CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención divulga un procedimiento para la síntesis de ésteres etílicos de ácidos grasos, también conocidos como biodiesel (FAEE en sus siglas en inglés) a partir de glicerina o glicerol. Por tanto la presente invención puede englobarse dentro del campo de las biorefinerías industriales. ESTADO DE LA TÉCNICA

La glicerina cruda o glicerol es un subproducto del proceso de fabricación de biodiesel en las biorefinerías industriales. La principal función del biodiesel es su utilización como combustible en sustitución de los combustibles derivados del petróleo, debido a los problemas inherentes que genera el uso de combustibles derivados del petróleo, en cuanto a contaminación, efecto invernadero y calentamiento global, existiendo así la necesidad de una fuente renovable del petróleo que, además, pueda producirse económicamente.

En este sentido, el biodiesel puede ser utilizado en la mayoría de los motores de combustión interna diesel, ya sea en forma pura, lo que se conoce como "biodiesel limpio", o como una mezcla a cualquier concentración con combustible diesel derivado de petróleo. El biodiesel ofrece ventajas frente a los derivados diesel del petróleo, incluyendo, la reducción de emisiones de gases durante su combustión, además de ser capaz de mantener un ciclo de dióxido de carbono equilibrado, ya que se basa en el uso de materiales biológicos renovables, es biodegradable y da mayor seguridad debido a su alto punto de inflamación y baja inflamabilidad.

Otra ventaja es el menor desgaste de los motores, gracias a las buenas propiedades de lubricación que presenta.

Uno de los usos a los que se puede dedicar la glicerina que se obtiene como subproducto en la producción de biodiesel es, la propia obtención de biodiesel mediante un proceso alternativo que comprende utilizar dicha glicerina (glicerol) como sustrato en procesos fermentativos bacterianos.

El biodiesel se obtiene principalmente, a partir de aceites vegetales o grasas animales, mediante procesos industriales de esterificación y transesterificación (Figura 1) (Karmakar A., et al 2010). La glicerina formada en el proceso de obtención de biodiesel industrial, en un desecho industrial del que hay que deshacerse debido, al bajo coste del mismo, en los últimos años. Actualmente, una de las preocupaciones más importantes en el campo de las biorefinerías industriales, es como dar salida a este subproducto que está causando un gran impacto negativo a nivel económico y medioambiental en dichas empresas. Una planta de biodiesel de origen vegetal que genere alrededor de 250.000 toneladas de biodiesel/año, produce un 10% de glicerina, es decir, unas 25.000 toneladas/año de glicerina. Deshacerse de dicho subproducto implica unos enormes gastos, como por ejemplo, el transporte del mismo para, eventualmente, proceder a su posterior comercialización. Ante esta situación, el desarrollo de procesos biotecnológicos encaminados a la conversión de la glicerina cruda en productos de alto valor añadido, es una "necesidad". Estos procesos biotecnológicos podrían incorporarse en plantas de biodiesel ya existentes, donde se procesaría in situ la glicerina generada como subproducto de la fabricación de dicho biodiesel, o dar lugar a biorefinerías que integren múltiples procesos, en un concepto análogo al utilizado para las refinerías industriales, las cuáles producen múltiples combustibles y productos a partir del petróleo. Desde hace años se han venido utilizado diferentes cepas bacterianas, principalmente de la especie Escherichia coli, para la producción de FAEE, lográndose avances significativos en el entendimiento de la vía de la síntesis de lípidos y su regulación en bacterias. Dicha regulación se ha presentado, en el pasado, como el principal factor limitante para la utilización de bacterias o plantas como "fábricas" de aceites o combustibles. Vaneechoutte M. et al, describen que para producir FAEE a partir de E. coli, es necesaria la esterificación del etanol producido en el metabolismo de la síntesis de dichos FAEE con los restos acilo unidos a la Coenzima A, mediante la sobre-expresión de la enzima sintetasa de triacilgliceroles y ceras (Atfl) de Acinetobacter baylyi (Atsumi S, et al. 2008). Dicha cepa de E. coli transformada, es capaz de producir concentraciones de FAEE de 1.3 g/L con un rendimiento de producción de 0.018 g/(L/h) en presencia de glucosa y ácido oleico (Atsumi S, et al. 2008). En este mismo sentido,

Kalscheuer R. et al, demostraron que mediante la expresión heteróloga en E. coli de las enzimas piruvato decarboxilasa (Pdc) y alcohol deshidrogenasa (AdhB) de Zymomonas mobilis y la sintetasa inespecífica (Atfl) de Acinetobacter cepa baylyi ADP1, se consigue la producción de FAEE (Kalscheuer R. et al 2008). Dicha síntesis del etanol se combinó con la posterior esterificación del mismo con los restos de acilo del Coenzima A de ácidos grasos cuando las bacterias se cultivaban en condiciones aeróbicas, en presencia de glucosa y ácido oleico.

La solicitud de patente internacional WO201 1/038134, divulga también la producción de biodiesel a partir de organismos bacterianos modificados genéticamente. Dicha solicitud internacional muestra ejemplos de bacterias E. coli capaces de producir biodiesel gracias a la expresión o sobreexpresión de un gen que codifica para una tioesterasa, de un gen que codifica para una Acil-CoA sintetasa y de un gen que codifica para una éster-sintasa. El biocombustible generado por las bacterias descritas en dicha solicitud internacional está compuesto principalmente por ácidos grasos lineales de número par de carbonos, en promedio, el 50% de los mismos, con una insaturación.

Otros autores también han divulgado la producción de biocombustibles a partir de la conversión de glicerol en etanol por medio de diferentes cepas de E. coli modificadas genéticamente con el propósito de producir dichos biocombustibles (Shams Yazdani S. et al 2008; da Silva GP. et al. 2009; Choi WJ. 2008). Otras especies bacterianas, también han sido modificadas genéticamente para la producción de dicho biocombustible mediante la transformación de glicerol en etanol. Por ejemplo, cepas mutantes de Klebsiella pneumoniae, obtenidas mediante irradiación γ y transformadas con los genes pdc y adhll obtenidos de Z. mobilis y que sobre-expresan las enzimas pdc y adh, respectivamente, muestran una producción de etanol a partir de glicerol de 25 g/L (Oh BR. et al, 2011). Hasta la fecha, las principales cepas bacterianas utilizadas para la síntesis de FAEE a partir de glicerol han sido cepas patógenas (o potencialmente patógenas), como por ejemplo, Z. mobilis y E. coli, como se ha comentado previamente.

La finalidad de la obtención de dichas cepas bacterianas, capaces de sintetizar FAEE a partir de glicerol, es que dichas cepas sean capaces de secretar al exterior los FAEE sintetizados. En este sentido y como se ha comentado previamente, las principales cepas bacterianas utilizadas hasta este momento en el estado de la técnica para la obtención de FAEE, son principalmente bacterias patógenas (Z. mobilis y E. coli ), por lo que, una vez sintetizado el FAEE, las bacterias remanentes que queden en el medio, al ser tóxicas, pueden constituir un problema de manejo de residuos tóxicos, ya que, por ejemplo, E. coli es la responsable de la contaminación entérica de aguas de consumo (coliformes).

La presente invención describe un método de producción de biodiesel (FAEE) a partir de glicerina como fuente de carbono, mediante la transformación de bacterias no patógenas, del género Bacillus, con diferentes genes mutados sintéticos heterólogos, implicados en la síntesis de dichos FAEE. Las bacterias del género Bacillus están aprobadas para consumo en humanos y son utilizadas a gran escala en la industria como biofactorías para la producción de diferentes enzimas y proteínas (Westers et al. 2004). Más específicamente, la invención divulga bacterias de la especie Bacillus subtilis transformadas con genes mutados sintéticos heterólogos, diseñados específicamente para aumentar su expresión en las bacterias de dicha especie. En este sentido, se han aislado los genes de las enzimas piruvato descarboxilasa (pdc) (SEQ ID NO: 1) y alcohol deshidrogenasa (adhB) (SEQ ID NO: 3) pertenecientes a Zymomonas mobilis, además de la porción activa de la enzima tioesterasa A ('tesA) (SEQ ID NO: 5) de Escherichia coli y la sintetasa de triacilgliceroles y ceras {atfl) (SEQ ID NO: 7) de Acinetobacter sp. ADP1. A partir de las secuencias de dichos genes, se han obtenido los correspondientes genes mutados sintéticos de las enzimas pdc (SEQ ID NO: 2), adhB (SEQ ID NO: 4), 'tesA (SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 17) y atfl (SEQ ID NO: 8), con los que se ha transformado a las bacterias B. subtilis descritas en la presente invención. Además, para clonar dichos genes en un plásmido de expresión, para que posteriormente se expresen en B. subtilis, se adicionaron, en los extremos de sus secuencias mutadas sintéticas, secuencias que codifican para sitios de enzimas de restricción específicas, así como la secuencia de unión al ribosoma (rbs), para así favorecer la expresión de los mismos en B. subtilis, dando lugar a las secuencias SEQ ID NO: 18 para el gen pdc, SEQ ID NO: 19 para el gen adhB, SEQ ID NO: 20 o 21, respectivamente, para el gen 'tes A y SEQ ID NO: 22 para el gen atfl, respectivamente. Además, para incrementar el rendimiento en la producción de biodiesel mediante las bacterias descritas en la presente invención, se puede sobre-expresar, en las mismas, al menos uno de los propios genes de B. subtilis que codifican para las enzimas acil- CoA sintetasas (IcfA, yhfL e yhfT) (E.C. 6.2.1.3) y para las cuatro subunidades de la enzima acetil-CoA carboxilasa (accDABC) (E.C. 6.4.1.2). Es interesante indicar que, además, las bacterias del género B. subtilis son capaces de crecer utilizando glicerol como única fuente de carbono y energía.

Al mismo tiempo, la utilización de las cepas descritas en la invención para la síntesis de FAEE a partir de glicerina, presentan las siguientes ventajas:

• A nivel de procesos en general (habilidad para consumir sustratos, masa celular máxima alcanzable, rendimientos, etc), B. subtilis es tanto o más eficiente que E. coli (Westers et al, 2004).

• B. subtilis no es patógena y de hecho se utiliza como probiótico para animales de consumo humano. Además, los FAEE serían secretados fuera de la célula y las bacterias remanentes, en lugar de constituir un problema de manejo de residuos tóxicos, tendrían valor agregado, mientras que E. coli o K. pneumoniae no podrían utilizarse para tal fin, al ser patógenas.

• La ruta de síntesis de ácidos grasos en B. subtilis permite manipular con relativa sencillez modificaciones en la metilación omega-terminal de los FAEE, lo que puede llevar a la producción de biocombustibles con distintas o mejores propiedades que los FAEE lineales sintetizados habitualmente, como por ejemplo la producción de ácidos grasos ramificados y totalmente saturados. • B. subtilis secreta eficientemente enzimas hidrolíticas, como glucanasas, amilasas, lipasas, celulasas, etc, lo que permite adaptar dicha bacteria para la degradación de otros compuestos baratos, como fuentes de carbono, que no son asimilables directamente por E. coli u otros organismos.

· Las modificaciones genéticas, propuestas en la presente invención, son muy estables en B. subtilis ya que la sencilla integración, de dichas modificaciones en distintos lugares de su genoma hace innecesario el uso de plásmidos replicativos.

Por lo tanto, para resolver el problema del exceso de glicerina derivada de los procesos de producción de biodiesel, junto con la necesidad de obtener un biocombustible que no presente, como se ha mencionado anteriormente, tantas desventajas como los combustibles derivados del petróleo, la presente invención describe cepas de la especie B. subtilis capaces de incrementar la producción de biodiesel a partir del propio subproducto, glicerina, como fuente de carbono, al estar transformadas con genes mutados sintéticos heterólogos, capaces de inducir una expresión más eficiente en B. subtilis, obtenidos en base a los genes: pdc (SEQ ID NO: 1) y adhB (SEQ ID NO:3) originarios de Z. mobilis, 'tesA (SEQ ID NO:5) originario de E. coli y atfl (SEQ ID NO:7) originario de Acinetobacter sp. ADP1. Adicionalmente, las cepas de la presente invención, sobre-expresan al menos uno de los genes de los complejos enzimáticos ACC (acetil- CoA carboxilasa) (E.C. 6.4.1.2) y acil CoA sintetasa (E.C. 6.2.1.3). La presente invención describe a su vez el uso de dichas cepas para la síntesis de biodiesel y un método de obtención de biodiesel, a partir de glicerina como fuente de carbono, basado en el uso de dichas cepas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Breve descripción de la invención

Para solventar los problemas expuestos anteriormente, la presente invención describe cepas bacterianas de la especie B. subtilis, preferentemente las cepas CECT 7968, CECT 7969 y NCIMB 42026, que han sido transformadas con genes mutados sintéticos heterólogos optimizados para una expresión más eficiente en B. subtilis y que además, para incrementar el rendimiento en la producción de biodiesel mediante el uso de dichas cepas bacterianas, sobre- expresan al menos uno de los propios genes bacterianos que codifican para los complejos enzimáticos ACC (E.C. 6.4.1.2) y acil CoA sintetasa (E.C. 6.2.1.3), dando lugar así, a una mayor producción de biodiesel a partir del propio subproducto, glicerina, como fuente de carbono. Dichos genes codifican para enzimas implicadas en el metabolismo lipídico bacteriano, especialmente en la síntesis de lípidos a partir de glicerina como fuente de carbono. Por otro lado, los genes sintéticos mutados heterólogos, con los que son transformadas las bacterias B. subtilis de la presente invención son: pdc (SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO.18) y adhB (SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO: 19) obtenidos a partir de los genes pdc (SEQ ID NO: 1) y adhB (SEQ ID NO:3) de Z. mobilis, 'tesA (SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NOs: 20- 21) obtenido a partir del gen ^' tesA (SEQ ID NO: 5) de E. coli y atfl (SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 22) obtenido a partir del gen atfl (SEQ ID NO: 7) de Acinetobacter sp. ADP1. Adicionalmente, las cepas bacterianas descritas en la presente invención, sobre-expresan, al menos uno de los genes que codifican para los complejos enzimáticos ACC (acetil-CoA carboxilasa) (E.C. 6.4.1.2) y acil CoA sintetasa (E.C. 6.2.1.3).

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al uso de las cepas descritas anteriormente, preferentemente las cepas CECT 7968, CECT 7969 y NCIMB 42026, para la producción de biodiesel a partir de glicerina como fuente de carbono. Otro objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de biodiesel, a partir de glicerina como fuente de carbono, mediante la utilización de las cepas bacterianas descritas en la presente invención (CECT 7968, CECT 7969 y NCIMB 42026). La composición del biodiesel así producido puede ser utilizado como un combustible diesel solo, o mezclado con diesel de petróleo de acuerdo a las proporciones habituales, lo que resulta en perfiles de emisión más limpios.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición de combustible, incluyendo, por ejemplo, una composición de diesel, que comprende un éster graso producido por un método o un microorganismo genéticamente modificado según se describe en la presente invención. En ciertas realizaciones, la composición del combustible comprende además uno o más aditivos de combustible adecuados. El combustible obtenido mediante el procedimiento descrito en la presente invención haciendo uso de las cepas CECT 7968, CECT 7969 y NCIMB 42026, está formado preferentemente por etil-ésteres de ácidos grasos ramificados y totalmente saturados, de número impar de carbonos, siendo preferentemente dichos etil-ésteres de ácidos grasos: iso-C15 (13-metilltetradecanoico), anteiso-C15:0 (12-metiltetradecanoico), n-C15:0 (n- pentadecanoico); iso-C17:0 (15-metilhexadecanoico), anteiso-C17:0 (14-metilhexadecanoico) y n-C17:0 (n-heptadecanoico). El combustible obtenido mediante el procedimiento descrito previamente también puede estar formado por etil-ésteres de ácidos grasos ramificados de número par de carbonos (aunque este tipo de ácidos grasos son minoritarios), siendo preferentemente dichos etil-ésteres: iso-C16:0 (14-metilpentadecanoico), n-C16:0 (n- hexadecanoico), iso-C18:0 (16-metilheptadecanoico) y n-C18:0 (n-octadecanoico); según se describe, para ambos casos (etil-ésteres de numero impar o par de carbonos), en el Ejemplo 3.

Salvo disposición en contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia, a la que pertenece esta invención.

Como se usa aquí, el término "biodiesel" es un biocombustible que puede ser un sustituto del diesel derivado del petróleo. El biodiesel puede ser utilizado en motores de combustión interna diesel, ya sea en forma pura, lo que se conoce como "limpio", o como una mezcla de cualquier concentración con diesel derivado de petróleo. En una realización, el biodiesel puede incluir ésteres o hidrocarburos, tales como aldehidos, aléanos o alquenos. El término "biocombustible" se refiere a cualquier tipo de combustible derivado de biomasa o fuentes biológicas, en general. Los biocombustible s pueden sustituir a los combustibles basados en petróleo. Por ejemplo, los biocombustible s incluyen todos los combustibles de transporte (por ejemplo, la gasolina, diesel, jet fuel, etc), los combustibles para calefacción, y los combustibles para generar electricidad. Los biocombustibles son una fuente de energía renovable.

El término "fuente de carbono" se refiere a un sustrato o compuesto adecuado para ser utilizado como suministrador de átomos de carbono para el crecimiento de las células procariotas o eucariotas simples. Las fuentes de carbono pueden ser de varias formas, incluyendo, sin carácter limitativo, a ácidos grasos orgánicos, como por ejemplo el succinato, lactato y acetato, los polímeros, los hidratos de carbono, ácidos, alcoholes, aldehidos, cetonas, aminoácidos, péptidos y gases (por ejemplo, CO y C0 ₂ ). Los mismos también incluyen, por ejemplo, diversos monosacáridos como la glucosa, fructosa, mañosa y galactosa; oligosacáridos, como los fructo- oligosacáridos y galacto-oligosacáridos, polisacáridos como xilosa y arabinosa, disacáridos, tales como sacarosa, maltosa y turanosa; material celulósico, como la metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio, ésteres de ácidos grasos saturados o insaturados, alcoholes, tales como glicerol, metanol, etanol, propanol, o mezclas de los mismos. La fuente de carbono también puede ser un producto de la fotosíntesis, incluyendo, sin carácter limitativo, a la glucosa. A efectos de la presente invención, una fuente de carbono preferida es el glicerol o glicerina.

A efectos de la presente invención, el término "elemento promotor", "promotor", o "secuencia promotora" se refiere a una secuencia de ADN que funciona como un interruptor que activa la expresión de un gen, gracias a su interacción con la ARN polimerasa. Si el gen se activa, se dice que se transcribe o participa en la transcripción. La transcripción implica la síntesis de ARNm del gen. Un promotor, por lo tanto, actúa como elemento regulador de la transcripción y también proporciona un sitio para la iniciación de la transcripción del gen en ARNm. En función del nivel de expresión, los promotores se pueden agrupar en promotores fuertes o débiles. Un promotor fuerte es aquel que, por poseer una gran afinidad por la ARN polimerasa, permite formar una gran cantidad de ARN que, en última instancia, se traducirá en proteínas (cuando su expresión esté permitida). Por el contrario, un promotor débil posee una baja afinidad por la ARN polimerasa, y en consecuencia, bajo su control la expresión del gen es mucho menor. En función del mecanismo de control, los promotores se pueden clasificar en promotores constitutivos o regulables. Se dice que un promotor es constitutivo cuando permite que la expresión del gen o genes que están bajo su control se dé de forma continua. Por el contrario, los promotores regulables sólo permiten la expresión de los genes que controlan cuando su producto es esencial. Pueden ser inducibles si sólo permiten la expresión del gen o genes que regulan tras un estímulo determinado (en presencia de las condiciones de inducción), y reprimibles, cuando la expresión de los genes bajo su control es continua y sólo se detiene tras un determinado estímulo o bajo determinadas condiciones (bajo las condiciones de represión).

A efectos de la presente invención, los términos "glicerina" y "glicerol" son sinónimos y se usan indistintamente.

A efectos de la presente invención, se describe el término "reguión" como un grupo de genes regulados por el mismo factor de transcripción. Los genes regulados pueden estar agrupados, caso de los operones, o dispersos a lo largo del genoma. A efectos de la presente invención se define el término "operón" como una unidad genética funcional formada por un grupo o complejo de genes que se transcriben a partir de un mismo promotor y su expresión está coordinada por los mismos sistemas.

A efectos de la presente invención se define el término "heterólogo" relativo a genes, proteínas, tejidos, células, etc, como perteneciente a un individuo de un género o especie diferente a la del individuo del que se aisla.

A efectos de la presente invención el término "célula u organismo hospedador" o "célula u organismo huésped", se refiere a una célula u organismo que puede ser modificada genéticamente para expresar, sobre-expresar o infra-expresar, genes específicos seleccionados. Ejemplos no limitativos de células u organismos huésped incluyen células vegetales, animales, humanas, bacterianas o fúngicas. Las células huésped preferidas en la presente invención son células bacterianas.

A efectos de la presente invención, el término "sobre-expresar" o "sobre-expresión" hace referencia a un nivel de expresión o concentración mayor de un ácido nucleico, polipéptido, proteína, enzima, hidrato de carbono, grasa, hidrocarburo, etc, en una célula dada en comparación con el nivel de expresión o concentración de dicho ácido nucleico, polipéptido, proteína, enzima, hidrato de carbono, grasa, hidrocarburo, en el mismo tipo de célula pero perteneciente a un fenotipo silvestre. Por ejemplo, un polipéptido puede ser "sobre-expresado" en una célula huésped recombinante cuando el polipéptido está presente en una concentración mayor que en la célula no recombinante de la misma especie.

Como se usa aquí, el término "polipéptido recombinante" se refiere a un polipéptido que es producido por técnicas de ADN recombinante, donde por lo general, el ADN o ARN que codifica el polipéptido expresado se inserta en un vector de expresión adecuado que a su vez es utilizado para transformar una célula huésped para producir el polipéptido o ARN.

El término "genes imitados" se refiere a la introducción de mutaciones en la región codificante de los genes con la finalidad de incrementar la producción proteica. Los criterios usados para llevar a cabo las mutaciones se describen en el Ejemplo 2 de la presente invención.

A efectos de la presente invención se define el término "sintético" referido a secuencias génicas o proteicas obtenidas artificialmente mediante procedimientos de ingeniería genética. El término "comprende" o "que comprende", a lo largo de toda la descripción de la patente presente, significa la presencia de las características, elementos, números enteros, etapas o componentes, especialmente, secuencias de ADN o secuencias proteicas, que se mencionan en las reivindicaciones, pero que no excluye la presencia o adición de una o más de otras características, elementos, números enteros, etapas, componentes, secuencias o grupos de los mismos. El término "comprende" o "que comprende" pretende incluir también realizaciones abarcadas por los términos "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" . Asimismo, el término "consiste esencialmente en" se pretende que incluya formas de realización comprendidos por el término "que consiste en" . El término "variante" utilizado en la presente invención se entiende como una secuencia de nucleótidos de los genes descritos en la presente invención o incluso como una secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido, codificado por las secuencias de nucleótidos mencionadas anteriormente, modificadas en uno o más de sus nucleótidos o incluso aminoácidos. A efectos de la presente invención, el término variante se refiere preferentemente a una modificación de uno o más nucleótidos en una secuencia génica dada. La variante puede tener cambios "conservativos", en los que el nucleótido o aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares al nucleótido o aminoácido sustituido. La variante también puede tener cambios "no-conservativos" o una deleción y/o inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos. A efectos de la presente invención, la variante, preferentemente, es una variante conservativa. Una "variante funcional" a efectos de la presente invención se entiende como una variante que retiene la capacidad funcional de la secuencia de nucleótidos o de amino ácidos originales sin modificaciones o mutaciones y de la cual deriva. A efectos de la presente invención, las variantes polinucleotídicas o polipeptídicas son variantes funcionales que presentan la misma función que las secuencias originales sin modificaciones o mutaciones, de las que derivan.

A efectos de la presente invención, el término aditivo, se refiere a una sustancia química agregada a un producto para mejorar sus propiedades y asegurar el correcto funcionamiento de los motores. Descripción de las Figuras

Figura 1. Esquema de la síntesis de biodiesel a partir de aceites vegetales y/o grasas animales.

Figura 2. Diagrama de las rutas metabólicas modificadas en B. subtilis para incrementar la síntesis de biodiesel a partir de glicerina. Los genes que se muestran dentro de cuadrados (pdc, adhB, 'tes A y atfl) son los genes mutados sintéticos heterólogos, que pertenecen a especies diferentes a B. subtilis y, que se han obtenido de forma sintética, optimizando el uso de codones específicos para incrementar la expresión de dichos genes en B. subtilis. Los genes que aparecen incluidos en una elipse (accDABC, IcfA, yhfL y yhfT), son los genes propios presentes en B. subtilis que, alternativamente, pueden sobre-expresarse en dichas bacterias, mediante promotores específicos para incrementar y potenciar la producción de biodiesel. glpF: facilitador de glicerol; glpT: transportador de glicerol-3P; glpK: glicerol kinasa; glpD: glicerol-3P deshidrogenasa; pdc: piruvato decarboxilasa; adhB: alcohol deshidrogenasa; atfl : sintetasa de ceras-triacilglicéridos; pdh: piruvato deshidrogenasa; accDABC: acetil-CoA carboxilasa; fabD: malonil-CoA:ACP transferasa; lcfA,yhfL,yhfT : acil-CoA sintetasas. Descripción detallada de la invención

La presente invención describe cepas bacterianas de la especie B. subtilis, preferentemente las cepas CECT 7968, CECT 7969 y NCIMB 42026, capaces de producir biodiesel (FAEE) a partir de glicerina como fuente de carbono. Dichas cepas bacterianas de la especie B. subtilis, están transformadas con un vector de expresión que expresa el plásmido pNAKA62 (en las cepas CECT 7968 y CECT 7969) o pNAKA143 (en la cepa NCIMB 42026), que portan los genes mutados sintéticos heterólogos: pdc (SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 18 o variantes de las mismas) y adhB (SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 19 o variantes de las mismas) originarios de Z. mobilis, 'tesA (SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NOs: 20-21 o variantes de las mismas) originario de E. coli y atfl (SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 22 o variantes de las mismas) originario de Acinetobacter sp. ADPl, bajo el control de un promotor inducible. En el caso de la presente invención, dicho promotor es el promotor Pspac, inducible mediante isopropil- -D-tiogalactósido (IPTG). Mencionar que, a efectos de la presente invención, puede utilizarse cualquier promotor inducible o constitutivo conocido en el estado de la técnica para el mismo fin. Además, las bacterias CECT 7968 CECT 7969 y NCIMB 42026, descritas en la presente invención, sobre-expresan al menos uno de los genes que codifican para las enzimas ACC (E.C. 6.4.1.2) y Acil CoA sintetasa (E.C. 6.2.1.3), potenciando así la síntesis de biodiesel a partir de glicerol, ya que dichos genes son expresados en muy poca (ACC) o nula cantidad (Acil CoA sintetasa) en la fase exponencial del crecimiento bacteriano.

La producción de biodiesel a partir de glicerina, como fuente de carbono y mediante el uso de las cepas bacterianas CECT 7968, CECT 7969 y NCIMB 42026 descritas en la presente invención, ha sido llevada a cabo mediante diferentes estrategias capaces de modificar el metabolismo de las mismas, produciendo un incremento en la síntesis y concentración de ácidos grasos junto con un incremento en la síntesis de etanol. Dichos incrementos tienen como resultado final la síntesis de biodiesel, a partir del propio subproducto, glicerina, como fuente de carbono. Las cepas bacterianas CECT 7968, CECT 7969 y NCIMB 42026 presentan un incremento en la síntesis de ácidos grasos y etanol gracias a la transformación de las mismas con el vector de expresión pDR67 que porta el plásmido pNAKA62 o el plásmido pNAKA143, ambos capaces de expresar, como hemos mencionado anteriormente, los cuatro genes mutados sintéticos heterólogos: SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 18 o variantes de las mismas, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO: 19 o variantes de las mismas, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NOs: 20-21 o variantes de las mismas y SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 22, o variantes de las mismas, y además, alternativamente, dichas cepas, mediante la transformación de las mismas con un vector que porta un plásmido capaz de sobre-expresar al menos uno de los genes del complejo enzimático ACC (E.C. 6.4.1.2) y/o acil CoA sintetasa (E.C. 6.2.1.3), aumentan el rendimiento en la producción de dicho biodiesel.

Los genes que se muestran en la Figura 2 dentro de cuadrados (pdc, adhB, 'tes A y atfl) son los genes mutados sintéticos heterólogos, que pertenecen a especies diferentes a B. subtilis y, que se han obtenido de forma sintética, optimizando el uso de codones específicos para este organismo. Por otro lado, los genes que aparecen incluidos en una elipse (accDABC, IcfA, yhfl, y yhfT) en dicha Figura 2, son los genes que, alternativamente, pueden sobre-expresarse en dichas bacterias, mediante promotores específicos, como por ejemplo, promotores inducibles por IPTG (Pspac o Pspachy) y/o promotores fuertes y constitutivos (Pacp), para incrementar y potenciar la producción de biodiesel. Dichos promotores facilitan e incrementan la producción de biodiesel gracias al incremento en la expresión de los genes de los complejos ACC (E.C. 6.4.1.2) y acil- CoA sintetasa (E.C. 6.2.1.3), durante la fase exponencial del crecimiento de B. subtilis, ya que su expresión es baja, en el caso del complejo accDABC, o nula, en el caso del complejo acil-CoA sintetasas.

Como se ha comentado previamente, el incremento en la síntesis y concentración de ácidos grasos producido mediante la modificación de las rutas metabóhcas de las cepas de la invención, es consecuencia de la expresión del gen mutado sintético heterólogo que codifica para la enzima ^' tesA (SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NOs: 20-21 o variantes de las mismas) originario de E. coli. Dicha enzima cataliza la hidrólisis de la unión tioéster entre grupos acilos y la proteína transportadora de acilos (ACP). En este sentido, cepas de E. coli que expresan el dominio catalítico de dicha enzima sintetizan gran cantidad de ácidos grasos debido a la disminución de la retroalimentación negativa que los acil-ACPs ejercen sobre la sintetasa de ácidos grasos (FAS). Así, las cepas de la presente invención, expresan el dominio catalítico mutado de la tioesterasa ^' tesA de E. coli (SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 17 o variantes de las mismas), mediante la optimización del uso de codones específicos para las bacterias B. subtilis. Además, para clonar dichos genes en un plásmido de expresión, para que posteriormente se expresen en B. subtilis, se adicionaron en los extremos de las SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 17, secuencias que codifican para sitios de enzimas de restricción específicas, así como la secuencia de unión al ribosoma, dando lugar a las SEQ ID NO: 20 y 21, respectivamente. A efectos de la presente invención, es necesario poner de manifiesto, que pueden utilizarse cualquier secuencia específica de otras enzimas de restricción diferentes a las utilizadas en la presente invención, para el mismo fin. Por otro lado, para potenciar y aumentar el rendimiento en la síntesis de dichos ácidos grasos, las cepas bacterianas descritas en la presente invención, pueden sobre- expresar el complejo enzimático ACC y a su vez, para potenciar e incrementar el rendimiento en la síntesis de biodiesel, también pueden sobre-expresar el complejo enzimático acil-CoA ligasa. Ambos complejos se sobre-expresan mediante la transformación de las mismas con vectores de expresión que portan plásmidos bajo el control de promotores fuertes y constitutivos específicos, como por ejemplo el promotor Pacp-accDABC para la sobre-expresión de la acil CoA carboxilasa (ACC) o promotores inducibles, como es el caso del promotor Pspac o Pspachy, inducibles en presencia de IPTG.

El ciclo de elongación de los ácidos grasos en B. subtilis, en particular, es llevado a cabo por la sintetasa de ácidos grasos (FAS). Brevemente, la isoforma FabF de la sintetasa de ácidos grasos, cataliza la condensación de malonil-ACP con el acil-ACP para producir la elongación del ácido graso, la isoforma FabG reduce el cetoácido formado, la isoforma FabZ cataliza la deshidratación del hidroxiácido y finalmente la isoforma FabI (y eventualmente FabL) reduce el doble enlace formado, generando un nuevo acil-ACP con dos carbonos más que al comenzar el ciclo. El complejo enzimático FAS, descrito en la Figura 2, se puede sobre-expresar en las cepas de B. subtilis de la presente invención para incrementar el rendimiento en la síntesis de biodiesel a partir de glicerina como fuente de carbono. Dicha sobre-expresión puede llevarse a cabo mediante diferentes estrategias. Una de dichas estrategias implica la eliminación del represor global de la síntesis de ácidos grasos, el FapR (fapR ), lo que implica una actividad FAS, en B. subtilis 5 veces mayor que en cepas que poseían dicho represor (fapR ⁺ ) (Schujman,G.E. et al. 2003). Otra de las estrategias que pueden utilizarse es la sobre-expresión del complejo enzimático ACC (E.C.6.4.1.2). Dicho complejo cataliza la síntesis de malonil-CoA a partir de acetil-CoA. En E. coli la sobre-expresión de este complejo aumenta en más de 10 veces la actividad FAS, siempre que se eliminen los acil-ACPs de cadena larga formados, mediante, por ejemplo, la expresión del gen ^" tesA (Davis, M.S. et al. 2000). Las cepas de la presente invención, pueden para incrementar el rendimiento en la síntesis de biodiesel, sobre-expresar los genes que comprenden dicho complejo enzimático ACC (accD, accA, accB y accC). Para ello, se ha construido un operón sintético, accDABC, que comprende los cuatro genes en conjunto, mientras que en las bacterias silvestres sin transformar, se encuentran los operones accDA y accBC, por separado. El operón sintético accDABC obtenido, se incluyó en el plásmido pGES468 bajo el control de un promotor que como hemos mencionado anteriormente, puede ser fuerte y constitutivo, como por ejemplo el promotor Yacp-accDABC, o inducible como el Pspac- accDABC, en presencia de por ejemplo, IPTG, aunque puede utilizarse cualquier promotor conocido en el estado de la técnica. Además, para la eliminación de los acilACPs de cadena larga formados por las cepas descritas en la presente invención, las mismas, expresan el gen mutado heterólogo ^' tesA (SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 17 o SEQ ID Nos: 20-21 o variantes de las mismas). El incremento en la síntesis de etanol, producido por las cepas descritas en la presente invención, se ha obtenido mediante la expresión de los genes mutados sintéticos heterólogos que codifican para las enzimas pdc (SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 18 o variantes de las mismas) y adhB (SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 19 o variantes de las mismas) de Z. mobilis. A partir de acetil-CoA, dichas enzimas, pdc y adhB, generan acetaldehído y posteriormente etanol. Los genes pdc y adhB de la especie bacteriana Z. mobilis han sido empleados exitosamente para transformar bacterias Gram negativas, como por ejemplo E. coli (Kalscheuer, R., et al,. 2006). Por lo tanto, mediante el incremento de la concentración de etanol y de acil-CoAs, así como la expresión del gen mutado sintético heterólogo Atfl (SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 22 o variantes de las mismas), las cepas descritas en la presente invención son capaces de esterificar el etanol sintetizado junto con los restos acilo unidos a la acil-CoA dando lugar a la producción de biodiesel a partir de glicerina, obtenida como subproducto del proceso de fabricación de biodiesel en biorefinerías, como fuente de carbono (ver Figura 2). Depósito de microorganismos según el tratado de Budapest

Los microorganismos utilizados en la presente invención fueron depositados en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) sita en el Edificio de Investigación de la Universidad de Valencia, Campus Burjassot, Burjassot 46100 (Valencia, España), con n° de depósito:

CECT 7968 depositada el 23 de Junio de 2011, que comprende en su genoma las construcciones: thrC: :lacI-Pspachy-lcfA amyE: :Pspac-pdc-adh-atfl-'tesA.

CECT 7969 depositada el 23 de Junio de 2011, que comprende en su genoma las construcciones: thrC: :lacI-Pspachy-yhfL amyE: :Pspac-pdc-adh-atfl-'tesA.

El otro microorganismo utilizado en la presente invención se ha depositado el 10 de

Agosto de 2012 en la National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB), sita en el Edificio Ferguson, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA (Reino Unido), con el n° de depósito NCIMB 42026, comprendiendo en su genoma las construcciones : thrC: :lacI-Pspachy-yhfL amyE: :Pspac-pdc-adh-atfl-'tesA.

Uno de los objetos de la presente invención se refiere a una construcción génica que comprende al menos los genes seleccionados entre SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 22, o variantes de las mismas, junto con un promotor. En una realización preferida, la construcción génica descrita en la presente invención comprende al menos los genes seleccionados entre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 8, o variantes de las mismas, junto con un promotor.

En otra realización más preferida, la construcción génica descrita aquí comprende al menos los genes seleccionados entre SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, o variantes de las mismas, junto con un promotor.

En una realización preferida de la presente invención, la construcción génica se caracteriza por que además comprende al menos una de las secuencias nucleotídicas o variantes de las mismas, que codifican para al menos uno de los genes que forman los complejos enzimáticos Acil CoA sintetasa (E.C.6.2.1.3) y/o ACC (E.C.6.4.1.2) seleccionados entre: IcfA, yhfL, yhfl ¹ , accD, accA, accB o accC y/o cualquiera de sus combinaciones. En otra realización preferida de la presente invención, la construcción génica se caracteriza por que dichos genes pertenecen a la especie bacteriana B. subtilis.

En otra realización preferida, la construcción génica descrita en la presente invención se caracteriza por que el promotor es inducible o constitutivo. El promotor inducible es preferentemente el promotor Pspac o el promotor Pspachy, inducibles por la adición en el medio de cultivo de isopropil- -D-tiogalactósido (IPTG). El promotor constitutivo es preferentemente el promotor Pacp. Cualquier otro promotor, bien inducible o constitutivo, conocido en el estado de la técnica para el mismo fin, puede ser también utilizado.

En otra realización preferida, la construcción génica descrita en la presente invención se caracteriza por que se selecciona de entre cualquiera de las siguientes: pNAKA62, pNAKA 143, pNAKA52, pNAKA53 y/o combinaciones de las mismas.

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere a un vector de expresión caracterizado por comprender las secuencias SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 4 o

SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 22 o variantes de las mismas.

En una realización preferida, el vector de expresión descrito en la presente invención, comprende al menos los genes seleccionados entre: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 8 o variantes de las mismas.

En otra realización más preferida, el vector de expresión descrito en la presente invención, comprende al menos los genes seleccionados entre SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 o variantes de las mismas.

En una realización preferida, el vector de expresión se caracteriza por que además comprende al menos una de las secuencias nucleotídicas o variantes de las mismas, que codifican para al menos uno de los genes que forman los complejos enzimáticos Acil CoA sintetasa (E.C.6.2.1.3) y/o ACC (E.C.6.4.1.2) seleccionados entre: lcfA, yhfL, yhfT, accD, accA, accB o accC y/o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida, el vector de expresión se caracteriza por que las secuencias nucleotídicas o variantes de las mismas, que codifican para al menos uno de los genes que forman los complejos enzimáticos Acil CoA sintetasa (E.C.6.2.1.3) y/o ACC (E.C.6.4.1.2) (IcfA, yhfL, yhfT, accD, accA, accB o accC) pertenecen a la especie bacteriana B. subtilis.

En otra realización preferida, el vector de expresión se caracteriza por que comprende al menos una de las construcciones génicas descritas en la presente invención.

En una realización preferida, el vector de expresión se caracteriza por que consiste en el plásmido pNAKA62. En otra realización preferida, el vector de expresión consiste en los plásmido pNAKA62 y pNAKA52. En otra realización preferida, el vector de expresión consiste en los plásmido pNAKA62 y pNAKA53.

En una realización preferida, el vector de expresión se caracteriza por que consiste en el plásmido pNAKA143. En otra realización preferida, el vector de expresión consiste en los plásmido pNAKA 143 y pNAKA53.

Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere a una célula hospedadora transformada con cualquiera de los vectores de expresión descritos previamente. En una realización preferida, la célula es preferentemente una célula bacteriana. En otra realización preferida, la célula es una célula bacteriana del género Bacillus, preferentemente de de la especie B. subtilis.

En otra realización preferida, la célula hospedadora se selecciona de entre cualquiera de las siguientes: CECT 7968 y/o CECT 7969 y/o NCIMB 42026. Otro de los objetos descritos en la presente invención, se refiere al uso de la/s célula/s

CECT 7968 y/o CECT 7969 y/o NCIMB 42026 descritas, para la producción de biocombustible, preferentemente, biodiesel.

Otro de los objetos de la presente invención se refiere a un método de producción de biocombustible que comprende cultivar las cepas bacterianas descritas en la presente invención en presencia de una fuente de carbono, en condiciones adecuadas.

En una realización preferida, el método descrito en la presente invención se caracteriza por que la fuente de carbono es glicerina, preferentemente glicerina como subproducto.

En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que comprende, además, el aislamiento del biocombustible producido. En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que el aislamiento del biocombustible se realiza mediante cualquier procedimiento disponible en la técnica usualmente aplicada en el sector, preferentemente se realiza mediante solventes orgánicos, como por ejemplo: hexano, acetato de etilo, etc.

En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que el biocombustible obtenido está compuesto por etil-ésteres de ácidos grasos ramificados y totalmente saturados.

En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que los etil- esteres de ácidos grasos son preferentemente: iso-C15 (13-metilltetradecanoico), anteiso-C15:0 (12-metiltetradecanoico), n-C15:0 (n-pentadecanoico); iso-C16:0 (14-metilpentadecanoico), n- C16:0 (n-hexadecanoico), iso-C17:0 (15-metilhexadecanoico), anteiso-C17:0 (14- metilhexadecanoico), n-C17:0 (n-heptadecanoico), iso-C18:0 (16-metilheptadecanoico) y n- C18:0 (n-octadecanoico).

En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que el biocombustible e s biodie sel .

En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que además comprende la adición de al menos un aditivo.

Otro de los objetos de la presente invención se refiere a una composición de biocombustible que comprende etil-ésteres de ácidos grasos ramificados y totalmente saturados.

En una realización preferida, la composición de la invención se caracteriza por que los etil-ésteres de ácidos grasos están formados por cadenas carbonadas y totalmente saturadas del tipo: ÍSO-C15 (13-metilltetradecanoico), anteiso-C15:0 (12-metiltetradecanoico), n-C15:0 (n- pentadecanoico); iso-C16:0 (14-metilpentadecanoico), n-C16:0 (n-hexadecanoico), iso-C17:0 (15-metilhexadecanoico), anteiso-C17:0 (14-metilhexadecanoico), n-C17:0 (n-heptadecanoico), iso-C18:0 (16-metilheptadecanoico) y n-C18:0 (n-octadecanoico).

En otra realización preferida, la composición de la invención se caracteriza por que es una composición de biodiesel y además puede comprender al menos un aditivo adecuado. Los ejemplos que se detallan a continuación tienen como objetivo ilustrar la invención sin limitar el alcance de la misma. Ejemplo 1. Caracterización del crecimiento de B. subtilis en medios conteniendo glicerol recuperado de distintos procesos industriales, como fuente de carbono.

Para corroborar que las bacterias B. subtilis crecen en presencia de glicerol o glicerina como fuente de carbono, se procedió a la cuantificación mediante un kit comercial del contenido en glicerol de dos muestras provenientes de procesos industriales. Una de las muestras provenía del procesamiento de aceite de soja (AS) y la otra provenía de descartes de aceites de frituras (AF). En ambos casos el contenido de glicerol (pureza) fue aproximadamente 50% (p/v), mientras que la glicerina comercial tiene un porcentaje de pureza del 87%. El aspecto del AS es más límpido que el aspecto del AF. Ambos aumentan marcadamente la turbidez de los medios acuosos, sugiriendo un importante remanente lipídico de ácidos grasos, fosfolípidos u otros productos orgánicos. El pH de ambos aceites es aproximadamente 9.

Se analizó, por tanto, la utilidad de ambas muestras como fuente de carbono y energía en cultivos de bacterias B. subtilis silvestres JH642 en medio de cultivo mínimo de Spizizen (SPI) formado por (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 2,0 g/1; KH ₂ P0 ₄ , 14,0 g/1; K ₂ HP0 ₄ , 6,0 g/1; Citrato de Na, 1,0 g/1; MgS0 7 H ₂ 0, 0,2 g/1. Suplementado con triptófano al 0,01 %, fenilalanina al 0,01 % y treonina 0,01% (concentraciones finales). Se utilizó como control glicerina comercial. El crecimiento de los cultivos de las bacterias B. subtilis silvestres JH642 no se pudo analizar directamente por medida de absorbancia, debido a la turbidez generada por las impurezas de las muestras comerciales. Por este motivo, se obtuvieron alícuotas del medio de cultivo y se centrifugaron antes de proceder a la medida de absorbancia, y se resuspendieron en medio fresco, agregando el mismo volumen centrifugado. Las bacterias crecidas en AS alcanzaron, con el tiempo, valores de crecimiento similares a los obtenidos para los cultivos de bacterias B. subtilis silvestres JH642 crecidas en glicerol, aunque la fase de latencia (período de tiempo durante el que el inoculo bacteriano se adapta a las condiciones del medio sobre el que se ha sembrado y efectúa se ajuste metabólico) fue mayor y la velocidad de crecimiento menor. En cambio, el crecimiento de bacterias B. subtilis silvestres JH642 en AF fue menor y a una velocidad muy baja, por lo que resultó una fuente menos adecuada para el crecimiento de bacterias B. subtilis silvestres. Por lo tanto, mediante el presente ejemplo, se pone de manifiesto que las cepas bacterianas silvestres de la especie B. subtilis son capaces de crecer en cultivos con glicerina cruda como única fuente de carbono. Ejemplo 2. Obtención de las cepas CECT 7968, CECT 7969 y NCIMB 42026 de la especie B. subtilis capaces de producir biodiesel a partir de glicerina como fuente de carbono.

Un inconveniente en la expresión de genes heterólogos en bacterias de la especie B. subtilis, es el distinto uso de codones de dicha especie bacteriana Gram positiva, respecto al uso de dichos codones por parte de otras especies bacterianas Gram negativas. Esto es así por la diferente disponibilidad de ARNt para cada codón en distintos organismos. Para resolver dicho inconveniente y maximizar la traducción de los genes mutados sintéticos heterólogos adhB (SEQ ID NO:4), /«fc (SEQ ID NO:2), ^' tesA (SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO: 17) y atfl (SEQ ID NO:8), todos ellos provenientes de bacterias Gram negativas, se han mutado las secuencias originales de dichos genes para potenciar una mayor y más estable expresión en B. subtilis.

Para ello, se ha determinado la frecuencia de utilización de codones en una serie de genes codificantes para proteínas ribosomales (rplA, rplJ con n° de acceso al GenBank: D50303.1; rplC, rplD, rplB, rpsC con n° de acceso al GenBank: U43929.1; rplF, rpsE con n° de acceso al GenBank: L47971.1; rpsD con n° de acceso al GenBank: S45404.1 y rpsG con n° de acceso al GenBank: D64127.1), los cuales son altamente expresados en B. subtilis. Una vez conocidos los codones más frecuentemente utilizados en la expresión de dicho genes en dicha especie bacteriana, se determinó, en las secuencias de los genes originales de interés: adhB (SEQ ID NO:3), pdc (SEQ ID NO: \), 'tesA (SEQ ID NO: 5) y atfl (SEQ ID NO: 7), los codones cuya frecuencia de uso fue menor a un 20%. Dichos codones que presentaron una frecuencia de expresión muy baja, fueron reemplazados por el codón de mayor uso encontrado en el análisis de la frecuencia de utilización de codones en los genes ribosomales de B. subtilis, siempre teniendo en cuenta que el nuevo codón introducido debe codificar para el mismo aminoácido que el codón al que sustituye, es decir, la sustitución de un codón por otro debe ser conservativa, no alterar en ningún momento la secuencia aminoacídica de la proteína final.

En este sentido y, como se ha comentado anteriormente, se obtuvieron las secuencias mutadas sintéticas heterólogas para cada uno de los genes de interés, siendo dichas secuencias la SEQ ID NO: 2 o variantes de la misma para el gen pdc, SEQ ID NO: 4 o variantes de la misma para el gen adhB, SEQ ID NO: 8 o variantes de la misma para el gen atfl y las SEQ ID Nos: 6 y 17 o variantes de las mismas para el gen ^' tes A. A efectos de la presente invención, en el presente ejemplo se describen cinco secuencias optimizadas para su expresión en B. subtilis, mediante el método descrito aquí, pero, pueden utilizarse, cualquier otra/s secuencia/s de dichos genes, obtenidas mediante el método de optimización aquí descrito, para su expresión estable e incrementada en B. subtilis, siempre que dicha optimización de la secuencia génica de origen codifique para la misma proteína, es decir, dicha optimización debe ser conservativa, no alterar en ningún momento la secuencia aminoacídica de la proteína final.

Una vez obtenidas las nuevas secuencias optimizadas de los cuatro genes heterólogos (SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 y 17 o variantes de las mismas), la síntesis in vi tro de los mismos fue realizada por la empresa Blue Heron Biotechnology (Bothell, USA) la cual proporcionó los genes mutados sintéticos heterólogos, cada uno clonado en el sitio Smal del vector derivado del Bluescript SK, al que se le eliminó el sitio de múltiple clonado. Para dicha clonación, se adicionó, en los extremos de cada una de las secuencias SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 y 17, o variantes de las mismas, secuencias extra que codifican para sitios de restricción para enzimas específicas, así como para la secuencia de unión al ribosoma (rbs). En la presente invención se han utilizado las secuencias de los sitios de restricción para las enzimas HindIII, BglII, BamHI, Xbal y Salí, entre otras, pudiéndose utilizar cualquier otra enzima de restricción conocida en el estado de la técnica para el mismo fin. Las secuencias optimizadas de los cuatro genes heterólogos sintéticos que, además comprenden en sus extremos, las secuencias con los sitios de restricción para las enzimas y la secuencia rbs son: SEQ ID NO: 18 o variantes de la misma para el gen pdc, SEQ ID NO: 19 o variantes de la misma para el gen adhB, SEQ. ID NOs. 20-21 o variantes de las mismas para el gen ^' tesA y SEQ ID NO: 22 o variantes de la misma para el gen atfl . Los vectores obtenidos fueron posteriormente utilizados para transformar bacterias competentes E. coli DH5a para conservar y amplificar los plásmidos.

Posteriormente se procedió al subclonado de los genes mutados sintéticos heterólogos, en el vector de expresión pDR67 (Ireton K, 1993), obteniéndose, por un lado, el plásmido pNAKA62 (pDR67 (HindIII/BglII) + pdc-adh-atfl- 'tesA), que contiene las secuencias mutadas heterólogas sintéticas de los cuatro genes de interés, pdc-adh-atfl- 'tesA (SEQ ID NO:2-SEQ ID

NO:4-SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:6, respectivamente) y por otro lado, el plásmido pNAKA143 (pDR67 (HindIII/BglII) + pdc-adh-atfl- 'tesA), que contiene las secuencias mutadas heterólogas sintéticas de los cuatro genes de interés, pdc-adh-atfl- 'tesA (SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:8-SEQ ID NO: 17, respectivamente). En ambos plásmidos, pNAKA62 y pNAKA143, los cuatro genes quedan bajo el control del promotor Yspac, inducible en presencia de isopropil-β-

D-tiogalactósido (IPTG) en el medio de cultivo, pero puede utilizarse cualquier otro plásmido conocido en es estado de la técnica para el mismo fin, bajo el control de un promotor inducible o constitutivo, en función de las exigencias del procedimiento. Además, dichos plásmidos pNAKA62 y pNAKA143, contienen la región inicial y final del gen amyE, flanqueando al operón y un cassette de resistencia para el antibiótico cloranfenicol. Mediante el uso del plásmido pNAKA62 se transformaron cepas silvestres JH642 de B. subtilis, obteniéndose la cepa denominada LN72 (JH642/pNAKA62). De la misma manera, mediante el uso del plásmido pNAKA143 se transformaron cepas silvestres JH642 de B. subtilis, obteniéndose la cepa denominada LN145 (JH642/pNAKA143). Se confirmó la inserción del plásmido en el locus amyE por pérdida de actividad amilasa de la cepa obtenida. Por tanto, dichas cepas LN72 y LN143 son capaces de expresar los genes sintéticos heterólogos pdc (SEQ ID NO:2), adh (SEQ ID NO:4), atfl (SEQ ID NO:8) y 'tesA (SEQ ID NO:6) en el caso de la cepa LN72 y los genes sintéticos heterólogos pdc (SEQ ID NO: 2), adh (SEQ ID NO: 4), atfl (SEQ ID NO:8) y 'tes A (SEQ ID NO: 17) en el caso de la cepa LN145, siendo así capaces de incrementar la síntesis de ácidos grasos y etanol, en presencia de glicerina como fuente de carbono y producir biodiesel.

Para incrementar el rendimiento en la síntesis de biodiesel mediante las cepas descritas en la presente invención, es recomendable sobre-expresar, al menos uno de los genes que forman el complejo acil-Co ligasas (E.C.6.2.1.3) así como el complejo ACC (E.C.6.4.1.2). Para la sobre- expresión de al menos uno de los genes del complejo enzimático acil-CoA ligasas (E.C.6.2.1.3), se eligieron los genes IcfA e yltfL. Brevemente, se amplificaron dichos genes mediante PCR utilizando como molde ADN cromosomal de la cepa silvestre de B. subtilis JH642 y como cebadores los definidos como SEQ ID NOs: 9-13. Para ello, se construyó el plásmido pNAKA60 subclonando el gen lacl, que codifica para el represor Lac, y el promotor Vspac^ en el vector pDG1731 (Guérout-Fleury AM., 1996). Dicho plásmido pNAKA60 contiene la región inicial y final del gen thrC, flanqueando a Iacl-Pspac ^hy y un cassette de resistencia para el antibiótico espectinomicina. A continuación, se subclonaron en dicho plásmido los genes IcfA e yltfL, codificantes para acil-CoA-ligasas, generándose los plásmidos pNAKA52 y pNAKA53, respectivamente. Con dichas construcciones, pNAKA52 y pNAKA53, se transformaron las cepas LN72, obteniéndose las cepas CECT 7968 y CECT 7969, respectivamente. De la misma manera, con la construcción pNAKA53 se transformaron cepas LN145, obteniéndose la cepa NCIMB 42026. Se confirmó la integración de dichos genes en el locus trhC por generación de auxotrofía para el aminoácido treonina, por lo que las cepas se han convertido en auxótrofas para dicho aminoácido. Además, los cuatro genes imitados sintéticos se expresan en el locus amyE, por lo que dichas cepas ya no pueden degradar almidón. Las cepas CECT 7968, CECT 7969 y NCIMB 42026, contienen, por lo tanto, los locus amyE y thrC con todos los genes necesarios para la biosíntesis de biodiesel bajo el control del promotor inducible por IPTG, Pspac, aunque como se ha comentado a lo largo de la presente invención, puede seleccionarse cualquier promotor, ya sea inducible o constitutivo, conocido en el estado de la técnica. De la misma manera que se ha mencionado anteriormente, para sobre-expresar las cuatro subunidades del complejo enzimático de la acetil-CoA carboxilasa (AccDABC) en las cepas descritas en la presente invención, y así conseguir, si se desea, un mayor rendimiento en la síntesis de biodiesel, se siguió el mismo protocolo que se ha descrito para la sobre-expresión de las enzimas del complejo Acil-CoA ligasas. Brevemente, se realizó la amplificación de los genes accDA y accBC, mediante PCR utilizando como molde ADN cromosomal de la cepa silvestre de B. subtilis JH642 y como cebadores los definidos como SEQ ID NOs: 13-16. Se hicieron clonados sucesivos para obtener finalmente el plásmido pGES468, que contiene el operón accDABC bajo control del promotor inducible por IPTG, Yspac, aunque, como se ha mencionado anteriormente, puede seleccionarse cualquier promotor, ya sea inducible o constitutivo, conocido en el estado de la técnica. Mediante dicho plásmido, si se desea, se procede a la transformación de las cepas B. subtilis CECT 7968, CECT 7969 y NCIMB 42026, para incrementar la expresión del complejo enzimático de la acetil-CoA carboxilasa e incrementar el rendimiento de la síntesis de biodiesel mediante las cepas descritas en la presente invención.

Ejemplo 3. Producción de biodiesel mediante las cepas de B. subtilis CECT 7968, 7969 y NCIMB 42026. Las cepas de B. subtilis CECT 7968 y CECT 7969 descritas en la presente invención, se cultivaron en 50 mi de medio de cultivo mínimo SPI formado por (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 2,0 g/1; KH ₂ P0 ₄ , 14,0 g/1; K ₂ HP0 ₄ , 6,0 g/1; Citrato de Na, 1,0 g/1; MgS0 ₄ 7H ₂ 0, 0,2 g/1. Suplementado con glucosa al 0,5 %; triptófano al 0,01 %, fenilalanina al 0,01 % y treonina al 0,01% (concentraciones finales) e IPTGM 500μΜ a 37°C hasta la fase estacionaria -5). Posteriormente, se agregó a cada cultivo un volumen de 10 mi de hexano y se procedió a la extracción de los lípidos sintetizados por dichas cepas bacterianas, a temperatura ambiente durante 20 min. La extracción puede realizarse mediante procedimientos de extracción orgánica en presencia de cualquier compuesto de dicha naturaleza como solvente, como puede ser, por ejemplo, el hexano o el acetato de etilo. Tras centrifugar, se evaporó la fase orgánica mediante una corriente de N ₂ a temperatura ambiente, y posteriormente, mediante cromatografía de capa gaseosa acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), se analizó la composición del biocombustible obtenido.

Dicho análisis de la composición del biocombustible obtenido, puso de manifiesto la presencia de etíl-ésteres de ácidos grasos o biodiesel de cadena carbonada y totalmente saturada, formada preferentemente por: iso-C15 (13-metilltetradecanoico), anteiso-C15:0 (12- metiltetradecanoico), n-C15:0 (n-pentadecanoico); iso-C16:0 (14-metilpentadecanoico), n-C16:0 (n-hexadecanoico), iso-C17:0 (15-metilhexadecanoico), anteiso-C17:0 (14-metilhexadecanoico), n-C17:0 (n-heptadecanoico), iso-C18:0 (16-metilheptadecanoico) y n-C18:0 (n-octadecanoico). Estas especies constituyeron aproximadamente el 10% de la muestra lipídica, siendo el resto principalmente ácidos grasos libres. Los etíl-ésteres fueron identificados utilizando estándares y confirmados por su espectro de masas. Dicho biodiesel producido, como puede observarse está formado por ácidos grasos ramificados, en su mayor parte y saturados, a diferencia de otros biocombustibles producidos, por ejemplo, por cepas de E. coli que están formados principalmente por ácidos grasos lineales de número par de carbono, en promedio, el 50% con una insaturación. Ambos extractos obtenidos de los cultivos de las cepas CECT 7968 y CECT 7969 descritas en la presente invención, presentaron la misma composición.

Para la obtención de biodiesel mediante el uso de la cepa NCIMB 42026 se siguió la misma estrategia descrita previamente para las cepas CECT 7968 y CECT 7969, siendo la única diferencia la densidad óptica del IPTG que en lugar de ser de -5 para el caso de las cepas CECT 7968 y 7969, fue de para la cepa NCIMB 42026. El análisis del biodiesel obtenido mediante la cepa NCIMB 42026 puso de manifiesto que presentaba una composición de etilésteres similar a la obtenida mediante el uso de las cepas CECT 7968 y 7969 y que se describe arriba.

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