штамм-продуцент растворимой формы рекомбинантного хепсина человека (HPNTM ^A ).

область техники.

изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для производства рекомбинантной сериновой протеазы хепсин для применения в здравоохранении, в частности для диагностирования и лечения рака предстательной железы.

предшествующий уровень техники.

в настоящее время рак предстательной железы (рпж) - одно из наиболее распространенных опухолевых заболеваний у мужчин, частота которого напрямую связана с возрастом: так, начиная с 45 лет, заболеваемость рпж растет в геометрической прогрессии и у мужчин в возрасте 70 лет и выше встречается более чем у 60%.

в связи с этим стоит задача выбора из общей массы потенциальных маркеров рпж тех, которые обладают наиболее высокой прогностической ценностью и специфичностью и могут быть использованы в клинической практике без усложнения методики использования при диагностике и существенного ее удорожания.

из уровня техники известно, что таким маркером может служить хепсин (1). хепсин представляет собой сериновую протеазу, которая не экспрессируется клетками здоровой предстательной железы, но присутствует в значительном количестве на поверхности клеток рпж. это обстоятельство позволяет с высокой степенью достоверности использовать хепсин в диагностике и лечении заболевания (2). другая важная особенность хепсина связана с его ферментативной активностью, обуславливающей его роль в процессе онкогенеза опухоли предстательной железы. в экспериментальных данных было показано, что при использовании моноклональных антител для связывания хепсина на поверхности клеток, значительно уменьшалась способность опухоли к метастазированию (3). следовательно, тест, основанный на определении именно этой его функции (ферментативной) наиболее полно характеризует стадию заболевания и развитие опухолевого процесса.

раскрытие изобретения.

для решения поставленной задачи использования хепсина для диагностики рпж и стадии этого заболевания необходимо создание штамма-продуцента растворимого

хепсина, поскольку из него предусмотрено последующее получение белка в активной форме.

из уровня техники не известен штамм-продуцент хепсина, но на сегодняшний день в мире получена полноразмерная форма неактивного рекомбинантного хепсина с глутатион-с-трансферазой (аbпоvа, кат Na H00003249-P01). данный продукт используется в качестве концентрационного стандарта при постановке методик ифа и вестерн-блот. однако он не является активной формой белка и не пригоден для осуществления ферментативных реакций специфичных для полноценного хепсина и соответственно не применим для диагностики рпж.

штамм-продуцент E. CoIi, несущий плазмидную днк pHPNTM ^"A со встроенным геном, кодирующим хепсин человека, получен методом кальциевой трансформации клеток BL21 (DEз)CodonPlusRIL. штамм-продуцент депонирован во всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (вкпм) под NsB-10098

условия хранения.

штамм может храниться без потери полезных свойств при температуре -70 ° с в среде следующего состава: 1% бакто-триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% NaCl, pH 7,0,

15% глицерина, 7% дмсо не менее 6 месяцев с обязательным пересевом не реже одного раза в 2 месяца.

культурально-морфологические признаки штамма.

клетки представляют собой короткие (длина 1-3 мкм, ширина 0,5-0,8 мкм) полиморфные подвижные грамотрицательные палочки, не образующие спор.

на мясопептонном бульоне дают обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легкоразбивающийся. образуют пристеночное кольцо, пленка на поверхности бульона обычно отсутствует. на мясопептонном агаре колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой. на среде эндо образуют плоские красные колонии средней величины с темным металлическим блеском.

физиолого-биохимические свойства.

факультативный аэроб. температурный диапазон роста - 18-38°C. оптимальная температура роста 37°C. растет при значениях рн среды - 5,0-8,0. оптимум рн роста - 6,5-7,5. отрицательная реакция фогис-параскау; положительная реакия на образование индола; отрицательная реакция на образование сероводорода; отрицательная реакция на цитрат; отрицательная реакция на образование малоната; отрицательная реакция на образование мочевины; положительная реакция на лизиндекарбоксилазу; отрицательная реакция на орнитин; положительная реакция на газообразование; отрицательная реакция на синтез лактозы; положительная реакция на расщепление маннита.

вид E. CoIi, к которому отнесен штамм BL21(DEз)CodonPlusRIL (Strаtаgеп, U. S. раtепt No. 6,706,525), не числится в качестве патогенного в «пoлoжeнии о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения*, отсутствует в списках патогенных бактерий по положению минздрава и в списках патогенных бактерий в оffiсiаl Jоurпаl оf thе European Communities NC 217/3237, 24.08.92.

характеристика штамма:

семейство епtеrоbасtеriасеае;

род еsсhеriсhiа;

вид еsсhеriсhiа соli; происхождение рrоtоgепе; источник выделения - желудочно-кишечный тракт крупного рогатого скота; генотип: E. соli в F ^" отрт hsdS(r _в ^~ mв ^~ ) dcm ⁺ теf даl λ(DEз) епdа нtе [аrдU HeY lеиW Cam ^r ]; биотехнологическая характеристика.

штамм-продуцент содержит плазмидную днк , полученную на основе вектора pET28a

на фиг.1 представлена физическая карта плазмиды pHPNTM ^"Ai , нуклеотидная и аминокислотная последовательности.

общие сведения о клонированном фрагменте, размер и включенные в его состав гены

включенные в состав гены: внеклеточная часть хепсина (5128 bр - 6246 bр), сайт разрезания тромбином (5464 bр - 5481 bр),

6 нis-tаg (5089 bр - 5106 bр), сайт разрезания фактором X (5107 bр - 5127 bр) генетическая карта клонированного фрагмента (размер - 1175 bр): Nсоl

5051 атGGGсаGсс GсGGтаGсса тсатсатсат

тасссGтсGG сGссатсGGт аGтаGтаGта 5101 сатсасаGсG стаGсаттGа GGGтсGтссG стGтасссаG

тGсаGGтсаG

GтаGтGтсGс GатсGтааст сссаGсаGGс GасатGGGтс асGтссаGтс 5151 стстGсGGас GстсGGстса тGGтстттGа сааGасGGаа

GGGасGтGGс

GаGасGсстG сGаGссGаGт ассаGаааст GттстGсстт ссстGсассG 5201 GGстGстGтG стсстсGсGс тссаасGсса GGGтаGссGG

астсаGстGс

ссGасGасас GаGGаGсGсG аGGттGсGGт сссатсGGсс тGаGтсGасG 5251 GаGGаGатGG GсттсстсаG GGсастGасс састссGаGс

тGGасGтGсG

стсстстасс сGааGGаGтс ссGтGастGG GтGаGGстсG асстGсасGс 5301 аасGGсGGGс GссаатGGса сGтсGGGстт сттстGтGтG

GасGаGGGGа

ттGссGсссG сGGттассGт GсаGсссGаа GааGасасас стGстсссст 5351 GGстGсссса сасссаGаGG стGстGGаGG тсатстссGт

GтGтGаттGс

ссGасGGGGт GтGGGтстсс GасGасстсс аGтаGаGGса сасастаасG

5401 сссаGаGGсс GTTTCTTGGC сGссатстGс сааGастGтG

GссGсаGGаа

GGGтстссGG саааGаассG GсGGтаGасG GттстGасас сGGсGтсстт 5451 GстGсссGтG GасстGGтGс сGсGсGGсаG сGтGGGаGGс

сGGGасасса

сGасGGGсас стGGассасG GсGсGссGтс GсассстссG GссстGтGGт 5501 GсттGGGссG GтGGссGтGG сааGтсаGсс ттсGстатGа

тGGаGсасас

сGаасссGGс сассGGсасс GттсаGтсGG ааGсGатаст асстсGтGтG

ваmнI

5551 CTCTGTGGGG GATCCCTGCT CTCCGGGGAC TGGGTGCTGA CAGCCGCCCA

GAGACACCCC CTAGGGACGA GAGGCCCCTG ACCCACGACT GTCGGCGGGT

5601 TTGCTTCCCG GAGCGGAACC GGGTCCTGTC CCGATGGCGA GTGTTTGCCG

AACGAAGGGC CTCGCCTTGG CCCAGGACAG GGCTACCGCT CACAAACGGC

Pstl

5651 GTGCCGTGGC CCAGGCCTCT CCCCACGGTC TGCAGCTGGG

GGTGCAGGCT

CACGGCACCG GGTCCGGAGA GGGGTGCCAG ACGTCGACCC CCACGTCCGA

5701 GTGGTCTACC ACGGGGGCTA TCTTCCCTTT CGGGACCCCA

ACAGCGAGGA

CACCAGATGG TGCCCCCGATAGAAGGGAAA GCCCTGGGGT TGTCGCTCCT 5751 GAACAGCAAC GATATTGCCC TGGTCCACCT CTCCAGTCCC

CTGCCCCTCA

CTTGTCGTTG CTATAACGGG ACCAGGTGGA GAGGTCAGGG GACGGGGAGT 5801 CAGAATACAT CCAGCCTGTG TGCCTCCCAG CTGCCGGCCA

GGCCCTGGTG

GTCTTATGTA GGTCGGACAC ACGGAGGGTC GACGGCCGGT CCGGGACCAC 5851 GATGGCAAGA TCTGTACCGT GACGGGCTGG GGCAACACGC

AGTACTATGG

CTACCGTTCT AGACATGGCA CTGCCCGACC CCGTTGTGCG TCATGATACC

аvаl

5901 ссаасаGGсс GGGGтастсс аGGаGGстсG аGтссссата атсаGсаатG

GGттGтссGG ссссатGаGG тсстссGаGс тсаGGGGтат таGтсGттас

5951 атGтстGсаа тGGсGстGас ттстатGGаа ассаGатсаа GсссааGатG

тасаGасGтт ассGсGастG ааGатасстт тGGтстаGтт сGGGттстас

аvаl

6001 ттстGтGстG GстассссGа GGGтGGсатт GатGсстGсс аGGGсGасаG

ааGасасGас сGатGGGGст сссассGтаа стасGGасGG тсссGстGтс

6051 CGGTGGTCCC TTTGTGTGTG AGGACAGCAT CTCTCGGACG

CCACGTTGGC

GCCACCAGGG AAACACACAC TCCTGTCGTA GAGAGCCTGC GGTGCAACCG 6101 GGCTGTGTGG CATTGTGAGT TGGGGCACTG GCTGTGCCCT

GGCCCAGAAG

CCGACACACC GTAACACTCA ACCCCGTGAC CGACACGGGA CCGGGTCTTC

6151 CCAGGCGTCT ACACCAAAGT CAGTGACTTC CGGGAGTGGA

TCTTCCAGGC

GGTCCGCAGA TGTGGTTTCA GTCACTGAAG GCCCTCACCT AGAAGGTCCG

6201 CATAAAGACT CACTCCGAAG CCAGCGGCAT GGTGACCCAG CTCTGA

GTATTTCTGA GTGAGGCTTC GGTCGCCGTA CCACTGGGTC GAGACT

аминокислотная последовательность:

mgsrgshhhhhhsаsiеgrрlурvqvssаdаrlmvfdktеgtwrllсs srsпаrvаglsсееmgflrаlthsеldvrtаgап gtsgffсvdеgrlрhtqrllеvisvсdсрrgrflааiсqdсgrrklрv dlvрrgsvggrdtslgrwрwqvslrуdgаhlсggsllsgdwvlt ааhсfреmr/lsrwrvfаgаvаqаsрhglqlgvqаvvуhggуlрfr dрпsеепsпdiаlvhlssрlрltеуiqрvсlрааgqаlvd gkiсtvtgwgпtqууgqqаgvlqеаrvрiisпdvспgаdfуgпqik рkmfсаgуреggidасqgdsggрfvсеdsisrtрrwrlсg ivswgtgсаlаqkрgvуtkvsdfrеwifqаikthsеаsgmvtql

продуцируемое полезное вещество - внеклеточный фрагмент хепсина, трансмембранной сериновой протеазы Il типа.

обладает всеми характерными признаками сериновых протеаз, гидролизует пептидную связь по аргинину в положении Lуs P ₂ рз аrg I, где P ₂ - предпочтительно аsп, Lеu или тhr, P ₃ предпочтительно Lуs или GIn (4).

- уровень продуктивности 20%

пример осуществления изобретения.

плазмидная днк pHPNTM ^"A , несущая ген, кодирующий хепсин человека, создана в соответствии с представленной на рис 1 картой и заданными нуклеотидной и аминокислотной последовательностями с использованием стандартных методов молекулярной биологии известных из научно-технической литературы (5). полученную плазмиду, содержащую ген HPNTM ^"A , трансформировали в клетки е.соli штамма BL21 (DEз)CodonPlus RIL

проводили аналитическую экспрессию целевого белка с использованием химического индуктора. для этого колонии е.соli, несущие ген целевого белка,

выращивали на жидкой питательной среде LB с антибиотиком в пробирках в течение 15+2 часов при температуре 37° с при постоянном покачивании в качалке. добавляли 0.5 мл в колбы объемом 250 мл, содержащие 50 мл жидкой среды LB с антибиотиком. растили при температуре 37° с при постоянном покачивании до оптической плотности 0.5+0.1 (OD540). затем добавляли химический индуктор - иптг (изопропил-β-D- тиогалактопиранозид) и наращивали далее в течение 3 часов. биомассу собирали центрифугированием в пластиковых пробирках на 50 мл (центрифуга OпH-8, 4.000 об/мин 8 минут).

проводили электрофоретический анализ клеточного белка в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. для этого к аликвоте клеток 10 мг добавляли 40 мкл воды, перемешивали на встряхивателе и добавляли 40 мкл 2x буфера для образцов для белкового денатурирующего электрофореза. образец прогревали при 95° с в течение 4 минут и наносили на денатурирующий гель с концентрацией акриламида 12%. после проведения электрофоретического разделения гель промывали дистиллированной водой, после чего окрашивали краской, содержащей краситель кумасси. избыток краски отмывали раствором, содержащим этанол и уксусную кислоту.

анализ наличия целевого белка проводили визуально, сравнивая набор клеточных белков в неиндуцированных клетках и клетках, индуцированных иптг. для определения молекулярной массы полученного целевого белка использовали набор белков с известными молекулярными весами.

проводили анализ количества целевого белка по отношению к общему клеточному белку. для этого гель сканировали на сканере ерsоп 1660 рhоtо. полученное изображение обрабатывали с помощью программы опеdsсап.

результаты экспрессии показывают высокий уровень синтеза целевого белка, целевой белок составляет не менее 20% от общего клеточного белка (в среднем составляет 20-25%).

источники информации:

1. Lеуtus SP, Lоеb KR, Hagen FS, кurасhi к, Dаviе EW. а поvеl trурsiп-likе sеriпе рrоtеаsе (hерsiп) with а рutаtivе trапsmеmbrапе dоmаiп ехрrеssеd bу humап livеr апd hераtоmа сеlls. вiосhеmistrу. 1988;27(3): 1067-74.

2. Tanimoto H, Yan Y, сlаrkе J, Korourian S, Shigеmаsа к, раrmlеу TH, раrhаm GP, о'вriеп TJ. Hерsiп, а сеll surfасе sеriпе рrоtеаsе idепtifiеd iп hераtоmа сеlls, is оvеrехрrеssеd iп оvаriап сапсеr. сапсеr Rеs. 1997;57(i4):2884-7.

3. хuап JA, Sсhпеidеr D, тоу P, Liп R, Nеwtоп а, Zhu Y, Fiпstеr S, Vоgеl D, мiпtzеr в, Diпtеr H, Light D, раrrу R, роlоkоff M, Whitlоw M, Wu Q, раrrу G. апtibоdiеs пеutrаliziпg

hерsiп рrоtеаsе асtivitу dо поt imрасt сеll grоwth but iпhibit iпvаsiоп оf рrоstаtе апd оvаriап tumоr сеlls iп сulturе. сапсеr Rеsеаrсh 2006;66(7):3611-9.

4. неrtеr S, рiреr DE, Aaron W, Gаbгiеlе T, сutlеr G, сао P, вhаtt AS ₁ сhое Y, сrаiк CS, Wаlкеr N, Meininger D, ноеу T, Austin RJ. нераtосуtе grоwth fасtоr is а рrеfеrrеd iп vitrо substrаtе fоr humап hерsiп, а mеmbrапе-апсhоrеd sеriпе рrоtеаsе imрliсаtеd iп рrоstаtе апd оvаriап сапсеrs. вiосhеmistrу Jоurпаl 2005;390(Pt 1): 125-36.

5. моlесulаr сlопiпg: а Lаbоrаtоrу шпua\(Third еditiоп) By Jоsерh Sаmbrоок, реtеr массаllиm, Dаvid Rиssеll