bzw. Prodrug steht und

#2 für die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper (z.B. L2).

Eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen umfasst in der Regel einen α,ω-divalenten Alkylrest mit der jeweils angegebenen Zahl von

Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methylen, Ethan-1 ,2- diyl (1 ,2-Ethylen), Propan-1 ,3-diyl (1 ,3-Propylen), Butan-1 ,4-diyl (1 ,4-Butylen), Pentan- 1 ,5-diyl (1 ,5-Pentylen), Hexan-1 ,6-diyl (1 ,6-Hexylen), Heptan-1 ,7-diyl (1 ,7-Hexylen), Octan-1 ,8-diyl (1 ,8-Octylen), Nonan-1 ,9-diyl (1 ,9-Nonylen), Decan-1 ,10-diyl (1 ,10- Decylen).

Eine verzweigte Kohlenwasserstoff kette bedeutet, dass ein oder mehrere H-Atome der geradkettigen Kohlenwasserstoffkette bzw. der geradkettigen Alkylengruppen durch CMO- Alkylgruppen substituiert sind und so verzweigte Kohlenwasserstoff- bzw. Seitenketten (verzweigte Kohlenwasserstoffkette) bilden.

Die Kohlenwasserstoffkette kann weiterhin cyclische Alkylengruppen (Cycloalkandiyl) enthalten, z.B. 1 ,4-Cyclohexandiyl oder 1 ,3-Cyclopentandiyl. Diese cyclischen Gruppen können ungesättigt sein. Insbesondere können in der Kohlenwasserstoff kette aromatische Gruppen (Arylengruppen) vorliegen, z.B. Phenylen. Auch in den cyclischen Alkylengruppen und den Arylengruppen können wiederum ein oder mehrere H-Atome ggf. durch Ci-10-Alkylgruppen substituiert sein. Es wird so eine Kohlenwasserstoffkette gebildet, die ggf. verzweigt ist. Diese Kohlenwasserstoffkette weist insgesamt 0 bis 100 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 50, besonders bevorzugt 2 bis 25

Kohlenstoffatome auf.

Die verzweigten Kohlenwasserstoff- bzw. Seitenketten (verzweigte Kohlenwasserstoffkette) können mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein.

Die Kohlenwasserstoffketten können einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0) ₂-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-,

-CH(COOH)-, -CH(CH ₂-C(=0)-NH ₂), -NMe-, -NHNH-, -S(=0) ₂-NHNH-, -C(=0)-NHNH- und einen 5 bis l Ogliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus =N-, -O- und -S-, -S(=0)- oder -S(=0) ₂- unterbrochen sein.

Bevorzugt ist hier eine Gruppe

Weitere unterbrechende Gruppen in G2 sind vorzugsweise

Besonders bevorzugt und mit Bezug auf die obigen Definitionen entspricht der folgenden vereinfachten Formel

-NR ¹¹B- , in der

R ¹¹ für -H oder -NH ₂ steht,

B für die Gruppe -[(CH ₂)x-(X ⁴) _y] _w-(CH ₂)z- steht,

w 0 bis 20 ist,

x 0 bis 5 ist,

y 0 oder 1 ist,

z 0 bis 5 ist und

X ⁴ für -O-, -C(=0)-NH-,-NH-C(=0)- oder

Bevorzugt weist der Linker L die Formel

auf,

in der

#3 für die Bindung an das Wirkstoffmolekül bzw. Prodrug steht,

#4 für die Bindung an das Binderpeptid oder -protein steht,

R ¹¹ für -H oder -NH ₂ steht,

B für die Gruppe-[(CH ₂) _x-(X ⁴) _y] _w-(CH ₂) _z- steht,

w 0 bis 20 ist,

x 0 bis 5 ist, y 0 oder 1 ist,

z 1 bis 5 ist und

für -O-, -C(=0)-NH-, -NH-C(=0)- oder steht.

Die oben genannten Linker werden insbesondere bevorzugt in Konjugaten der Formel (IIa), in denen der Linker durch Substitution eines H-Atoms an R ¹ d.h. R ¹ für -L-#1 steht, wobei #1 für die Bindung an den Antikörper steht.

In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % vor, jeweils bezogen auf die

Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper.

Hierbei besonders bevorzugt sind die beiden Strukturen der allgemeinen Formeln und (A6)

(A5) und

(A6), in denen # ¹ für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht, # ² für die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L ¹ steht,

R ²² für -COOH, -C(=0)-OR, -C(=0)-R, -C(=0)-NH ₂, -C(=0)-NR ₂ oder -C(=0)-NHR steht und

R für Ci-s-Alkyl- steht. Besonders bevorzugt steht R ²² für -COOH.

Hierbei liegen die Strukturen der allgemeinen Formeln A5 und A6 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur

vor, in der

#1 und #2 die oben angegebenen Bedeutungen haben.

Bevorzugte Gruppen für L1 in der obigen Formel §-(C(=0))m-(L1 ) _n-L2-§§ sind die, die in der folgenden Tabelle aufgeführt sind, wobei r eine Zahl von 0 bis 20, vorzugsweise von 0 bis 15, insbesondere bevorzugt von 0 bis 10 aufweist. 

Besonders bevorzugt ist AK1 ein Antikörper oder eine Antigen-bindendes Fragment hiervon. Der Antikörper ist vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon, insbesondere ein anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR-Antikörper, ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2 -Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment von diesen. Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAKR-Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP-10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2-Antikörper Trastuzumab und TPP-1015 oder eine Antigen- bindendes Fragment von diesen. Weiterhin bevorzugt ist ein Linker mit der Grundstruktur (ii),

(ii) -(C=0) _m -(L1 ) _n-SG-L2, wobei SG eine durch Protease, wie z.B. Cathepsin, spaltbare Gruppe darstellt, und m, n, SG, L1 und L2 die oben angegebenen Bedeutungen haben.

Besonders bevorzugt sind die folgenden Gruppen:

-Val-Ala-C(=0)-NH- (hierdurch Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Alanin)

-NH-Val-Lys-C(=0)-NH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin) -NH-Val-Cit-C(=0)-NH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Citrullin) -NH-Phe-Lys-C(=0)-NH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin) -NH-Ala-Lys-C(=0)-NH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin) -NH-Ala-Cit-C(=0)-NH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Citrullin)

Hierbei steht SG vorzugsweise für:

und

für -H oder eine Ci-10-Alkylgruppe, die gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH2 -COOH, -OH, -IMH2, oder Sulfonsäure substituiert sein kann.

Im Falle der Transglutaminase-katalysierten Konjugation offenbart die Literatur verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Binder wie z.B. Antikörper in einer konjugationsstellenspezifischen Art und Weise, (siehe zum Beispiel (Sochaj et al., Biotechnology Advances, 33^ 775-784, (2015), Panowski et al., MAbs 6, 34-45 (2014)). Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Konjugation der KSP-lnhibitoren bzw. Prodrugs an einen Antikörper über Akzeptor-Glutaminreste des Antikörpers unter Verwendung von Transglutaminase. Solche Akzeptorglutaminreste können über Engineering des Antikörpers oder durch Mutationen generiert werden, die agiykosylierte Antikörper erzeugen. Die Anzahl dieser Akzeptorglutamine im Antikörper ist bevorzugt 2 oder 4. Für die Kopplung (Konjugation) werden geeignete Linker verwendet. Geeignete Linkerstrukturen sind solche, die über eine über eine freie Amin-Donor- Funktionalität verfügen, die ein geeignetes Substrat für die Transglutaminase darstellt. Die Verknüpfung des Linkers an den Antikörper kann dabei auf vielfältige Weise erfolgen.

Vorzugsweise weist bei einer Transglutaminase-katalysierten Konjugation der Linker eine der bereits oben genannten Grundstrukturen (i) und (ii)

(i) -(C=0) _m -(L1 ) _n-L2-

(ii) -(C=0) _m -(L1 ) _n-SG-L2 auf, in denen

L1 , SG, SG1 und m die oben genannten Bedeutungen haben,

L2 jedoch vorzugsweise eine der folgenden Gruppen darstellt: in denen

Ry für -H, -NH-C(=0)-alkyl, steht,

# ¹ für den Verknüpfungspunkt mit L ¹ steht und # ² für den Verknüpfungspunkt mit dem Glutaminrest des Binders steht. Vorzugsweise steht hierbei Ry für -H oder -NH-C(=0)-CH3.

Beispiele entsprechender Konjugate weisen die folgenden Strukturen auf, wobei MOD und L1 die oben angegebenen Bedeutungen haben, AK3 für einen Binder steht, der vorzugsweise ein Antikörper ist und n vorzugsweise 2 oder 4 ist.

Besonders bevorzugte KSP-lnhibitor-Konjugate

Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß die folgenden KSP-lnhibitor-Konjugate, bei denen

AK (ΑΚι; AK2; AK3) für einen Binder, vorzugsweise für einen Antikörper oder ein

Antigen-bindendes Fragment steht und

n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1 , 2 bis 20, besonders bevorzugt 2 bis 8 und insbesondere 2 bis 6 steht.

AKi steht vorzugsweise für einen Antikörper, der über einen Cysteinrest an den KSP-lnhibitor gebunden ist.

AK2 steht vorzugsweise für einen Antikörper, der über einen Lysinrest an den KSP-lnhibitor gebunden ist.

AK3 steht vorzugsweise für einen Antikörper, der über einen

Glutaminrest an den KSP-lnhibitor gebunden ist.

Als Binder oder Antikörper werden hierbei vorzugswiese die in der Beschreibung als bevorzugt beschriebenen Binder bzw. Antikörper verwendet. Insbesondere bevorzugt sind die anti-TWEAKR-Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP-10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR- Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2 -Antikörper Trastuzumab und TPP- 1015 oder eine Antigen-bindendes Fragment von diesen.

Besonders bevorzugte Konjugate sind:



ı63

ı64

ı65

ı66

und

in denen

AKi und AK2 für einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment steht, und

n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 20, besonders

bevorzugt 2 bis 8 und insbesondere 2 bis 6 steht.

KSP-lnhibitor - Linker-Intermediate bzw. Prodrug-Linker-Intermediate und Herstellung der Konjugate Die erfindungsgemäßen Konjugate werden hergestellt, in dem zunächst der niedermolekulare KSP-lnhibitor bzw. das Prodrug hiervon mit einem Linker versehen wird. Da so erhaltene Intermediat wird dann mit dem Binder (vorzugsweise Antikörper) umgesetzt. Für die Kopplung an einen Cysteinrest wird vorzugsweise eine der folgenden

Verbindungen mit dem Cystein-haltigen Binder wie z.B. einem Antikörper, der dazu ggf. partiell reduziert wurde, umgesetzt:

ı72

in denen

Xi für CH steht,

X ₂ für C steht,

X ₃ für N steht,

R für -H oder -COOH steht,

K für lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit C1-C6 Alkoxy- oder -OH substituiertes C1-C6 Alkyl- steht und

und L ₄ die oben angegebenen Bedeutungen haben. In den zuvor beschriebenen Formeln wie auch in den folgenden Reaktionsschemata bzw. Strukturformeln kann das Wasserstoffatom in Position R4 gemäß Formel IIa, d.h. in der Gruppe

-IMH2, durch die durch die erfindungsgemäß verwendete, durch Legumain spaltbare Gruppe der Formel la ersetzt sein.

In jeder der obigen Verbindungen wie auch den folgenden Verbindungen kann die tert- butyl-Gruppe durch Cyclohexyl ersetzt sein.

Die Verbindung kann z.B in Form ihres Trifluoressigsäuresalzes verwendet werden. Zur Reaktion mit dem Binder wie z.B. dem Antikörper wird die Verbindung vorzugsweise in 2 bis 12fachem molaren Überschuss gegenüber dem Binder verwendet. Für die Kopplung an einen Lysinrest wird vorzugsweise eine der folgenden Verbindungen mit dem Lysin-haltigen Binder wie z.B. einem Antikörper umgesetzt:

In der Formel steht

Xi für CH steht,

X ₂ für C steht,

X3 für N steht und

l_4 die gleiche Bedeutung wie hat, wobei die gleiche Bedeutung wie oben beschrieben hat.

Für ein an einen Cysteinrest ankoppelndes Intermediat können die Reaktionen wie folgt veranschaulicht werden:

Die anderen Intermediate und anderen Antikörper können entsprechend umgesetzt werden. Für ein an einen Lysinrest ankoppelndes Intermediat kann die Reaktion wie folgt veranschaulicht werden:

Erfindungsgemäß werden so die folgenden Konjugate erhalten:

Diese Umsetzung (Ringöffnung) kann bei pH 7.5 bis 9, vorzugsweise bei pH 8, bei einer Temperatur von 25 ° C bis 37 °C erfolgen, z.B. durch Rühren. Die bevorzugte Rührzeit beträgt 8 bis 30 Stunden. In den obigen Formeln stellen X1 CH, X2 C, und X3 N dar; haben SG1 und L1 die gleiche Bedeutung wie oben beschrieben, und L2, L3 und L4 die gleiche Bedeutung wie L1 ; und R und K haben die gleiche Bedeutung wie oben beschrieben.

AK1 ist ein über einen Cysteinrest gekoppelter anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR- Antikörper, ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2-Antikörper oder ein Antigen- bindendes Fragment von diesen, und AK2 ist ein über einen Lysinrest gekoppelter anti- TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR-Antikörper, ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti- HER2-Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment von diesen. Besonders bevorzugt sind AK1 und AK2 die anti-TWEAKR-Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP-10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2-Antikörper Trastuzumab und TPP-1015 oder eine Antigen- bindendes Fragment von diesen.

Weitere Definitionen Der Ausdruck„Transglutaminase", austauschbar auch verwendet als„TGase" oder„TG", wird verstanden als ein Enzym, welches die Fähigkeit besitzt, Proteine durch eine Acyl- Transfer-Reaktion zwischen der γ-Carboxamid-Gruppe von peptidgebundenem Glutamin und der ε-Aminogruppe von Lysin oder einem strukturell verwandten primären Amin, so wie zum Beispiel einer Aminopentylgruppe oder zum Beispiel einem peptidgebundenen Lysin, zu verknüpfen, was in einer 8-(Y-glutamyl)-Lysin-lsopeptidbindung resultiert.

TGasen schließen unter anderem bakterielle Transglutaminase (BTG) wie zum Beispiel das Enzym mit der EC Referenznummer 2.3.2.13 (Protein-Glutamin-v- Glutamyltransferase) ein.

Der Ausdruck Akzeptorglutamin meint, wenn er bezogen ist auf einen Aminosäurerest eines Antikörpers, einen Glutaminrest, der, unter geeigneten Bedingungen, durch eine Transglutaminase erkannt wird und transglutaminasekatalysiert durch eine Reaktion zwischen ebendiesem Glutamin und einem Lysin oder einem strukturell verwandten primären Amin, wie zum Beispiel einer Aminopentylgruppe, mit diesem verknüpft werden kann. Gegebenenfalls ist das Akzeptor-Glutamin ein oberflächen-exponiertes Glutamin. Mit„Aminosäuremodifikation" oder„Mutation" ist hier eine Aminosäuresubstitution, - Insertion, und/oder eine -deletion in einer Polypeptidsequenz gemeint. Die bevorzugte Aminosäuremodifikation ist hier eine Substitution. Mit„Aminosäuresubstitution" oder „Substitution" ist hier ein Austausch einer Aminosäure an einer gegebenen Position in einer Proteinsequenz durch eine andere Aminosäure gemeint. Zum Beispiel beschreibt die Substitution Y50W eine Variante eines parentalen Polypeptids, in welcher das Tyrosin an Position 50 durch ein Tryptophan ausgetauscht ist. Eine„Variante" von einem

Polypeptid beschreibt ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz hat, die substanziell identisch zu einem Referenzpolypeptid ist, typischerweise einem nativen oder „parentalen" Polypeptid. Die Polypeptidvariante kann eine oder mehrere

Aminosäureaustauche, -deletionen, und/oder -Insertionen an bestimmten Positionen in der nativen Aminosäuresequenz aufweisen.

Der Ausdruck„konjugationsstellenspezifisches Konjugat" beschreibt ein Konjugat eines Binders, vorzugsweise eines Antikörpers, und einem Rest, vorzugsweise einem Linker- Wirkstoff-Rest, wobei der Binder an einer oder mehreren definierten Positionen, vorzugsweise Glutamin-Resten, funktionalisiert ist. Transglutaminasen (TGasen,

TGases), beinhaltend bakterieller Transglutaminase (BTG) (EC 2.3.2.13), zeigen starke Spezifität in der Erkennung von Glutamin-Protein-Substraten und können eine

„konjugationsstellenspezifische Konjugation" katalysieren.

Der Ausdruck„homogenes Konjugat" oder„homogenes ADC" beschreibt ein Gemisch von konjugationsstellenspezifischen Konjugaten wobei mindestens 60, 70, 80, oder 90 % der Binder dieselbe Anzahl von konjugierten Resten pro Binder haben. Im Fall eines

Antikörpers sollte diese Anzahl eine gerade Zahl sein, vorzugsweise 2 oder 4.

Isotope, Salze, Solvate, isotopische Varianten

Die vorliegende Erfindung umfasst auch alle geeigneten isotopischen Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen. Unter einer isotopischen Variante einer

erfindungsgemäßen Verbindung wird hierbei eine Verbindung verstanden, in welcher mindestens ein Atom innerhalb der erfindungsgemäßen Verbindung gegen ein anderes Atom der gleichen Ordnungszahl, jedoch mit einer anderen Atommasse als der gewöhnlich oder überwiegend in der Natur vorkommenden Atommasse ausgetauscht ist. Beispiele für Isotope, die in eine erfindungsgemäße Verbindung inkorporiert werden können, sind solche von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor, Chlor, Brom und lod, wie ²H (Deuterium), ³H (Tritium), ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁷0, ¹⁸0, ³²P, ³³P, ³³S, ³⁴S, ³⁵S, ³⁶S, ¹⁸F, ³⁶CI, ⁸²Br, ¹²³l, ¹²⁴l, ¹²⁹l und ¹³¹1. Bestimmte isotopische Varianten einer erfindungsgemäßen Verbindung, wie insbesondere solche, bei denen ein oder mehrere radioaktive Isotope inkorporiert sind, können von Nutzen sein

beispielsweise für die Untersuchung des Wirkmechanismus oder der Wirkstoff-Verteilung im Körper; aufgrund der vergleichsweise leichten Herstell- und Detektierbarkeit sind hierfür insbesondere mit ³H- oder ¹⁴C-lsotopen markierte Verbindungen geeignet. Darüber hinaus kann der Einbau von Isotopen, wie beispielsweise von Deuterium, zu bestimmten therapeutischen Vorteilen als Folge einer größeren metabolischen Stabilität der

Verbindung führen, wie beispielsweise eine Verlängerung der Halbwertszeit im Körper oder eine Reduktion der erforderlichen Wirkdosis; solche Modifikationen der

erfindungsgemäßen Verbindungen können daher gegebenenfalls auch eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellen. Isotopische Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen können nach den dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, so beispielsweise nach den weiter unten beschriebenen Methoden und den bei den Ausführungsbeispielen wiedergegebenen Vorschriften, indem entsprechende isotopische Modifikationen der jeweiligen Reagenzien und/oder

Ausgangsverbindungen eingesetzt werden.

Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methan- sulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Naphthalin- disulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C- Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyl- diisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, /V-Methylpiperidin, /V-Methylmorpholin, Arginin, Lysin und 1 ,2-Ethylendiamin.

Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt. Als Solvate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Hydrate bevorzugt.

Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindungen. Der Begriff "Prodrugs" bezeichnet hierbei Verbindungen, welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch während ihrer Verweilzeit im Körper zu erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden (beispielsweise metabolisch oder hydrolytisch).

Besondere Ausführungsformen

Die folgenden Ausführungsformen sind besonders bevorzugt:

Ausführungsform A':

Ein APDC der Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'", wobei Di in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Verbindung der Formel (lle)

(lle)

ist, in der

x ₂ für N und

x ₃ für C steht

oder

Xi für CH steht,

X2 für C steht und

X ₃ für N steht

oder

Xi für NH steht,

X ₂ für C steht und

X ₃ für C steht

oder

Xi für CH steht,

X2 für N steht und

X ₃ für C steht,

A für -C(=0)- steht,

R ¹ für -L-#1 , -H, -COOH, -C(=0)-NHNH ₂, -(CH ₂)i-3N H ₂, -C(=0)-NZ"(CH ₂)i- 3NH2 und -C(=0)-NZ"CH ₂C(=0)-OH steht,

Z" für -H oder -NH2 steht,

R ² für -H steht,

R ⁴ für eine Gruppe der Formel (la) steht,

R ³ für -L-#1 oder eine Ci-10-Alkyl-Gruppe steht, die gegebenenfalls mit -OH,

-O-Alkyl, -SH, -S-Alkyl, -0-C(=0)-Alkyl, -0-C(=0)-NH-Alkyl,

-NH-C(=0)-Alkyl, -NH-C(=0)-NH-Alkyl, -S(=0) _n-Alkyl, -S(=0) ₂-NH-Alkyl, -NH-Alkyl, -N(Alkyl) ₂, oder -NH ₂ substituiert sein kann,

R ⁵ für -H oder -F steht,

R ⁶ und R ⁷ unabhängig voneinander für -H, Ci-3-Alkyl, Fluor- Ci-3-Alkyl, C2-4-Alkenyl-,

Fluor- C ₂-4-Alkenyl-, C2-4-Alkinyl-, Fluor- C ₂-4-Alkinyl-, Hydroxy- oder Halogen- stehen,

R ⁸ für eine verzweigte Ci _-5-Alkyl-Gruppe oder Cyclohexyl-Gruppe steht,

R ⁹ für -H oder -F steht, -L-#1 für die Linker-Gruppe

§-(C(=0))m-(L1 )„-L2-§§ steht, in der

unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,

die Bindung an den KSP-lnhibitor darstellt,

die Bindung an den Antikörper darstellt,

für eine der Gruppen

steht, für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht, für die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 steht, für die Gruppe

# ¹-(NR ¹⁰) _n-(G1 ) _o-G2-# ² steht, in der

R ¹⁰ für -H, -IMH2 oder Ci _-3-Alkyl- steht,

— N N-CO—

G1 für -NHC(=0)- oder \ / steht,

n 0 oder 1 ist,

o 0 oder 1 ist und

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100

Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=0) ₂-NHNH-, -C(=0)-NHNH- und einen 3 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus =N- -O- und -S-, oder -S(=0)- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH,

-OH, -IMH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

#1 für die Bindung zum KSP-lnhibitor steht,

#2 für die Bindung zu L2 zum Antikörper steht,

wobei einer der Substituenten R ¹ und R ³ für die Linker-gruppe -L-#1 steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze der Solvate und wobei die in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa"'genannten Antikörper humane, humanisierte oder chimäre monoklonale Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon sind und n in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Zahl von 1 bis 10 ist.

Vorzugsweise ist hierbei der Antikörper ein anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR- Antikörper ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2-Antikörper oder ein Antigen- bindendes Fragment von diesen.

Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (lle) in denenRß in der Bedeutung von Alkyl vorzugsweise für C1-3 Alkyl- steht.

Hierbei steht G2 vorzugsweise für

Alternativ kann der Linker -L-#1 an eine Lysin-Seitenkette bzw. einen Lysinrest gebunden sein. Dann, weist er vorzugsweise die folgende Formel

-§-(SG) _x-L4-C(=0)-§§, auf, in der

§ die Bindung an den KSP-lnhibitor darstellt,

§§ die Bindung an den Antikörper darstellt,

x 0 oder 1 ist,

SG für eine spaltbare Gruppe steht,

L4 für eine Einfachbindung oder eine Gruppe

-(C(=0)) _y-G4- steht,

y 0 oder 1 ist und

G4 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100

Kohlenwasserstoffkette mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, Sulfonamid, Sulfon,

Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein kann.

Hierbei steht SG vorzugsweise für ein 2-8 Oligopeptid, besonders bevorzugt für ein Dipeptid.

Vorzugsweise kann die geradkettige oder verzweigte Kohlenstoffkette von G4 durch nterbrochen sein.

Ausführungsform B'

Ein APDC der Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'", wobei Di in den Formeln IVa' bzw. IVa' bzw. IVa'" eine Verbindung der Formel (llf)

(llf)

ist, in der

Xi für N steht,

X ₂ für N steht und

Xs für C steht, oder

Xi für CH steht,

X ₂ für C steht und

x ₃ für N steht,

oder

Xi für NH steht,

x ₂ für C steht und

Xs für C steht,

oder

Xi für CH steht,

X ₂ für N steht und

Xs für C steht, für -C(=0)- steht,

R ¹ für -L-#1 , -H, -COOH, -C(=0)-NHNH ₂, -(CH ₂)i _-3NH ₂,

-C(=0)-NZ"(CH ₂)i _-3NH ₂ und -C(=0)-NZ"CH ₂C(=0)-OH steht,

Z" für -H oder -NH ₂ steht,

R ² für -H steht,

R ⁴ für eine Gruppe der Formel (la) steht,

R ³ für -L-#1 oder eine Ci-10-Alkyl-Gruppe steht, die gegebenenfalls mit -OH,

-O-Alkyl, -SH, -S-Alkyl, -0-C(=0)-Alkyl, -0-C(=0)-NH-Alkyl, -NH-C(=0)-Alkyl, -NH-C(=0)-NH-Alkyl, -S(=0) _n-Alkyl, -S(=0) ₂-NH-Alkyl, -NH-Alkyl, -N(Alkyl) ₂ und -NH ₂ substituiert sein kann,

R ⁵ für -H oder -F steht,

R ⁶ und R ⁷ unabhängig voneinander für -H, Ci- ₃-Alkyl, Fluor- Ci- ₃-Alkyl, C ₂- ₄-Alkenyl-,

Fluor- C _2-4-Alkenyl-, C _2-4-Alkinyl-, Fluor- C _2-4-Alkinyl-, Hydroxy- oder Halogen- stehen,

R ⁸ für eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe steht,

R ⁹ für -H oder -F steht,

-L-#1 für die Gruppe

§-(C(=0))m-(L1 ) _n-L2-§§ steht, in der

m 0 oder 1 ist; die Bindung an den KSP-lnhibitor darstellt,

die Bindung an den Antikörper darstellt,

für die Gruppe

steht, # ¹ für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht,

# ² für die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 steht,

L1 für die Gruppe

# ¹-(NR ^{1 0}) _n-(G1 ) _o-G2-# ² steht, in der R ¹⁰ für -H, -IMH2 oder Ci-ca-Alkyl- steht,

— N N-CO—

G1 für -NH-C(=0)- oder \ / steht, n 0 oder 1 ist,

o 0 oder 1 ist,

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100

Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=0) ₂-NHNH-, -C(=0)-NHNH- und einen 3 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus =N-, -O- und -S-, oder -S(=0)- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -IMH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

#1 für die Bindung zum KSP-lnhibitor steht,

#2 für die Bindung zu L2 zum Antikörper steht, wobei einer der Substituenten R ¹ und R ³ für die Linker-Gruppe-L-#1 steht, sowie deren Salze, Solvate und Salze der Solvate und wobei die in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa"'genannten Antikörper humane, humanisierte oder chimäre monoklonale Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon sind und n in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Zahl von 1 bis 10 ist.

Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAKR-Antikörper TPP-7006, TPP-7007 und TPP- 10337, die anti-B7H3-Antikörper TPP-8382 und TPP-8567, der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab (TPP-981 ) und die anti-HER2-Antikörper Trastuzumab und TPP-1015 oder eine Antigen-bindendes Fragment von diesen. Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (llf) in der R3 in der Bedeutung von Alkyl vorzugsweise für C1-3 Alkyl- steht.

Hierbei steht G2 vorzugsweise für

Alternativ kann der Linker -L-#1 an eine Lysin-Seitenkette bzw. einen Lysinrest gebunden sein. Dann, weist er vorzugsweise die folgende Formel

-§-(SG) _x-L4-C(=0)-§§ auf, in der

§ die Bindung an den KSP-lnhibitor darstellt,

§§ die Bindung an den Antikörper darstellt,

x 0 oder 1 ist,

SG für eine spaltbare Gruppe steht,

L4 für eine Einfachbindung oder für eine Gruppe

steht,

y 0 oder 1 ist und

G4 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100

Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigte und/oder cyclischen Alkylengruppen steht, die einfach oder mehrfach gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -S(=0) ₂-NHNH-, -C(=0)-NHNH- und einen 5 bis 10-gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen, ausgewählt aus =N-, -O- und -S-, -S(=0)- oder -S(=0)2- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein kann. Hierbei steht SG vorzugsweise für ein 2-8 Oligopeptid, besonders bevorzugt für ein Dipeptid. Vorzugsweise kann die geradkettige oder verzweigte Kohlenstoff kette von G4 durch

unterbrochen sein.

Ausführungsform C:

Ein APDC der Formel IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'", wobei Di in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Verbindung der Formel (Ilg)

ist, in der

x ₂ für N und

X ₃ für C steht

oder

Xi für CH steht,

x ₂ für C steht und

Xs für N steht

oder

Xi für NH steht,

x ₂ für C steht und

Xs für C steht für CH steht,

für N steht und

für C steht, für -C(=0)- steht, für -L-#1 steht, für -H steht,

für eine Gruppe der Formel (la) steht,

für eine Ci-10-Alkyl-Gruppe steht, die gegebenenfalls mit -OH, -O-Alkyl, -SH, -S-Alkyl, -0-C(=0)-Alkyl, -0-C(=0)-NH-Alkyl, -NH-C(=0)-Alkyl, -NH-C(=0)-NH-Alkyl, -S(=0) _n-Alkyl, -S(=0) ₂-NH-Alkyl, -NH-Alkyl, -N(Alkyl) ₂ oder -NH2 substituiert sein kann oder für -MOD steht,

für die Gruppe

steht,

für -H oder Ci-C ₃-Alkyl- steht,

für -NH-C(=0)- , -C(=0)-NH- oder ^N\ / ^{N C}° steht

0 oder 1 ist,

für eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -SO-, -S(=0) ₂, -NRY-, -NRYC(=0)-,

-C(=0)NRY-, -NRYNRY-, -S(=0) ₂-NRYNRY-, -C(=0)-NRYNRY-C(=0)- oder -CR ^x=N-0- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH ₂,-COOH, -OH, -NH ₂,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, für -H, C-| -C3-Alkyl- oder Phenyl- steht,

für -H, Phenyl-, C-| -C-|o-Alkyl-, C2-C-| Q-Alkenyl- oder C2-C-| Q-Alkinyl- steht, die jeweils mit -NH-C(=0)-NH ₂, -COOH, -OH, -NH ₂, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,

für -H oder -F steht, R ⁶ und R ⁷ unabhängig voneinander für -H, Ci-3-Alkyl, Fluor- Ci-3-Alkyl, C2-4-Alkenyl-, Fluor- C2-4-Alkenyl-, C2-4-Alkinyl-, Fluor- C2-4-Alkinyl-, Hydroxy- oder Halogen- stehen,

R ⁸ für eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe steht,

R ⁹ für -H oder -F steht,

-L-#1 für die Linker-Gruppe

§-(C(=0)) _m-(L1 )n-L2-§§ steht, in der

m, n unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,

§ die Bindung an den KSP-lnhibitor darstellt,

§§ die Bindung an den Antikörper darstellt,

L2 für eine der Gruppen

# ¹ für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht,

# ² für die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 steht,

L1 für die Gruppe

# ¹-(NR ¹⁰) _n-(G1 ) _o-G2-# ² steht, in der

R ¹⁰ für -H, -NH ₂ oder Ci _-3-Alkyl- steht,

G1 für -NHC(=0)- oder steht,

n 0 oder 1 ist,

o 0 oder 1 ist und

G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100

Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen steht, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -NMe-, -NHNH-, -S(=0) ₂-NHNH-, -C(=0)-NHNH- und einen 3 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus =N-, -O- und -S-, oder -S(=0)- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH,

-OH, -IMH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

#1 für die Bindung zum KSP-lnhibitor steht,

#2 für die Bindung zu L2 zum Antikörper steht,

sowie deren Salze, Solvate und Salze der Solvate und wobei die in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa"'genannten Antikörper humane, humanisierte oder chimäre monoklonale Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon sind und n in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Zahl von 1 bis 10 ist. Vorzugsweise ist hierbei der Antikörper ein anti-TWEAKR-Antikörper, ein anti-EGFR- Antikörper ein anti-B7H3-Antikörper oder ein anti-HER2-Antikörper oder ein Antigen- bindendes Fragment von diesen.

Hierbei bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (llg), in der R ³ in der Bedeutung von Alkyl vorzugsweise für C1-3 Alkyl- steht.

Hierbei weist -MOD vorzugsweise zumindest eine COOH-Gruppe auf.

Ausführungsform D':

Ein APDC der Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'", wobei Di in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Verbindung der Formel (llh)

(llh) ist, in der

Xi für N, X ₂ für N und

X ₃ für C steht

oder

Xi für CH steht,

X2 für C steht und

X ₃ für N steht

oder

Xi für NH steht,

X2 für C steht und

X ₃ für C steht

oder

Xi für CH steht,

X ₂ für N steht und

X ₃ für C steht,

A für -C(=0)- steht,

R ¹ für -H oder -COOH steht,

R ² für -H steht,

R ⁴ für eine Gruppe der Formel la steht,

R ³ für -L-#1 steht,

R ⁵ für -H oder -F steht,

R ⁶ und R ⁷ unabhängig voneinander für -H, Ci _-3

Fluor- C ₂-4-Alkenyl-, C ₂-4-Alkinyl-, Fluor- C ₂-4-Alkinyl-, Hydroxy- oder Halogen- stehen,

R ⁸ für eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe steht,

R ⁹ für -H oder -F steht,

-L-#1 für die Linker-Gruppe

§-(C(=0)) _m-(L1 )n-L2-§§ steht, in der

m, n unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,

§ die Bindung an den KSP-lnhibitor darstellt,

§§ die Bindung an den Antikörper darstellt,

L2 für eine der Gruppen

steht,

# ¹ für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht,

# ² für die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 steht,

L1 für die Gruppe

# ¹-(NR ¹⁰) _n-(G1 ) _o-G2-# ² steht, in der

R ¹⁰ für -H, -IMH2 oder Ci _-3-Alkyl- steht,

— N N-CO—

G1 für -NHC(=0)- oder \ / steht,

n 0 oder 1 ist,

o 0 oder 1 ist und G2 für eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100

-C(=0)-NHNH- und einen 3 bis 10gliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus =N-, -O- und -S-, oder -S(=0)- unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff kette mit -NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH, -IMH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

#1 für die Bindung zum KSP-lnhibitor steht,

#2 für die Bindung zu L2 zum Antikörper steht, sowie deren Salze, Solvate und

Salze der Solvate und wobei die in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa"'genannten Antikörper humane, humanisierte oder chimäre monoklonale Antikörper oder ein Antigen- bindendes Fragment hiervon sind und n in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Zahl von 1 bis 10 ist.

Hierbei steht G2 vorzugsweise für Ausführungsform Ε':

Ein APDC der Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'", wobei Di in den Formeln IVa' bzw. IVa" bzw. IVa'" eine Verbindung der Formel (Iii)

(Iii) ist, in der

R ¹ für -L-#1 steht,

-L-#1 für die Linker-Gruppe

§-(C(=0)) _m-(L1 )n-L2-§§ steht, in der

m, n unabhängig voneinander 0 oder 1 ist,

§ die Bindung an den KSP-lnhibitor darstellt,

§§ die Bindung an den Antikörper darstellt, L2 für die Gruppe

steht,

für -COOH, -C(=0)-0-Ci _-3-Alkyl, -C(=0)-Ci _-3-Alkyl, -C(=0)-NH-Ci _-3-Alkyl oder -C(=0)-NH ₂ steht,

für die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers steht, für die Bindung zu L1 steht,

für die Gruppe

# ¹-(NR ¹⁰) _n-(G1 ) _o-G2-# ² steht, in der für -H steht, für -NHC(=0)- oder steht,

0 oder 1 ist,

0 oder 1 ist, G2 für Ci-s-Alkyl steht,

#1 für die Bindung zum KSP-lnhibitor steht,

#2 für die Bindung zu L2 zum Antikörper steht,

R ² und R ⁵ für -H stehen,

R ³ für -CH ₂OH steht und

R ⁴ für eine Gruppe der Formel (la) steht,

Bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (Iii), in der R ²² für -COOH steht.

In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers, jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper, vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % vor.

Hierbei besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß Konjugate, die als L2 die Gruppe

aufweisen, in denen R ²² die oben angegebenen Bedeutungen hat. In der Regel liegen Konjugate mit beiderlei L2 Gruppen vor, vorzugsweise in einem

Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann mit der Struktur

vor, in der #1 und #2 die oben angegebenen Bedeutungen haben

Therapeutische Verwendungen

Zu den hyperproliferativen Erkrankungen, zu deren Behandlung die erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt werden können, zählt insbesondere die Gruppe der Krebs- und Tumorerkrankungen. Hierunter werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere die folgenden Erkrankungen verstanden, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein: Brustkarzinome und Brusttumore (Mammakarzinome einschließlich ductaler und lobulärer Formen, auch in situ), Atemwegstumore (kleinzelliges und nicht-kleinzelliges Karzinom, Bronchialkarzinome), Hirntumore (z.B. des Hirnstamms und des Hypothalamus, Astrocytoma, Ependymoma, Glioblastoma, Gliome, Medulloblastoma, Meningiome sowie neuro-ektodermale und pineale Tumore), Tumore der Verdauungsorgane (Speiseröhren-, Magen-, Gallenblasen-, Dünndarm-, Dickdarm-, Rektum- und Analkarzinome), Lebertumore (u.a. hepatozelluläres Karzinom, Cholangiokarzinom und gemischt- hepatozelluläres Cholangiokarzinom), Tumore des Kopf- und Halsbereiches (Larynx-, Hypopharynx-, Nasopharynx-, Oropharynx-, Lippen- und Mundhöhlenkarzinome, orale Melanome), Hauttumore (Basaliome, Spinaliome, Plattenepithelkarzinome, Kaposi- Sarkom, maligne Melanome, nicht-melanomartiger Hautkrebs, Merkelzell-Hautkrebs, Mastzelltumore), Tumore des Stütz- und Bindegewebes (u.a. Weichteilsarkome,

Osteosarkome, maligne fibröse Histiozytome, Chondrosarkome, Fibrosarkome,

Hämangiosarkome, Leiomyosarkome, Liposarkome, Lymphosarkome und

Rhabdomyosarkome), Tumore der Augen (u.a. intraokuläres Melanom und Retino- blastom), Tumore der endokrinen und exokrinen Drüsen (z.B. der thyroiden und para- thyroiden Drüsen, Bauchspeicheldrüsen- und Speicheldrüsenkarzinome,

Adenokarzinome), Tumore des Harntrakts (Blasen-, Penis-, Nieren-, Nierenbecken- und Harnleitertumore) sowie Tumore der reproduktiven Organe (Endometrium-, Zervix-, Ovarial-, Vaginal-, Vulva- und Uteruskarzinome der Frau sowie Prostata- und

Hodenkarzinome des Mannes). Dazu gehören auch proliferative Erkrankungen des

Blutes, des Lymphsystems und des Rückenmarks, in solider Form und als zirkulierende Zellen, wie Leukämien, Lymphome und myeloproliferative Erkrankungen, z.B. akute mye- loide, akute lymphoblastische, chronisch-lymphozytische, chronisch-myelogene und Haarzell-Leukämie, sowie AIDS-korrelierte Lymphome, Hodgkin-Lymphome, Non- Hodgkin-Lymphome, kutane T-Zell-Lymphome, Burkitt-Lymphome und Lymphome im zentralen Nervensystem.

Diese gut charakterisierten Krankheiten des Menschen können mit vergleichbarer Ätiologie auch in anderen Säugetieren vorkommen und dort ebenfalls mit den

Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Die Behandlung der zuvor genannten Krebserkrankungen mittels der erfindungsgemäßen Verbindungen umfasst sowohl eine Behandlung der soliden Tumore als auch eine Behandlung metastasierter oder zirkulierender Formen hiervon.

Der Begriff "Behandlung" oder "behandeln" wird im Rahmen dieser Erfindung

konventionell verwendet und bedeutet die Versorgung, Pflege und Betreuung eines Patienten mit dem Ziel, eine Krankheit oder gesundheitliche Abweichung zu bekämpfen, zu verringern, abzuschwächen oder zu erleichtern und die Lebensbedingungen zu verbessern, die durch diese Krankheit beeinträchtigt werden, wie beispielsweise bei einer Krebserkrankung.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung der erfin- dungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der

erfindungsgemäßen Verbindungen in einem Verfahren zur Behandlung und/oder

Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens einer der erfin- dungsgemäßen Verbindungen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder bei Bedarf in Kombination mit einer oder mehreren anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, solange diese Kombination nicht zu unerwünschten und inakzeptablen

Nebenwirkungen führt. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder

Prävention der zuvor genannten Erkrankungen.

Beispielsweise können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit bekannten anti- hyperproliferativen, zytostatischen, zytotoxischen oder immuntherapeutischen

Substanzen zur Behandlung von Krebserkrankungen kombiniert werden. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft genannt:

131 1-chTNT, Abarelix, Abirateron, Aclarubicin, Adalimumab, Ado-Trastuzumab Emtansin, Afatinib, Aflibercept, Aldesleukin, Alemtuzumab, Alendronsäure, Alitretinoin, Altretamin, Amifostine, Aminoglutethimid, Hexyl-5-Aminolevulinat, Amrubicin, Amsacrin, Anastrozol, Ancestim, Anethole dithiolethione, Anetumab ravtansine, Angiotensin II, Antithrombin III, Aprepitant, Arcitumomab, Arglabin, Arsentrioxid, Asparaginase, Atezolizumab, Avelumab, Axitinib, Azacitidin, Belotecan, Bendamustin, Besilesomab, Belinostat, Bevacizumab, Bexaroten, Bicalutamid, Bisantren, Bleomycin, Blinatumomab, Bortezomib, Buserelin, Bosutinib, Brentuximab vedotin, Busulfan, Cabazitaxel, Cabozantinib, Calcitonin,

Calciumfolinat, Calciumlevofolinat, Capecitabin, Capromab, Carbamazepine, Carboplatin, Carboquon, Carfilzomib, Carmofur, Carmustin, Catumaxomab, Celecoxib, Celmoleukin, Ceritinib, Cetuximab, Chlorambucil, Chlormadinon, Chlormethin, Cidofovir, Cinacalcet, Cisplatin, Cladribin, Clodronsäure, Clofarabin, Cobimetinib, Copanlisib, Crisantaspase, Crizotinib, Cyclophosphamid, Cyproteron, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin,

Daratumumab, Dabrafenib, Darolutamide, Dasatinib, Daunorubicin, Decitabin, Degarelix, Denileukin-Diftitox, Denosumab, Depreotid, Deslorelin, Dexrazoxane,

Dibrospidiumchlorid, Dianhydrogalactitol, Diclofenac, Docetaxel, Dolasetron, Doxifluridin, Doxorubicin, Doxorubicin + Estron, Dronabinol, Durvalumab, Edrecolomab,

Elliptiniumacetat, Endostatin, Enocitabin, Enzalutamid, Epacadostat, Epirubicin,

Epitiostanol, Epoetin-alfa, Epoetin-beta, Epoetin-zeta, Eptaplatin, Eribulin, Erlotinib, Esomeprazol, Estramustin, Etoposid, Ethinylestradiol, Everolimus, Exemestan, Fadrozol, Fentanyl, Fluoxymesteron, Floxuridin, Fludarabin, Fluoruracil, Flutamid, Folinsäure, Formestan, Fosaprepitant, Fotemustin, Fulvestrant, Gadobutrol, Gadoteridol,

Gadotersäure-Megluminsalz, Gadoversetamid, Gadoxetsäure Dinatriumsalz (Gd-EOB- DTPA Dinatriumsalz), Galliumnitrat, Ganirelix, Gefitinib, Gemcitabin, Gemtuzumab, Glucarpidase, Glutoxim, Goserelin, Granisetron, Granulocyten Kolonie stimulierender Factor (G-CSF), Granulocyten Macrophagen Kolonie stimulierender Factor (GM-CSF), Histamindihydrochlorid, Histrelin, Hydroxycarbamid, Ι-125-Seeds, Ibandronsäure, Ibritumomab-Tiuxetan, Ibrutinib, Idarubicin, Ifosfamid, Imatinib, Imiquimod, Improsulfan, Indisetron, Incadronic acid, Ingenolmebutat, Interferon-alfa, Interferon-beta, Interferon- gamma, lobitridol, lobenguane (1231), lomeprol, Ipilimumab, Irinotecan, Itraconazole, Ixabepilon, Ixazomib, Lanreotid, Lansoprazol, Lapatinib, Lasocholine, Lenalidomid, Lenvatinib, Lenograstim, Lentinan, Letrozol, Leuprorelin, Levamisol, Levonorgestrel, Levothyroxin-Natrium, Lipegfilgrastim, Lisurid, Lobaplatin, Lomustin, Lonidamin,

Masoprocol, Medroxyprogesteron, Megestrol, Melarsoprol, Melphalan, Mepitiostan, Mercaptopurin, Mesna, Methadon, Methotrexat, Methoxsalen, Methylaminolevulinat, Methylprednisolon, Methyltestosteron, Metirosin, Mifamurtid, Miltefosin, Miriplatin,

Mitobronitol, Mitoguazon, Mitolactol, Mitomycin, Mitotan, Mitoxantron, Mogamulizumab, Molgramostim, Mopidamol, Morphinhydrochlorid, Morphinsulfat, Nabilon, Nabiximols, Nafarelin, Naloxon + Pentazocin, Naltrexon, Nartograstim, Necitumumab, Nedaplatin, Nelarabin, Neridronsäure, Netupitant/palonosetron, Nivolumab, Nivolumabpentetreotid, Nilotinib, Nilutamid, Nimorazol, Nimotuzumab, Nimustin, Nintedanib, Nitracrin, Nivolumab, Obinutuzumab, Octreotid, Ofatumumab, Olaparib, Olaratumab, Omacetaxin- Mepesuccinat, Omeprazol, Ondansetron, Orgotein, Orilotimod, Osimertinib, Oxaliplatin, Oxycodon, Oxymetholon, Ozogamicin, p53-Gentherapie, Paclitaxel, Palbociclib,

Palifermin, Palladium-103-Seed, Palonosetron, Pamidronsäure, Panitumumab,

Panobinostat, Pantoprazol, Pazopanib, Pegaspargase, Pembrolizumab, Peg-interferon- alfa-2b, Pembrolizumab, Pemetrexed, Pentostatin, Peplomycin, Perflubutane,

Perfosfamid, Pertuzumab, Picibanil, Pilocarpin, Pirarubicin, Pixantron, Plerixafor,

Plicamycin, Poliglusam, Polyestradiolphosphat, Polyvinylpyrrolidone + Natriumhyaluronat, Polysaccharid-K, Pomalidomid, Ponatinib, Porfimer-Natrium, Pralatrexat, Prednimustin, Prednison, Procarbazin, Procodazole, Propranolol, Quinagolid, Rabeprazol,

Racotumomab, Radium-223-chlorid, Radotinib, Raloxifen, Raltitrexed, Ramosetron, Ramucirumab, Ranimustin, Rasburicase, Razoxan, Refametinib, Regorafenib,

Risedronsäure, Rhenium-186 Etidronat, Rituximab, Rogaratinib, Rolapitant, Romidepsin, Romurtid, Roniciclib, Samarium (153Sm) lexidronam, Satumomab, Secretin, Siltuximab, Sipuleucel-T, Sizofiran, Sobuzoxan, Natriumglycididazol, Sonidegib, Sorafenib,

Stanozolol, Streptozocin, Sunitinib, Talaporfin, Talimogen Laherparepvec, Tamibaroten, Tamoxifen, Tapentadol, Tasonermin, Teceleukin, Technetium (99mTc) Nofetumomab Merpentan, 99mTc-HYNIC-[Tyr3]-octreotid, Tegafur, Tegafur + Gimeracil + Oteracil, Temoporfin, Temozolomid, Temsirolimus, Teniposid, Testosteron, Tetrofosmin,

Thalidomid, Thiotepa, Thymalfasin, Thyrotropin alfa, Tioguanin, Tocilizumab, Topotecan, Toremifen, Tositumomab, Trabectedin, Trametinib, Tramadol, Trastuzumab, Treosulfan, Tretinoin, Trifluridine + Tipiracil, Trametinib, Trilostan, Triptorelin, Trofosfamid,

Thrombopoietin, Ubenimex, Valrubicin, Vandetanib, Vapreotid, Valatinib, Vemurafenib, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinflunin, Vinorelbin, Vismodegib, Vorinostat, Yttrium-90- Glasmikrokugeln, Zinostatin, Zinostatin-Stimalamer, Zoledronsäure, Zorubicin.

Zudem können die Antikörper ausgewählt sein aus der Klasse der MPS1 -Inhibitoren oder Antikörper gegen die Targets OX-40, CD137 / 4-1 BB, DR3, ID01 / ID02, LAG-3, und CD40.

Die Kombination eines erfindungsgemäßen Binder-Wirkstoff-Konjugates (ADCs) mit einer Krebsimmuntherapie zur Verwendung in der Behandlung von Krebs oder Tumoren ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung. Der intrinsische Wirkmechanismus von

zytotoxischen Binder-Wirkstoffkonjugaten beinhaltet die direkte Auslösung von Zelltod der Tumorzellen und somit die Freisetzung von Tumorantigenen, die eine Immunantwort stimulieren können. Zudem gibt es Hinweise, dass die KSP-lnhibitor-Toxophorklasse Marker des sogenannten immunogenen Zelltod [immunogenic cell death (ICD)] in vitro induziert. Somit stellt die Kombination der Binder-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) der vorliegenden Erfindung mit einem oder mehreren therapeutischer Ansätzen zur Krebs- Immuntherapie oder mit einem oder mehreren Wirkstoffen, bevorzugt Antikörpern, gerichtet gegen ein molekulares Target aus der Krebs-Immuntherapie eine bevorzugte Methode zur Behandlung von Krebs oder Tumoren da. i) Beispiele therapeutischer Ansätze zur Krebs-Immuntherapie umfassen Immun-modulatorische monoklonale Antikörper und niedermolekulare Substanzen gerichtet gegen Targets aus der Krebs Immuntherapie, Vakzine, CAR T Zellen, bi-spezifische T Zell-rekrutierende Antikörper, onkolytische Viren, zellbasierte Vakzinierungsansatze. ii) Beispiele ausgewählter Targets aus der Krebs Immuntherapie geignet für Immun-modulatorische monoklonale Antikörper umfassen CTLA-4, PD-1/PDL-1 , OX-40, CD137, DR3, ID01 , ID02,TD02, LAG-3, TIM-3 CD40.JCOS / ICOSL,TIGIT; GITR/GITRL, VISTA, CD70, CD27, HVEM/BTLA,

CEACAM1 , CEACAM6, ILDR2, CD73, CD47, B7H3, TLR's. Die Kombination eines erfindungsgemäßen Binder-Wirkstoff-Konjugates (ADCs) mit eine Krebsimmuntherapie könnte daher zum einen Tumoren mit schwach immunogenen Eigenschaften

immunogener machen und die Wirksamkeit eine Krebsimmuntherapie verstärken und außerdem eine langanhaltende therapeutische Wirkung entfalten.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden. Generell können mit der Kombination von Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit anderen, zytostatisch, zytotoxisch oder immuntherapeutisch wirksamen Agenzien folgende Ziele verfolgt werden:

• eine verbesserte Wirksamkeit bei der Verlangsamung des Wachstums eines Tumors, bei der Reduktion seiner Größe oder sogar bei seiner völligen Eliminierung im Vergleich zu einer Behandlung mit einem einzelnen Wirkstoff;

• die Möglichkeit, die verwendeten Chemotherapeutika in geringerer Dosierung als bei der Monotherapie einzusetzen;

• die Möglichkeit einer verträglicheren Therapie mit weniger Nebeneffekten im

Vergleich zur Einzelgabe; · die Möglichkeit zur Behandlung eines breiteren Spektrums von Tumorerkrankungen;

• das Erreichen einer höheren Ansprechrate auf die Therapie; • eine längere Überlebenszeit der Patienten im Vergleich zur heutigen Standardtherapie.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie beispielsweise, parenteral, möglicherweise inhalativ oder als Implantat bzw. Stent.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, vaginal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.

Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.

Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende

Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/ oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nichtüberzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder

Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder

Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen. Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. . intramuskulär, subkutan, intrakutan, perkutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen,

Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.

Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a.

Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien,

Augentropfen, Augensalben, Augenbäder, okulare Inserte, Ohrentropfen, -sprays, -pulver, -Spülungen, -tampons, , Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen,

Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Emulsionen, Mikroemulsionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.

Bevorzugt ist die parenterale Applikation, insbesondere die intravenöse Applikation.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit

pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. · Füll- und Trägerstoffe (beispielsweise Cellulose, mikrokristalline Cellulose wie z.B.

Avicel®, Laktose, Mannitol, Stärke, Calciumphosphate wie z.B. Di-Cafos®),

• Salbengrundlagen (beispielsweise Vaselin, Paraffine, Triglyceride, Wachse,

Wollwachs, Wollwachsalkohole, Lanolin, hydrophile Salbe, Polyethylenglycole),

• Suppositoriengrundlagen (zum Beispiel Polyethylenglycole, Kakaobutter, Hartfett), · Lösungsmittel (z.B. Wasser, Ethanol, Isopropanol, Glycerol, Propylenglycol,

mittelkettige Triglyceride fetter Öle, flüssige Polyethylenglycole, Paraffine),

• Tenside, Emulgatoren, Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise

Natriumdodecylsulfat, Lecithin, Phospholipide, Fettalkohole wie z.B. Lanette®, Sorbitanfettsäureester wie z.B. Span®, Polyoxy-ethylen-Sorbitanfettsäureester wie z.B. Tween®, Polyoxyethylen-Fettsäureglyceride wie z.B. Cremophor®, Polyoxethlyen-Fettsäureester, Polyoxethlyen-Fettalkoholether, Glycerolfettsäure- ester, Poloxamere wie z.B. Pluronic®),

Puffersubstanzen sowie Säuren und Basen (beispielsweise Phosphate,

Carbonate, Citronensäure, Essigsäure, Salzsäure, Natronlauge,

Ammoniumcarbonat, Trometamol, Triethanolamin),

Isotonisierungsmittel (beispielsweise Glucose, Natriumchlorid),

Adsorptionsmittel (beispielsweise hochdisperse Siliciumdioxide),

Viskositätserhöhende Mittel, Gelbildner, Verdickungs- bzw. Bindemittel

(beispielsweise Polyvinylpyrrolidon, Methylcellulose, Hydroxypropylmethyl- cellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose-Natrium, Stärke, Carbomere, Polyacrylsäuren wie z.B. Carbopol®, Alginate, Gelatine),

Sprengmittel (beispielsweise modifizierte Stärke, Carboxymethylcellulose-Natrium, Natriumstärkeglycolat wie z.B. Explotab®, quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Croscarmellose-Natrium wie z.B. AcDiSol®),

Fließregulier-, Schmier-, Gleit- und Formtrennmittel (beispielsweise Magnesium- stearat, Stearinsäure, Talkum, hochdisperse Siliciumdioxide wie z.B. Aerosil®),

Überzugsmittel (beispielsweise Zucker, Schellac) sowie Filmbildemittel für sich schnell oder modifiziert auflösende Filme bzw. Diffusionsmembranen

(beispielsweise Polyvinylpyrrolidone wie z.B. Kollidon®, Polyvinylalkohol,

Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Ethylcellulose,

Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, Celluloseacetat, Celluloseacetatphthtalat, Polyacrylate, Polymethacrylate wie z.B. Eudragit®),

Kapselmaterialien (z.B. Gelatine, Hydroxypropylmethylcellulose),

Synthetische Polymere (beispielsweise Polylactide, Polyglycolide, Polyacrylate, Polymethacrylate wie z.B Eudragit®, Polyvinylpyrrolidone wie z.B. Kollidon®, Polyvinylalcohole, Polyvinylacetate, Polyethylenoxide, Polyethylenglycole und deren Copolymere und Blockcopolymere),

Weichmacher (beispielsweise Polyethylenglycole, Propylenglykol, Glycerol, Triacetin, Triacetylcitrat, Dibutylphthalat),

Penetrationsenhancer, • Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure,

Ascorbylpalmitat, Natriumascorbat, Butylhydroxyanisol, Butylhydroxytoluol, Propylgallat),

• Konservierungsmittel (beispielsweise Parabene, Sorbinsäure, Thiomersal,

Benzalkoniumchlorid, Chlorhexidinacetat, Natriumbenzoat),

• Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide,

Titandioxid),

• Aromen, Süßungsmittel, Geschmacks- und / oder Geruchskorrigentien.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische

Zusammensetzungen, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.

Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0.1 bis 20 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.3 bis 7 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen.

Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg,

individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als isotopische Varianten vorliegen. Die Erfindung umfasst daher eine oder mehrere isotopische Varianten der

erfindungsgemäßen Verbindungen, insbesondere deuteriumhaltige Verbindungen. Der Begriff "isotopische Variante" einer Verbindung oder eines Reagenzes ist definiert als eine Verbindung mit einem unnatürlichen Anteil eines oder mehrerer der Isotope, aus denen eine derartige Verbindung aufgebaut ist.

Der Begriff "isotopische Variante der erfindungsgemäßen Verbindungen" ist definiert als eine erfindungsgemäße Verbindung mit einem unnatürlichen Anteil eines oder mehrerer der Isotope, aus denen eine derartige Verbindung aufgebaut ist.

Unter dem Ausdruck "unnatürlicher Anteil" ist ein Anteil eines derartigen Isotops zu verstehen, der höher als dessen natürliche Häufigkeit ist. Die in diesem Zusammenhang anzuwendenden natürlichen Häufigkeiten von Isotopen finden sich in "Isotopic

Compositions of the Elements 1997", Pure Appl. Chem., 70(1 ), 217-235, 1998.

Beispiele für derartige Isotope sind stabile und radioaktive Isotope von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor, Chlor, Brom und lod, wie ²H (Deuterium), ³H (Tritium), ¹¹C, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁷0, ¹⁸0, ³²P, ³³P, ³³S, ³⁴S, ³⁵S, ³⁶S, ¹⁸F, ³⁶CI, ⁸²Br, ¹²³l, ¹²⁴l, ¹²⁵l, ¹²⁹l bzw. ¹³¹l.

Im Hinblick auf die Behandlung und/oder Prophylaxe der hier angegebenen Störungen enthalten die isotopischen Variante(n) der erfindungsgemäßen Verbindungen

vorzugsweise Deuterium ("deuteriumhaltige erfindungsgemäße Verbindungen").

Isotopische Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen, in die ein oder mehrere radioaktive Isotope, wie ³H oder ¹⁴C, eingebaut sind, sind beispielsweise bei Arzneistoff- und/oder Substratsgewebeverteilungsstudien von Nutzen. Diese Isotope sind wegen ihrer leichten Einbaubarkeit und Nachweisbarkeit besonders bevorzugt. In eine

erfindungsgemäße Verbindung können Positronen emittierende Isotope wie ¹⁸F oder ¹¹C eingebaut werden. Diese isotopischen Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich zur Verwendung bei in-vivo-Bildgebungsanwendungen. Deuteriumhaltige und ¹³C-haltige erfindungsgemäße Verbindungen können im Rahmen präklinischer oder klinischer Studien bei Massenspektrometrie-Analysen verwendet werden

Isotopische Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen können im Allgemeinen nach dem Fachmann bekannten Verfahren wie den in den hier beschriebenen Schemata und/oder Beispielen beschrieben hergestellt werden, indem man ein Reagenz durch eine isotopische Variante des Reagenzes, vorzugsweise ein deuteriumhaltiges Reagenz, ersetzt. Je nach den gewünschten Deuterierungsstellen kann in einigen Fällen Deuterium aus D2O entweder direkt in die Verbindungen oder in Reagenzien, die für die Synthese derartiger Verbindungen verwendet werden können, eingebaut werden. Ein nützliches Reagenz zum Einbau von Deuterium in Moleküle ist auch Deuteriumgas. Eine schnelle Route zum Einbau von Deuterium ist die katalytische Deuterierung von olefinischen Bindungen und acetylenischen Bindungen. Zum direkten Austausch von Wasserstoff gegen Deuterium in funktionelle Gruppen enthaltenden Kohlenwasserstoffen können auch Metallkatalysatoren (d.h. Pd, Pt und Rh) in Gegenwart von Deuteriumgas verwendet werden. Verschiedene deuterierte Reagenzien und Synthesebausteine sind im Handel von Firmen wie beispielsweise C/D/N Isotopes, Quebec, Kanada; Cambridge Isotope Laboratories Inc., Andover, MA, USA; und CombiPhos Catalysts, Inc., Princeton, NJ, USA, erhältlich.

Der Begriff "deuteriumhaltige Verbindung" ist definiert als eine erfindungsgemäße

Verbindung, in der ein oder mehrere Wasserstoffatome durch ein oder mehrere

Deuteriumatome ersetzt sind und in der die Häufigkeit von Deuterium in jeder deuterierten Position der Verbindung der allgemeinen Formel (I) höher ist als die natürliche Häufigkeit von Deuterium, die etwa 0,015% beträgt. Insbesondere ist in einer deuteriumhaltigen erfindungsgemäßen Verbindung die Häufigkeit von Deuterium in jeder deuterierten

Position der Verbindung der allgemeinen Formel (I) höher als 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% oder 80%, vorzugsweise höher als 90%, 95%, 96% oder 97%, noch weiter bevorzugt höher als 98% oder 99% in dieser Position bzw. diesen Positionen. Es versteht sich, dass die Häufigkeit von Deuterium in jeder deuterierten Position von der Häufigkeit von Deuterium in anderen deuterierten Positionen unabhängig ist.

Durch den selektiven Einbau eines oder mehrerer Deuteriumatome in eine

erfindungsgemäße Verbindung können die physikalisch-chemischen Eigenschaften (wie beispielsweise Acidität [C. L. Perrin, et al., J. Am. C em. Soc, 2007, 129, 4490], Basizität [C. L. Perrin et al., J. Am. Chem. Soc, 2005, 127, 9641 ], Lipophilie [B. Testa et al., Int. J. Pharm., 1984, 19(3), 271 ]) und/oder das Stoffwechselprofil des Moleküls verändert und Veränderungen des Verhältnisses von Stammverbindung zu Metaboliten oder der gebildeten Mengen von Metaboliten verursacht werden. Derartige Veränderungen können zu bestimmten therapeutischen Vorteilen führen und daher unter bestimmten Umständen bevorzugt sein. Es ist über verringerte Stoffwechsel raten und Stoffwechselumschaltung, bei der sich das Verhältnis von Metaboliten ändert, berichtet worden (A. E. Mutlib et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., 2000, 169, 102). Diese Veränderungen der Exposition gegenüber Stammverbindung und Metaboliten können wichtige Konsequenzen hinsichtlich Pharmakodynamik, Verträglichkeit und Wirksamkeit einer deuteriumhaltigen erfindungsgemäßen Verbindung haben. In einigen Fällen wird durch den Deuteriumersatz die Bildung eines unerwünschten oder toxischen Metaboliten verringert oder eliminiert und die Bildung eines gewünschten Metaboliten verstärkt (z.B. Nevirapin: A. M. Sharma et al., Chem. Res. Toxicol., 2013, 26, 410; Efavirenz: A. E. Mutlib et al., Toxicol. Appl.

Pharmacol., 2000, 169, 102). In anderen Fällen besteht der Haupteffekt der Deuterierung darin, die Geschwindigkeit der systemischen Clearance zu verringern. Dadurch wird die biologische Halbwertszeit der Verbindung erhöht. Zu den potentiellen klinischen Vorteilen gehören die Fähigkeit zur Aufrechterhaltung einer ähnlichen systemischen Exposition mit verringerten Spitzenspiegeln und erhöhten Talspiegeln. Dies könnte je nach der

Pharmakokinetik/Pharmakodynamik-Beziehung der jeweiligen Verbindung zu geringeren Nebenwirkungen und erhöhter Wirksamkeit führen. Beispiele für diesen Deuterium-Effekt sind ML-337 (C. J. Wenthur et al., J. Med. Chem., 2013, 56, 5208) und Odanacatib (K. Kassahun et al., WO2012/1 12363). Es ist auch noch über weitere Fälle berichtet worden, bei denen verringerte Verstoffwechslungsraten zu einer Erhöhung der

Arzneistoffexposition ohne Änderung der Rate der systemischen Clearance führen (z.B. Rofecoxib: F. Schneider et al., Arzneim. Forsch. / Drug. Res., 2006, 56, 295; Telaprevir: F. Maltais et al., J. Med. Chem., 2009, 52, 7993). Deuterierte Arzneistoffe, die diesen Effekt zeigen, können verringerte Dosierungsanforderungen haben (z.B. geringere Zahl von Dosen oder niedrigere Dosierung zur Erzielung der gewünschten Wirkung) und/oder zu geringeren Metabolitenbelastungen führen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können mehrere potenzielle Angriffsstellen für die Verstoffwechslung aufweisen. Zur Optimierung der oben beschriebenen Effekte auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften und das Stoffwechselprofil können

deuteriumhaltige erfindungsgemäße Verbindungen mit einem bestimmten Muster eines oder mehrerer Deuterium-Wasserstoff-Austausche gewählt werden. Insbesondere ist/sind das Deuteriumatom/die Deuteriumatome deuteriumhaltiger erfindungsgemäßer

Verbindung(en) an ein Kohlenstoffatom gebunden und/oder steht/stehen in den

Positionen der erfindungsgemäßen Verbindungen, bei denen es sich um Angriffsstellen für Verstoffwechslungsenzyme wie z.B. Cytochrom P450 handelt. Beispiele

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Ausführbarkeit der vorliegenden Erfindung, ohne die Erfindung nur alleine auf diese Beispiele zu beschränken.

Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen.

Synthesewege:

Exemplarisch zu den Ausführungsbeispielen sind in folgenden Schemata beispielhafte Synthesewege dargestellt.

In diesen Schemata kann gemäß Formel IIa der an der Amino-Gruppe -NHR ⁴ stehende Substituent R ⁴ durch die Gruppe Zi-(C=0)-N H-CH(CH ₂C(=0)N H ₂)-C(=0) substituiert sein.

Hierbei steht

Zi für eine Ci-10-Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder C6-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, C1-10-

Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Cö-io-Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alkoxy-, C6-io-Aryloxy-, C6-io-Aryl-Ci-io- alkyloxy- oder C6-io-Aralkoxy-, Cs-io-Heteroalkoxy-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io- Aryloxy- oder Cs-io-Heterocyclo-alkoxy-Gruppe steht, die ein- oder mehrfach mit -NH ₂, -C(=0)-, -NH-Alkyl, -N(Alkyl) ₂, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -S(=0) ₃-H, -S(=0) ₂-NH ₂, -S(=0) ₂-N(Alkyl) ₂, -COOH, -C(=0)NH ₂, -C(=0)-N(Alkyl) ₂ oder -OH substituiert sein kann, oder für -H oder eine Gruppe -(CH ₂) ₀-i-O _x-(CH ₂CH ₂O) _v-R ¹ steht, x für 0 oder 1 , v für eine Zahl von 1 bis 20 und für die in der Formel (II) angegebenen Bedeutungen. Schema 1 : Synthese von Cystein-verknüpften ADCs

Schema 3: Synthese von Lysin-verknüpften ADCs Schema 4: Synthese von Cvstein-verknüpften ADCs über hydrolysierte Bernsteinsäureamide

Dieses Verfahren wurde insbesondere bei ADCs mit L1 = # ¹-CH2-# ² angewendet um diese ADCs in die offenkettige Verknüpfungsform zu überführen.

Schema 5: S nthese von ADC-Precurser Molekülen

[a): HATU, DMF, Diisopropylethylamin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA.] Schema 6: Allgemeines Verfahren zur Synthese von Intermediaten und ADC-Precursern

[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT oder EDCI, HOBT, N,N- Diisopropylethylamin, DMF, RT b) H ₂, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) Z1-COOH, EDCI, HOBT, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT oder Zi-COOH, HATU, N,N-Diisopropylethylamin, DMF, RT oder Zi-COOSu, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT]

Schema 7: Synthese von ADC-Precurser Molekülen mit Legumain-spaltbaren Linkern

[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT oder EDCI, HOBT, N,N- Diisopropylethylamin, DMF, RT b) H ₂, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan- 1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT]

chema 8: Synthese von ADC-Precurser Molekülen mit Legumain-spaltbaren Linkern

[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT oder EDCI, HOBT, N,N- Diisopropylethylamin, DMF, RT b) H ₂, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) ) 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan- 1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT]

Weiterhin können andere Intermediate gemäß Schema 6, 7 und 8 in Legumain-spaltbare ADC-und APDC Precursor überführt werden.

Alternativ zu der in Schemata 6-8 dargestellten Benzyloxycarbonyl-Gruppe können andere in der Peptidchemie etablierte Schutzgruppen eingesetzt werden und nach entsprechenden ebenso bekannten Methoden abgespalten werden. Die Auswahl der Schutzgruppenstrategie erfolgt nach entsprechenden dem Fachmann bekannten Anforderungen zur Kompatibilität mit anderen im Molekül vorkommenden

Strukturelementen. Falls noch vorhanden können weitere Schutzgruppen im Molekül in einem letzten Schritt entfernt werden. Synthesen können auch ggf. in ihrer Sequenz umgestellt werden.

Schema 9: Synthese von C stein-verknüpften ADCs mit Legumain-spaltbarer Kopfgruppe

[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT; b) 2-5 Eq TCEP, PBS pH7.2, 30 min Rühren bei RT; c) 90 min Rühren bei RT unter Argon, dann Umpuffern auf pH 8 mittels PD 10-Säulen (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) und Rühren über Nacht unter Argon bei RT und anschließendes Aufkonzentrieren mittels Ultrazentrifugation und Einstellen der angestrebten Konzentration mit PBS bei pH 7.2)] Schema 10: Synthese von L sin-verknüpften ADCs mit Legumain-spaltbarem Linker

[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT; b) H ₂, 10% Pd-C, Methanol 1.5 h, RT; c) 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion, N,N-Diisopropylethylamin, DMF, Rühren über Nacht bei RT; d) AK2 in PBS, 5 Equiv. Aktivester gelöst in DMSO zugeben, 60 min Rühren bei RT unter Argon, erneut 5 Equiv. Aktivester gelöst in DMSO nachsetzen, 60 min Rühren bei RT unter Argon, dann Reinigung über mit PBS Puffer (pH 7.2) equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) und anschließendes Aufkonzentrieren mittels Ultrazentrifugation und Einstellen der angestrebten

Konzentration mit PBS Puffer (pH 7.2)]. chema 1 1 : Synthese von ADC-Precursern mit Legumain-spaltbarer Kopfgruppe

[a): NaBH(OAc) ₃, HOAc, Dichlormethan, RT; b) Chloracetylchlorid, NEt ₃, DCM, RT; c) L- Cystein, NaHCOs, DBU, Isopropanol/Wasser, 50 °C; d) HATU, DMF,

Diisopropylethylamin, RT; e) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C; f) d) HATU, DMF, Diisopropylethylamin, RT] hema 12: Synthese von ADCs über Transglutaminase-Kupplung

[a: 5 mg AK3 in DPBS pH 7.4 (c~10mg/ml_), 6 Equivalente eines Toxophor-Linker- Precursors, 50 μΙ_ einer Lösung aus 12.5 μί (1.25 U) rekombinanter bakterieller Transglutaminase Lösung in Wasser (100 U/mL) und 37.5 μί DPBS pH 7.4 hinzugegeben, 24h bei 37°C inkubieren]

A. Beispiele

Abkürzungen und Akronyme:

ABCB1 ATP-binding cassette sub-family B member 1 (Synonym für P- gp und MDR1 )

abs. Absolut

Ac Acetyl

ACN Acetonitril

aq. wässrig, wässrige Lösung

ATP Adenosintriphosphat

BCRP Brustkrebs-Resistenz-Protein, ein Efflux-Transporter

BEP 2-Brom-1 -ethylpyridinium-Tetrafluoroborat

Boc ie/f.-Butoxycarbonyl

br. breit (bei NMR)

Bsp. Beispiel

BxPC3 humane Tumorzelllinie

ca. circa, ungefähr

Cl chemische Ionisation (bei MS)

D Dublett (bei NMR)

D Tag(e)

DAR Drug Antibody Ratio (Beladung des Antikörpers)

DC Dünnschichtchromatographie

DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)

DCM Dichlormethan

Dd Dublett von Dublett (bei NMR)

DMAP 4-/V,/V-Dimethylaminopyridin

DME 1 ,2-Dimethoxyethan DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium (standardisiertes

Nährmedium für die Zellkultur)

DMF Λ/,/V-Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

DPBS, D-PBS, Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salz-Lösung

D/P Dye (FlopreszenzfarbstoffyProtein Verhältnis

PBS PBS = DPBS = D-PBS, pH7,4, Fa. Sigma, No D8537

Zusammensetzung:

0,2 g KCl

0,2 g KH2PO4 (anhyd)

8,0 g NaCI

1 ,15 g Na ₂HP0 ₄ (anhyd)

ad 1 I mit H2O auffüllen

Dt Dublett von Triplett (bei NMR)

DTT DL-Dithiothreitol

d. Th. der Theorie (bei chemischer Ausbeute)

EDC /V'-(3-Dimethylaminopropyl)-/V-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid

EGFR Epidermal growth factor receptor = Epidermaler

Wachstumsfaktor Rezeptor

El Elektronenstoß-Ionisation (bei MS)

ELISA Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay

eq. Äquivalent(e)

ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)

ESI-MicroTofq ESI- MicroTofq (Name des Massenspektrometer mit Tof =

Time Of Flight und q = Quadrupol)

FCS fötales Kälberserum

Fmoc (9/-/-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl

ges. Gesättigt

GTP Guanosin-5'-triphosphat

H Stunde(n)

HATU 0-(7-Azabenzotriazol-1 -yl)-/V,/V,/V',/V'-tetramethyluronium- hexafluorophosphat

HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1 -ethansulfonsäure

HOAc Essigsäure

HOAt 1 -Hydroxy-7-azabenzotriazol HOBt 1 -Hydroxy-1 H-benzotriazol-Hydrat

HOSu /V-Hydroxysuccinimid

HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie

IC50 halbmaximale Inhibitionskonzentration

i.m. intramuskulär, Applikation in den Muskel

i.v. intravenös, Applikation in die Vene

konz. konzentriert

KPL-4 humane Tumorzelllinien

KU-19-19 humane Tumorzelllinie

LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie

LLC-PK1 -Zellen Lewis lung Carcinoma pork kidney cell line

L-MDR Human MDR1 transfizierte LLC-PK1 Zellen

LoVo humane Tumorzelllinie

M Multiplett (bei NMR)

MDR1 Multidrug resistence protein 1

MeCN Acetonitril

Min Minute(n)

MS Massenspektrometrie

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbrom id

NCI-H292 humane Tumorzelllinie

-Nme- Eine am Stickstoffatom gebundene Methyl-Gruppe bedeutet

NMM /V-Methylmorpholin

NMP /V-Methyl-2-pyrrolidinon

NMR Kernresonanzspektrometrie

NMRI Mausstamm, Herkunft aus dem Naval Medical Research

Institute (NMRI)

Nude Mäuse Nacktmäuse(Versuchstiere)

NSCLC Non small cell lung Cancer (Nicht-kleinzelliges

Bronchialkarzinom)

PBS Phosphat-gepufferte Salz-Lösung

Pd/C Palladium auf Aktivkohle P-gp P-Glycoprotein, ein Transporterprotein

PNGaseF Enzym zur Zuckerabspaltung

quant. quantitativ (bei Ausbeute)

Quart Quartett (bei NMR)

Quint Quintett (bei NMR)

Rf Retentionsindex (bei DC)

RT Raumtemperatur

Rt Retentionszeit (bei HPLC)

S Singulett (bei NMR)

s.c. subcutan, Applikation unter die Haut

SCID Mäuse Versuchsmäuse mit einem schweren kombinierten

Immundefekt (severe combined immunodeficiency)

SK-HEP-1 humane Tumorzelllinie

t Triplett (bei NMR)

TBAF Tetra-n-butylammoniumfluorid

TCEP Tris(2-carboxyethyl)phosphin

TEMPO (2,2,6,6-Tetramethyl-piperidin-1 -yl)oxyl

Teoc Trimethylsilylethoxycarbonyl

tert. Tertiär

TFA Trifluoressigsäure

THF Tetrahydrofuran

T3P ^® 2 _!4 _!6-Tripropyl-1 _!3 _!5 _!2 _!4 _!6-trioxatriphosphinan-2 _!4,6-trioxid

U251 humane Tumorzelllinie

UV Ultraviolett-Spektrometrie

v/v Volumen zu Volumen-Verhältnis (einer Lösung)

Z Benzyloxycarbonyl

Aminosäuren Abkürzungen

Ala = Alanin

Arg = Arginin

Asn = Asparagin

Asp = Asparaginsäure Cys = Cystein

Glu = Glutaminsäure

Gin = Glutamin

Gly = Glycin

His = Histidin

lle = Isoleucin

Leu = Leucin

Lys = Lysin

Met = Methionin

Nva = Norvalin

Phe = Phenylalanin

Pro = Prolin

Ser = Serin

Thr = Threonin

Trp = Tryptophan

Tyr = Tyrosin

Val = Valin

HPLC- und LC-MS-Methoden: Methode 1 (LC-MS):

Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1 .8 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A 1 .2 min 5% A

2.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.40 mL/min; UV-Detektion: 208 - 400 nm.

Methode 2 (LC-MS):

Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity l-CLASS; Säule: Waters, BEH300, 2.1 x 150 mm, C18 1.7 m; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 %

Ameisensäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B— > 1 .5 min 2% B -> 8.5 min 95% B -> 10.0 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.50 mL/min; UV- Detektion: 220 nm

Methode 3 (LC-MS):

Instrument MS: Waters (Micromass) QM; Instrument HPLC: Agilent 1 100 Serie; Säule : Agient ZORBAX Extend-C18 3.0x50mm 3.5-Micron; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 mol Ammoniumcarbonat, Eluent B: 1 I Acetonitril; Gradient: 0.0 min 98% A -> 0.2min 98% A -> 3.0 min 5% A^ 4.5 min 5% A ; Ofen: 40°C; Fluss: 1 .75 mL/min; UV-Detektion: 210 nm Methode 4 (LC-MS):

Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity l-CLASS; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μηι; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 % Ameisensäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% B -> 0.3 min 10% B -> 1 .7 min 95% B -> 2.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 1 .20 mL/min; UV-Detektion: 210 nm

Methode 5 (LC-MS):

Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1 .8 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 95% A -> 6.0 min 5% A -> 7.5 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.35 mL/min; UV-Detektion: 210 - 400 nm.

Methode 6 (LC-MS):

Instrument: Micromass Quattro Premier mit Waters UPLC Acquity; Säule: Thermo

Hypersil GOLD 1.9 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.5 mL 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.5 mL 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 97% A -> 0.5 min 97% A -> 3.2 min 5% A -> 4.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.3 mL/min; UV- Detektion: 210 nm. Methode 7 (LC-MS):

Instrument: Agilent MS Quad 6150;HPLC: Agilent 1290; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1 .8 μ 50 x 2.1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A -> 0.3 min 90% A -> 1 .7 min 5% A -> 3.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 1 ,20 mL/min; UV- Detektion: 205 - 305 nm. Methode 8 (LC-MS):

Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity l-CLASS; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μηι; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 % Ameisensäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B -> 2.0 min 2% B -> 13.0 min 90% B -> 15.0 min 90% B; Ofen: 50°C; Fluss: 1.20 ml/min; UV-Detektion: 210 nm

Methode 9: LC-MS-Prep Reinigungsmethode für die Beispiele 181 -191 (Methode LIND- LC-MS-Prep)

Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Waters X-Bridge C18, 19 mm x 50 mm, 5 μηη, Eluent A: Wasser + 0.05% Ammoniak, Eluent B: Acetonitril (ULC) mit Gradient; Fluss: 40 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm). bzw.

Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Phenomenex Luna 5μ C18(2) 100A, AXIA Tech. 50 x 21.2 mm, Eluent A: Wasser + 0.05% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril (ULC) mit Gradient; Fluss: 40 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm).

Methode 10: LC-MS-Analytik-Methode für die Beispiele 181 -191 ( L I N D_S Q D_S B_AQ ) Instrument MS: Waters SQD; Instrument HPLC: Waters UPLC; Säule: Zorbax SB-Aq

(Agilent), 50 mm x 2.1 mm, 1 .8 μηη; Eluent A: Wasser + 0.025% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril (ULC) + 0.025% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 98%A - 0.9 min 25%A - 1 .0 min 5%A - 1 .4 min 5%A - 1 .41 min 98%A - 1.5 min 98%A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.600 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 nm.

Methode 1 1 (HPLC):

Gerät: HP1 100 Serie Säule: Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50-4,6mm, Best-

Nr.1 .51450.0001 , Vorsäule Chromolith Guard Cartridge Kit, RP-18e,

5-4,6mm, Best.-Nr. 1 .51470.0001

Gradient: Flow 5ml_/ Min

Injection Volume 5μΙ

Solvent A: HCL04 (70%ig) in Wasser (4

Solvent B: Acetonitril

Start 20% B

0.50 Min 20% B

3.00 Min 90% B

3.50 Min 90% B

3.51 Min 20% B

4.00 Min 20% B

Säulentemperatur: 40°C

Wellenlänge: 210nm

Methode 12: (LC-MS):

Gerätetyp MS: Thermo Scientific FT-MS; Gerätetyp UHPLC+: Thermo Scientific UltiMate 3000; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 75 mm, C18 1 .8 [Ji m ; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 % Ameisensäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% B -> 2.5 min 95% B -> 3.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.90 ml/min; UV-Detektion: 210 nm/ Optimum Integration Path 210-300 nm

Methode 13: (LC-MS):

Instrument MS: Waters (Micromass) Quattro Micro; Instrument Waters UPLC Acquity; Säule : Waters BEH C18 1 .7 μ 50 x 2.1 mm; Eluent A: 1 I Wasser + 0.01 mol

Ammoniumformiat, Eluent B: 1 I Acetonitril; Gradient: 0.0 min 95% A— > 0.1 min 95% A— > 2.0 min 15% A -> 2.5 min 15% A^ 2.51 min 10% A -> 3.0 min 10% A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.5 ml/min; UV-Detektion: 210 nm Für alle Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden nicht explizit beschrieben ist, gilt, dass sie von allgemein zugänglichen Quellen kommerziell bezogen wurden. Für alle übrigen Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden ebenfalls nicht beschrieben ist und die nicht kommerziell erhältlich waren oder von Quellen bezogen wurden, die nicht allgemein zugänglich sind, ist ein Verweis auf die veröffentlichte Literatur angegeben, in der ihre Herstellung beschrieben ist.

Methode 14: (LC-MS) (MCW-LTQ-POROSHELL-TFA98-10min)

Gerätetyp MS: ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL; Gerätetyp HPLC: Agilent 1200SL; Säule: Agilent, POROSHELL 120, 3 x 150 mm, SB - C18 2.7 μπι; Eluent A: 1 I Wasser + 0.1 % Trifluoressigsäure; Eluent B: 1 I Acetonitril + 0.1 % Trifluoressigsäure; Gradient: 0.0 min 2% B -> 0.3 min 2% B -> 5.0 min 95% B -> 10.0 min 95% B; Ofen: 40°C; Fluss: 0.75 ml/min; UV-Detektion: 210 nm

Ausgangsverbindungen und Intermediate: Für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen geeignete

Ausgangsverbindungen sowie die Herstellung geeigneter Intermediate sind bereits in der WO2015/96982 A1 sowie in der WO2016/96610 A1 beschrieben.

Die Intermediate C1 bis C73, L1 bis L73, F1 bis F58 sowie F82 bis F91 , F103 bis F129, F142 bis F156, F163 bis F180, F192 bis F196, F204 bis F207, F209 bis F218, F235, F236, F238, F241 bis F245, F247, F248 und F254 gemäß WO2015/96982 A1 gehören zur Offenbarung der vorliegenden Anmeldung. Ebenso gehören weitere Intermediate, die in WO2016/96610 A1 beschrieben wurden, zur Offenbarung der vorliegenden

Anmeldung. Sofern im Folgenden auf Verbindungen mit bestimmten Nummern verwiesen wird (z.B. Intermediat C1 , L1 oder F1 ), handelt es sich um die Verbindungen mit diesen Nummern gemäß WO2015/96982 A1. Weitere Ausgangsverbindungen und Intermediate werden im Folgenden beschrieben. Intermediat C102

(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}

(glycoloyl)amino]-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}butansäu re

Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyl-(2S)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-4- oxobutanoat in Analogie zu Intermediat C2 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat acyliert und schließlich mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der beiden Estergruppen durchgeführt. LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1 .31 min; MS (ESIpos): m/z = 646 (M-H)\

Intermediat C109

Di-tert-butyl-N-{(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-L-glut amat

Zunächst wurde das Dipeptidderivat Di-tert-butyl-beta-alanyl-L-glutamat nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung von kommerziell erhältlichen N- [(Benzyloxy)carbonyl]-beta-alanin und Di-tert-butyl L-glutamat Hydrochlorid (1 :1 ) in Gegenwart von HATU und anschließender hydrogenolytischer Abspaltung der Z- Schutzgruppe hergestellt. Die Titelverbindung wurde dann durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C102 in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch 45-minütige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Methanol bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hergestellt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.99 min; MS (ESIpos): m/z = 826 [M+H] ⁺. Intermediat C111

Di-tert-butyl-N-{(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glut amat

Die Synthese der Titelverbindung erfolgte in Analogie zu Intermediat C109.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1 .06 min; MS (ESIpos): m/z = 826 [M+H] ⁺.

Intermediat C116

Trifluoressigsäure N ¹-{(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]- amino}ethyl)amino]-1 -oxobutan-2-yl}-L-aspartamid

Trifluoressigsäure (2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl] 2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-(2 -{[(2, 5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 - yl)acetyl]amino}ethyl)butanamid (1 :1 ) (81 .0 mg, 100 μηιοΙ) (Intermediat F104) und 2,5- Dioxopyrrolidin-1 -yl-N ²-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat (43.0 mg, 131 μmol) wurden 5.0 ml DMF gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit N,N-Diisopropylethylamin (61 μΙ, 350 μηηοΙ), 1 h bei RT nachgerührt, und dann direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule:

Chromatorex 125x30; 10μ, Fluss: 75 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand lyophilisiert. Man erhielt 84 mg (88 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-[(2S)-4-amino-1 -({(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4 (2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(2-{[(2,5-dioxo- 2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]amino}ethyl)amino]-1 -oxobutan-2-yl}amino)-1 ,4- dioxobutan-2-yl]carbamat.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1 .09 min; MS (ESIpos): m/z = 907 [M+H] ⁺ Tert-Butyl-[(2S)-4-amino-1 -({(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 - yl)acetyl]amino}ethyl)amino]-1 -oxobutan-2-yl}amino)-1 ,4-dioxobutan-2-yl]carbamat (83.0 mg, 91.5 μηηοΙ) wurde in 5.0 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (74.8 mg, 549 μηηοΙ) versetzt und 15 min bei 50°C nachgerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (160 mg, 549 μηηοΙ) versetzt, mit 5.0 ml Acetonitril/Wasser verdünnt, mit TFA (20 μΙ) versetzt und 10 min nachgerührt. Der Ansatz wurde durch einen Spritzenfilter filtriert und mittles präp. RP-HPLC (Säule:

Chromatorex 125x30; 10μ, Fluss: 75 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 50 mg (58 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.81 min; MS (ESIpos): m/z = 807 [M+H] ⁺

Intermediat C118

tert-Butyl-N-[(8S)-8-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]ethyl}-2,2-dimethyl-6,9-diox o-5-oxa-7,10-diaza-2- siladodecan-12-yl]-D-alpha-glutaminat

Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung von Intermediat L1 19 und Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und anschließender hydrogenolytischer Abspaltung der Z-Schutzgruppe hergestellt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1 .05 min; MS (ESIpos): m/z = 885 (M+H) ⁺. Intermediat C119

tert-Butyl-glycyl-N-[(8S)-8-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]ethyl}-2,2-dimethyl-6,9-diox o-5-oxa-7,10-diaza-2- siladodecan-12-yl]-D-alpha-glutaminat

Intermediat C1 19 wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung von 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]glycinat und Intermediat C1 18 in Gegenwart von HATU und anschließender Abspaltung der Z-Schutzgruppe Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Methanol/Dichlormethan bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hergestellt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1 .03 min; MS (ESIpos): m/z = 942 (M+H) ⁺.

Intermediat C121

Dibenzyl-N-{(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glut amat

Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von Dibenzyl-D-glutamat, das zuvor durch Verteilung zwischen Ethylacetat und 5%-iger Natriumhydrogencarbonatlösung aus seinem p-Toluolsulfonsäure-Salz freigesetzt wurde mit Intermediat C61 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der Teoc- Schutzgruppe mittels Zinkchlorid in Trifluorethanol hergestellt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1.05 min; MS (ESIpos): m/z = 894 [M+H] ⁺.

Intermediat C122 tert-Butyl-N-[2-({(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-

2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl] -N ²-(tert-butoxycarbonyl)-D- alpha-glutaminat

Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von tert-Butyl N-(2-aminoethyl)-N ²-(tert- butoxycarbonyl)-D-alpha-glutaminat trifluoracetat , mit Intermediat C102 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender hydrogenolytischer Abspaltung der Z-Schutzgruppe hergestellt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1.06 min; MS (ESIpos): m/z = 841 [M+H] ⁺.

Intermediat C123 tert-Butyl-N-[2-({(2S)-2-(L-asparaginylamino)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl} amino)ethyl]-N ²-(tert- butoxycarbonyl)-D-alpha-glutaminat

Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 4-Nitrophenyl-N ²-[(benzyloxy)carbonyl]-L- asparaginat mit Intermediat C122 in DMF in Gegenwart Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT hergestellt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.98 min; MS (ESIpos): m/z = 955 [M+H] ⁺.

Intermediat C130

9H-Fluoren-9-ylmethyl-{3-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]propyl}carbamat

9H-Fluoren-9-ylmethyl-[3-({(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino)propyl]carbamat (2.50 g, 3.94 mmol) (Intermediat C67) und Triethylamin (1 .6 ml, 12 mmol) wurden in Dichlormethan (200 ml) vorgelegt.

Chloracetylchlorid (2.23 g, 19.7 mmol) wurde zugegeben und die Reaktion wurde für 5 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit 10%iger Zitronensäurelösung, Wasser, ges.

Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen.

Anschließend wurde die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 1 .7 g der Titelverbindung

Intermediat C131

tert-Butyl-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(3-{[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]a

cysteinat

Unter Argon wurden Di-tert-butyl-L-cystinatdihydrochlorid (135 mg, 317 μmol) in 6.0 mL Wasser und 7.5 mL / ^'so-Propanol vorgelegt und mit TCEP (303 mg, 1.06 mmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 9H-Fluoren-9-ylmethyl-{3-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]propyl}carbamat (300 mg, 422 μηιοΙ) und 1 ,8- Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en (760 μΙ, 5.1 mmol) in 1.5 mL / ^'so-Propanol zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 50 °C gerührt. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 360 mg der Titelverbindung.

LC-MS (Methodel ): R _t = 1 .17 min; MS (ESIpos): m/z = 851 [M+H] ⁺ Intermediat C132

tert-Butyl-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(3-{[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]amino}p ropyl)amino]-2-oxoeth cysteinat (361 mg, 424 μηηοΙ) wurden in absolutem DMF (3 ml_) gelöst und zu 2,2- Dimethyl-4-oxo-3, 8,1 1 ,14, 17-pentaoxa-5-azaicosan-20-säure (186 mg, 509 μηιοΙ) gegeben. Die Mischung wurden mit HATU (193 mg, 509 μηηοΙ) sowie mit N,N- Diisopropylethylamin (300 μΙ, 1 .7 mmol) versetzt und die Reaktion wurde 5 min. bei RT gerührt. Der Ansatz wird mit 1 ml Wasser + 0,1 %TFA gequencht und direkt über die präp. HPLC (Eluent: ACN/Wasser + 0.1 % TFA, Gradient) gereinigt. Es wurden 167 mg der Zielverbindung erhalten

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1 .56 min; MS (ESIpos): m/z = 1 198 [M+H] ⁺

Intermediat C133

Eine Lösung aus tert-Butyl-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}(3-{[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]ami no}propyl)amino]-2- oxoethyl}-N-(2,2-dimethyl-4,20-dioxo-3,8,1 1 ,14,17-pentaoxa-5-azaicosan-20-yl)-L- cysteinat (214 mg, 178 μηιοΙ) in DMF (5 mL) wurde mit Morpholin (160 μΙ, 1 .8 mmol) versetzt und bei Raumtemperatur für 5 Stunden gerührt. Der Ansatz wird mit Wasser +0,1 % TFA gequencht und direkt über die präp. HPLC (Acetoniril/Wasser + 0.1 % TFA Gradient) gereinigt. Es wurden 1 1 1 mg der Zielverbindung erhalten

LC-MS (Methodel ): R _t = 1 .03 min; MS (ESIpos): m/z = 976 [M+H] ⁺

Intermediat C134

tert-Butyl-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(3-{[N2-(pyridin-4-ylacetyl)-L-asparaginyl]am ino}propyl)amino]-2-oxoeth N-(2,2-dimethyl-4,20-dioxo-3,8,1 1 ,14,17-pentaoxa-5-azaicosan-20-yl)-L-cysteinat

tert-Butyl-S-{2-[(3-aminopropyl){(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-N-(2,2-dimethyl-4,20-dioxo -3,8,1 1 ,14,17-pentaoxa-5- azaicosan-20-yl)-L-cysteinat (27.2 mg, 27.9 μmol) und N ²-(Pyridin-4-ylacetyl)-L-asparagin (8.40 mg, 33.4 μηηοΙ, Intermediat L136) wurden in absolutem DMF (3 ml_) gelöst und mit HATU (12.7 mg, 33.4 μηιοΙ) sowie mit N,N-Diisopropylethylamin (15 μΙ, 84 μmol) versetzt. Die Reaktion wurde 10 min. bei RT gerührt. Der Ansatz wird mit 1 ml Wasser + 0,1 %TFA gequencht und direkt über die präp. HPLC (Eluent: ACN/Wasser + 0.1 % TFA, Gradient) gereinigt. Es wurden 23 mg der Zielverbindung erhalten LC-MS (Methode 12): R _t = 2.12 min; MS (ESIpos): m/z = 1209 [M+H] ⁺

Intermediat C135

N-(15-Amino-4,7, 10,13-tetraoxapentadecan-1 -oyl)-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(3-{[N2-(pyridin-4-ylacety l)-L- asparaginyl]amino}propyl)amino]-2-oxoethyl}-L-cystein Trifluoressigsäure Salz

tert-Butyl-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(3-{[N ²-(pyridin-4-ylacetyl)-L-asparaginyl]amino}propyl)amino ]-2-o^ N-(2,2-dimethyl-4,20-dioxo-3,8,1 1 ,14,17-pentaoxa-5-azaicosan-20-yl)-L-cysteinat (63.6 mg, 52.6 μηηοΙ) wurde in Trifluorethanol (3.0 ml, 41 mmol) gelöst und mit Zinkchlorid (43.0 mg, 316 μηηοΙ) versetzt. Die Reaktion wurde 2h 20 min bei 50°C nachgerührt. Es werden noch einmal 6eq. ZnCI2 nachgegeben und 1 h bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (184 mg, 631 μηηοΙ) versetzt und auf

Raumtemperatur abkühlen gelassen. Der Reaktionsmischung wurde mit Wasser (+ 01. %TFA) versetzt, filtriert und mittles präp. RP-HPLC (Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 40 mg der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.75 min; MS (ESIneg): m/z = 1051 lntermediat C136

Benzyl [2-({(2S)-2-(L-asparaginylamino)-4-[{(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]butanoyl}am ino)ethyl]carbamat trifluoracetat

Zunächst wurde Intermediat C58 mit Benzyl-(2-aminoethyl) carbamathydrochlorid (1 :1 ) in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Anschließend erfolgte die Abspaltung der Teoc-Schutzgruppe durch 2-stündiges Rühren bei 50°C in Tnfluorethanol mit 8 Equiv. Zinkchlorid. Das erhaltene Intermediat wurde dann mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 - yl-N ²-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat in Gegenwart von N,N-Diisopropylethylamin gekuppelt. Im letzten Schritt erfolgte durch 1 -stündiges Rühren bei 50°C in Tnfluorethanol mit 6 Equiv. Zinkchlorid die Abspaltung der Boc-Schutzgruppe, wobei die Zielverbindung erhalten wurde. LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 804 [M+H] ⁺. Intermediat C137

Benzyl N-(2-{[2-({(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]sul fonyl}ethyl)-N ²- [(benzyloxy)carbonyl]-D-alpha-glutaminat trifluoracetat

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat L81 durch Kupplung mit

Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 30-minütige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt. Das entschützte Intermediat wurde anschließend durch Kupplung mit (2R)-5- (Benzyloxy)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-5-oxopentansäure in Gegenwart von 2 Equiv. HATU und 3 Equiv. N, N Diisopropylethylamin und schließlich durch Entschützung mit 6 Equiv. Zinkchlorid (1 h Rühren bei 50°C in Trifluorethanol) in die Titelverbindung überführt.

LC-MS (Methode 12): R _t = 1 .89 min; MS (ESIpos): m/z = 1001 (M+H) ⁺.

Intermediat C138 tert-Butyl-N-[(8S)-8-{2-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl propyl}(glykoloyl)amino]ethyl}-2,2-dimethyl-13 ,13-dioxido-6,9-dioxo-5-oxa-13lambda ⁶-thia- 7,10-diaza-2-silapentadecan-15-yl]-D-alpha-glutaminat

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C58 durch Kupplung mit

Intermediat L81 Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 1 -stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt. Das entschützte Intermediat wurde anschließend durch Kupplung mit (2R)-2- {[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-5-tert-butoxy-5-oxopentansäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylamin und schließlich durch Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch 2-stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck in die Titelverbindung überführt. LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1.14 min; MS (ESIpos): m/z = 977 (M+H) ⁺. Intermediat C139

Di-tert-butyl-N-{(2S)-2-(L-asparaginylamino)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]butanoyl}-b eta-alanyl-D-glutamat

Die Synthese der Titelverbindung erfolgte durch Kupplung von Intermediat C1 1 1 mit 1.5 Equiv. 4-Nitrophenyl-N ²-[(benzyloxy)carbonyl]-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch 2-stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1.02 min; MS (ESIpos): m/z = 940 [M+H] ⁺.

Intermediat C140

N-{(2S)-2-Amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-N N ⁵-dibenzyl-D-glutamamid trifluoracet

Zunächst wurde N ¹,N ⁵-Dibenzyl-D-glutamamid-trifluoracetat durch Kupplung von N-(tert- Butoxycarbonyl)-D-glutaminsäure mit Benzylamin in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit TFA hergestellt. Dieses Intermediat wurde dann in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin mit Boc-ß-Alanin gekuppelt und anschließend die Boc-Schutzgruppe mit TFA in DCM entfernt. Die erhaltene Verbindung wurde anschließend mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt und schließlich wurde durch Abspaltung der Teoc-Schutzgruppe mittels Zinkchlorid in Trifluorethanol die Titelverbindung hergestellt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.95 min; MS (ESIpos): m/z = 892 [M+H] ⁺.

Intermediat C141

N-{(2S)-2-Amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-L-aspa ragin trifluoracetat

Zunächst wurde Intermediat C61 mit tert-Butyl-L-asparaginat in Gegenwart von 1 .5 Equiv. HATU und 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Anschließend wurde durch Rühren mit 6Equiv. Zinkchlorid in Trifluorethanol bei 50°C die Teoc-Schutzgruppe sowie der tert-Butylester entfernt und somit die Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.95 min; MS (ESIpos): m/z = 892 [M+H] ⁺.

Intermediat C142

Di-tert-butyl-N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)etho xy]carbonyl}amino)bu beta-alanyl-D-glutamat

Zu einer Lösung aus N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)etho xy]carbonyl}amino)butanoyl]- beta-alanin (745 mg, 1.02 mmol, Intermediat C61 ) in DMF (10 ml) wurde Di-tert-butyl-D- glutamathydrochlorid (363 mg, 1.23 mmol), HATU (505 mg, 1.33 mmol) und N,N- Diisopropylethylamin (530 μΙ, 3.1 mmol) gegeben und die Reaktion wurde für 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde Ethylacetat versetzt und mit Wasser und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet eingeengt und der Rückstand wurde mittels präp. RP- HPLC (Gradient, MeCN/Wasser + 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1 .58 min; MS (ESIpos): m/z = 970 [M+H] ⁺ Intermediat C143

Di-tert-butyl-N-[(2S)-4-({(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}{[(methylsulfonyl)oxy]acetyl}amino)-2-({[2-(t rimethylsilyl)etho^ amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutamat

Zu einer Lösung aus Di-tert-butyl-N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]-2-({[2-(tr imethylsilyl)ethoxy]carbonyl}- amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutamat (257 mg, 264 μηιοΙ Intermediat C142) in Dichlormethan (20 ml) wurde bei 0°C Methansulfonylchlorid (49 μΙ, 630 μηηοΙ) und Triethylamin (92 μΙ, 660 μmol) geben und die Reaktion wurde für 1 h bei 0°C gerührt. Anschließend wurde mit Dichlormethan verdünnt und mit einer gesättigten

Natriumhydrogencarbonat Lösung (3 x) und einer gesättigten Natriumchlorid Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet eingeengt und der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter umgesetzt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1 .52 min; MS (ESIpos): m/z = 1048 [M+H] ⁺ Intermediat C144

Di-tert-butyl N-[(2S)-4-[({[(2R)-2-amino-3-tert-butoxy-3-oxopropyl]sulfany l}acetyl){(1 R)-1 - [1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-({[2-(trim silyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutamat trifluoracetat

Unter Argon wurden Di-tert-butyl-L-cystinatdihydrochlorid (306 mg, 719 μmol) in 25 mL Wasser und 50 mL / ^'so-Propanol vorgelegt und mit TCEP (687 mg, 2.40 mmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von Di-tert-butyl-N-[(2S)-4-({(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}{[(methylsulfonyl)oxy]acetyl}amino)-2-({[2-

(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-beta-alan yl-D-glutamat (1 .00 g, 958 μηηοΙ Intermediat C143) und 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en (1 .7 ml, 1 1 mmol) in 35 mL / ^'so- Propanol zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 14 h bei 50 °C gerührt. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges.

Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Gradient, MeCN/Wasser + 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 923 mg der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 12): R _t = 2.46 min; MS (ESIpos): m/z = 1 129 [M+H] ⁺ Intermediat C145

Di-tert-butyl-N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}({[(2R)-3-tert-butoxy-2-({N ²-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L- asparaginyl}amino)-3-oxopropyl]sulfanyl}acetyl)amino]-2-({[2 -(trimethylsilyl)- ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutamat

Zu einer Lösung aus Di-tert-butyl N-[(2S)-4-[({[(2R)-2-amino-3-tert-butoxy-3- oxopropyl]sulfanyl}acetyl){(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl }amino)butanoyl]-beta-alanyl- D-glutamat trifluoracetat (60.0 mg, 48.2 μηιοΙ Intermediat C144) und N ²-[(9H-Fluoren-9- ylmethoxy)carbonyl]-L-asparagin (20.5 mg, 57.9 μηηοΙ) in DMF (3.0 ml) wurde HATU (22.0 mg, 57.9 μηηοΙ) und N,N-Diisopropylethylamin (25 μΙ, 140 μηηοΙ) gegeben und die

Reaktion wurde für 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz wird mit 1 ml Wasser + 0,1 %TFA versetzt und direkt über die präp. HPLC (Eluent: ACN/Wasser + 0.1 % TFA, Gradient) gereinigt. Es wurden 71 mg der Zielverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 12): R _t = 3.15 min; MS (ESIpos): m/z = 1466 [M+H] ⁺ Intermediat C146

Di-tert-butyl N-[(2S)-4-[({[(2R)-2-(L-asparaginylamino)-3-tert-butoxy-3-ox opropyl]sulfanyl}- acetyl){(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2- ({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-beta-al anyl-D-glutamat trifluoracetat

(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-beta-alan yl-D-glutamat (63.5 mg, 43.3 μηηοΙ, Intermediat C145) wurde in DMF (3 ml) vorgelegt, mit Morpholin (38 μΙ, 430 μηιοΙ) versetzt und bei Raumtemperatur für 18 h gerührt. Der Ansatz wird mit 1 ml Wasser + 0,1 %TFA versetzt und direkt über die präp. HPLC (Eluent: ACN/Wasser + 0.1 % TFA, Gradient) gereinigt. Es wurden 38 mg der Zielverbindung erhalten.

LC-MS (Methodel ): R _t = 1 .25 min; MS (ESIpos): m/z = 1243 [M+H] ⁺ Intermediat L81

Trifluoressi

250 mg (1 .1 1 mmol) 2,2'-Sulfonyldiethanamin wurden mit 92.3 mg (0.37 mmol) 1 - {[(Benzyloxy)carbonyl] oxy}pyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von N, N- Diisopropylethylamin in DMF gekuppelt. Nach anschließender HPLC Reinigung wurden 70 mg (47% d. Th.) der Titelverbindung erhalten. C-MS (Methode 12): R _t = 0.64 min; MS (ESIpos): m/z = 257.1 1 (M+H) ⁺.

Intermediat L103

N-(pyridin-4-ylacetyl)-L-alanyl-L-alanyl-L-asparagine trifluoroacetate

Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie beginnend mit der Kupplung von 4-Pyridinessigsäure mit kommerziell erhältlichem tert-Butyl-L-alanyl-L- alaninat in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin, dann folgender Entschützung mit Trifluoressigsäure, Kupplung mit tert-Butyl-L-asparaginat und anschließender Entschützung der Carboxygruppe mit Trifluoressigsäure hergestellt. LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.15 min; MS (ESIpos): m/z = 394 (M+H) ⁺.

Intermediat L119

Trifluoressigsäure -tert-butyl-N-(2-aminoethyl)-N ²-[(benzyloxy)carbonyl]-D-;

glutaminat Salz

Intermediat L1 19 wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Kupplung von kommerziell erhältlichen (2R)-2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-5-tert-butoxy-5- oxopentansäure (1 .00 g, 2.96 mmol) und tert-Butyl-(2-aminoethyl)carbamat (560 μΙ, 3.6 mmol) in Gegenwart von HATU und anschließender saurer Abspaltung der Boc- Schutzgruppe mit TFA in Dichlormethan hergestellt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.62 min; MS (ESI-pos): m/z = 380 (M+H) ⁺.

Intermediat L136 2-(Pyridin-4-ylacetyl)-L-asparagin

Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von Pyridin-4-ylessigsäurehydrochlorid mit tert-Butyl-L-asparaginat in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der ί-Butyl-Schutzgruppe mittels Trifluoressigsaeure in Dichloromethan hergestellt. LC-MS (Methode 12): R _t = 0.65 min; MS (ESIneg): m/z = 250 [M-H] ^" Intermediat L137

Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von Pyridin-4-ylessigsäurehydrochlorid (1 :1 ) mit tert-Butyl-L-glutaminat in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Abspaltung der ί-Butyl-Schutzgruppe mittels Trifluoressigsaeure in Dichloromethan hergestellt.

LC-MS (Methode 12): R _t = 0.59 min; MS (ESIneg): m/z = 264 [M-H] ^" Intermediat L138

1 -Brom-2-oxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-säure

Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 1 -Amino-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15- säure mit Bromessigsäureanhydrid in Gegenwart von N,N-Diisopropylethylamin hergestellt.

LC-MS (Methode 5): R _t = 1.05 min; MS (ESIpos): m/z = 386 und 388 (M+H) ⁺. Intermediat F104

Trifluoressigsäure-(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-

2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-(2-{[(2,5-dioxo-2, 5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]- amino}ethyl)butanamid

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C58 hergestellt. 15 mg (0.023 mmol) von Intermediat C58 wurden zunächst mit 1 1 mg (0.036 mmol) Intermediat L1 in Gegenwart von 13 mg ( 0.034 mmol) HATU sowie 10 μΙ N,N-Diisopropylethylamin umgesetzt. Nach 60 min Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 12.3 mg (63% d. Th.) des geschützten

Intermediats erhalten.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1 .3 min; MS (Elpos): m/z = 837 [M+H] ⁺. Im zweiten Schritt wurde dieses Intermediat in 3 ml_ 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12 mg (0.088 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 26 mg (0.088 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure sowie 2 ml_ einer 0.1 %-igen wässrigen Trifluoressigsäurelösung zugesetzt. Der Ansatz wurde mittels praparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 8.1 mg (68% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 693 (M+H) ⁺. Allgemeine Vorschrift zur Synthese der APDC oder ADC Precursor (Intermediatserie S)

Die zuvor in früheren Offenbarungen WO2015/96982 A1 und WO2016/096610 A1 beschriebenen Intermediate der F-Serie (F1-F305) können ggf. nach Anpassung der Syntheseroute oder der Schutzgruppenstrategie in die APDC-Precurser S überführt werden. Wie in Schema 1 a und Schema 1 b exemplarisch dargestellt kann im Falle einer Freisetzung der N-terminalen Aminogruppe des Legumain-spaltbaren Asparagins im APDC-Precursormolekül diese zur Verbesserung des Eigenschaftsprofils im letzten Schritt mit strukturdiversen substituierten Acylresten oder Alkylresten modifiziert werden. Gegebenenfalls kann die proteinreaktive Gruppe (beispielsweise Maleinimid oder Aktivester) zu späteren Zeitpunkten in der Synthese eingeführt werden.

Eine examplarische Vorschrift ist hier dargestellt:

0.037 mmol eines Intermediats F1 -Fx werden in 1-20 ml_ bevorzugt 5-10 ml_ eines geeigneten Lösungsmittels wie beispielsweise DMF, DMSO, DCM, Chloroform, Toluol, THF, Methanol oder einer Mischung derselben aufgenommen und mit 0.039 mmol eines N-terminal modifizierten Asparaginsäurederivat wie z.B. Intermediat L136 sowie mit 0.041 mmol eines gängigen Kupplungsreagenzes wie z. B. HATU, EDCI/HOBT, BEP etc. und 0.1 1 mmol einer gängigen Base wie z.B. Ν,Ν-Diisopropylethylamin, Triethylamin, 4- Methylmorpholin etc. versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wird der Ansatz mit 2 Tropfen Trifluoressigsäure angesäuert und eingeengt. Der Rückstand wird durch präparative HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus Acetonitril/Wasser lyophilisiert.

Wenn es sich bei der besagten N-terminalen Modifizierung des angeknüpften Tripeptid- Derivats um eine Schutzgruppe handelt, kann diese anschließend nach bekannten Methoden abgespalten werden, beispielsweise eine Z-Schutzgruppe bevorzugt mittels Hydrogenolyse, eine Boc-Schutzgruppe mittels Säurespaltung, eine Fmoc-Schutzgruppe durch basische Spaltung oder eine Teoc-Gruppe mittels Fluoriden oder mit Zinkchorid. Schließlich kann die so freigesetzte Aminogruppe zur Verbesserung des

Eigenschaftsprofils acyliert oder alkyliert werden, beispielsweise mit aminreaktiven Gruppen wie Aktivestern, Säurechloriden, Isocyanaten etc. oder durch Kupplung mit Carbonsäurederivaten in Gegenwart eines gängigen Kupplungsreagenzes wie z. B. HATU, EDCI/HOBT, BEP etc. sowie einer gängigen Base wie z.B. Ν,Ν-Diisopropylethylamin, Triethylamin, 4-Methyl- morpholin etc. Falls noch vorhanden können weitere Schutzgruppen im Molekül in einem letzten Schritt entfernt werden.

Schema 1 a:

[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT oder EDCI, HOBT, N,N- Diisopropylethylamin, DMF, RT b) H ₂, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) Zi-COOH, EDCI, HOBT, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT oder Zi-COOH, HATU, N,N-Diisopropylethylamin, DMF, RT oder Zi-COOSu, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT] Schema 1 b:

[a): 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N ²-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat, DMF, N,N-

Diisopropylethylamin, RT; b) ZnC , Trifluorethanol, 50°C; c) Zi-COOH, EDCI, HOBT, N,N- Diisopropylethylamin, DMF, RT oder Zi-COOH, HATU, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT oder Zi-COOSu, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT]

Weiterhin können andere Intermediate gemäß Schema 2a und 3a in Legumain-spaltbare ADC-Precursor überführt werden: Sche

[a): HATU, DMF, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, RT oder EDCI, HOBT, N,N- Diisopropylethylamin, DMF, RT; alternativ kann die Acylierung beispielsweise auch mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N ²-[(benzyloxy)carbonyl]-L-asparaginat in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin in DMF erfolgen; b) H ₂, 10% Pd-C, MeOH, RT; c) 1 ,1 '-[(1 ,5- Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion, Ν,Ν-Diisopropylethylamin, DMF, RT]

chema 3a:

Alternativ zu der in Schemata 1 -3 dargestellten Benzyloxycarbonyl-Gruppe können andere in der Peptidchemie etablierte Schutzgruppen eingesetzt werden und nach entsprechenden ebenso bekannten Methoden abgespalten werden. Die Auswahl der Schutzgruppenstrategie erfolgt nach entsprechenden dem Fachmann bekannten Anforderungen zur Kompatibilität mit anderen im Molekül vorkommenden

Strukturelementen. Falls noch vorhanden können weitere Schutzgruppen im Molekül in einem letzten Schritt entfernt werden.

Die Synthesen können auch ggf. in ihrer Sequenz umgestellt werden. Weiterhin kann die proteinreaktive Gruppe im Sinne des Linkerstrukturen L1 -L2 im Rahmen der Ansprüche variiert werden.

Intermediat S1 N ¹-{(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-1 -[(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]amino}ethyl)amino]- 1 -oxobutan-2-yl}-N ²-(pyridin-4-ylacetyl)-L-aspartamid

5 mg (0.0062 mmol) von Intermediat F104 wurden in 2 ml DMF gelöst und mit 1.9 mg (0.0074 mmol) von Intermediat L136 in Gegenwart von 3.5 mg (0.0093 mmol) HATU und 3 μΙ_ Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach 16 h Rühren bei RT und Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 2.8 mg (49% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 926 (M+H) ⁺.

Intermediat S2

N ²-Acetyl-N ¹-{(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl] amino}ethyl)amino]-1 -oxobutan-2-yl}-L-aspartamid

6 mg (0.0065 mmol) von Intermediat C1 16 wurden in 2 mL DMF mit 2 mg (0.013 mmol) 1 - Acetoxypyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von 3 μΙ_ Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 5 mg (90% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.95 min; MS (ESIpos): m/z = 849 (M+H) ⁺.

Intermediat S3

Benzyl-[(2S)-4-amino-1 -({(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -[(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]- amino}ethyl)amino]-1 -oxobutan-2-yl}amino)-1 ,4-dioxobutan-2-yl]carbamat

10 mg (0.0124 mmol) von Intermediat F104 wurden in DMF mit 3.6 mg (0.0136 mmol) N ²- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-asparagin in Gegenwart von 5.7 mg (0.0149 mmol) HATU und 9 μΙ_ Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach 30 min Rühren bei RT und Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 6 mg (51 % d.Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 12): R _t = 2.06 min; MS (ESIneg): m/z = 939 (M-H)\

Intermediat S4

N-[2-({(2S)-2-[(N ²-Acetyl-L-asparaginyl)amino]-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl} amino)ethyl]-N ²-[(2,5-dioxo 2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-D-alpha-glutamin

15 mg (0.016 mmol) von Intermediat C123 wurden in 3 mL DMF mit 7.4 mg (0.047 mmol) 1 -Acetoxypyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von 8 μΙ_ Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 10 mg (64% d.Th.) des geschützen Intermediats erhalten. Dann erfolgte die Abspaltung des tert.-Butylesters sowie der Boc- Schutzgruppe durch 3 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol. Im letzten Schritt wurde aus 6 mg (0.006 mmol) des erhaltenen Intermediats durch Kupplung mit 1 .9 mg (0.008 mmol) 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H- pyrrol-2,5-dion in DMF in Gegenwart von 3 μΙ Ν,Ν-Diisopropylethylamin die

Titelverbindung hergestellt. Nach Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 3 mg (49% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 978 (M+H) ⁺. Intermediat S5

N-(2-{[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-2-{[N ²-(pyridin-4-ylacetyl)-L-asparaginyl]amino}bi amino}ethyl)-N ²-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-D-alpha-glutamin

15 mg (0.016 mmol) von Intermediat C123 wurden in 5.6 ml_ DMF mit 3.3 mg (0.019 mmol) Pyridin-4-ylessigsäurehydrochlorid (1 :1 ) in Gegenwart von 7.2 mg (0.019 mmol) HATU und 14 μΙ_ Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung mittels

präparativer HPLC wurden 1 1 mg (63% d.Th.) des geschützen Intermediats erhalten.

Dann erfolgte die Abspaltung des tert.-Butylesters sowie der Boc-Schutzgruppe durch 3 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol. Im letzten Schritt wurde aus 6.5 mg (0.006 mmol) des erhaltenen Intermediats durch Kupplung mit 1 .2 mg (0.008 mmol) 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in 2 ml_ DMF in Gegenwart von 3.3 μΙ Ν,Ν-Diisopropylethylamin die Titelverbindung hergestellt. Nach Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 3 mg (49% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.82 min; MS (ESIpos): m/z = 1055 (M+H) ⁺. Intermediat S6

N-{(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}

(glycoloyl)amino]-2-[(N ²-{5-[(2,5-dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-asparaginyl) amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutaminsäure

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C121 zunächst durch Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N ²-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Dann erfolgte die Abspaltung der Boc- Schutzgruppe durch 1 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol. Im nächsten Schritt wurden die Benzylester durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5- diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF in die Titelverbindung überführt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.92 min; MS (ESIpos): m/z = 1039 [M+H] ⁺. Intermediat S7

N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-2-({N ²-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)hexanoyl]-L-asparaginyl} amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutaminsäure

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C121 zunächst durch Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N ²-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Dann erfolgte die Abspaltung der Boc- Schutzgruppe durch 1 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol. Im nächsten Schritt wurden die Benzylester durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 .5 Equivalenten 1 -{6-[(2,5- Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-6-oxohexyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equivalenten Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF in die Titelverbindung überführt.

LC-MS (Methode 12): R _t = 1 .81 min; MS (ESIneg): m/z = 1019 [M-H]\ Intermediat S8

N ¹-{3-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl) amino]propyl}-N ²-{5-[(2,5-dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-aspartamid

Die Titelverbindung wurde ausgehend von dem in WO 2015096982 beschriebenen Beispiel 98 hergestellt:

Zunächst wurde die Verbindung aus Beispiel 98 mit 1 .8 Equivalenten 4-Nitrophenyl-N ²- [(benzyloxy) carbonyl]-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von 2 Equivalenten N,N- Diisopropylethylamin gekuppelt. Dann erfolgte die Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff- Normaldruck bei RT. Im letzten Schritt wurde die Titelverbindung durch Umsetzung mit 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)] dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin in DMF hergestellt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1.03 min; MS (ESIpos): m/z = 795 [M+H] ⁺.

Intermediat S9

(8S,1 1 S)-1 1 -(2-Amino-2-oxoethyl)-8-{2-[{(1 R)-1 -[1-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]ethyl}-1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)- 2,7,10,13-tetraoxo-3,6,9,12-tetraazahexadecan-16-säure

Zunächst wurde Intermediat C136 mit 1 .4 Equiv. Dihydrofuran-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin gekuppelt. Im nächsten Schritt wurden der Benzylester sowie die Z-Schutzgruppe durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol-DCM unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt. Im letzten Schritt wurde durch Umsetzung mit 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin die Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.93 min; MS (ESIpos): m/z = 907 [M+H] ⁺.

Intermediat S10

N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}

(glykoloyl)amino]-2-({N2-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-L-asparaginyl}- amino)butanoyl]-beta-alanyl-D-glutaminsäure

Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat S6 hergestellt, wobei im letzten Schritt an Stelle von 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion die Kupplung mit 1.5 Equiv. 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin erfolgte.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.90 min; MS (ESIpos): m/z = 965 [M+H] ⁺.

Intermediat S11

N-(2-{[2-({(2S)-2-[(N ²-Acetyl-L-asparaginyl)amino]-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl)amino]butanoyl} amino sulfonyl}ethyl)-N ²-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-D-alpha-glutamin

Zunächst wurde Intermediat C137 mit 1 .3 Equiv. 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N ²-(tert- butoxycarbonyl)-L-asparaginat in Gegenwart von 3 Equiv. N,N-Diisopropylethylamin gekuppelt. Die Boc-Gruppe wurde anschließend durch 3-stündiges Rühren mit 6 Equiv. Zinkchlorid in Trifluorethanol bei 50°C abgespalten. Das Reaktionsprodukt wurde mit 2 Equiv. 1 -Acetoxypyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. N,N-Diisopropylethylamin gekuppelt. Dann wurde die Z-Schutzgruppe durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt. Im letzten Schritt wurde schließlich durch Umsetzung mit 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2- oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin die Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 12): R _t = 1 .66 min; MS (ESIpos): m/z = 1070 [M+H] ⁺. Intermediat S12

N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}

(glykoloyl)amino]-2-{[N ²-(bromacetyl)-L-asparaginyl]amino}butanoyl]-beta-alany l-D- glutaminsäure

Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat S10 hergestellt, wobei die

Umsetzung im letzten Schritt mit 3 Equiv. 1 -(2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion an Stelle von 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von 2 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin erfolgte.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.93 min; MS (ESIpos): m/z = 948 und 950 [M+H] ⁺.

Intermediat S13

N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glykoloyl)amino]-2-({N ²-[1 -(2,5-dioxo-2 _!5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)-2 _!18-dioxo-6 _!9 _!12,15- tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-asparaginyl}amino)butanoyl] -beta-alanyl-D- glutaminsäure

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C121 zunächst durch Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N ²-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Dann erfolgte die Abspaltung der Boc- Schutzgruppe durch 1 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol. Das erhaltene Intermediat wurde im nächsten Schritt mit 3-Oxo-1 -phenyl-2,7,10,13,16- pentaoxa-4-azanonadecan-19-säure in Gegenwart 1 .2 Equiv. HATU und 3 Equiv. von Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF gekuppelt. Dann wurden die Benzylester sowie die Z- Schutzgruppe durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in

Methanol/DCM 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2- oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF in die Titelverbindung überführt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 1212 [M+H] ⁺. Intermediat S14

N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glykoloyl)amino]-2-({N2-[1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)-6,22-dioxo- 3,10,13,16,19-pentaoxa-7-azadocosan-22-yl]-L-asparaginyl}ami no)butanoyl]-beta-alanyl- D-glutaminsäure

Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat S13 hergestellt, wobei die

Umsetzung im letzten Schritt mit 3 Equiv. 1 -(2-{3-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-3- oxopropoxy}ethyl)-1 H-pyrrol-2,5-dion an Stelle von 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2- oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin erfolgte.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 1270 [M+H] ⁺. Intermediat S15

N ²-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-L-asparaginyl-N-(2-{[2-({(2S)-2-amino-4- [{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glykoloyl) amino]butanoyl}amino)ethyl]sulfonyl}ethyl)-D-alpha-glutamin trifluoracetat

Die Synthese der Titelverbindung begann zunächst mit der Kupplung von Intermediat C138 mit 4-Nitrophenyl-N ²-[(benzyloxy)carbonyl]-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von 2 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin. Anschließend erfolgte die Abspaltung der Z-Schutz- gruppe durch 2-stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in

DCM/Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT. Dann erfolgte die Umsetzung mit 1 .2 Equiv. 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF. Im letzten Schritt wurde durch 2 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol die Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.79 min; MS (ESIpos): m/z = 1028 [M+H] ⁺.

Intermediat S16

N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glykoloyl)amino]-2-{[N ²-(18-brom-17-oxo-4,7, 10,13-tetraoxa-16-azaoctadecan-1 -oyl)-L- asparaginyl]amino}butanoyl]-beta-alanyl-D-glutaminsäure

Die Synthese der Titelverbindung erfolgte zunächst durch Kupplung von Intermediat C139 mit Intermediat L138 in DMF in Gegenwart von 1.2 Equiv. HATU und 3 Equiv. N,N- Diisopropylethylamin. Anschließend erfolgte die Abspaltung der tert.-Butylestergruppen durch 1 h Rühren bei 50°C mit 18 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.91 min; MS (ESI-neg): m/z = 1 193 und 1 195 [M-H]\

Intermediat S17

S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(3-{[N2- (pyridin-4-ylacetyl)-L-asparaginyl]amino}propyl)amino]-2-oxo ethyl}-N-[1 -(2,5-dioxo-2,5- dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)-2,18-dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-c ystein

Zu einer Lösung aus N-(15-Amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecan-1 -oyl)-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 - benzyl-4-(2 _!5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(3-{[N2-(pyridin-4-ylacety l)- L-asparaginyl]amino}propyl)amino]-2-oxoethyl}-L-cystein Trifluoressigsäure Salz (10.0 mg, 8.57 μηηοΙ) und 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion (2.38 mg, 9.42 μηηοΙ) in DMF (1 ml) wurde 4-Methylmorpholin (2.8 μΙ, 26 μmol) gegeben und die Reaktion wurde für 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der

Reaktionsmischung wurde mit einem Tropfen Essigsäure versetzt und mittles präp. RP- HPLC (Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 2.2 mg der Titelverbindung

LC-MS (Methode 12): R _t = 1 .62 min; MS (ESIpos): m/z = 1 190 [M+H] ⁺

Intermediat S18

S-{2-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(3-{[N2- (pyridin-4-ylacetyl)-L-asparaginyl]amino}propyl)amino]-2-oxo ethyl}-N-{21 -[(2,5-dioxo- pyrrolidin-1 -yl)oxy]-17,21 -dioxo-4,7, 10,13-tetraoxa-16-azahenicosan-1 -oyl}-L-cystein

Zu einer Lösung aus N-(15-Amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecan-1 -oyl)-S-{2-[{(1 R)-1 -[1 - benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(3-{[N2-(pyridin-4-ylacety l)- L-asparaginyl]amino}propyl)amino]-2-oxoethyl}-L-cystein Trifluoressigsäure Salz (10.6 mg, 9.08 μηηοΙ) in DMF (1 mL) wurde 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin- 2,5-dion (7.41 mg, 22.7 μηηοΙ) und N,N-Diisopropylethylamin (6.3 μΙ, 36 μηηοΙ) gegeben und die Reaktionsmischung wurde bis zur vollständigen Umsetzung bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz wurde mit Wasser + 0,1 %TFA versetzt , filtriert und direkt über die präp. HPLC (Eluent: ACN/Wasser + 0.1 % TFA, Gradient) gereinigt. Es wurden 1.2 mg der Zielverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 1263 [M-H] ⁺

Intermediat S19

N-{(2S)-2-Amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}({[(2R)-2-carboxy-2-({N ²-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-L- asparaginyl}amino)ethyl]sulfanyl}acetyl)amino]butanoyl}-beta -alanyl-D-glutamin säure trifluoracetat

Zu einer Lösung aus Di-tert-butyl N-[(2S)-4-[({[(2R)-2-(L-asparaginylamino)-3-tert-butoxy- 3-oxopropyl]sulfanyl}acetyl){(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl }amino)butanoyl]-beta-alanyl- D-glutamat trifluoracetat (12.0 mg, 8.84 μηιοΙ, Intermediat C146) und 1 -{2-[(2,5- Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion (2.45 mg, 9.72 μηηοΙ) wurden in DMF (1 .0 ml) wurde N,N-Diisopropylethylamin (6.2 μΙ, 35 μmol) gegeben und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 2h gerührt. Anschließend wurde 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 - yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5-dion (2.45 mg, 9.72 μmol)hinzugeben und für weitre 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz wird mit 1 ml Wasser + 0,1 %TFA versetzt und direkt über die präp. HPLC (Eluent: ACN/Wasser + 0.1 % TFA, Gradient) gereinigt.

Anschließend wurden die Schutzgruppen durch 4 h Rühren bei 50°C mit 12 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol abgespalten.

LC-MS (Methodel ): R _t = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 1068 [M+H] ⁺ Intermediat S20

N-{(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-

(glykoloyl)amino]-2-[(N ²-{5-[(2,5-dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-5-oxopentanoyl}-L-asparaginyl)- amino]butanoyl}-beta-alanyl-L-asparagin

Zunächst wurde Intermediat C141 mit 1 .8 Equivalenten 4-Nitrophenyl-N ²-[(benzyloxy) carbonyl]-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von 12 Equivalenten N,N- Diisopropylethylamin gekuppelt. Dann erfolgte die Abspaltung der Z-Schutzgruppe durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 unter

Wasserstoff-Normaldruck bei RT. Im letzten Schritt wurde die Titelverbindung durch Umsetzung mit 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5-diyl)bis(oxy)] dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF hergestellt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 1024 [M+H] ⁺.

Intermediat S21

N-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}- (glykoloyl)amino]-2-({N ²-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -yl)acetyl]-L-asparaginyl}- amino)butanoyl]-beta-alanyl-L-asparagin

Umsetzung mit 2.5 Equiv. 1 -{2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-1 H-pyrrol-2,5- dion in Gegenwart von 4 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.90 min; MS (ESIpos): m/z = 950 [M+H] ⁺.

Intermediat S22

N-{(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glykoloyl)amino]-2-[(N ²-{16-[(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-16-oxo-4,7, 10,13-tetraoxa- hexadecan-1 -oyl}-L-asparaginyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glutamins� �ure

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Verbindung C121 zunächst durch Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N ²-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat in DMF in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Dann erfolgte die Abspaltung der Boc- Schutzgruppe durch 1 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol. Im nächsten Schritt wurden die Benzylester durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 3 Equiv. 1 ,1 '-[(1 ,19- Dioxo-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecan-1 ,19-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in

Gegenwart von 3 Equiv. Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF in die Titelverbindung überführt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.96 min; MS (ESIpos): m/z = 1245 [M+H] ⁺. B: Herstellung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADO

B-1. Allgemeines Verfahren zur Generierung von Antikörpern

Die Proteinsequenz (Aminosäuresequenz) der verwendeten Antikörper, zum Beispiel TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP- 10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP-751 1 , TPP-8382 und TPP- 8567, wurde in eine für das Protein kodierende DNA Sequenz nach einem dem

Fachmann gut bekannten Verfahren überführt und in einen für die transiente

Säugerzellkultur geeigneten Expressionsvektor inseriert (wie von Tom et al., Kapitel 12 in Methods Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 beschrieben).

B-2. Allgemeines Verfahren zur Expression von Antikörpern in Säugerzellen

Die Antikörper, zum Beispiel TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP- 751 1 , TPP-8382 und TPP-8567, wurden in transienten Säugerzellkulturen produziert, wie von Tom et al., Kapitel 12 in Methods Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 beschrieben.

B-3. Allgemeines Verfahren zur Aufreinigung von Antikörpern aus

Zellüberständen.

Die Antikörper, zum Beispiel TPP-2090, TPP-2658, TPP-5442, TPP-8825, TPP-7006, TPP-7007, TPP-10334, TPP-10335, TPP-10336, TPP-10337, TPP-1015, TPP-7510, TPP- 751 1 , TPP-8382 und TPP-8567, wurden aus den Zellkulturüberständen gewonnen. Die Zellüberstände wurden durch Zentrifugation von Zellen geklärt. Anschließend wurde der Zellüberstand durch Affinitätschromatographie auf einer MabSelect Sure (GE Healthcare) Chromatographiesäule gereinigt. Dazu wurde die Säule in DPBS pH 7.4 (Sigma/Aldrich) equillibriert, der Zellüberstand aufgetragen und die Säule mit ca 10 Säulenvolumina DPBS pH 7.4 + 500 mM Natriumchlorid gewaschen. Die Antikörper wurden in 50 mM

Natriumacetat pH 3.5 + 500 mM Natriumchlorid eluiert und anschliessend durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Superdex 200 Säule (GE Healthcare) in DPBS pH 7.4 weiter gereinigt.

Die kommerziell erhältlichen Antikörper wurden mit Standard- Chromatographiemethoden aufgereinigt (Protein A Chromatopgraphie, präparative Gelfiltrationschomatographie (SEC - size exclusion Chromatographie)).

B-4. Allgemeines Verfahren zur Kupplung an Cystein-Seitenketten

In die Kupplungsreaktionen wurde folgender Antikörper eingesetzt: Beispiele a: Cetuximab (Anti EGFR AK) Beispiele e: TPP-1015 (Anti-Her2 AK) Beispiele k: Anti-TW EAKR AK (TPP-7007) Beispiele k: Anti-TW EAKR AK (TPP-2658)

Die Kupplungsreaktionen wurden üblicherweise unter Argon durchgeführt.

Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt im Bereich von ungefähr 10mg/ml bis 15 mg/ml wurden zwischen 2 und 5 Äquivalenten Tris(2-carboxyethyl)phosphin-Hydrochlorid (TCEP), gelöst in PBS-Puffer, gegeben und 30 min bis 1 h bei RT gerührt. Dazu kann die Lösung des jeweils eingesetzten Antikörpers in der in den Ausführungsbeispielen angegebenen Konzentration eingesetzt werden oder gegebenenfalls auch mit PBS Puffer bis etwa auf die Hälfte der angegebenen Startkonzentration verdünnt werden, um in den bevorzugten Konzentrationsbereich zu kommen. Anschließend wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 20 Äquivalenten, bevorzugt etwa 5-10 Äquivalente der zu kuppelnden Maleinimid-Vorläufer-Verbindung oder Halogenid-Vorläufer-Verbindung als Lösung in DMSO hinzugefügt. Um höhere DARs zu erzielen, können auch 15-20

Äquivalente eingesetzt werden. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Der Ansatz wurde bei Maleinimid-Precursern 60-240 min bei RT und bei Halogenid-Precursern zwischen 8 und 24 h bei RT gerührt und anschließend über in PBS equillibierte PD 10-Säulen (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Üblicherweise wurden, wenn nicht anders angegeben, 5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer zur Reduktion und der nachfolgenden Kupplung eingesetzt. Nach Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Lösungen des entsprechenden ADCs in 3.5 ml_ PBS-Puffer erhalten.

Anschließend wurde eine Aufkonzentration mittels Ultrazentrifugation durchgeführt und die Probe ggf. mit PBS-Puffer zurückverdünnt. Falls notwendig wurde zur besseren Abtrennung niedermolekularer Bestandteile die Aufkonzentration mittels Ultrafiltration nach Rückverdünnung mit PBS Puffer wiederholt. Für biologische Testungen wurden je nach Bedarf in den finalen ADC Proben ggf. durch Rückverdünnung Konzentrationen im Bereich von 0.5-15 mg/mL eingestellt. Für die ADC Lösungen wurde die in den

Ausführungsbeispielen jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-7.

beschriebenen Methoden ermittelt.

Die in den Beispielen dargestellten ADCs können in Abhängigkeit vom Linker gegebenenfalls auch mehr oder weniger stark ausgeprägt in Form der hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsäureamide mit den Antikörpern verknüpft vorliegen.

Insbesondere die KSP-l-ADCs, die über die Linker-Substruktur

mit Thiolgruppen der Antikörper verknüpft sind, können auch ggf. durch Umpuffern im Anschluss an die Kupplung und ca. 20-24-stündiges Rühren bei pH 8 gemäß Schema 4 und 9 gezielt in die die über offenkettige Bersteinsäureamide verknüpften ADCs hergestellt werden.

#1 stellt die Schwefelbrücke zum Antikörper dar und #2 die Verknüpfungsstelle zum modifizierten KSP-lnhibitor Solche ADCs, bei denen der Linker über hydrolysierte offenkettige Bernsteinsäureamide mit den Antikörpern verknüpft vorliegt, können gegebenenfalls auch gezielt nach exemplarischen Vorschrift wie folgt dargestellt werden:

Small Scale Kupplung:

Zu einer Lösung von 2-5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im

Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt im Bereich von ungefähr 5 mg/ml bis 15 mg/ml wurden zwischen 2 und 5 Äquivalenten Tris(2- carboxyethyl)phosphin-Hydrochlorid (TCEP), gelöst in PBS-Puffer, gegeben und 30 min bis 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 20 Äquivalenten, bevorzugt etwa 5-10 Äquivalente der zu kuppelnden Maleinimid- Vorläufer-Verbindung als Lösung in DMSO hinzugefügt. Um höhere DARs zu erzielen, können auch 15-20 Äquivalente eingesetzt werden. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Der Ansatz wurde 60-240 min bei RT gerührt und anschließend mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5-7.5 ml verdünnt und dann über eine mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde die Lösung durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).

Medium scale Kupplung:

20-200 mg des betreffenden Antikörpers in PBS-Puffer (c~5-15 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 2-5 Equivalenten, bevorzugt 3 Equivalenten TCEP in PBS- Puffer (c-0.2-0.8 mg/ml bevorzugt 0.5 mg/ml) versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 2-20, bevorzugt 5-10 Equivalente einer Maleinimid- Vorläuferverbindung gelöst in DMSO zugegeben. Um höhere DARs zu erzielen, können auch 15-20 Äquivalente eingesetzt werden. Nach weiteren 1.5h-2h Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.

Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen

(Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde mit PBS-Puffer pH8 auf eine Konzentration von 1 -7 mg/mL verdünnt. Diese Lösung wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Dann erfolgte ggf. wieder ein Umpuffern auf pH 7.2. Die ADC-Lösung wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH7.2) und dann ggf. erneut bis auf eine Konzentration von etwa 10mg/ml_ aufkonzentriert.

Weitere potentiell hydrolyse-sensitive Thianylsuccinimid-Brücken zum Antikörper in den Ausführungsbeispielen enthalten folgende Linker-Substrukturen, wobei #1 die

Thioetherverknüpfung zum Antikörper und #1 die Verknüpfungsstelle zum modifizierten KSP-lnhibitor darstellt:

Diese Linker-Substrukturen stellen die Verknüpfungseinheit zum Antikörper dar und haben (neben der weiteren Linkerzusammensetzung) einen signifikanten Einfluß auf die Struktur und das Profil der in Tumorzellen gebildeten Metabolite.

In den dargestellten Strukturformeln kann dabei AKi die Bedeutung haben

Beispiele a: Cetuximab (partiell reduziert)- S§ ¹

Beispiele e: anti-HER2 AK (TPP-1015 partiell reduziert)- S§ ¹ Beispiele k: Anti-TW EAKR AK (TPP-7007 partiell reduziert) - S§ ¹ Beispiele k: Anti-TW EAKR AK (TPP-2658 partiell reduziert) - S§ ¹

wobei § ¹ die Verknüpfung mit der Succinimid-Gruppe oder mit ggf. daraus entstandenen isomeren hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsäureamiden bzw. des

Alkylenrestes bedeutet, und

S für das Schwefelatom eines Cystein-Restes des partiell reduzierten Antikörpers steht.

B-5. Allgemeines Verfahren zur Kupplung an Lvsin-Seitenketten

In die Kupplungsreaktionen wurden folgende Antikörper eingesetzt: Beispiele a: Cetuximab (Anti EGFR AK) Beispiele e: TPP-1015 (Anti-Her2 AK)

Beispiele k: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-7007) Beispiele k: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-2658)

Die Kupplungsreaktionen wurden üblicherweise unter Argon durchgeführt. Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt etwa 10 mg/mL, wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 10 Äquivalente der zu kuppelnden Vorläufer- Verbindung als Lösung in DMSO gegeben. Nach 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge an Vorläufer-Verbindung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Nach weiteren 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde der Ansatz über in PBS equillibierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Üblicherweise wurden, wenn nicht anders angegeben, 5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS- Puffer zur Kupplung eingesetzt. Nach Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Lösungen des entsprechenden ADCs in 3.5 ml_ PBS-Puffer erhalten.

Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausführungsbeispielen jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-7. beschriebenen Methoden ermittelt. In den dargestellten Strukturformeln hat dabei AK2 die Bedeutung

Beispiele a: Cetuximab - NH§ ²

Beispiele e: Anti-HER2 AK (TPP-1015) - NH§ ²

Beispiele k: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-7007) - NH§ ²

Beispiele k: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-2658) - NH§ ² wobei

§ ² die Verknüpfung mit der Carbonylgruppe bedeutet, und

NH für die Seitenketten-Aminogruppe eines Lysin-Restes des Antikörpers steht. B-5a. Allgemeines Verfahren zur ADC Synthese mittels bakterieller Transglutaminase

In die Kupplungsreaktionen mit bakterieller Transglutaminase können folgende Antikörper eingesetzt werden (die nachfolgende Nomenklatur Antikörper-HC-N297Z meint den Antikörper, bei dem an beiden schweren Ketten die Aminosäure N297 (Kabat- Nummerierung) durch die Aminosäure Z ausgetauscht wurde, die Nomenklatur TPP-xxxx- HC-Q295N-HC-N297Q meint den Antikörper mit der TPP-XXXX, bei dem an beiden schweren Ketten die Aminosäure Q295 (Kabat-Nummerierung) durch die Aminosäure N und die Aminosäure N297 (Kabat-Nummerierung) durch die Aminosäure Q ausgetauscht wurde. Der Antikörpername des Ursprungsantikörpers kann dabei entweder als Name (Beispiel Trastuzumab) oder als TPP-XXXX angegeben sein (Antikörper mit der TPP- Nummer XXXX)):

AK _3a: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-2658) (entspricht TPP-2090-HC-N297A)

AK _3b: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-5442) (entspricht TPP-2090-HC-N297Q) AK _3c: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-8825) (entspricht TPP-2090-HC-Q295N-HC- N297Q)

AK _3d: anti-HER2 Antikörper (TPP-7510) (entspricht TPP-1015-HC-N297A) AK _3e: anti-HER2 Antikörper (TPP-751 1 ) (entspricht TPP-1015-HC-N297Q)

Allgemeine Vorschrift um eine maximale DAR von 2 zu erzielen:

Zu einer Lösung von 5 mg der entsprechenden aglyco Antikörper Variante (HC-N297A) in DPBS pH 7.4 (c-5-15 mg/mL) wurden 20 μί (6 Equivalente) einer Lösung eines geeigneten Toxophor-Linker-Precursors (e.g. Intermediate R50 und R51 ; 10 mM Lösung in DMSO) hinzugegeben. Nach 5 min Inkubation bei 37°C wurden 50 μί einer Lösung von rekombinanter bakterieller Transglutaminase Lösung in Wasser (Produkt Nummer T001 von Zedira GmbH, Darmstadt, Germany) (25 U/mL) hinzugegeben und weitere 24h bei 37°C inkubiert. Dann wurde die Reaktionsmischung mit DPBS pH 7.4 auf ein

Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt und durch Gelfiltration über mit DPBS equillibierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit DPBS-Puffer bei pH 7.4 eluiert. Anschließend wurde die ADC Lösung mittels Amicon Ultracel-30K

Zentrifugation (Millipore) aufkonzentriert und wieder rückverdünnt mit DPBS auf ein Volumen von etwa 2.5 mL. Schließlich wurden noch 0.00625 μηηοΙ des b- Transglutaminase Blockers Zedira C100 in 12.5 μί DPBS zu der Lösung hinzugefügt. Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausführungsbeispielen jeweils angegebene

Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-7. beschriebenen Methoden ermittelt.

Allgemeine Vorschrift um eine maximale DAR von 4 zu erzielen: Zu einer Lösung von 5 mg der entsprechenden agiyco Antikörper Variante (HC-N297Q) in DPBS pH 7.4 (c~5-15mg/mL) wurden 16-24 Euivalente einer Lösung eines geeigneten Toxophor-Linker-Precursors (e.g. Intermediat R50 und R51 ; 10 mM Lösung in DMSO) hinzugegeben. Nach 5 min Inkubation bei 37°C wurden 400 μί (10 U) einer Lösung von rekombinanter bakterieller Transglutaminase Lösung in Wasser (Produkt Nummer T001 von Zedira GmbH, Darmstadt, Germany) (25 U/mL) hinzugegeben und weitere 24h bei 37°C inkubiert. Dann wurde die Reaktionsmischung mit DPBS pH 7.4 auf ein

Zentrifugation (Millipore) aufkonzentriert und wieder rückverdünnt mit DPBS auf ein Volumen von etwa 2.5 mL. Schließlich wurden noch 0.1 μηηοΙ des b-Transglutaminase Blockers Zedira C100 in 200 μί DPBS zu der Lösung hinzugefügt. Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausführungsbeispielen jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-7. beschriebenen Methoden ermittelt.

Allgemeine Vorschrift für Transglutaminase vermittelte Kupplung im größeren Maßstab um eine maximale DAR von 2 zu erhalten:

Zu einer Lösung von 30 mg der aglycosylierten Variante (HC-N297A) des jeweiligen Antikörpers in DPBS pH 7.4 (c~5-15 mg/mL) wurden 6 Equivalente einer Lösung des entsprechenden Toxophor-Linker-Precursors (10 mM in DMSO) hinzugegeben. Nach 5 min Inkubation bei 37°C wurden 200 [i L (7.5 U) einer Lösung von rekombinanter bakterieller Transglutaminase in Wasser (Produkt Nummer T001 von Zedira GmbH, Darmstadt, Germany) (25 U/mL) hinzugegeben und weitere 24h bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde über Gelfiltrationschromatographie auf einer Superdex 200 Säule (GE Healthcare) in DPBS pH 7.4 gereinigt, um kleine Moleküle und die

Transglutaminase vom ADC abzutrennen. Anschließend wurde die ADC-Lösung über Amicon Ultracel-30K Zentrifugationsrohrchen (Millipore) auf finale Konzentrationen von 5- 25 mg/mL ankonzentriert. Die Lösung wurde anschließend sterilfiltriert.

Die jeweiligen in den Ausführungsbeispielen angegebenen Konzentrationen der ADC- Lösungen wurden bestimmt. Die Beladung wurde nach den in Kapitel B7 beschriebenen Methoden bestimmt. Die ADC batches wurden wie in den Ausführungsbeispielen angezeigt charakterisiert.

Allgemeine Vorschrift für Transglutaminase vermittelte Kupplung im größeren Maßstab um eine maximale DAR von 4 zu erhalten:

Zu einer Lösung von 30 mg der aglycosylierten Variante (HC-N297Q) des jeweiligen Antikörpers in DPBS pH 7.4 (c~5-15 mg/mL) wurden 16-24 Equivalente einer Lösung des entsprechenden Toxophor-Linker-Precursors (10 mM in DMSO) hinzugegeben. Nach 5 min Inkubation bei 37°C wurden 2400 μί (60 U) einer Lösung von rekombinanter bakterieller Transglutaminase in Wasser (Produkt Nummer T001 von Zedira GmbH, Darmstadt, Germany) (25 U/mL) hinzugegeben und weitere 24h bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde über Gelfiltrationschromatographie auf einer Superdex 200 Säule (GE Healthcare) in DPBS pH 7.4 gereinigt, um kleine Moleküle und die

AK3 hat jeweils die Bedeutung AK _3a: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-2658) (entspricht TPP-2090-HC-N297A) - C0-§ ₂

AK _3b: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-5442) (entspricht TPP-2090-HC-N297Q) - C0-§ ₂

AK _3c: Anti-TW EAKR Antikörper (TPP-8825) (entspricht TPP-2090-HC-Q295N-HC- N297Q) - C0-§ ₂ AK _3d: anti-HER2 Antikörper (TPP-7510) (entspricht TPP-1015-HC-N297A) - C0-§ ₂ AK _3e: anti-HER2 Antikörper (TPP-751 1 ) (entspricht TPP-1015-HC-N297Q) - C0-§ ₂

wobei

§ ² die Verknüpfung mit der Aminogruppe eines Toxophor-Linker-Precursors bedeutet, und

CO für die Seitenketten-Carbonylgruppe eines Glutamin-Restes des Antikörpers steht.

Potenziell geeignete Substrate für bakterielle Transglutaminase im Sinne der Anmeldung sind:

300

B-6a. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von geschlossenen Succinimid-

Cystein-Addukten:

In einer beispielhaften Ausführung wurden 10 μηιοΙ der oben beschriebenen Maleinimid- Vorläuferverbindungen wurden in 3-5 ml_ DMF aufgenommen und mit 2.1 mg (20 μηηοΙ) L- Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen 2h und 24 h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels praparativer HPLC gereinigt.

B-6aa. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von isomeren geöffneten

Bernsteinsäureamid-Cvstein-Addukten: In einer beispielhaften Ausführung wurden 68 μηηοΙ der oben beschriebenen Maleinimid- Vorläuferverbindungen in 15 mL DMF aufgenommen und mit 36 mg (136 μηηοΙ) N-{[2- (Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde ~20h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels praparativer HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der

Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 15 mL THF/Wasser 1 :1 gelöst. Es wurden 131 L einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit einer 1 M Salzsäure neutral gestellt, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch präparative H PLC gereinigt. Es wurden -50% d. Th. der regioisomeren geschützten Intermediate als farbloser Schaum erhalten.

Im letzten Schritt wurden 0.023 mmol von diesen regiosisomeren Hydrolyseprodukten in 3 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12.5 mg (0.092 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 4 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 27 mg (0.092 mmol)

Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels praparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Aceton itril/Wasser wurden die hydrolysierten offenen Sulfanylbernsteinsäure-amide als

Regioisomerengemisch erhalten. Weitere Aufreinigung und Charakterisierung der erfindungsgemäßen Konjugate

Nach erfolgter Umsetzung wurde in einigen Fällen das Reaktionsgemisch beispielsweise durch Ultrafiltration aufkonzentriert und anschließend mittels Chromatographie, beispielsweise mittels einer Sephadex® G-25, entsalzt und gereinigt. Die Elution erfolgte beispielsweise mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). Anschließend wurde die Lösung sterilfiltriert und eingefroren. Alternativ kann das Konjugat lyophilisiert werden.

B-7. Bestimmung des Antikörpers, der Toxophorbeladung und des Anteils geöffneter Cvstein-Addukte Zur Protein-Identifizierung wurde neben der Molekulargewichtsbestimmung nach

Deglykosylierung und/oder Denaturierung ein tryptischer Verdau durchgeführt, der nach Denaturierung, Reduktion und Derivatisierung die Identität des Proteins anhand der nachgewiesenen tryptischen Peptide bestätigt.

Von den erhaltenen Lösungen der in den Ausführungsbeispielen beschriebenen

Konjugate in PBS Puffer wurde die Toxophorbeladung wie folgt bestimmt:

Die Bestimmung der Toxophor Beladung von Lysin-verknüpften ADCs erfolgte nach massenspektrometrischer Bestimmung der Molekulargewichte der einzelnen

Konjugatspezies. Hierbei wurden vorab die Antikörperkonjugate mittels PNGaseF deglycosyliert, die Probe angesäuert und nach HPLC-T rennung/Entsalzung

massenspektrometrisch mittels ESI-MicroTofo (Bruker Daltonik) analysiert. Alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion Chromatogramm) wurden addiert und das

Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies auf Basis von MaxEnt

Deconvolution berechnet. Nach Signal Integration der verschiedenen Spezies wurde dann die DAR (= Drug/Antibody Ratio) berechnet. Hierzu wurde die Summe der Toxophor- Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller Spezies geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller Spezies.

Die Bestimmung der Toxophorbeladung von Cystein-verknüpften Konjugaten wurde über Reversed-Phase-Chromatographie des reduzierten und denaturierten ADCs bestimmt. Zur ADC-Lösung (1 mg/mL, 50μί) wurde Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCI) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500mM, 3 [iL) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und über HPLC analysiert.

Die HPLC-Analyse wurde auf einem Agilent 1260 HPLC-System mit Detektion bei 220 nm durchgeführt. Es wurde eine Polymer Laboratories PLRP-S Polymerie Reversed Phase Säule (Katalognummer PL1912-3802) (2.1 x150 mm, 8 μηι particle size, 1000 A) bei einer Flussrate von 1 mL/min mit folgendem Gradienten verwendet: 0 min, 25 %B; 3 min, 25 %B; 28 min, 50 %B. Laufmittel A bestand aus 0.05 % Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, Laufmittel B aus 0.05 % Trifluoressigsäure in Acetonitril.

Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren wurde aus den durch Integration bestimmten Peakflächen als die zweifache Summe der HC-Beladung und der LC-Beladung bestimmt, wobei sich die LC-Beladung aus der Summe der Toxophor- Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller LC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller LC- Peaks berechnete, und wobei sich die HC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten

Integrationsergebnisse aller HC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller HC- Peaks berechnete. In vereinzelten Fällen konnte es vorkommen, dass die Toxophorbeladung aufgrund von Ko-Elutionen einiger Peaks nicht exakt möglich war.

In den Fällen, in denen keine ausreichende HPLC-T rennung von leichter und schwerer Kette möglich war, erfolgte die Bestimmung der Toxophorbeladung von Cystein verknüpften Konjugaten mittels massenspektrometrischer Bestimmung der

Molekulargewichte der einzelnen Konjugatspezies an leichter und schwerer Kette.

Dazu wurde zur ADC-Lösung (1 mg/mL, 50μί) Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCI) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500mM, 3 μί) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und massenspektrometrisch nach online Entsaltzung mittels ESI-MicroTofo (Bruker Daltonik) analysiert. Zur DAR-Bestimmung wurden alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion

Chromatogramm) addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies an leichter und schwerer Kette auf Basis von MaxEnt Deconvolution berechnet. Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren wurde aus den durch

Integration bestimmten Peakflächen als die zweifache Summe der HC-Beladung und der LC-Beladung bestimmt. Hierbei berechnete sich die LC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller LC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller LC- Peaks und die HC- Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller HC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller HC- Peaks.

Bei den geöffneten Konstukten wurde zur Bestimmung des Anteils des geöffneten Cystein-Addukts das Molekulargewichtsflächenverhältnis vom geschlossenen und offenen Cystein-Addukt (Molekulargewichtsdelta 18Dalton) aller einfach konjugierten leichten und schweren Kettenvarianten bestimmt. Der Mittelwert über alle Varianten ergab den Anteil des geöffneten Cystein-Addukts.

Die Bestimmung der Toxophorbeladung von Glutamin-verknüpften Konjugaten wurde über Reversed-Phase-Chromatographie des reduzierten und denaturierten ADCs bestimmt. Zur ADC-Lösung (1 mg/ml_, 50μΙ_) wurde Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCI) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500mM, 3 μΙ_) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und über HPLC analysiert.

Die HPLC-Analyse wurde auf einem Agilent 1260 HPLC-System mit Detektion bei 220 nm durchgeführt. Es wurde eine Polymer Laboratories PLRP-S Polymerie Reversed Phase Säule (Katalognummer PL1912-3802) (2.1 x150 mm, 8 μηι particle size, 1000 A) bei einer Flussrate von 1 mL/min mit folgendem Gradienten verwendet: 0 min, 31 %B; 1 min, 31 %B; 14 min, 38 %B, 16 min, 95 %B. Laufmittel A bestand aus 0.05 % Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, Laufmittel B aus 0.05 % Trifluoressigsäure in Acetonitril.

Die detektierten Peaks wurden durch Retentionszeitvergleich mit der leichten Kette (L0) und der schweren Kette (HO) des nicht konjugierten Antikörpers zugeordnet. Peaks, die ausschließlich in der konjugierten Probe detektiert wurden, wurden den schweren Ketten mit einem und zwei Toxophoren (H1 , H2) zugeordnet. Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren wurde aus den durch Integration bestimmten Peakflachen als die zweifache Summe der HC-Beladung und der LC-Beladung bestimmt, wobei sich die LC-Beladung aus der Summe der Toxophor- Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller LC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller LC- Peaks berechnete, und wobei sich die HC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten

Integrationsergebnisse aller HC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller HC- Peaks berechnete.

Alternativ erfolgte die Bestimmung der Toxophor Beladung von Glutamin-verknüpften ADCs nach massenspektrometrischer Bestimmung der Molekulargewichte der einzelnen Konjugatspezies. Hierbei wurde die Probe angesäuert und nach HPLC- Trennung/Entsalzung massenspektrometrisch mittels ESI-MicroTofo (Bruker Daltonik) analysiert. Alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion Chromatogramm) wurden addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies auf Basis von MaxEnt Deconvolution berechnet. Nach Signal Integration der verschiedenen Spezies wurde dann die DAR (= Drug/Antibody Ratio) berechnet. Hierzu wurde die Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller Spezies geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller Spezies.

Alternativ wurde die Toxophor Beladung unabhängig von der Verknüpfungsstelle über UV-Absorption während der Size Exclusion Chromatographie (SEC) bestimmt, im

Folgenden abgekürzt als SEC-UV. Hierzu wurde 50 μΙ_ der ADC-Lösung über SEC analysiert. Die Analytik wurde auf einem Agilent 1260 HPLC System mit einer Detektion bei 280 nm und einer Detektion bei 260 nm durchgeführt. Eine Superdex 200 10/300 GL Säule von GE Healthcare (Lot No: 10194037) (10 x 310 mm, 1 μηι Partikelgröße) wurde mit einer Flussrate von 1 ml/min unter isokratischen Bedingungen verwendet. Die mobile Phase bestand aus PBS Puffer (pH 7.2). Für die Bestimmung der Drug Load aus dem HPLC-Chromatogramm wurde das Verhältnis R der Peakflächen des Monomerpeaks bei 260 nm und bei 280 nm bestimmt. Aus diesem Verhältnis wurde die Drug Load (DAR) wie folgt ermittelt: Hierbei steht ε für den molaren Extinktionskoefizienten des Antikörpers (Ab) und der Drug (D). λ steht für die Wellenlänge 260 nm, während 280 für 280 nm steht. Die

Extinktionskoeffizienten der Antikörper bei 280 nm und bei 260 nm wurden experimentell bestimmt. Der Mittelwert dieser Bestimmungen für verschiedene Antikörper wurde für die DAR Kalkulation verwendet. Auch für das KSP Toxophor wurden die molaren

Extinktionskoeffizienten bei 280 nm und bei 260 nm experimentell bestimmt. Die folgenden Wellenlängen und Extinktionskoeffizienten wurden für die DAR Berechnungen verwendet:

Die Konzentration der ADCs wurde über die Bestimmung der UV-Absorption bei 280 nm bestimmt. Die Konzentration wurde unter Verwendung des molaren

Absorptionskoeffizienten des jeweiligen Antikörpers bestimmt. Um ebenfalls die

Absorption des Toxophors bei 280 nm zu berücksichtigen, wurde die bei 280 nm gemessene Konzentration unter Verwendung der folgenden Gleichung korrigiert: concentration = preliminary concentration / (1 +DARuv ^* (nToxo hore 280nm nAntibod _y 280nm))

Hierbei steht "preliminary concentration" für die Konzentration, die nur unter Verwendung des Absorptionskoeffizienten des Antikörpers kalkuliert wurde, DARuv ist die über SEC-UV bestimmte DAR des jeweiligen ADCs, und DToxo hore 280nm Und DAntibody 280n _m sind die jeweiligen Extinktionskoeffizienten des Toxophors und des Antikörpers bei 280 nm. B-8. Überprüfung der Antigen-Bindung des ADCs

Die Bindefähigkeit des Binders an das Zielmolekül wurde nach erfolgter Kopplung überprüft. Dazu sind dem Fachmann vielfältige Methoden bekannt, beispielsweise kann die Affinität des Konjugats mittels ELISA-Technologie oder

Oberflächenplasmonresonanzanalyse (BIAcore™ Messungen) überprüft werden. Die Konjugatkonzentration kann der Fachmann mit gängigen Methoden messen,

beispielsweise für Antikörper-Konjugate mittels Proteinbestimmung, (siehe auch Doronina et al.; Nature Biotechnol. 2003; 21 :778-784 und Polson et al., Blood 2007; 1 102:616-623).

Ausführungsbeispiele APDCs und ADCs

Die in den Strukturformen der Ausführungsbeispiele dargestellten APDCs und ADCs, die über Maleinimid-Reste an Cysteinseitenketten der Antikörper gekuppelt wurden, liegen in Abhängigkeit vom Linker und von dem Kupplungsprotokoll zum überwiegenden Teil in den jeweils dargestellten ring-geöffneten bzw. ring-geschlossenen Formen vor. Zu einem kleinen Anteil kann jedoch die jeweils andere Form in der Präparation enthalten sein. Die Kupplungsreaktionen wurden unter Argon durchgeführt.

Beispiel 1

Exemplarische Vorschrift A:

5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.4 ml PBS (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S1 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde die Lösung mit PBS Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf 2.5 ml verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

1 a-981 EGFR 981 A 1 .93 3.3

1 e-1015 HER2 1015 A 1 .69 3.7

1 k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .90 3.4

Beispiel 2

Exemplarische Vorschrift A:

5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.4 ml PBS (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.2 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S2 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch

Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).

Exemplarische Vorschrift B: 30 mg des entsprechenden Antikörpers in 2.52 ml PBS (c=1 1.9 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.172 mg TCEP in 0.2 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 1 .2 mg (0.0014 mmol) von Intermediat S2 gelöst in 200 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10- Säule (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde mit PBS-Puffer pH8 auf ein Volumen von 7.5 mL verdünnt und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).

Für Beispiel 2k ^*-7007 wurde der Prozentsatz der ring-geöffneten Form durch

Massenspektrometrie mit 87.4% ermittelt.

Beispiel 3

Exemplarische Vorschrift A:

5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.5 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S3 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule

(Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch

Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).

Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

3a-981 EGFR 981 A 1 .93 4.3

3e-1015 HER2 1015 A 1 .9 4.8

3k-2658 TWEAKR 2658 A 1 .88 3.6 Beispiel 4

Exemplarische Vorschrift A:

5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.5 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.23 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S4 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule

(Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch

Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).

Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

4a-981 EGFR 981 A 1 .79 2.8

4e-1015 HER2 1015 A 2.22 3.2

4k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .84 2.8 Beispiel 5

Exemplarische Vorschrift A:

5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.5 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.23 mg (0.00019 mmol) von Intermediat S5 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule

(Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch

Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).

Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

5a-981 EGFR 981 A 1 .87 3.5

5e-1015 HER2 1015 A 1 .79 3.6

5k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .73 3.5 Beispiel 6

Exemplarische Vorschrift A:

Zu 5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.4 ml_ PBS (c = 12.5 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.18 mg) von Intermediat S6 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 ml_ verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch

Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).

Exemplarische Vorschrift B:

Zu 80 mg des betreffenden Antikörpers in 5.58 ml_ PBS (c = 14.3 mg/mL; die

Konzentration kann im Allgemeinen aber auch zwischen 3 und 20 mg/mL liegen) wurden unter Argon 5 Eq (2.8 mg) von Intermediat S6 gelöst in 500 μί DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 7.5 mL verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch

Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).

Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

6a-981 EGFR 981 A 2.6 5.9

6e-1015 HER2 1015 A 2.32 6.9 Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

6k-7007 TWEAKR 7007 A 2.53 5.3

Beispiel 7

Exemplarische Vorschrift A:

(Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer (pH 7.2) eluiert.

Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS- Puffer (pH 7.2).

Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

7a-981 EGFR 981 A 2.13 3.6 Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

7e-1015 HER2 1015 A 2.02 3.9

7k-7007 TWEAKR 7007 A 2.12 3.8

Exemplarische Vorschrift A:

Zu 5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.4 ml_ PBS (c = 12.5 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.14 mg) von Intermediat S8 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 ml_ verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch

Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).

Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

8a-981 EGFR 981 A 1 .23 3.8 Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

8e-1015 HER2 1015 A 1 .59 4.5

8k-7007 TWEAKR 7007 A 2.22 3.1

Beispiel 9

Exemplarische Vorschrift A:

5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.5 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S9 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule

(Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch

Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

9a-981 EGFR 981 A 2.06 3.4

9e-1015 HER2 1015 A 1 .92 3.6

9k-7007 TWEAKR 7007 A 2.05 3.1

Beispiel 10

Exemplarische Vorschrift A:

5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.4 ml PBS Puffer (pH 7.2) (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.23 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S10 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

10a-981 EGFR 981 A 2.13 3.0

10e-1015 HER2 1015 A 1 .8 3.1

10k-7007 TWEAKR 7007 A 2.02 2.6

Beispiel 11

Exemplarische Vorschrift A:

(Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch

Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

1 1 a-981 EGFR 981 A 1 .90 3.2

1 1 e-1015 HER2 1015 A 1 .77 3.5

1 1 k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .99 3.4

Beispiel 12

Exemplarische Vorschrift A:

5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.4 ml PBS Puffer (pH 7.2) (c=12.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S12 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt. Diese Lösung wurde über eine mit PBS-Puffer equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Anschließend wurde durch

Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

12a-981 EGFR 981 A 1 .92 2.2

12e-1015 HER2 1015 A 1 .66 2.5

12k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .84 2.5

Beispiel 13

Exemplarische Vorschrift A:

5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 ml PBS Puffer (pH 7.2) (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.28 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S13 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

13a-981 EGFR 981 A 1 .72 3.0

13e-1015 HER2 1015 A 1 .67 3.0

13k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .73 2.3

Beispiel 14

Exemplarische Vorschrift A:

Gesamtvolumen von 2.5 mL verdünnt. Diese Lösung wurde über eine mit PBS-Puffer (pH 8) equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer (pH 8) eluiert und über Nacht bei RT gerührt. Anschließend wurde durch

Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

14a-981 EGFR 981 A 1 .77 3.3

14e-1015 HER2 1015 A 1 .65 3.4

14k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .65 2.5

Bei den unter diesen Bedingungen und mit diesem Linker hergestellten ADCs von Beispiel 14 verlief die Ringöffnung unvollständig. Sie enthielten noch größere Anteile (über 50%), bei denen die Verknüpfung mit dem Antikörper über die ringgeschlossene Succinimid Form vorlag (vgl. Beispiel 7).

Beispiel 15

Exemplarische Vorschrift A:

5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.5 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.27mg (0.00023 mmol) von Intermediat S15 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben und der Ansatz weitere 90 min bei RT gerührt. Die Lösung wurde dann mit PBS Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf 2.5 ml verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch

Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).

Beispiel 16

Exemplarische Vorschrift A (zum Erzielen einer höheren DAR):

5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.5 ml PBS (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.067 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.68mg (0.00057 mmol) von Intermediat S16 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiterem Rühren unter Argon über Nacht bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer auf ein Volumen von 2.5 mL verdünnt. Diese Lösung wurde dann über eine mit PBS-Puffer pH7.2 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH7.2 eluiert. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).

Beispiel 17

Exemplarische Vorschrift A:

5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.45 ml PBS (c=1 1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.30mg (0.00023 mmol) von Intermediat S17 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben und der Ansatz weitere 90 min bei RT gerührt. Die Lösung wurde dann mit PBS Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf 2.5 ml verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule

(Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch

Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

17a-981 EGFR 981 A 1 .45 3.0

17e-1015 HER2 1015 A 0.86 3.0

17k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .01 2.5

Exemplarische Vorschrift A:

Zu 3 mg des betreffenden Antikörpers in 0.3 mL PBS (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.12 mg) von Intermediat S18 gelöst in 30μί DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 mL verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).

Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

18a-981 EGFR 981 A 1 .98 2.8

18e-1015 HER2 1015 A 1 .16 3.8

18k-7007 TWEAKR 7007 A 2.00 3.7

Exemplarische Vorschrift A:

5 mg des entsprechenden Antikörpers in 0.45 ml PBS (c=1 1 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.28 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S19 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben und der Ansatz weitere 90 min bei RT gerührt. Die Lösung wurde dann mit PBS Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf 2.5 ml verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule

(Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch

Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).

Beispiel 20

Exemplarische Vorschrift A:

Zu 5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 mL PBS (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.17 mg) von Intermediat S20 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 mL verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).

Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

20a-981 EGFR 981 A 2.0 6.2

20e-1015 HER2 1015 A 2.19 4.3

20k-7007 TWEAKR 7007 A 2.1 4.6 Beispiel 21

Exemplarische Vorschrift A:

5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 ml PBS Puffer (pH 7.2) (c=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 0.05 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermediat S21 gelöst in 50 μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 2.5 ml_ verdünnt, anschließend über eine mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).

Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

21 a-981 EGFR 981 A 1 .79 2.5

21 e-1015 HER2 1015 A 1 .72 2.7

21 k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .95 2.0 Beispiel 22

Exemplarische Vorschrift A:

Zu 5 mg des betreffenden Antikörpers in 0.5 mL PBS (c = 10 mg/mL) wurden unter Argon 5 Eq (0.22 mg) von Intermediat S22 gelöst in 50μΙ_ DMSO zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 mL verdünnt, über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS (pH7.2).

Beispiel Target Antikörper Vorschrift C [mg/mL] DAR

TPP-

22a-981 EGFR 981 A 1 .86 6.4

22e-1015 HER2 1015 A 1 .97 5.6

22k-7007 TWEAKR 7007 A 1 .90 5.3 Ausführungsbeispiele Metabolite:

Die aus den erfindungsgemäßen ADCs in den verschiedenen Ausführungsbeispielen im Tumor gebildeten Metabolite wurden zu Vergleichszwecken hergestellt und

charakterisiert. Teilweise wurden sie bereits in früheren Offenbarungen von anderen ADCs beschrieben.

Metabolite, die beispielsweise aus Beispiel 2, 3 und 9 gebildet werden können

Die Synthese der 4 isomeren Cystein-Metabolite, die aus Beispiel 1 , 2, 3, 9 gebildet werden können, wurden in WO2016/096610 beschrieben und dort als Beispiele M13, M14, M15 und M16 charakterisiert.

Metabolite M1 und M2, die beispielsweise aus Beispiel 4 und 5 gebildet werden können

Beispiel M1 N-(3-{[(2R)-2-Amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-3-carboxypropan oyl)glycyl-N-[2-({(2S)-2- amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino] butanoyl}amino)ethyl]-D-alpha-glutamin -Trifluoressigsäure Salz

Regioisomer 1 , Epimerengemisch

Zu einer Lösung von Methyl-L-cysteinathydrochlorid (1 :1 ) (5.00 g, 29.1 mmol) in 1 ,4- Dioxan (200 ml) wurde Triethylamin (10 ml, 73 mmol) und anschließend 1 -({[2- (Trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl}oxy)pyrrolidin-2,5-dion (8.31 g, 32.0 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde 20 h bei Raumtemperatur gerürht. Anschließend wurde der Feststoff abfiltriert und das Filtrat wurde im Hochvakkum eingeengt. Der Rückstand wurde über präparative HPLC gereinigt.

Zu einer Lösung des erhaltenen Methyl-N-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cysteinat (130 mg, 465 μηηοΙ) und 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure (393 mg, 1 .86 mmol) in DMF (6.5 ml) wurden 210 μΙ (1 .4 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben und die Reaktion wurde für 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch praparative HPLC gereinigt. Das Lösemittel wurde im Vakuum abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet.

Dieses erhaltene Intermediat wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie in Gegenwart von HATU mit Intermediat C1 19 gekuppelt. Anschließend wurden die

Methylester durch Behandlung mit einer Lithiumhydroxid-Lösung in THF/Wasser (1 :1 ) verseift.

Im letzten Schritt wurden 22 mg von dem erhaltenen Intermediat in 10 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 34 mg (0.252 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 1 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 74 mg (0.252 mmol) Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure 10 mL Wasser und 500 μί TFA zugesetzt. Die Mischung wurde filtriert und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 13 mg (72% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 5): Rt = 2.44 min; MS (ESIneg): m/z = 959 [M-H] ^" Beispiel M2

N-(2-{[(2R)-2-Amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-3-carboxypro panoyl)glycyl-N-[2-({(2S)-2- amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]-D-alpha-glutamin -trifluoressigsäure Salz

Regioisomer 2, Epimerengemisch

Die Titelverbindungen M2 wurden als Epimerengemisch analog Beispiel M1 hergestellt:

Zu einer Lösung aus Methyl-N-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cysteinat ( 1000 mg, 3.58 mmol) und 2-Brom-4-ethoxy-4-oxobutansäure ( 926 mg, 4.1 1 mmol) in DMF (40 ml) wurden801 μΙ, 5.4 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben und die Reaktion wurde für 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt.

Das erhaltene Intermediat wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie in Gegenwart von HATU und Methylmorpholin mit Intermediat C1 19 gekuppelt.

Anschließend wurden der Methylester sowie der Ethylester durch Behandlung mit einer Lithiumhydroxid-Lösung in THF/Wasser (1 :1 ) verseift.

Im letzten Schritt wurden 48 mg von diesem Intermediat in 5 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 75 mg (0.550 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 3 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 160 mg (0.550 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure 2 mL Wasser und 20 μί TFA zugesetzt. Das Lösemittel wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand wurde mittels praparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 14 mg (39% d. Th.) der Titelverbindung erhalten. LC-MS (Methode 5): Rt = 2.41 min; MS (ESIneg): m/z = 959 [M-H] ^"

Metabolit M3, der beispielsweise aus Beispiel 6, 7, 10, 12, 13, 14, 16 und 22 gebildet werden kann

Beispiel M3 N-{(2S)-2-Amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-D-glut aminsäure

Intermediat C121 wurden durch 1 -stündige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT in die Titelverbindung überführt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1 .78 min; MS (ESIpos): m/z = 714 [M+H] ⁺.

Metabolit M4, der beispielsweise aus Beispiel 8 gebildet werden kann Beispiel Metabolit M4:

N-(3-Aminopropyl)-N-{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2-hydrox acetamid

Die Herstellung sowie die Charakterisierung dieses Metaboliten M4 wurde in

WO2016/096610 als Metabolit M9 beschrieben. Dieser aus den erfindungsgemäßen ADCs in Beispiel 8 gebildete Metabolit zeigt ein Profil, das sich bzgl. Transportersubstrateigenschaften und zellulärer Cytotoxizität von den anderen Metaboliten M1 , M2 und M3 unterscheidet.

Referenzbeispiele: APDCs und kleine Moleküle

Zunächst wurden zu Vergleichszwecken das APDC R1 e sowie das ADC R6k jeweils mit Tripeptidsequenzen als Legumainsubstrat hergestellt.

Weiterhin wurden zur Untersuchung der Legumain-vermittelten Spaltung zu

Vergleichszwecken die Legumain-spaltbaren Prodrugs von kleinen Molekülen RM-A und RM-B hergestellt. Referenzbeispiel R1e mit TPP1015

Die Herstellung des ADCs mit TPP1015 erfolgte in Analogie zu Beispiel 1 .

Protein Konzentration: 1.7 mg/mL

Drug/mAb Ratio: 3.3

Der Precursor wurde in Analogie zu Intermediat S1 durch Kupplung von Intermediat F104 mit Intermediat L103 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 1068 (M+H) ⁺.

Referenzbeispiel R6k mit TPP7007

Die Herstellung des ADCs mit TPP7007 erfolgte in Analogie zu Beispiel 6.

Protein Konzentration: 2.1 1 mg/mL

Drug/mAb Ratio: 5.3

Der Precursor wurde in Analogie zu Intermediat S6 ausgehend von Verbindung C121 zunächst durch Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-1 -yl-N ²-(tert-butoxycarbonyl)-L- asparaginat in DMF in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Dann erfolgte die Abspaltung der Boc-Schutzgruppe durch 1 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten

Zinkchlorid in Trifluorethanol. Im nächsten Schritt wurde das erhaltene Intermediat mit N- (tert-Butoxycarbonyl)-L-alanyl-L-alanin in DMF in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin gekuppelt. Dann erfolgte wiederum die Abspaltung der Boc- Schutzgruppe durch 2 h Rühren bei 50°C mit 6 Equivalenten Zinkchlorid in Trifluorethanol. Im nächsten Schritt wurden die Benzylester durch Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Wasserstoff-Normaldruck bei RT entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-1 ,5- diyl)bis(oxy)]dipyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin in DMF in die Titelverbindung überführt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.90 min; MS (ESIpos): m/z = 1 181 [M+H] ⁺. RM-A (Modellverbindung A)

N-(Pyridin-4-ylacetyl)-L-alanyl-L-alanyl-N ¹-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-1 -(methylamino)-l -oxobutan-2-yl]-L- aspartamid

Zunächst wurde Trifluoressigsäure-(2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N- methylbutanamid(1 :1 ) wie in WO 2015096982 A1 (Beispiel 99) beschrieben, hergestellt. Anschließend wurde aus diesem Intermediat durch Kupplung mit Intermediat L103 in DMF in Gegenwart von HATU und von Ν,Ν-Diisopropylethylamin die Titelverbindung hergestellt.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 902 [M+H] ⁺.

RM-B (Modellverbindung B)

N ¹-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-1 -(methylamino)-1 -oxobutan-2-yl]-N ²-(pyridin-4-ylacetyl)-L-aspartami

Zunächst wurde Trifluoressigsaure (2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl) -1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-methyl butanamid (1 :1 ) wie in WO 2015096982 A1 (Beispiel 99) beschrieben, hergestellt. Anschließend wurde aus diesem Intermediat durch Kupplung mit Intermediat L136 in DMF in Gegenwart von HATU und von Ν,Ν-Diisopropylethylamin die Titelverbindung hergestellt.

LC-MS (Methode 12): R _t = 1 .57 min; MS (ESIpos): m/z = 760 [M+H] ⁺.

RM-C (Modellverbindung C) N ¹-[(2S)-4-[{(1 R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glykoloyl)amino]-1 -(methylamino)-1 -oxobutan-2-yl]-N ²-(pyridin-4-ylacetyl)-L-glutamamid

Zunächst wurde Trifluoressigsaure (2S)-2-amino-4-[{(1 R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl) -1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-methyl butanamid (1 :1 ) wie in WO 2015096982 A1 (Beispiel 99) beschrieben, hergestellt. Anschließend wurde aus diesem Intermediat durch Kupplung mit Intermediat L137 in DMF in Gegenwart von HATU und von Ν,Ν-Diisopropylethylamin die Titelverbindung hergestellt.

LC-MS (Methode 12): R _t = 1 .56 min; MS (ESIpos): m/z = 774 [M+H] ⁺.

Bewertung der biologischen Wirksamkeit

Die biologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch die nachstehend beschriebenen Assays gezeigt werden:

C-1 a Bestimmung der cvtotoxischen Wirkung der ADCs

Die Analyse der cytototoxischen Wirkung der ADCs erfolgt auf verschiedenen Zelllinien:

NCI-H292: humane mukoepidermoide Lungenkarzinomzellen, ATCC-CRL-1848,

Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Sigma #F2442), TWEAKR-positiv; EGFR-positiv. BxPC3: humane Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, ATCC-CRL-1687, Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Sigma #F2442), TWEAKR- positiv.

LoVo humane kolorektale Krebszellen, ATCC No. CCL-229, Kultivierung für MTT-Assay: Standardmedium: Kaighn's + L-Glutamin (Invitrogen 21 127) + 10% heat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064). Kultivierung für CTG-Assay: RPMI 1640 (Biochrom;

#FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Sigma #F2442). TWEAKR-positiv.

KPL4: humane Brustkrebszelllinie, Bayer Pharma AG (identity checked and confirmed on 19.7.2012 at DSMZ), Standardmedium: RPMI 1640 (Fa. Gibco; #21875- 059, stab. L- Glutamin) + 10% heat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064); HER2-positiv. SK-HEP-1 : humane Leberkrebszelllinie, ATCC No. HTB-52, Standardmedium: MEM mit Earle's Salzen + Glutamax I (Invitrogen 41090) + 10% heat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064); EGFR-positiv, TWEAKR-positiv. KU-19-19: humane

Blasenkarzinomzellen, DMSZ, Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Sigma #F2442), TWEAKR-positiv

U251 : humane Glioblastomzellen, Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Biochrom; #S0415);B7H3-positiv. Die Kultivierung der Zellen erfolgt nach Standard-Methode, wie bei der American Tissue Culture Collection (ATCC) oder des Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) für die jeweiligen Zelllinien angegeben.

CTG -Assay

Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach Standard-Methode, mit den unter C-1 a angegebenen Wachstumsmedien. Zur Durchführung wurden die Zellen mit einer Lösung von Trypsin (0.05%) und EDTA (0.02%) in PBS (Biochrom AG #L2143) abgelöst, pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert, gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weissem Boden (Costar #3610) ausgesät (in 75μΙ/ίοοΙι, folgende Zellzahlen je Loch: NCI- H292: 2500 Zellen/ Loch, BxPC3 2500 Zellen / Loch, LoVo 3000 Zellen / Loch) und im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. Nach 24h wurden die Antikörper- Wirkstoff konjugate in 25μΙ Kulturmedium (vierfach konzentriert) auf die Zellen gegeben, so dass finale Konzentrationen der Antikörper-Wirkstoffkonjugate von 3 x 10 ^"7 M bis 3 x 10 ^"11 M auf den Zellen erreicht wurden (Triplikate). Anschließend wurden die Zellen im

Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. In einer parallelen Platte wurde die Zellvitalität zu Beginn der Wirkstoffbehandlung (Tag 0) mit dem Cell Titer Glow (CTG) Luminescent Cell Viability Assay (Promega #G7573 und #G7571 ) bestimmt. Dazu wurden pro Zellansatz 100μΙ des Substrats hinzugefügt, die Platten anschließend mit Alufolie abgedeckt, für 2 Minuten mit dem Plattenschüttler bei 180 rpm geschüttelt, für 8 Minuten auf der Laborbank stehen gelassen und dann mit einem Luminometer (Victor X2, Perkin Elmer) gemessen. Das Substrat detektiert den ATP-Gehalt in den lebenden Zellen, wobei ein Lumineszenz-Signal erzeugt wird, dessen Höhe direkt proportional zur Vitalität der Zellen ist. Nach 72h Inkubation mit den Antikorper-Wirkstoffkonjugaten wurde nun auch in diesen Zellen die Vitalität mit dem Cell Titer Glow Luminescent Cell Viability Assay wie oben beschrieben bestimmt. Aus den gemessenen Daten wurde die I C50 der

Wachstumshemmung im Vergleich zum Tag 0 unter Verwendung des DRC (Dose

Response Curve) Analysis Spreadsheets anhand einer 4-Parameter Anpassung berechnet. Das DRC Analysis Spreadsheet ist ein von Bayer Pharma AG und Bayer Business Services auf der Plattform IDBS E-WorkBook Suite entwickeltes Biobook Spreadsheet (IDBS: ID Business Solutions Ltd., Guildford, UK). MTT-Assay

Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach Standardmethode, mit den unter C-1 a angegebenen Wachstumsmedien. Zur Durchführung wurden die Zellen mit einer Lösung von Accutase in PBS (Fa. Biochrom AG #L2143) abgelöst, pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert, gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weißem Boden (Fa. Costar #3610) ausgesät (NCI-H292: 2500 Zellen/well; SK-HEP-1 : 1000 Zellen/well; KPL4: 1200 Zellen/well; in 100μί Gesamtvolumen). Anschließend wurden die Zellen im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. Nach 48h wurde ein Mediumwechsel durchgeführt. Dann wurden die Antikörper-Wirkstoff-Konjugate in 10μΙ Kulturmedium in Konzentrationen von 10 ^"5M bis 10 ^"13M zu den Zellen (Triplikate) pipettiert, bevor der Ansatz im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubierte. Nach 96h erfolgte die Detektion der Zellproliferation mit Hilfe des MTT-Assays (ATCC, Manassas, Virginia, USA, Katalog-Nr. 30-101 OK). Hierzu wurde das MTT Reagens für 4h mit den Zellen inkubiert, bevor durch Zugabe des Detergenzes die Lyse der Zellen über Nacht erfolgte. Die Detektion des gebildeten Farbstoffs erfolgte bei 570nm (Infinite M1000 pro, Fa.

Tecan). Aus den gemessenen Daten wurde die I C50 der Wachstumshemmung unter Verwendung der DRC (Dose Response Curve) berechnet. Die Proliferation ohne

Testsubstanz, aber ansonsten identisch behandelten Zellen, wird als 100% Wert definiert.

In der folgenden Tabelle sind die I Cso-Werte repräsentativer Ausführungsbeispiele aus diesen Assays aufgeführt:

Tabelle 1 a

NCI-H292 LoVo SKHep-1 BxPC3 KPL-4

Beispiel ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M]

MTT/CTG CTG MTT CTG [MTT]

1 a-981 4.08E-1 1 5.29E-08

1 e-1015 1 .42E-10

1 k-7007 2.96E-10 4.14E-1 1 4.76E-10

2a-981 7.96E-12 3.30E-07

2e-1015 8.03E-1 1

2k-7007 2.48E-10 1 .50E-1 1 5.75E-10 NCI-H292 LoVo SKHep-1 BxPC3 KPL-4

Beispiel ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M]

MTT/CTG CTG MTT CTG [MTT] k ^*-7007 3.99E-10 1.50E-11 4.07E-10

3a-981 9.73E-10 1.69E-07

3e-1015 4.50E-10

3k-2658 2.44E-08 4.78E-10 4.62E-09

4a-981 1.56E-11 3.18E-07

4e-1015 2.93E-10

4k-7007 3.71E-10 8.11E-11 7.14E-10

5a-981 2.63E-12 5.60E-08

5e-1015 1.43E-10

5k-7007 2.68E-10 6.21 E-11 5.55E-10

6a-981 1.00E-11 5.00E-07

6e-1015 1.91E-10

6k-7007 7.60E-11 1.50E-11 9.67E-11

7a-981 4.29E-12 1.22E-07

7e-1015 1.82E-10

7k-7007 2.09E-10 4.81 E-11 2.27E-10

8a-981 4.50E-10 4.25E-09

8e-1015 3.84E-09

8k-7007 5.68E-10 2.18-09 7.68E-10

9a-981 4.50E-12 4.34E-09

9e-1015 1.31E-10

9k-7007 2.80E-10 3.32E-11 6.06E-10

10a-981 5.15E-12 8.42E-09

0e-1015 2.54E-12 NCI-H292 LoVo SKHep-1 BxPC3 KPL-4

Beispiel ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M]

MTT/CTG CTG MTT CTG [MTT]0k-7007 1.83E-10 3.29E-11 2.25E-10

11a-981 3.25E-11 8.38E-09

1e-1015 4.97E-10 1 k-7007 9.95E-10 8.07E-11 3.68E-09

12a-981 2.50E-11 2.62E-08

2e-1015 7.66E-10 2k-7007 7.38E-10 6.14E-11 3.81E-10

13a-981 3.71 E-11

3e-1015 7.72E-11 3k-7007 2.07E-10 5.31 E-11 2.61E-10

14a-981 7.81E-10

4e-1015 4.32E-11 4k-7007 6.13E-11 1.5E-11 8.67E-11

15a-981 4.13E-10

5e-1015 7.91E-10 5k-7007 9.97E-09 6.00E-07 7.47E-09

6e-1015 2.01 E-11 6k-7007 5.45E-11 1.50E-11 4.00E-11

17a-981 1.40E-12 3.16E-11

7e-1015 2.99E-11 7k-7007 8.95E-10 2.36E-10 8.96E-10

18a-981 1.00E-12 6.01 E-11

8e-1015 2.07E-11 8k-7007 1.62E-10 6.00E-07 2.55E-10 NCI-H292 LoVo SKHep-1 BxPC3 KPL-4

Beispiel ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M] ICso [M]

MTT/CTG CTG MTT CTG [MTT]

19e-1015 3..48E-11

19k-7007 1.20E-10 1.50E-11 1.37E-10

20Θ-1015 1.17E-11

20k-7007 1.54E-10 1.52E-10 1.91E-10

21e-1015 3.66E-11

21k-7007 3.14E-10 1.08E-09 3.60E-10

22e-1015 6.13E-11

22k-7007 8.26E-11 1.50E-11 9.41 E-11

In der folgenden Tabelle 1b sind die ICso-Werte der Referenzbeispiele aus diesen Assays aufgeführt.

Tabelle 1b

Die angegebenen Wirkdaten beziehen sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausführungsbeispiele mit den angegebenen Drug/mAB-Ratios. Die Werte können bei anderen Drug/mAB-Ratios gegebenenfalls abweichen. Bei den IC50-Werten handelt es sich um Mittelwerte aus mehreren unabhängigen Exprimenten oder um Einfachwerte. Die Wirkung der Antikörper-Wirkstoffkonjugate war selektiv versus der jeweiligen Isotypkontrolle, die den jeweils entsprechenden Linker und Toxophor enthielt. C-1 b Bestimmung der Inhibition des Kinesinspindelproteins KSP/ Eg5 durch die aus ausgewählten Beispiele gebildeten aktiven Metabolite

Die Motordomäne des humanen Kinesinspindelproteins KSP /Eg5 (Fa. tebu-bio/

Cytoskeleton Inc, No. 027EG01 -XL) wurde in einer Konzentration von 10nM mit δθμς/ηηΐ Taxol (Fa. Sigma No. T7191 -5MG) stabilisierten Microtubuli (bovine oder porcine, Fa. tebu-bio/ Cytoskeleton Inc) für 5 min bei RT in 15mM PIPES, pH 6,8 (5mM MgC und 10mM DTT, Fa. Sigma) inkubiert. Die frisch hergestellte Mischung wurde in eine 384 MTP (Fa. Corning) aliquotiert. Es folgte die Zugabe der zu untersuchenden Inhibitoren in Konzentration von 1 .0 x10-6M bis 1 .0x 10-13M und ATP (finale Konzentration 500μΜ; Fa. Sigma). Die Inkubation erfolgte über 2h bei RT. Die ATPase-Aktivität wurde durch den Nachweis des entstehenden anorganischen Phosphats mit Malachit-Grün detektiert (Fa. Biomol). Nach der Zugabe des Reagenz erfolgte eine 50min Inkubation bei RT, bevor die Detektion der Absorption bei einer Wellenlänge von 620nm erfolgt. Als Positivkontrolle wurden Monastrol (Fa. Sigma, M8515-1 mg) und Ispinesib (Fa. AdooQ Bioscience A10486) verwendet. Die Einzeldaten der Dosis-Wirkungskurve stellen achtfach

Bestimmungen dar. Bei den I Cso-Werten handelt es sich um Mittelwerte aus zwei unabhängigen Experimenten. Als 100% Kontrolle diente die nicht mit Inhibitoren behandelte Probe.

In der folgenden Tabelle 2 sind die I Cso-Werte von den aus repräsentativen

Ausführungsbeispielen gebildeten aktiven Metaboliten aus dem beschriebenen Assay und den korrespondierenden zytotoxischen Daten (MTT-Assay) zusammengefasst:

Tabelle 2

Die angegebenen Wirkdaten beziehen sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausführungsbeispiele. C-1 c Enzymatische Assays und Stabilitätsuntersuchungen

Zunächst wurde die Spaltung der kleinen Molekül Prodrugs RM-A und RM-B unter verschiedenen Bedingungen getestet:

a: Legumain Assay

Der Legumain Assay wurde mit rekombinantem humanen Enzym durchgeführt. Die rhLegumain Enzymlösung (Catalog # 2199-CY, R&D Systems) wurde in 50mM Na-Acetat Puffer/ 100mM NaCI, pH4.0 auf die gewünschte Konzentration verdünnt und 2h bei 37°C vorinkubiert. rhLegumain wurde dann in 50mM MES Puffer, 250mM NaCI, pH 5.0 auf eine finale Konzentration von 1 ng^L eingestellt. Für jede zu untersuchende Legumain- spaltbare Prodrug wurde ein Ansatz in einem Mikroreaktionsgefäße (0.5ml, Fa.

Eppendorf) angesetzt. Hierzu wurde die Substratlösung mit 50mM MES Puffer, 250mM NaCI, pH 5.0 auf die gewünschte Konzentration (2-fach konzentriert) eingestellt. Für die kinetische Messung der enzymatischen Reaktion wurden zunächst 250μί der

Legumainlösung vorgelegt und durch Zugabe von 250μί der Substratlösung (finale Konzentration einfach konzentriert) wurde die Enzymreaktion gestartet. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden je 50μΙ_ Proben entnommen. Diese Probe wurde sofort mit 100μΙ_ eiskaltem Methanol versetzt, um die enzymatische Reaktion zu stoppen und dann bei - 20°C eingefroren. Die gewählten Zeitpunkte zur Probenentnahme waren nach 0,5h, 1 h, 3h und 24h. Die Proben wurden dann anschließend mittels RP-HPLC-Analyse und durch LC-MS Analytik untersucht. Die Bestimmung des freigesetzten Toxophors ermöglichte die Bestimmung der Halbwertszeit ti/2 der enzymatischen Reaktion (Abbildung 1 ).

Modellverbindung A (RM-A) wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen des Legumain-Assays mit einer Halbwertszeit von 0.2 h zur Zielverbindung gespalten.

Modellverbindung B (RM-B) wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen des Legumain-Assays mit einer Halbwertszeit von ca. 10 h zur Zielverbindung gespalten.

Modellverbindung C (RM-C) wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen des Legumain-Assays nicht zur Zielverbindung gespalten.

b: Assay zur Ermittlung der Stabilität in Rattenplasma

Zur Untersuchung der Stabilität von Verbindung A und B wurden jeweils 1 mL

Rattenplasma in 1 .5 mL Eppendorftubes auf einem Eppendorfschüttler auf 37°C temperiert. Es wurde eine Stammlösung (9 Acetonitril/ 1 DMSO) mit einer Konzentration von 100 μg mL für Verbindung A und Verbindung B hergestellt. Jeweils 10 μί der Stammlösung wurden in 1 mL temperiertes Rattenplasma pipettiert, sodass sich eine Konzentration von ^g mL ergab.

Die Proben wurden bei 450 rpm über 24 h bei 37°C gehalten. Bei den

Entnahmezeitpunkten 0, 0.25h, 0.5h, 1 h, 2h, 4h, 6h und 24h wurden jeweils 50 μί entnommen und zu 150 μί Methanol pipettiert. Interner Standard wurde mit einer Konzentration von 0.05 μg mL im Methanol vorgelegt. Nach kurzem vortexen wurden 300 L 10 mM Ammoniumacetat Puffer (pH 6.8) zugegeben und bei 1881 g 10 min zentrifugiert. Die Proben wurden dann anschließend mittels RP-HPLC-Analyse und durch LC-MS Analytik untersucht. c: Assay zur Ermittlung der Stabilität in Rattenleberlysosomen

Zur lysosomalen Stabilitätsuntersuchung der Verbindungen RM-A und RM-B wurden lysosomale Enzyme aus Rattenleberzellen isoliert. Zu diesem lysosomalen Extrakt wurde jeweils Verbindung A und B zugegeben, um die Stabilität unter lysosomalen Bedingungen zu untersuchen. Das proteolytische Enzym Legumain ist in Rattenleberlysosomen nicht oder nur in sehr geringem Maße expremiert (Chen, J-M. et al 1997). Zur Kontrolle der enzymatischen Aktivität der lysosomalen Enzyme wurde ein Cathepsin spezifisches Substrat zugegeben.

Zunächst wurde eine frische Rattenleber entnommen, gewogen und sofort auf Eis in Homogenisierungs-Medium (0.25 M Saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, pH7) gelegt. Die Leber wurde zerkleinert und ein Medienwechsel vorgenommen. Die

Homogenisierung der Rattenleber erfolgte mit der 4-fachen Menge des

Rattenlebergewichts bei 750 rpm in einem Potter (B. Braun). Das Homogenat wurde 10 min bei 1000g zentrifugiert und der Überstand filtriert. Im nächsten Schritt wurde mithilfe einer Ultrazentrifuge die„leichte mitochondriale Fraktion" (LMF) aus dem Überstand bei 26500g über 20 min abzentrifugiert. Im Pellet sind außer Mitochondrien auch die

Lysosomen enthalten. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 0.8 mL/g Homogenisierungs-Medium resuspendiert.

Um die lysosomale Fraktion von den übrigen Zellbestandteilen der LMF abzutrennen wurden 6 Optiprep Dichtegradienten mit 8, 12, 16, 19, 22.5 und 27% Sucroseanteil im Optiprep Puffer (100 mM MOPS, 20mM EDTA, 0.5% EtOH, pH 7.6) hergestellt. Die Sucrose wurde aus einer 2.3M Stammlsoung in der jeweiligen Prozentigkeit zugegben. In die Dichtestufe mit 19% Sucroseanteil wurden zusätzlich 2.5 mL der isolierten LMF gegeben. Anschließend wurden die Dichtestufen in 10 mL Zentrifugenröhrchen übereinandergeschichtet und bei 48500g 17h zentrifugiert. Die Fraktionen 1 -8 liegen in den oberen 5.6 mL des Gradienten und wurden verworfen. Die Fraktionen 9 und 10 befinden sich in den darunter liegenden 1 .6 mL und wurden aus dem Gradient

entnommen und mit 1.6 mL Lysepuffer (25 mM HEPES, 150 mM NACI, 0.1 % Triton X100, pH 5) 5 min auf Eis lysiert. In Fraktion 9 und 10 sind die Lysosomen enthalten. Zur

Lysekontrolle wurde der Proteingehalt der lysierten lysosomalen Fraktion mit Hilfe eines BCA assays (Pierce BCA Protein Assay Kit) kontrolliert.

Zur Untersuchung der lysosomalen Stabilität der Verbindungen RM-A und RM-B wurden nun 6 μί einer 100 g/mL Stammlösung (9 Aectonitril/ 1 DMSO) zu 290 μί 90 mM

Citratpuffer und 300 μί lysosmalem Extrakt gegeben und bei 37°C auf dem Eppendorfschüttler inkubiert. Es wurden nach Oh, 1 h, 2h, 6h, 24h und 48h je 50 [i L aus der Inkubationslösung entnommen und zu 150 μΙ_ MeOH pipettiert. Interner Standard wurde mit 0.05 μg mL vorgelegt. Die Proben wurden final zur RP-HPLC LCMS Analyse mit 300 μΙ_ 10 mM Amoniumacetatpuffer (pH 6.8) verdünnt und gemessen.

Unter den Bedingungen des lysosomalen Stabilitätsassays wurde Verbindung A

(Referenzbeispiel RM-A) mit einer Halbwertszeit von etwa 6 h innerhalb von 24h zu etwa 80% gespalten, während Verbindung B (Referenzbeispiel RM-B) im gleichen Zeitraum zu lediglich 13% gespalten wird. Somit ist RM-B deutlich stabiler als RM-A im lysosomalen Stabilitätsassay, wodurch man von einem reduzierten Ausmaß der Bildung von aktiven Metaboliten in der gesunden Leber ausgehen kann.

C-2 Internalisierungsassay Internalisierung ist der Schüsselprozess, um eine spezifische und effiziente Bereitstellung der zytotoxischen Payload in Antigen-exprimierenden Krebszellen durch Antikörper-Drug- Konjugate (ADC) zu ermöglichen. Dieser Prozess wird über Fluoreszenzmarkierung von spezifischen Antikörpern und einem Isotyp-Kontrollantikörper verfolgt. Hierzu wurde zunächst die Konjugation des Fluoreszenzfarbstoffes an Lysine des Antikörpers durchgeführt. Die Konjugation erfolgte mit zweifach molarem Überschuss von CypHer 5E mono N HS ester (Batch 357392, GE Healthcare) bei pH 8, 3. Nach erfolgter Kupplung wurde die Reaktionsmischung gelchromatographisch aufgereinigt (Zeba Spin Desalting Columns, 40K, Fa. Thermo Scientific, No. 87768; Elutionspuffer: DULBECCO ^'S PBS, Fa. Sima-Aldrich, No. D8537), um überschüssigen Farbstoff zu eliminieren und den pH-Wert zu adjustieren. Die Ankonzentrierung der Proteinlösung erfolgte mittels VIVASPIN 500 Säulen (Fa Sartorius stedim biotec). Die Bestimmung der dye load des Antikörpers erfolgte mittels spektrophotometrischer Analyse (Fa. NanoDrop) und anschließender Berechnung

(D: P = Adye□ protein :(A280"0, 16Adye)üdye). Die dye load der hier untersuchten Antikörpern sowie der Isotyp-Kontrolle lagen in vergleichbarer Größenordnung. In Zellbindungs-Assays wurde getestet, dass die

Kupplung zu keiner Affinitätsänderung der Antikörper führte. Die markierten Antikörper wurden im Internalisierungs-Assays eingesetzt. Vor dem Behandlungsstart wurden Zellen (2x10 ⁴/well) in 100μΙ_ Medium in einer 96-MTP ausgesät (fat, black, clear bottom No 4308776, Fa. Applied Biosystems). Nach 18h Inkubation bei 37°C/5%CC>2 wurde das Medium gewechselt und markierte Antikörper in variierender Konzentration hinzugefügt (10, 5, 2.5, 1 , O.^g/mL). Das gleiche Behandlungsschema erfolgte mit der markierten Isotyp-Kontrolle (negative Kontrolle). Die gewählten

Inkubationszeiten waren Oh, 0,25h, 0,5h, 1 h, 1 ,5h 2h, 3h, 6h and 24h. Die Fluoreszenz- Messung wurde mit Hilfe des InCellAnalyzer 1000 (Fa. GE Healthcare) durchgeführt. Es erfolgte eine kinetische Evaluierung über die Messung der Parameter granule counts/cell und totale granule intensity/cell.

Antikörper wurden nach Bindung an den Rezeptor auf ihre Internalisierungsfähigkeit hin untersucht. Hierzu wurden Zellen mit verschiedenen Expressionsleveln des Rezeptors gewählt. Es konnte Target-vermittelte spezifische Internalisierung mit den im Rahmen der Erfindung beschriebenen Antikörpern beobachtet werden, wohingegen die Isotyp- Kontrolle keine Internalisierung zeigte.

C-3 In vitro Tests zur Bestimmung der Zell-Permeabilität

Die Zell-Permeabilität einer Substanz kann mittels in v/ ^'iro-Testung in einem Flux-Assay unter Verwendung von Caco-2-Zellen untersucht werden [M.D. Troutman und D.R.

Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]. Hierzu wurden die Zellen auf 24-Loch- Filterplatten für 15-16 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz in einem HEPES-Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC (Agilent 1200, Böblingen, Deutschland) unter Verwendung von reverse phase-Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Quadropol-Massen- spektrometer API 4000 (AB SCIEX Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp-Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als aktiv transportiert klassifiziert, wenn das Verhältnis von P _app (B-A) zu P _apP (A-B) (efflux ratio) >2 oder <0.5 war. Von entscheidender Bedeutung für Toxophore, die intrazellulär freigesetzt werden, sind die Permeabilität von B nach A [P _a (B-A)] und das Verhältnis von P _a (B-A) zu P _a (A-B) (efflux ratio): Je niedriger diese Permeabilität ist, desto langsamer sind die aktiven und passiven Transportvorgänge der Substanz durch die Monoschicht von Caco-2-Zellen. Gibt das efflux ratio zudem keine Hinweise auf aktiven Transport, kann die Substanz nach intrazellulärer Freisetzung länger in der Zelle verweilen. Damit steigt auch die Zeit, die für eine Interaktion mit dem biochemischen Target (hier: Kinesin-Spindelprotein, KSP / Eg5) zur Verfügung steht.

In der folgenden Tabelle 4 sind Permeabilitätsdaten repräsentativer Ausführungsbeispiele aus diesem Assay aufgeführt:

Tabelle 4

Die Metabolite M1 , M2 und M3, die aus den erfindungsgemäßen ADCs aus diversen Beispielen gebildet werden, zeigen sowohl einen sehr niedrigen Transport aus der Zelle als auch eine geringe Efflux-Ratio. Der Metabolit M4 zeigt beispiehaft ein anderes Profil.

C-4 In vitro Tests zur Bestimmung der Substrateigenschaften für P-Glycoprotein

Viele Tumorzellen exprimieren Transporterproteine für Wirkstoffe, was häufig mit einer Resistenzentwicklung gegenüber Cytostatika einhergeht. Substanzen, die keine Substrate von solchen Transporterproteinen wie beispielsweise P-Glycoprotein (P-gp) oder BCRP sind, könnten somit ein verbessertes Wirkprofil aufzeigen.

Die Substrateigenschaften einer Substanz für P-gp (ABCB1 ) wurden mittels eines Flux- Assays unter Verwendung von LLC-PK1 -Zellen, die P-gp überexprimieren (L-MDR1 - Zellen), bestimmt [A.H. Schinkel et at., J. Clin. Invest. 96, 1698-1705 (1995)]. Hierzu wurden die LLC-PK1 - oder L-MDR1 -Zellen auf 96-Loch-Filterplatten für 3-4 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz allein oder in Gegenwart eines Inhibitors (wie z.B. Ivermectin oder Verapamil) in einem HEPES-Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC unter Verwendung von reverse phase-Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Quadropol- Massenspektrometer API 4000 (Applied Biosystems Applera, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp-Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als P-gp-Substrat klassifiziert, wenn das Efflux-Verhältnis P _apP (B-A) zu P _apP (A-B) >2 war.

Als weitere Kriterien zur Bewertung der P-gp-Substrateigenschaften können die Efflux- Verhältnisse in L-MDR1 - und LLC-PK1 -Zellen oder das Efflux-Verhältnis in An- oder Abwesenheit eines Inhibitors miteinander verglichen werden. Wenn sich diese Werte um mehr als einen Faktor 2 unterscheiden, so handelt es sich bei der betreffenden Substanz um ein P-gp-Substrat.

C-5 Pharmakokinetik

C5a: Identifizierung der ADC-Metabolite nach Internalisierung in vitro

Methodenbeschreibung:

Internalisierungsuntersuchungen mit Immunkonjugaten werden durchgeführt, um intrazellulär entstandene Metaboliten zu analysieren. Hierzu werden humane

Lungentumorzellen NCI H292 (3x10 ⁵/well) in 6-well Platten ausgesät und über Nacht inkubiert (37 °C, 5% C0 ₂). Es erfolgt eine Behandlung mit 10 g/mL (66 nM) des zu untersuchenden ADCs. Die Internalisierung wurde bei 37 °C und 5% CO2 durch geführt. Zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 4, 24, 48, 72h) werden Zellproben zur weiteren Analyse genommen. Zunächst werden die Überstände (ca. 5 ml_) geerntet und nach erfolgter Zentrifugation (2 min, RT, 1000 rpm Heraeus Variofuge 3.0R) bei -80°C gelagert. Die Zellen werden mit PBS gewaschen, mit Accutase abgelöst und die Zellzahl bestimmt. Nach erneutem Waschen wird eine definierte Zellzahl (2x10 ⁵) mit 100 ml_ Lysis Puffer (Mammalian Cell Lysis Kit (Sigma MCL1 ) versetzt und unter ständigem Schütteln

(Thermomixer, 15min, 4°C, 650 rpm) in Protein LoBind tubes (eppendorf Cat.No. 0030 108.1 16) inkubiert. Nach der Inkubation wird das Lysat zentrifugiert (10min, 4°C, 12000g, eppendorf 5415R) und der Überstand geerntet. Der gewonnene Überstand wird bei -80 °C gelagert. Alle Proben werden anschließend wie folgt analysiert.

Die Messung der Verbindungen im Kulturüberstand bzw. Zellysat erfolgt nach Fällung der Proteine mit Methanol oder Acetonitril durch eine Hochdruck-Flüssigkeits- Chromatographie (HPLC) gekoppelt an ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (MS).

Zur Aufarbeitung von 50 μί Kulturüberstand/Zelllysat werden diese mit 150 μί

Fällungsreagenz (Methanol) versetzt und für 10 Sekunden geschüttelt. Das

Fällungsreagenz enthält einen internen Standard (ISTD) in geeigneter Konzentration (in der Regel im Bereich 20-100 g/L). Nach dem 10minütigen Zentrifugieren bei 1881 g wird der Überstand in ein Autosampler-Vial überführt, mit 300 μΙ_ eines auf das Laufmittel abgestimmten Puffers aufgefüllt und erneut geschüttelt und 10 min bei 1881 g zentrifugiert. Die Messung der Zelllysat- und Überstandsproben erfolgt schließlich an dem mit einer HPLC gekoppelten Triple-Quadrupol-Massenspektrometer API4500 der Firma AB SCIEX Deutschland GmbH.

Zur Kalibrierung wird Leerlysat bzw. Leerüberstand mit entsprechenden Konzentrationen (0.1 - 1000 g L) versetzt. Die Nachweisgrenze (LLOQ) liegt bei ca. 0.2 μg L.

Qualitätskontrollen zur Gültigkeitsprüfung enthalten 4 und 40 μg L.

C5b: Identifizierung der ADC-Metabolite in vivo

Nach i.v. Applikation von 10 mg/kg verschiedener erfindungsgemäßer Konjugate in Xenograft Mäuse können 24h nach Applikation dieser Konjugate, die Plasma-, Tumor-, Leber- und Nierenkonzentrationen des Antikörpers sowie potentiell auftretender

Metabolite gemessen werden. Unter C-6 ist eine genauere Methodenbeschreibung bezüglich der Xenograft Modelle zu finden. Hier soll nur auf die

Metabolitenkonzentrationen der erfindungsgemäßen Konjugate eingegangen werden. Die Messwerte der Metabolite in den genannten Matrizes geben darüber Aufschluss, wie stark die Belastung mit Metabolit in Plasma, Niere und Leber ausgeprägt ist im Vergleich zur Belastung im Tumor.

Analytik zur Quantifizierung der potentiell auftretenden Metabolite Die Messung der Verbindungen in Plasma, Tumor, Leber und Niere erfolgt nach Fällung der Proteine mit in der Regel Methanol durch eine Hochdruck-Flüssigkeits- Chromatographie (HPLC) gekoppelt an ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (MS).

Zur Aufarbeitung von 50 μί Plasma werden diese mit 150 μί Fällungsreagenz (in der Regel Methanol) versetzt und für 10 sec geschüttelt. Das Fällungsreagenz enthält einen internen Standard (ISTD) in geeigneter Konzentration (in der Regel im Bereich 20-100 μg L). Nach dem 10minütigen Zentrifugieren bei 1881 g wird der Überstand in ein

Autosampler-Vial überführt, mit 300 μΙ_ eines auf das Laufmittel abgestimmten Puffers aufgefüllt und erneut geschüttelt.

Bei der Aufarbeitung von Tumor- oder Organmaterial wird das jeweilige Material mit der 3- 20 fachen Menge an Extraktionspuffer versetzt. Der Extraktionspuffer enthält 50 mL Tissue Protein Extraction Reagent (Pierce, Rockford, IL), zwei Pellets Complete- Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) und Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma, St. Louis, MO) in einer finaler Konzentration von 1 mM. Je nach Gewebetyp (hart: Tumor; weich: Leber, Niere) wird das Lyse und

Homogeniserungsprogramm des Prescellys 24 Lysis and Homogenization Gerätes (Bertin Technologies) ausgewählt (www.prescellys.com). Die homogenisierten Proben werden über Nacht bei 4°C stehen gelassen. 50 μί des Homogenats werden in ein Autosampler- Vial überführt und mit 150 μί Methanol inklusive ISTD aufgefüllt und 10 sec geschüttelt und darauf 5 min stehen gelassen. Nach Zugabe von 300 μί Ammoniumacetat Puffer (pH6.8) und kurzem Schütteln wird die Probe 10min bei 1881 g zentrifugiert.

Zur Kalibrierung wird für Plasmaproben Plasma und für Gewebeproben entsprechende Leermatrix mit Konzentrationen von 0.6 - 1000 μg L versetzt. Die Nachweisgrenze (LOQ) liegt je nach Probentyp bzw. Gewebetyp zwischen 1 und 20 μg L. Die Messung der Plasma und Matrixproben erfolgt schließlich an dem mit einer HPLC gekoppelten Triple-Quadrupol-Massenspektrometer API6500 der Firma AB SCIEX Deutschland GmbH.

Qualitätskontrollen zur Gültigkeitsprüfung enthalten 4, 40 und 400 μg L.

C-6 Wirksamkeitstest in vivo

Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Konjugate wurde in vivo beispielsweise mittels Xenograft-Modellen getestet. Der Fachmann kennt Methoden im Stand der Technik, anhand derer die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen getestet werden kann (siehe z.B. WO 2005/08171 1 ; Polson et al., Cancer Res. 2009 Mar 15;69(6):2358- 64). Beispielsweise wurde hierzu Nagern (z.B. Mäusen) eine Tumorzelllinie, welche das Zielmolekül des Binders exprimiert, implantiert. Anschließend wurde den Implantat-Tieren entweder ein erfindungsgemäßes Konjugat, ein Isotyp-Antikörper-Kontrollkonjugate oder ein Kontrollantikörper oder isotonische Salzlösung appliziert. Die Applikation erfolgte einmalig oder öfter. Nach einer Inkubationszeit von mehreren Tagen wurde die

Tumorgröße im Vergleich von Konjugat-behandelten Tieren und der Kontrollgruppe bestimmt. Die Konjugat-behandelten Tiere zeigten eine geringere Tumorgröße.

C-6a. Wachstumshemmung / Regression von experimentellen Tumoren in der Maus

Humane Tumorzellen, die das Antigen für das Antikörper-Wirkstoffkonjugat exprimieren, werden subkutan in die Flanke von immunsupprimierten Mäusen inokuliert, beispielsweise NMRi Nude- oder SCID-Mäuse. 1 -10 Millionen Zellen werden aus der Zellkultur abgelöst, zentrifugiert und mit Medium oder Medium / Matrigel resuspendiert. Die Zellsuspension wird unter die Haut der Maus gespritzt.

Innerhalb von einigen Tagen wächst ein Tumor heran. Die Behandlung beginnt nach Etablierung des Tumors, ungefähr bei einer Tumorgröße von 40 mm ². Um die Wirkung auf größere Tumoren zu untersuchen, kann die Behandlung auch erst bei einer Tumorgröße von 50-100 mm ² begonnen werden. Die Behandlung mit APDCs und ADCs erfolgt über die intravenöse (i.v.) Route in die Schwanzvene der Maus. Das ADC wird mit einem Volumen von 5 ml_ / kg appliziert.

Das Behandlungsschema richtet sich nach der Pharmakokinetik des Antikörpers. Als Standard wird drei Mal in Folge jeden vierten Tag behandelt. Bei langsam wachsenden Tumoren bietet sich eine wöchentliche Behandlung an. Für eine zeitnahe Beurteilung kann sich auch ein Schema mit einer Einmalbehandlung eignen. Die Behandlung kann aber auch weiter fortgesetzt werden oder es kann sich zu einem späteren Zeitpunkt ein zweiter Zyklus mit drei Behandlungstagen anschließen.

Standardmäßig werden 8 Tiere pro Behandlungsgruppe eingesetzt. Neben den Gruppen, die die Wirksubstanzen bekommen, wird eine Gruppe als Kontrollgruppe nur mit dem Puffer nach dem gleichen Schema behandelt.

Im Verlauf des Experiments wird die Tumorfläche regelmäßig mit einer Schieblehre in zwei Dimensionen (Länge / Breite) gemessen. Die Tumorfläche wird mittels Länge x Breite bestimmt. Der Vergleich der mittleren Tumorfläche der Behandlungsgruppe mit der Kontrollgruppe wird als T/C area angegeben.

Werden alle Gruppen des Experimentes nach Behandlungsende gleichzeitig beendet, können die Tumore entnommen und gewogen werden. Der Vergleich der mittleren Tumorgewichte der Behandlungsgruppe mit der Kontrollgruppe wird als T/C weight angegeben.

C-6b. Wirksamkeit der anti-TWEAKR-APDCs in verschiedenen Xenograftmodellen

Die Tumorzellen (z.B. KU-19-19, NCI-H292, SCC4) werden subkutan in die Flanke von weiblichen NMRI-nude oder NOD.SCID Mäusen (Janvier) inokuliert. Bei einer

Tumorgröße von -40 mm ² wird intravenös mit dem Antikörper-Wirkstoffkonjugat behandelt. Im Anschluss an die Behandlung wird das Tumorwachstum ggf. weiterverfolgt.

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