La presente invención se refiere a la producción de polímeros plásticos y sus monómeros a partir de cultivos de un microrganismo en presencia de diferentes fuentes de carbono.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En los últimos años se ha producido un gran desarrollo de los plásticos obtenidos a partir de fuentes renovables. La Comisión Europea en su "Lead Markets Iniciative" (Final Evaluation of the Lead Market Iniciative, 2011) ha identificado a los plásticos obtenidos a partir de fuentes renovables como uno de los mercados de mayor importancia. El elevado precio del petróleo y los problemas de polución que generan los plásticos tradicionales ha provocado que se desarrollen nuevas tecnologías para producir materiales con características similares a los productos petroquímicos, que ofrezcan otras vías de recuperación y reciclado para ayudar a reducir el impacto sobre el medio ambiente.

Entre estos materiales se incluyen los polihidroxialcanoatos (PHAs), las polilactonas, ciertos poliésteres alifáticos, algunos polisacáridos y copolímeros derivados del petróleo (Shen et al. 2010. Biofuels Bioprod. Bioref, 4, 25-40; Gavrilescu et al. 2005. Biotechnol. Adv., 23, 471-499).

Los PHAs constituyen una familia de poliésteres de 3, 4, 5 y 6 hidroxiácidos sintetizados por diferentes grupos de microorganismos que se acumulan en el interior celular en forma de gránulos cuyo número y tamaño varía entre diferentes especies y sirven como compuestos de reserva de carbono y energía (Chen GQ. 2010. Plastics from Bacteria: Natural Functions and applications, GQ Chen Ed., Springer, 17-37). El 30% de las bacterias del suelo tienen la capacidad de sintetizar PHA (Wu et al., 2000. Acta Polym. Sin. 6, 751-756). Dependiendo del número de átomos de carbono de la unidad monomérica los PHAs se clasifican en PHAs de cadena corta (contienen de 3-5 átomos de carbono) y PHAs de cadena media (contienen 6-14 átomos de carbono).

La biosíntesis de polihidroxialcanoatos depende principalmente del microorganismo y de la fuente de carbono utilizada, diferentes rutas metabólicas están relacionadas con la formación de moléculas de hidroxiacil-CoA, principal precursor de los PHA. Por otra parte, sus propiedades físico-químicas varían considerablemente dependiendo de su composición monomérica y su estructura química. Hasta el momento se han descrito más de 150 monómeros diferentes producidos por bacterias a partir de diferentes fuentes de carbono (Steinbüchel y Valentín. 1995. FEMS Microbiol. Lett. 128, 219- 228), lo que da una idea de la gran diversidad de PHAs que pueden ser sintetizados y el amplio rango de propiedades físicas y mecánicas que pueden llegar a tener. Además, éstos bioplásticos son biodegradables y biocompatibles, lo que lo hacen muy adecuados para aplicaciones médicas y los 3-hidroxiácidos obtenidos de su despolimerización son compuestos con el elevado potencial biotecnológico.

Se han descrito las rutas metabólicas para la síntesis de PHA en diversos grupos de bacterias (Cupriavidus necátor, Rhodosporillum rubrum, Pseudomonads). Uno de los grupos más estudiados son las especies del género Pseudomonas, las cuales son capaces de acumular PHA a partir de ácidos grasos obtenidos a partir de las rutas de β- oxidación y síntesis de novo (Rhem. 2010. Nature 8, 578-592; Koller et al. 2010. Food Technoí. Biotechnol. 48, 255 -269) Los genes implicados en la biosíntesis de PHAmcl han sido caracterizados en varias especies de Pseudomonas y en todas ellas los genes están agrupados en el cluster pha, el cual está muy conservado entre cepas. El cluster está compuesto por dos genes que codifican para PHA sintasas (phaCl y phaC2), el gen phaZ que codifica para una despolimerasa responsable de la movilización de PHA y el gen phaD que codifica un regulador transcripcional. Además existen otros dos genes en el cluster, phaF y phal que codifican las fasinas. A pesar de la gran variabilidad de PHA que pueden ser sintetizados por los microorganismos, tan solo unos pocos se producen a escala industrial para su comercialización debido a los elevados costes de producción. La producción de PHA involucra pasos de fermentación, separación de la biomasa del caldo de cultivo, secado de la biomasa y la extracción, purificación y secado del PHA (Queiroz et al. 2009. Polymer Reviews. 49„65-78; Shen et al. 2010. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4, 25-40.). El aislamiento de cepas superproductoras de PHA, el aumento de la tasa de conversión de sustrato en PHA, el diseño de un buen proceso de fermentación o la optimización de los procesos de extracción y purificación son factores claves para conseguir un proceso rentable a nivel industrial para la producción de PHA

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención tiene por objetivo resolver desde el punto de vista estratégico, económico y técnico la producción de polímeros plásticos de origen microbiano (polihidroxialcanoatos) y los monómeros que los forman (3-hidroxiácidos).

Los autores de la presente invención han desarrollado un procedimiento para la producción de polímeros plásticos de origen microbiano (bioplásticos) y de los monómeros que los forman. El procedimiento se basa en la utilización de un nuevo microorganismo, que resulta ser súper-productor y que, de manera natural, es capaz: a) de metabolizar diferentes fuentes de carbono incluyendo derivados aromáticos, b) crecer a elevadas concentraciones celulares, y c) producir una gran cantidad de polihidroxialcanoatos o 3-hidroxiácidos. Ambos procesos de producción alcanzan elevados rendimientos de forma rápida, sencilla y con un bajo coste de producción.

En un primer aspecto la invención se relaciona con un microorganismo de la especie Pseudomonas putida depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso CECT 8092. Dentro de dicho primer aspecto, la invención también se relaciona con un microorganismo de la especie Pseudomonas putida CECT 8092 que presenta una deleción en los genes fadB y fadA y, finalmente, con un microorganismo de la especie Pseudomonas putida CECT 8092, que presenta una deleción en los genes fadB y fadA, y que contiene al menos una copia adicional del propio gen phaZ o, expresado de otra manera, que presenta una mayor dosis génica del propio gen phaZ. En un segundo aspecto la invención se relaciona con un cultivo biológicamente puro de cada uno de los microorganismos referidos en el párrafo anterior.

En un tercer aspecto la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de bioplásticos que comprende las siguientes etapas:

a. cultivo de un microorganismo seleccionado entre Pseudomonas putida

CECT 8092 y Pseudomonas putida CECT &092AfadBA, en presencia de al menos una fuente de carbono que incluye un ácido carboxílico, y de al menos una fuente de nitrógeno,

b. separación de la biomasa microbiana del caldo de cultivo,

c. extracción del bioplástico de la biomasa microbiana obtenida en la etapa anterior y, opcionalmente,

d. purificación del bioplástico

En un cuarto aspecto la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de 3-hidroxiácidos que comprende las siguientes etapas:

a. cultivo de Pseudomonas putida CECT &092AfadBA que contiene al menos una copia adicional del propio gen phaZ, en presencia de al menos una fuente de carbono que incluye un ácido arilcarboxílico, y de al menos una fuente de nitrógeno,

b. separación de la biomasa microbiana del caldo de cultivo, y

c. extracción de los 3-hidroxiácidos del caldo de cultivo obtenido en la etapa anterior.

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con el uso de un microorganismo de la especie Pseudomonas putida depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso CECT 8092 y el de dicho microorganismo que presenta una deleción en los genes fadB y fadA, en la obtención de biopolímeros. En otro aspecto adicional, la invención se relaciona con el uso del microorganismo anterior delecionado que contiene una mayor dosis génica del propio gen phaZ en la obtención de 3-hidroxiácidos.

En otro aspecto adicional, la invención se relaciona con un polinucleótido que presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 5.

Finalmente, en un último aspecto, la invención se relaciona con el uso del propio gen phaZ para aumentar el rendimiento en la obtención de 3-hidroxiácidos por un microorganismo de la especie Pseudomonas putida CECT 8092 y por un microorganismo Pseudomonas putida CECT 8092 que presenta una deleción en los genes fadB y fadA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Pseudomonas putida CECT 8092

El primer aspecto de la invención se relaciona con un microorganismo de la especie Pseudomonas putida depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso CECT 8092. La selección de esta cepa súper-productora de Pseudomonas putida se realizó aplicando procedimientos estándares (Gómez et al. 1996. Appl. Microbiol. Biotecnol. 45, 785-791) de una muestra de suelos, restos vegetales, etc. Dicha cepa se identificó mediante la secuenciación del gen rpoB (SEQ ID NO 1) y de la subunidad 16S del ADN ribosómico (SEQ ID NO 2) como Pseudomonas putida mostrando diferencias frente a otras secuencias de esta especie depositadas en las bases de datos consultadas. El microorganismo se ha depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como Pseudomonas putida CECT 8092. La presente cepa de Pseudomonas putida es capaz de metabolizar diferentes fuentes de carbono incluyendo derivados aromáticos (ácidos n-fenilalcanoicos); de crecer a elevadas concentraciones celulares (DO600nm superiores a 250 y densidades de 60 g/1 de biomasa) y, finalmente, de producir una gran cantidad de polihidroxialcanoatos y 3- hidroxiácidos de forma rápida, sencilla y a un bajo coste de producción. Como se demuestra en los ejemplos incluidos en el texto de la presente solicitud (ejemplo 1 y tabla 1 en el ejemplo 4), esta cepa llega a acumular más de un 50% de su peso seco en forma de polihidroxialcanoatos, con un rendimiento de conversión del ácido utilizado en PHA de 0,5.

En la presente invención se entiende por "bioplásticos" aquellos plásticos obtenidos a partir de fuentes naturales (origen microbiano) o renovables (total o parcialmente), así como los plásticos biodegradables, aquellos que pueden descomponerse en condiciones que se dan en la naturaleza, mediante la acción enzimática de microorganismos como bacterias, hongos y algas. En particular, los polihidroxialcanoatos obtenidos mediante los microorganismos de la presente invención son bioplásticos. De manera general, los "plásticos" son materiales sintéticos obtenidos mediante fenómenos de polimerización o multiplicación semi-natural de los átomos de carbono en las largas cadenas moleculares de compuestos orgánicos derivados del petróleo y otras sustancias naturales.

Pseudomonas putida CECT &092AfadBA

Dentro del primer aspecto, y en una realización particular, la invención se relaciona con el microorganismo Pseudomonas putida CECT 092 AfadBA. Este microorganismo corresponde a Pseudomonas putida CECT 8092 que presenta una deleción de los genes fadA (SEQ ID NO 3) y fadB (SEQ ID NO 4), implicados en el metabolismo de los ácidos grasos. Por este motivo la cepa o microorganismo delecionado ve aumentada la producción de polihidroxialcanoatos (polímeros o bioplásticos). Así, según se muestra en los ejemplos de la presente solicitud (ver tabla 1), la producción de polihidroxialcanoatos (PHA) producidos por el microorganismo Pseudomonas putida CECT S092AfadBA es entre un 5 y un 32% superior a la obtenida por el microorganismo o cepa parental. Gen phaZ

También dentro del primer aspecto, y en otra realización particular, la invención se relaciona con otro nuevo microorganismo que corresponde a Pseudomonas putida CECT 8092AfadBA que contiene una mayor dosis génica del propio gen phaZ (SEQ ID NO 5). Esto es, que contienen al menos una copia adicional del propio gen phaZ. Por "al menos una copia adicional" se entiende, en el contexto de la presente invención, la presencia de una o más copias adicionales; preferiblemente entre 1 y 20; más preferiblemente entre 5 y 20 copias adicionales. Este gen codifica una despolimerasa cuya expresión evita la formación y acumulación intracelular de polihidroxialcanoatos, favoreciendo, por el contrario, la liberación de 3-hidroxiácidos al medio de cultivo (Ren et al. 2005, Biomacromolecules 6:2290-2298; Prieto et al. 2007, Ramos JL y Filloux A (eds) Pseudomonas, 5. Springer, Amsterdam, 397-428; Sandoval et al. 2005, Appl. Microbiol. Biotechnol 67, 97-105). La presencia de varias copias de este gen en el microorganismo referido resulta en un aumento en el rendimiento de la producción de ácidos 3-hidroxicarboxílicos. En una realización preferida de la invención el número de copias adicionales del propio gen phaZ presente en el microorganismo es de 5 a 20 copias Así, según muestran los ejemplos de la presente solicitud, el rendimiento en la conversión de un ácido n-fenilalquilcarboxílico en 3-OH-fenilalquilcarboxílico puede ser superior al 75%.

En un segundo aspecto la invención se relaciona con un cultivo biológicamente puro de cada uno de los nuevos microorganismos descritos en la presente invención. En la presente invención se entiende por "cultivo biológicamente puro", aquel cultivo en el que el microorganismo de la invención se encuentra en una proporción igual o superior al 95% respecto al resto de microorganismos presentes en el cultivo. En el texto de la presente solicitud se ejemplifican cultivos biológicamente puros de los microorganismos de la invención.

Procedimiento para la obtención de bioplásticos

En un tercer aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de bioplásticos, en particular polihidroxialcanoatos, que comprende las siguientes etapas:

a. cultivo de un microorganismo seleccionado entre Pseudomonas putida CECT

8092 y Pseudomonas Putida CECT &092AfadBA en presencia de al menos una fuente de carbono que incluye un ácido carboxílico, y de al menos una fuente de nitrógeno,

b. separación de la biomasa microbiana del caldo de cultivo,

c. extracción del bioplástico de la biomasa microbiana obtenida en la etapa anterior y, opcionalmente,

d. purificación del bioplástico

El cultivo del microorganismo en la etapa a) implica el crecimiento del microorganismo productor, bien Pseudomonas putida CECT 8092 o bien Pseudomonas Futida CECT S092AfadBA, preferentemente en matraces o biorreactores hasta alcanzar un contenido en polihidroxialcanoatos que preferiblemente se encuentra entre el 20% y el 70% del peso seco.

El microorganismo se crece en medios de cultivo en los que está presente al menos una fuente de carbono que incluye un ácido carboxílico, y al menos una fuente de nitrógeno. La fuente de carbono incluye un ácido carboxílico. El ácido carboxílico presenta una cadena alquílica, la cual puede presentar entre 3 y 13 preferiblemente entre 5 y 11 átomos de carbono, ser lineal o ramificada, y puede presentar al menos un hidrógeno sustituido por un grupo OH, un grupo éster o un grupo amino. La cadena también puede contener grupos tiol, grupos halógeno y presentar una o más insaturaciones. Dicha cadena también puede presentar sustituyentes arilo (ácido arilcarboxílico), en particular en la posición n de la cadena (ácido n-arilcarboxílico), esto es, en la posición opuesta al grupo carboxilo. En la presente invención se entiende por grupo "arilo" un grupo aromático que presenta entre 6 y 18, más preferiblemente 6 ó 10 átomos de carbono, comprendiendo 1, 2 ó 3 núcleos aromáticos unidos a través de enlace carbono-carbono o fusionados entre sí. Ejemplos ilustrativos de grupos arilo incluyen fenilo, naftilo, difenilo, indenilo, etc. Preferentemente, el ácido carboxílico presenta una cadena lineal. En una realización particular, el ácido carboxílico es un ácido arilcarboxílico, preferiblemente n- arilcarboxílico; o un ácido graso. En una realización preferida, la fuente de carbono es un ácido carboxílico de entre 4 y 14 átomos de carbono, más preferiblemente de entre 6 y 12 átomos de carbono; o un ácido aril-carboxílico, preferiblemente n-arilcarboxílico, de entre 10 y 32 átomos de carbono, más preferiblemente n-fenil-carboxílico. En una realización preferida, la fuente de carbono incluye adicionalmente glucosa, lactosa, glicerol, melazas, mañosa, fructosa, acetato o combinaciones de los mismos; en particular glucosa o glicerina o combinaciones de las mismas.

En otra realización preferida de la invención, la fuente de carbono utilizada es una mezcla de glicerina y un ácido carboxílico, preferiblemente de cadena lineal, conteniendo entre 6 y 12 átomos de carbono. La glicerina se emplea en una cantidad entre el 0, 1% (p/v) y el 10% (p/v), preferiblemente entre el 2% (p/v) y el 6% (p/v) y más preferiblemente entre el 3% (p/v) y el 5% (p/v). En otra realización preferida de la invención, la fuente de carbono utilizada es una mezcla de glucosa y un ácido carboxílico, preferiblemente de cadena lineal, conteniendo entre 6 y 12 átomos de carbono. La glucosa se emplea en una cantidad entre el 0, 1% (p/v) y el 10% (p/v), preferiblemente entre el 2% (p/v) y el 6% (p/v) y más preferiblemente entre el 3% (p/v) y el 5% (p/v). En otra realización de la invención, el ácido carboxílico utilizado como fuente de carbono se selecciona entre ácido hexanoico, ácido heptanoico, ácido octanoico, ácido nonanoico y ácido decanoico. Estos ácidos se emplean en una concentración entre 5 mM y 500 mM, preferentemente entre 10 y 400 mM, y más preferentemente entre 20 y 250 mM.

En otra realización de la invención, el ácido n-fenilcarboxílico utilizado como fuente de carbono se selecciona entre ácido 6-fenilhexanoico, ácido 7-fenilheptanoico y ácido 8- feniloctanoico. Estos ácidos se emplean en una concentración entre 5 mM y 200 mM, preferentemente entre 10 y 150 mM, y más preferentemente entre 15 y 100 mM.

En una realización particular, el microorganismo se alimenta inicialmente empleando glicerina y/o glucosa como fuente de carbono, para posteriormente emplear un ácido carboxílico como con fuente de carbono. Normalmente, la fuente de carbono se encuentra en exceso en relación de masa con la fuente de nitrógeno presente en el mismo medio. La fuente de nitrógeno puede seleccionarse del grupo formado por extracto de levadura, peptona, corn steep liquor (líquido de macerado de maíz), urea, glutamato sódico y fuentes de nitrógeno inorgánico, como por ejemplo diferentes sales de amonio (cloruro, nitrato, sulfato), y combinaciones de ellos. En una realización de la invención, el cultivo de los microorganismos se realiza durante 2 a 5 días a una temperatura entre 18°C y 37°C, preferiblemente entre 25°C y 35°C, y más preferiblemente entre 28°C y 32°C, con agitación constante.

Una vez realizado el cultivo de los microorganismos, preferiblemente hasta alcanzar la máxima cantidad intracelular de polihidroxialcanoatos, la biomasa microbiana o celular se separa del caldo de cultivo. Esta separación se realiza mediante alguno de los procedimientos habitualmente utilizados para este fin como, por ejemplo, filtración, microfiltración, centrifugación, o combinaciones de los mismos, entre otros. En una realización preferente, tras realizar la etapa de separación de la biomasa microbiana del caldo de cultivo (etapa b), y antes de realizar la extracción del bioplástico de la biomasa (etapa c), la biomasa se seca en estufa u horno, preferentemente a unos 50-70 °C y durante 48-72 horas, o se realiza una liofilización de la biomasa separada.

La tercera etapa del procedimiento (etapa c) comprende la extracción del bioplástico de la biomasa celular o microbiana obtenida en la etapa anterior del procedimiento. En una realización particular, dicha extracción se realiza mediante un proceso de extracción sólido-líquido. Como disolvente puede emplearse cualquier disolvente orgánico inmiscible con el agua como, por ejemplo, n-hexano, tolueno, acetona, acetato de etilo o dimetoximetano, entre otros. Ejemplos conocidos de extracción de polihidroxialcanoatos de una biomasa con disolventes orgánicos se describen en documentos como US 4,310,684 y US 4,705,604, en particular sobre la extracción de PHB (poli-hidroxibutirato) con disolventes clorados; US 4,968,611 sobre el uso de dioles, butirolactona o ésteres de ácidos di o tricarboxilicos para la extracción de PHB y copolímeros de éste; US 5,213,976 describe la extracción de PHB con cloruro de metileno seguido de precipitación con agua. Los documentos W097/15681 y W093/11656 describen la extracción con acetona de poli-3-hidroxioctanoato a partir de Pseudomonas oleovorans; WO2005/052175 describe un proceso para la extracción con diferentes tipos de disolventes de PHB y PHBV (poli-hidroxibutirato-co- hidroxivalerato). Finalmente, EP 1781721 describe la extracción del copolímero PHB- co-PHH mediante el uso de acetona, metil-etil cetonas, o mezclas entre ambos. Los polímeros extraídos en la etapa c) pueden someterse, en función de su grado de pureza y utilización posterior, a un proceso de purificación (etapa d). Esta última etapa del procedimiento, que es opcional, se basa generalmente en la precipitación de las impurezas incluidas en el producto resultante de la etapa c) y puede realizarse mediante la adición de un agente precipitante en el que los polihidrixialcanoatos no son solubles como, por ejemplo, agua o diferentes tipos de alcoholes, como metanol, etanol, isopropanol o n-butanol (WO00/68409, WO2005/052175); mediante la adición de peróxido de hidrógeno y agentes quelantes (US 5,691,174), o mediante la adición de ozono (W099/51760). Los polihidroxialcanoatos (bioplásticos) obtenidos por el procedimiento de la invención son copolímeros formados a partir de derivados del ácido carboxílico empleado como fuente de carbono. Así, si la fuente de carbono es ácido octanoico, se obtendrán copolímeros formados por 3-hidroxioctanoato (80-90%) y 3-hidroxihexanoato (20- 10%). Dichos polihidroxialcanoatos (bioplástico) pueden servir como materia prima para la producción de diferentes productos como, por ejemplo, envases, films para embalaje, dispositivos biomédicos, productos para higiene personal, bolsas, etc. (Philip et al. 2007. J. Chem. Technol. Biotechnol, 82, 233; Mikova et al. 2006. Chem. Listy, 100, 1075; Chen et al. 2005. Biomaterials, 67, 592; Chen GQ. 2009. Chem. Soc. Rev., 38, 2434-2446). Procedimiento para la obtención de 3-hidroxiácidos

En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de 3-hidroxiácidos que comprende las siguientes etapas:

a. cultivo de Pseudomonas putida CECT &092AfadBA que contiene al menos una copia adicional del propio gen phaZ en presencia de al menos una fuente de carbono que incluye un ácido arilcarboxílico, y de al menos una fuente de nitrógeno,

b. separación de la biomasa microbiana del caldo de cultivo, y

c. extracción de los 3-hidroxiácidos del caldo de cultivo de la etapa anterior.

En una realización preferida de la invención, el número de copias adicionales del propio gen phaZ presente en el microorganismo delecionado es de 1 a 20 copias, más preferiblemente de 5 a 20 copias. El cultivo del microorganismo se realiza de manera similar al de la etapa a) del procedimiento para la obtención de bioplásticos descrito más arriba. Sin embargo, la fuente de carbono en este procedimiento incluye necesariamente un ácido arilcarboxílico, preferiblemente un ácido n-arilcarboxílico, que presenta preferiblemente de entre 10 y 32 átomos de carbono, más preferiblemente n-fenil-carboxílico. La fuente de nitrógeno es la misma que la empleada en el procedimiento para la obtención de bioplásticos descrito más arriba.

En una realización de la invención, el cultivo de los microorganismos se realiza durante 2 a 5 días a una temperatura entre 18°C y 37°C, preferiblemente entre 25°C y 35°C, y más preferiblemente entre 28°C y 32°C, con agitación constante.

Preferiblemente una vez alcanzada la máxima producción de 3-hidroxiácidos, la biomasa microbiana o celular se separa del caldo de cultivo en la etapa b mediante alguno de los procedimientos habitualmente utilizados para este fin como, por ejemplo, filtración, microfiltración, centrifugación o combinaciones de los mismos, entre otros. A continuación, el caldo de cultivo obtenido en la etapa b se somete a una extracción para recuperar los 3-hidroxiácidos (etapa c). En una realización particular, esta extracción consiste en una extracción de dicho caldo de cultivo (fase acuosa) con un disolvente orgánico. Disolventes orgánicos adecuados para esta extracción son, entre otros, dietil-éter, metil-terc-butil-éter, cloruro de metileno y acetato de etilo. Los 3-hidroxiácidos obtenidos en el procedimiento descrito en la presente invención son aquellos derivados del ácido alquilcarboxíloco empleado como fuente de carbono. Así, si la fuente de carbono es ácido fenilhexanoico, el producto obtenido será el ácido 3- hidroxihenanoico. Los 3-hidroxiácidos obtenidos pueden servir como precursores en la industria farmacéutica para la síntesis de compuestos como antibióticos, vitaminas, o feromonas (Chen G.Q. 2009, Chem. Soc. Rev. 38, 2434-2446).

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con el uso en la obtención de biopolímeros, en particular de polihidroxialcanoatos, de los microorganismos:

- Pseudomonas putida CECT 8092 y

- Pseudomonas putida CECT 8092 que presenta una deleción en los genes fadB y fadA.

En otro aspecto adicional, la invención se relaciona con el uso en la obtención de 3- hidroxiácidos del microorganismo:

- Pseudomonas putida CECT 8092 que presenta una deleción en los genes fadB y fadA que contiene

al menos una copia adicional del propio gen phaZ. En la presente solicitud se entiende por la expresión "más de una copia del propio gen phaZ' que el microorganismo contiene una mayor dosis génica del propio gen phaZ, esto es, del polinucleótido de secuencia ID SEQ NO 5. Dicha(s) copia(s) adicional(es) del propio gen phaZ se introducen en los referidos microorganismo siguiendo métodos estándar (Sambrook J. y Russell D. W. 2001., Cold Spring Harbor laboratory press, Cold Spring Harbor, NY), tal y como se ilustra en el ejemplo 5 de la solicitud. El número de copias adicionales del propio gen phaZ es preferentemente de 1 a 20, más preferentemente de 5 a 20 copias adicionales.

En otro aspecto adicional, la invención se relaciona con un polinucleótido que presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 5. Este polinucleótido corresponde al gen phaZ del microorganismo de la invención Pseudomonas putida CECT 8092. Finalmente, en un último aspecto, la invención se relaciona con el uso de un polinucleótido que presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 5 para aumentar el rendimiento en la obtención de 3-hidroxiácidos por un microorganismo de la especie Pseudomonas putida CECT 8092 que presenta una deleción en los genes fadB y fadA.

EJEMPLOS 1. Producción de PHA

La síntesis de PHA en biorreactores de 30 litros con la cepa P. putida CECT 8092 se realizó en medio M9 suplementado con una solución de elementos traza (Abril et al. 1989, J. Bacteriol. 171, 6782-6790) con glicerina (30 g/L) como fuente de carbono inicial. El cultivo se creció hasta una DOóOOnm de 20 y a partir de ese momento se inició una fase de alimentación con ácido octanoico. Después de 60 h de cultivo se obtuvieron 60 g/L de biomasa con un contenido de PHA superior al 50% de su peso seco.

Una vez separada la biomasa celular del caldo de cultivo mediante microfiltración, ésta se secó a 65°C durante 3-5 días. La biomasa seca se sometió a un proceso de extracción con acetato de etilo. La mezcla se mantuvo en el Shoxlet a 35-40°C durante 20 horas. Una vez finalizada la extracción se evaporó el disolvente y el PHA obtenido (copolímero formado por aproximadamente 90% de 3-hidroxioctanoico y 10% de 3- hidroxihexanóico) se purificó con isopropanol. La cantidad final de PHA purificado obtenido fue de 625 g, lo que supone un rendimiento de conversión de ácido octanoico en PHA de 47,60%. 2. Construcción de la cepa P putida CECT8092 AfadBA

Una vez obtenida la secuencia de los genes fadA (SEQ ID NO 3) y fadB (SEQ ID NO 4) de la cepa P. putida CECT 8092, se llevó a cabo el diseño de la construcción que iba a ser utilizada para la deleción. Para ello se amplificaron por PCR dos fragmentos situados en los extremos de los genes fadB A. Uno de ellos -de 665 pb- se localiza en el extremo 5' del gen fadB y el otro -de 667 pb- en el extremo 3 ' del gen fadA. Estos dos fragmentos se ligaron, y la construcción resultante se clonó en el plásmido pGEM- Teasy, desde aquí se liberaron los fragmentos y se clonaron en el pJQ200KS (plásmido que contiene el marcador de resistencia a gentamicina y el gen sacB que codifica una sacarasa). Esa construcción se transfirió a E. coli y posteriormente a P. putida CECT 8092 mediante conjugación.

Para conseguir un mutante delecionado mediante una doble recombinación, en primer lugar se hizo una selección en medio LB suplementado con ampicilina y gentamicina. Posteriormente, los transformantes seleccionados en este medio se crecieron en medio LB suplementado con ampicilina y sacarosa al 10%.

El análisis de los transconjugantes se realizó mediante PCR utilizando el DNA genómico de los mismos. Para ello se utilizaron oligonucleótidos específicos correspondientes a las regiones exteriores de los fragmentos clonados en el vector pJQ200KS.

3. Producción de PHA a partir de P putida CECT8092 AfadBA

P. putida CECT 8092 y P. putida CECT 8092 AfadBA se crecieron en sendos matraces en medio mínimo definido (Martínez-Blanco H. 1990, J. Biol. Chem. 265, 7084-7090), cuya composición en g l ^_1 es: KP0 ₄ H ₂ , 13,6; (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 2,0; MgS0 ₄ 7H ₂ 0, 0,25; FeS0 ₄ 7H ₂ 0, 0,0005. Se utilizó como fuente de carbono una mezcla compuesta por ácido octanoico a una concentración final de 30 mM y glucosa al 1% (p/v). 500 mL de medio se inocularon con una suspensión celular de la cepa correspondiente. Los matraces se incubaron a 30°C y 250 rpm durante el tiempo requerido. Cuando el cultivo alcanzó la fase estacionaria, las bacterias se recogieron por centrifugación y, tras eliminar el sobrenadante, se congelaron a -80 °C. Posteriormente, las bacterias se liofilizaron y este material fue el utilizado para extraer PHAs como se describe en el ejemplo 1.

Los resultados obtenidos en los distintos medios se muestran en la tabla 1. La cantidad final de PHA obtenido por la cepa P. putida CECT 8092 AfadBA fue de 53, 1% de su peso seco, es decir, aproximadamente un 5% superior al obtenido con la cepa parental.

4. Producción de PHA conteniendo residuos aromáticos

P. putida CECT 8092 y P. putida CECT 8092 AfadBA se crecieron en sendos matraces en medio mínimo definido descrito en ejemplo 3. Se utilizaron como fuentes de carbono una mezcla compuesta por diferentes ácidos n-fenilalcanoicos (6-fenilhexanoico, 7- fenilheptanoico y 8-feniloctanoico) a una concentración final de 15 mM y glucosa al 1% (p/v). 500 mL de medio se inocularon con una suspensión celular de la cepa correspondiente. Los matraces se incubaron a 30°C y 250rpm durante el tiempo requerido. Cuando el cultivo alcanzó la fase estacionaria, las bacterias se recogieron por centrifugación y, tras eliminar el sobrenadante, se congelaron a -80 °C. Posteriormente, las bacterias se liofilizaron y este material fue el utilizado para extraer PHAs siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Los resultados obtenidos en los distintos medios se muestran en la tabla 1 como % del peso seco del microorganismo.

Tabla 1. Producción de PHA en las cepas en medio definido suplementado con distintos ácidos grasos

MM + glucosa 1%

+ Octanoico ό-φ-Hexanoico 7-cj)-Heptanoico 8-(j)-Octanoico 30mM 15 mM 15 mM 15 mM

P. putida

47,60% 17,3% 36,2% 40,6%

CECT 8092

P. putida

CECT 8092 53, 1% 49,7% 55,9% 61,3%

AfadBA Dependiendo del precursor utilizado, la cantidad final de PHA producido por la cepa P. putida CECT 8092 AfadBA fue entre un 19% y un 32% superior al obtenido con la cepa parental. 5. Producción de 3-hidroxiácidos

El gen phaZ de P. putida CECT 8092 se amplificó mediante PCR (SEQ ID NO 5) y se clonó en el plásmido pBBRl-MCS3 (Tc ^R ).

La construcción se transfirió a E. coli DH10B mediante transformación y se comprobó mediante secuenciación del gen phaZ que el plásmido había sido incorporado. Posteriormente el plásmido fue transferido a la cepa P. putida CECT 8092 AfadBA mediante conjugación. Para comprobar el éxito de la construcción, se extrajo plásmido de los transconjugantes y éste se utilizó para transformar E. coli DH10B. A continuación se extrajo el plásmido de la cepa de E. coli y se amplificó mediante PCR el gen phaZ. La secuenciación del fragmento obtenido confirmó que la cepa de Pseudomonas contenía la construcción deseada.

Para analizar la producción de 3-hidroxiácidos por la cepa P. putida CECT 8092 AfadBA conteniendo al menos una copia adicional del propio gen phaZ, ésta se cultivó en medio descrito en ejemplo 3 , pero empleando glicerina en vez de glucosa y ácido 6- fenilhexanoico en lugar de ácido octanoico. Los matraces se incubaron a 30°C y 250 rpm durante 72 h. Las células se recogieron por centrifugación y el caldo de cultivo se filtró a través de un filtro de 0,2 μιη. La obtención de los 3-OH-monómeros se realizó mediante extracción líquido/líquido con disolventes orgánicos, como cloruro de metileno, dietil éter o acetato de etilo (Sandoval et al. 2005, Appl. Microbiol. Biotechnol, 67, 97-105). La fase orgánica (extracto de acetato de etilo) obtenida se secó con sulfato sódico anhidro y una alícuota se analizó mediante HPLC/Masas y por RMN, confirmándose que los compuestos contenidos en la misma consistían en una mezcla formada por ácido 3-hidroxi-6-fenilhexanoico (más de un 90%), trazas de ácidos libres y de ácido 3-hidroxi-4-fenilbutanoico, así como ésteres de ambos ácidos. El resto del extracto obtenido se evaporó hasta sequedad bajo corriente de nitrógeno y luego se secó en un liofilizador durante 12 horas. La separación y caracterización de los componentes de este extracto, se llevó a cabo mediante HPLC semipreparativo (columna Zorbax RX-C8, 9.4 X 250 mm, 5 um, gradiente 5- 100% ACN/Agua con 0.1 % de TFA, flujo 3.6 ml/min, detección en UV a 210 y 340 nm). El análisis de la fracción mayoritaria del extracto (más de un 90% del total) mediante RMN CDC1 ₃ confirmó la estructura correspondiente al ácido 3-hidroxi- fenilhexanoico. El rendimiento total de conversión a partir del ácido 6-fenilhexanoico fue del 75%.