L'invention se rapporte à un procédé de culture en mode mixotrophe, d'une microalgue du genre Botryococcus, en particulier des espèces de Botryococcus braunii et de Botryococcus sudeticus. Il permet l'enrichissement des microalgues ainsi cultivées en acide caprique (aussi connu comme l'acide décanoïque, C10 :0 ou C ₁₀ ) par rapport aux conditions en autotrophie classiques, où l'acide caprique est quasi absente. En présence d'un éclairement discontinu et/ou variable de lumière, le procédé permet d'obtenir un très haut rendement en biomasse. Le procédé permet ainsi de sélectionner des souches Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acide caprique.

Préambule

Les microalgues sont des microorganismes photosynthétiques à caractère autotrophe, c'est-à-dire ayant l'aptitude de croître de manière autonome par photosynthèse.

Les microalgues se développent aussi bien dans les milieux aquatiques marins qu'en eaux douces ou saumâtres, ainsi que dans divers habitats terrestres.

La plupart des espèces de microalgues rencontrées dans l'eau douce ou les océans sont généralement autotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent croître que par photosynthèse. Pour celles-ci, la présence dans leur milieu de substrats carbonés ou de matière organique ne leur est pas favorable et n'améliore pas leur croissance. Cependant, un certain nombre d'espèces de microalgues, de familles et d'origines très diverses, s'avèrent ne pas être strictement autotrophes. C'est ainsi que certaines d'entre elles, dites hétérotrophes, sont capables de se développer en l'absence totale de lumière, par fermentation, c'est-à-dire en exploitant la matière organique. D'autres espèces de microalgues, pour lesquelles la photosynthèse reste indispensable à leur développement, sont capables à la fois de tirer parti de la photosynthèse et de la matière organique présente dans leur milieu. Ces espèces intermédiaires, dites mixotrophes, peuvent être cultivées à la fois en présence de lumière et de matière organique.

Cette particularité des algues dites « mixotrophes » semble être liée à leur métabolisme, qui leur permet d'opérer simultanément photosynthèse et fermentation. Les deux types de métabolisme coexistent avec un effet global positif sur la croissance des algues [Yang, C. et al. (2000) ; Biochemical Engineering Journal, 6 :87-102].

Les microalgues font l'objet actuellement de nombreux projets industriels car certaines espèces sont capables d'accumuler ou de sécréter des quantités importantes de lipides, notamment des hydrocarbures et des acides gras. De tels acides gras, comprenant des acides gras polyinsaturés et des acides gras saturés, ont de nombreuses applications industrielles.

L'acide caprique (aussi connu en tant qu'acide décanoïque, C10 :0 ou C10) est un acide gras saturé à la formule chimique C10H20O. Il ne comporte aucune double liaison.

L'acide caprique est utilisé dans plusieurs secteurs industriels, par exemple en tant que solvant pour des encres, agent dégraissant, et en tant qu'émollient dans les formulations cosmétiques et dans les savons. Il est également utilisé dans la fabrication des parfums, des lubrifiants, des plastiques et des teintures. Les esters de glycérol de l'acide caprique sont utilisés dans les aliments et produits diététiques.

A ce jour, la production de l'acide caprique est principalement obtenue par la voie de production végétale (notamment de l'huile de coprah et de palmiste) ou par voie chimique. L'acide caprique représente 6 à 10 % des acides gras totaux dans l'huile de coprah, et 3 à 14 % des acides gras totaux dans l'huile de palmiste. Ce faible rendement d'acide caprique a pour conséquence de rendre coûteuse cette voie de production.

Une voie alternative pour la production d'acide caprique est la synthèse chimique. L'acide caprique (aussi connu comme l'acide décanoïque, C10 :0 ou C10) est couramment préparé par oxydation de décanol en utilisant du trioxyde de chrome (CrOa) en tant qu'agent oxydant, dans des conditions acides, avec un solvant d'acétone. Cette voie de production reste coûteuse, et l'impact sanitaire et environnemental du trioxyde de chrome est important.

De nouvelles sources de production de cet acide gras doivent donc être recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché.

Ainsi, c'est au terme de nombreuses expérimentations dans des conditions de lumière inhabituelles et par l'adjonction de différents substrats que le demandeur est parvenu à isoler des souches de microalgue du genre Botryococcus cultivables en mode mixotrophe, permettant une production d'acide caprique.

A ce jour, à la connaissance du demandeur, la production de l'acide caprique par les microalgues n'est pas connue. La production de l'acide caprique par des microalgues représente une alternative avantageuse par rapport à la production par la voie chimique ainsi que par la voie végétale, pour les raisons citées ci-dessus.

A l'heure actuelle, la classification des algues se fonde encore largement sur des critères morphologiques et sur la nature des pigments photosynthétiques que contiennent leurs cellules. De ce fait, elle est peu indicative du caractère autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe des espèces d'algues, alors que ces dernières recouvrent une très grande diversité d'espèces et de formes [Dubinsky et al. (2010) ; Hydrobiologia, 639:153-171].

La classification taxonomique des algues eucaryotes contient 14 phylums. Parmi des espèces des différentes classes composant ces phylums, qui produisent des acides gras, il existe des variations importantes en ce qui concerne la teneur des microalgues en lipides, notamment des hydrocarbures et des acides gras polyinsaturés et acides gras saturés. Par ailleurs, les proportions relatives de lipides, notamment dans les profils lipidiques, varient selon l'espèce et les conditions de culture.

Pour mettre en œuvre la production des acides gras par des microalgues à l'échelle industrielle, plusieurs facteurs doivent être pris en compte. Par exemple, les cultures peuvent être réalisées en condition autotrophe, mixotrophe ou hétérotrophe selon la souche, la température, les conditions de lumière et la taille des fermenteurs. Par exemple, les cultures peuvent également être réalisées dans des conteneurs d'un litre, dans un laboratoire, dans des photobioréacteurs, et dans des conteneurs de 100 000 litres ou bien dans des bassins ouverts (plusieurs hectares). Toutefois, les dépenses énergétiques et autres ressources telles que la main d'œuvre et la facilité de poursuivre la culture doivent être prises en compte en développant des conditions de culture idéales.

En tout état de cause, il est souhaitable que les microalgues soient cultivées dans les conditions optimales pour augmenter le rendement de(s) l'acide(s) gras à produire. Ainsi, il est préférable d'avoir un rendement le plus élevé possible (par exemple au-delà de 50 g/l de matière sèche et plus de 60% d'acides gras par rapport à la matière sèche).

II serait souhaitable de pouvoir obtenir des rendements en acide caprique plus importants pour une exploitation industrielle plus efficace et rentable.

Il est connu, en outre, que certaines souches de microalgues du genre Botryococcus (Chlorophyta, Chlorophyceae, Chlorococcales, Disctyosphaericae) [ITIS, Catalogue of Life, 2010] sont capables de produire des hydrocarbures en quantité non négligeable, notamment des n-alkadiènes, triènes, squalènes méthylés, triterpénoïdes, tétraterpénoïdes et des lycopadiènes. Ces souches produisent, en outre, des hydrocarbures particuliers à longues chaînes carbonées, regroupés sous le nom de botryococcénes. Ces hydrocarbures consistent majoritairement en des triterpènes isoprénoïdes non ramifiés de formule C _n H _2n -io. Us peuvent être transformés par craquage et raffinage en kérosène ou gasoil. Trois races de B. braunii ont été répertoriées, lesquelles se différencient sur la base des hydrocarbures caractéristiques qu'elles produisent. La race A produit des n-alkadiènes impairs, C25 à C31 , ainsi que des triènes. La race B produit des hydrocarbures triterpénoïdes connus en tant que botryococcénes (CnH _2n -io _> n=30-37), d'origine isoprénoïde. La race L produit le lycopadiène, un tétraterpène C ₄ o- Botryococcus braunii est l'espèce, qui, à ce jour, a été la plus étudiée, en raison de la qualité de ses hydrocarbures, et de sa facilité à être cultivée en mode autotrophe. La culture de cette algue verte, réputée fortement pigmentée, s'opère généralement en conditions de forte luminosité, entre 500 et 1500 μηιοΙ. m ^"2 , s ^"1 .

La souche B. braunii var. Showa est connue pour accumuler jusqu'à 30 % de son poids sec en botryococcènes. Les chaînes grasses de ces botryococcènes comprennent entre 30 et 37 atomes de carbone [Plant Patent US 6 ,169]. Le génome de cette souche est actuellement en cours de séquençage.

Une variété mutante de cette souche, Botryococcus braunii var. Ninsei a été décrite comme pouvant sécréter les botryococcènes vers la matrice extracellulaire [US 2006/0265800]. Cette sécrétion a pour effet de rendre les colonies de Botryococcus flottantes par rapport à leur milieu de culture liquide, ce qui permet avantageusement de récolter les algues chargées en botryococcènes à la surface du milieu de culture.

La souche Botryococcus braunii B70, isolée par Tanoi et Kawaachi, [Tanoi et Kawaachi (2011 ) Effects of carbon source on growth and morphology of Botryococcus braunii, J. Appl Phycol. 23 :25-33], est capable de croître en conditions autotrophe, hétérotrophe et mixotrophe. En présence de glucose en conditions d'obscurité ou lumineuses, les cellules et les granules contenant l'huile présentaient une taille notablement supérieure à celle obtenue en l'absence de glucose.

Toutefois, aucune souche de Botryococcus n'est connue aujourd'hui pour la production de l'acide caprique. Le demandeur a ainsi recherché parmi les souches de Botryococcus, celles ayant la capacité de produire l'acide caprique.

Ainsi, c'est au terme de nombreuses expérimentations dans des conditions de lumière inhabituelles et par l'adjonction de différents substrats que le demandeur est parvenu à constater que des souches de microalgues des espèces Botryococcus braunii ainsi que Botryococcus sudeticus, quand elles sont cultivées en mode mixotrophe, permettent une production d'acide caprique. Plus particulièrement, le rendement en acide caprique est amélioré quand les microalgues sont cultivées en mode mixotrophe, en présence d'un éclairement variable discontinu, notamment sous forme de flashs.

Les souches concernées sont respectivement nommées FCC 828 (CCAP 807/6) et FCC 841 (CCAP 807/4). La souche FCC 828 appartient à l'espèce de Botryococcus braunii et la souche FCC 841 appartient à l'espèce Botryococcus sudeticus. Ces souches ont été déposées, le 20 octobre 2010, auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371QA, Ecosse, Royaume-Uni) selon les dispositions du Traité de Budapest.

Le procédé de culture et de sélection a consisté plus particulièrement à cultiver les microalgues en conditions de mixotrophie avec un substrat carboné organique. L'apport de lumière peut être continu, c'est-à-dire en mode de mixotrophie classique. La culture peut aussi s'effectuer en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, avec une gamme de variations d'intensité lumineuse et une fréquence spécifique.

L'alternance rapprochée de phases éclairées et de phases obscures ou de moindre intensité lumineuse, perçue généralement comme stressante par les microalgues, a permis, de façon surprenante, d'obtenir des souches de Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus une production élevée de biomasse, de lipides et plus particulièrement d'acide caprique. Cette mise en œuvre des souches selon l'invention ouvre la perspective d'une production industrielle d'acide caprique dans des fermenteurs bénéficiant d'un apport lumineux réduit, et devrait donc permettre de réaliser des économies d'énergie par rapport aux modes d'obtention de cet acide.

Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci- après.

Selon l'invention, le rendement de l'acide caprique par les microalgues cultivées en mode mixotrophe est de 30 à 80 % des acides gras totaux. Le rendement en biomasse, et donc en acide caprique, est amélioré en utilisant le procédé en présence d'un éclairement variable discontinu, notamment sous forme de flashs. Dans de telles conditions de culture, le rendement des microalgues en acide caprique peut être supérieur à 55% des acides gras totaux.

Légende de ia figure

Figure 1 :

Pourcentage des acides gras issus de la souche FCC 828 (CCAP 807/6) et de la souche FCC 841 (CCAP 807/4) en culture autotrophe et mixotrophe. A. Pour la souche FCC 828, le pourcentage des acides gras respectifs par rapport au pourcentage de lipides totaux apparaît en blanc pour les conditions autotrophes et en noir pour les conditions mixotrophes.

B. Pour la souche FCC 841 , le pourcentage des acides gras respectifs par rapport au pourcentage de lipides totaux apparaît en blanc pour les conditions autotrophes et en noir pour les conditions mixotrophes.

Description détaillée

La présente invention a donc pour objet un procédé de culture des microalgues du genre Botryococcus, notamment des espèces Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus en mode mixotrophe, pour la production de l'acide caprique. La culture peut être effectuée en mode mixotrophie « classique », c'est-à-dire avec un apport de lumière naturelle (culture en extérieur) ou un apport de lumière continu et constant.

Selon un mode d'invention, la culture s'effectue dans des conditions d'éclairement continu ou discontinu et/ou variable au cours du temps. L'éclairement présente des variations d'intensité dont l'amplitude est généralement comprise entre 5 μητιοΙ. m ^"2 , s ^"1 et 1000 pmol. m ^"2 , s ^"1 , de préférence entre 30 et 400 μιηοΙ. m ^"2 , s ^"1 . Ces variations peuvent généralement avoir lieu entre 2 et 3600 fois par heure, de préférence entre 2 et 200 fois par heure. Ces conditions de culture permettent d'apporter une quantité définie de lumière. Cet apport lumineux peut comporter des phases d'éclairement discontinu et/ou variable, avec des variations d'intensité pouvant avoir des amplitudes identiques ou différentes. L'éclairement peut être notamment sous forme de flashs.

Ce procédé a pour avantage d'augmenter le rendement en biomasse obtenu de la culture. Il a aussi pour avantage d'enrichir les microalgues ainsi cultivées en acide caprique. Ce procédé peut être également utilisé pour sélectionner des souches du genre Botryococcus, en particulier des espèces Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acide caprique.

La culture en mode mixotrophe de cette microalgue, quelles que soient les conditions d'éclairement, s'effectue préférentiellement en présence de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800 mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500 mM d'un substrat carboné organique. L'apport du substrat est assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de lipides. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration constante. Ce substrat carboné organique comprend préférentiellement, sous forme pure ou en mélange : du glucose, des dérivés de cellulose, de lactate, de l'amidon, du lactose, du saccharose, de l'acétate et/ou du glycérol. Le substrat préféré est de l'acétate de sodium.

Le substrat carboné organique contenu dans le milieu de culture peut consister en des molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés adaptés à la culture en mixotrophie des microalgues selon l'invention.

Ce procédé est plus particulièrement destiné à la mise en œuvre des souches de microalgues du genre Botryococcus (Phylum: Chlorophyta, Ordre : Chlorococcales, Famille : Dictyosphaeriaceae) [ITIS Catalogue of Life, 2010] sélectionnées pour leur caractère mixotrophe, notamment pour leur capacité à être cultivées avec un apport lumineux supérieur à 10 μΕ, dans le milieu 3NBBM+ V (CCAP - Culture Collection of Algae and Protozoa) dans lequel est ajouté un substrat carboné organique. De préférence, le substrat carboné organique comprend l'acétate dans une concentration équivalente ou supérieure à 5 mM.

Ces souches de Botryococcus, plus particulièrement de Botryococcus braunii et de Botryococcus sudeticus, peuvent être isolées et sélectionnées selon le procédé de sélection et de culture selon l'invention.

Une souche représentative des souches de Botryococcus braunii selon l'invention est la souche FCC 828, isolée par le demandeur et déposée à la CCAP le 20 octobre 2010, sous les numéros CCAP 807/6. Une autre souche représentative des souches de Botryococcus sudeticus selon l'invention est la souche FCC 841 , isolée par le demandeur et déposée à la CCAP le 20 octobre 2010, sous le numéro CCAP 807/4.

De telles souches sont capables de produire des quantités significatives d'acide caprique quand elles sont cultivées en mode mixotrophe. Le rendement de biomasse de ces souches est encore supérieur quand l'apport en lumière est variable ou discontinu, selon l'invention.

Selon les analyses taxonomiques en cours, les souches CCAP 807/6 et CCAP 807/4 appartiennent aux espèces Botryococcus braunii, race A et Botryococcus sudeticus respectivement. L'invention porte sur toute souche des espèces Botryococcus braunii ou Botryococcus sudeticus, capable de croître en conditions de culture mixotrophe, telles que décrites dans la présente demande, et capable de produire de l'acide caprique. L'invention porte aussi sur toute espèce de microalgue du genre Botryococcus, capable de croître en conditions de culture mixotrophe, telle que décrite dans la présente demande, et capable de produire de l'acide caprique.

La culture des souches de Botryococcus identifiées dans la présente demande en conditions de culture mixotrophe selon l'invention permet de produire, en conditions de mixotrophie classique, des quantités significatives de biomasse ainsi que des lipides très riches en acide caprique pouvant représenter plus de 30 %, plus de 45 %, plus de 60 %, ou plus de 75 % des lipides totaux contenus dans les microalgues (voir Figure 1).

La Figure 1 représente les profils lipidiques des souches FCC 828 et FCC 841 cultivées en mode mixotrophe (avec 5mM d'acétate de sodium en tant que substrat carboné organique) ou en mode autotrophe. La souche FCC 828 (Figure 1A) cultivée en mode autotrophe ne produit pas d'acide caprique. La majorité des acides gras obtenus de la culture en mode autotrophe consistent en C18 :1 n9, C18 :3n3, C16 :0, C18 :2n6t, et C20:5n3 (listés par ordre d'importance). La nomenclature physiologue est utilisée dans la figure pour identifier des acides gras. Par exemple, C18 :1n9 (acide oléïque) est un acide gras comportant une longueur de chaîne carbonée de 18 carbones, et une double liaison qui se situe au niveau du neuvième carbone à compter du groupement méthyl terminal.

De manière inattendue, le profil des acides gras obtenu de la culture de la souche FCC 828 en mode mixotrophe a changé radicalement. L'acide caprique représente maintenant la majorité des acides gras obtenus, avec des faibles pourcentages de C18 :1 n9, C18 :3n3, C16 :0, C18 :3n3, C18 :2n6t et C20:5n3.

La souche FCC 841 (Figure 1B) cultivée en mode autotrophe ne produit pas d'acide caprique non plus. La majorité des acides gras obtenus de la culture en mode autotrophe consiste en C16 :0, C18 :1 n9, C18 :3n3 et C18 :2n6t (listés par ordre d'importance), et en acides de chaînes C20 et C22 en faibles quantités.

De la même façon que ce que l'on observe pour la souche FCC 828, en mode mixotrophe, le profil de l'acide gras produit par la souche FCC 841 change radicalement en un profil très riche en acide caprique. L'acide caprique est, de loin, l'acide gras majoritaire obtenu, avec des faibles pourcentages de C18 :1 n9, C18 :3n3, C16 :0, C18 :3n3, C18 :2n6t et C20:5n3.

Pour les deux souches, l'acide caprique représente plus de 70 % des acides gras totaux obtenus.

Non seulement l'on observe un changement radical du profil lipidique obtenu des souches FCC 828 et FCC 841 d'une culture en conditions mixotrophes, mais l'on constate également une augmentation importante de la biomasse obtenue. Cette augmentation est de 10 à 20 %, plus généralement de 20 à 50 %, supérieure à celle d'une culture avec la même souche effectuée en mode autotrophe.

Selon un mode de l'invention, la culture s'effectue en conditions mixotrophes en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs. Dans ces conditions, la biomasse obtenue avec les souches FCC 828 et FCC 841 est de 10 à 20 %, plus généralement de 20 à 50 %, supérieure à celle d'une culture avec la même souche effectuée en mode mixotrophe classique. Par mode mixotrophe classique, on entend des conditions de culture avec un milieu de culture identique, mais avec un apport de lumière naturelle (culture en extérieur) ou un apport de lumière continu et constant.

L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture de microalgues du genre Botryococcus, notamment des espèces Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus en mode mixotrophe, en vue de produire de l'acide caprique. L'invention a aussi pour objet un tel procédé en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu au cours du temps, par exemple sous forme de flashs.

L'invention a ainsi pour objet un procédé de sélection des microalgues du genre Botryococcus, notamment des espèces Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acide caprique, en particulier en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu au cours du temps.

II est apparu qu'un éclairement variable et/ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en oeuvre d'une culture en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des algues et permettait d'accroître la productivité de celles-ci, notamment en ce qui concerne leur production de lipides. Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu et/ou variable de lumière aux microalgues a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la croissance et à la synthèse des lipides. Ce phénomène pourrait s'expliquer, en partie, par le fait que dans la nature, les microalgues ont tendance à accumuler des réserves lipidiques pour résister aux contraintes de leur environnement.

Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées.

Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs. Un flash, au sens de l'invention, est un éclairement lumineux de courte durée, c'est-à-dire de moins de 30 minutes. La durée peut être de moins de 15 minutes, de préférence de moins de 5 minutes ou plus préférentiellement encore de moins de 1 minute. Selon certains modes de réalisation de l'invention, la durée du flash peut être de moins d'une seconde. Par exemple, le durée du flash peut être de 1/10 d'une seconde, ou de 2/10 d'une seconde, ou de 3/10 d'une seconde, ou de 4/10 d'une seconde ou de 5/10 d'une seconde, ou de 6/10 d'une seconde, ou de 7/10 d'une seconde, ou de 8/10 d'une seconde, ou de 9/10 d'une seconde. L'éclairement lumineux, ou le flash, est généralement d'une durée supérieure à 15 secondes. Elle est généralement comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.

En général, le nombre de flashs est compris entre environ 2 et 3600 par heure. Il peut être, par exemple, compris entre 100 et 3600 flashs par heure. Il peut être également compris entre 20 et 3000, ou entre 400 et 2500, ou entre 600 et 2000, ou entre 800 et 1500 flashs par heure. Il peut être également compris entre 2 et 200, préférentiellement entre 10 et 150, plus préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement encore entre 20 et 50 par heure. Les flashs peuvent être émis à intervalle régulier ou non dans le temps. En cas d'émission à intervalle régulier, le nombre de flashs par heure correspond alors à une fréquence (F) ayant une période temporelle (T), étant considéré que F = 1/T. Cette période temporelle peut être comprise entre 1 seconde et 30 minutes, ou entre 1 seconde et 36 secondes, ou encore entre 1 ,2 seconde et 30 secondes, ou entre 1 ,44 seconde et 9 secondes, ou entre 1 ,8 seconde et 6 secondes, ou entre 2,4 secondes et 4,5 secondes. Cette fréquence peut être également comprise entre 18 secondes et 30 minutes, préférentiellement entre 24 secondes et 6 minutes, plus préférentiellement entre 36 secondes et 4 minutes, et plus préférentiellement encore entre 72 secondes et 3 minutes. Le nombre de flashs par heure est choisi en fonction de l'intensité et la durée des flashs (voir ci-dessous). En général, l'intensité de la lumière apportée sous forme de flashs est entre 5 et 1000 pmol. m ^"2 , s ^"1 , de préférence entre 5 et 500 μητιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ou 50 et 400 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , et plus préférentiellement entre 150 et 300 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Par définition, 1 pmol. m ^"2 , s ^"1 correspond à 1 μΕ m ^"2 , s ^"1 (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature.

Selon un mode particulier de l'invention, l'intensité de la lumière est comprise entre 50 et 200 pmol. m ^"2 , s ^"1 , la période temporelle de la fréquence des flashs est comprise entre 10 secondes et 60 minutes pour une durée de flash comprise entre 1 seconde et 1 minute.

Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, mais que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de l'intensité de lumière est régulière et peut être périodique ou cyclique. Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues.

Selon l'invention, quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (μιηοΙ. m ^"2 , s ^"1 ), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement comprise entre 5 et 1000, ou entre 50 et 800, ou entre 100 et 600 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 . L'intensité de la lumière peut également varier, entre 5 et 400 pmol. m ^"2 , s ^"1 . De préférence, l'amplitude de la variation d'intensité de lumière est entre 70 et 300 pmol. m ^"2 , s ^"1 , et plus préférentiellement entre 100 et 200 pmol. m ^"2 , s ^'1 .

Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, en conditions d'éclairement variable, par exemple, les valeurs 50 pmol. m ^"2 , s ^"1 et 100 pmol. m ^"2 s ^" \ ou 5 et 400 μηιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ou 50 et 800 pmol. m ^"2 , s ^"1. plusieurs fois chaque heure. Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, de préférence, les valeurs 50 et 200 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Alternativement, en conditions d'éclairement discontinu, ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 50 μηιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , les valeurs 0 et 100 pmol. m ^"2 , s ^"1 ou préférentiellement encore les valeurs 0 et 200 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Elle peut également atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 300 pmol. m ^"2 , s ^"1 , les valeurs 0 et 600 pmol. m ^"2 , s ^"1 , les valeurs 0 et 800 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 ou encore les valeurs 0 et 1000 pmol. m ^'2 , s ^"1 .

Selon un mode de l'invention et quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité de la lumière apportée à la culture varie en fonction de la densité cellulaire. Plus la culture devient dense, plus la lumière peut être intense. La densité cellulaire est le nombre de cellules par ml et elle est mesurée selon les techniques connues de l'homme de l'art.

Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est comprise entre environ 10 ⁵ et 5 x10 ⁵ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 15 μιηοΙ. m ^"2 , s ^"1 , de préférence, entre 5 et 10 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Quand la culture atteint une densité entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 15 et 200 pmol. m ^"2 , s ^"1 , par exemple, de préférence, entre 20 et 50 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 50 et 400 pmol. m ^"2 , s ^"1 par exemple, de préférence, entre 50 et 150 pmol. m ^"2 , s ^"1 .

Selon certains modes de réalisation, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou moins d'une seconde, l'intensité de la lumière peut être plus importante par rapport aux valeurs citées ci-dessus. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est entre environ 10 ⁵ et 5 x10 ⁵ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 200 pmol. m ^"2 , s ^"1 , de préférence, entre 5 et 100 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Quand la culture atteint une densité entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 30 et 500 pmol. m ^"2 , s ^"1 , par exemple, de préférence, entre 50 et 400 pmol. m ^"2 , s ^"1 . Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 100 et 1000 pmol. m ^"2 , s ^"1 par exemple, de préférence, entre 200 et 500 pmol. m ^"2 , s ^"1 .

Selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture dans l'heure reste entre certaines valeurs. Elle est comprise entre environ 2000 et 600 000, de préférence entre 2000 et 300 000 pmol. m ^"2 . Elle peut être comprise entre environ 4000 et 200 000 pmol. m ^"2 , par heure.

Selon un mode de l'invention, la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 10 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 9000 pmol. m ^"2 . Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 20 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 20 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 12 000 pmol. m ^"2 . Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 45 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 15 secondes et une intensité de 5 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 3375 pmol. m ^"2 . Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité de 200 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 240 000 μιτιοΙ. m ^"2 .

Comme décrit pour l'intensité lumineuse ci-dessus, et selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture par heure peut varier en fonction de la densité cellulaire. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est 10 ⁵ et 5 x 10 ⁵ cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure est généralement compris entre environ 1500 et 8000, de préférence 1500 et 6000 μητιοΙ. m ^"2 , de préférence encore, entre 2000 et 5000 pmol. m ^"2 . Quand la culture atteint une densité entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 6000 et 67 000 pmol. m ^"2 , de préférence, entre 6000 et 50 000 et de préférence encore entre 12 000 et 45 000 pmol. m ^"2 , par exemple. Au stade final de la culture, à une densité cellulaire entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 45 000 et 300 000, par exemple, de préférence, entre 45 000 et 200 000 pmol. m ^"2 , et par exemple, de préférence encore, entre 50 000 et 150 000 pmol. m ^"2 .

Selon un mode de l'invention au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 10 ⁵ et 5 x 10 ⁵ cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 5 et 10 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 2250 pmol. m ^"2 à 4500 pmol. m ^"2 . Puis au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 15 et 50 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 13 500 à 45 000 pmol. m ^"2 . Puis au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 50 et 150 μηιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 45 000 à 135 000 pmol. m ^"2 .

Selon un mode de l'invention, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple moins d'une minute, ou moins d'une seconde, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 10 ⁵ et 5 x 10 ⁵ cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 50 et 100 μητιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 15 000 pmol. m ^"2 à 30 000 pmol. m ^"2 . Puis au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml), la culture est illuminée avec 50 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 200 et 300 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 100 000 à 150 000 μιτιοΙ. m ^"2 . Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml), la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 350 et 450 pmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 420 000 à 540 000 pmol. m ^'2 .

L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante.

Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi sélectionnées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue et/ou variable, prédispose lesdites souches à une production plus élevée d'acide caprique.

Le procédé de culture selon l'invention permet ainsi de sélectionner des souches du genre Botryococcus, en particulier des espèces de Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus, à caractère mixotrophe, similaires à celles isolées par le demandeur et déposées à la CCAP sous les numéros CCAP 807/6 et CCAP 807/4, et ayant un haut rendement en acide caprique. Ce procédé de culture est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Botryococcus dans des conditions d'éclairement discontinu ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 pmol. m ^"2 , s ^"1 et 1000, de préférence entre 5 et 400 μιηοΙ. m ^"2 . s ^"1 , ces variations ayant lieu entre 2 et 3600, de préférence 5-400 fois par heure,

b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations, en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement

c) une étape de récupération des microalgues ainsi cultivées.

Par étape de récupération, on entend plus particulièrement l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations.

Pour réaliser la sélection des souches, différentes souches du genre Botryococcus, en particulier des espèces Botryococcus braunii ou Botryococcus sudeticus, peuvent être cultivées, en parallèle, sur des microplaques dans une même enceinte, avec un suivi précis des conditions et de l'évolution des différentes cultures. Il est ainsi aisé de connaître la réponse des différentes souches à l'éclairement discontinu et/ou variable et, le cas échéant, à l'adjonction d'un ou plusieurs substrats carbonés dans le milieu de culture. Les souches qui répondent favorablement à l'éclairement discontinu et/ou variable et aux substrats carbonés offrent généralement un meilleur rendement pour la production de lipides sur le plan qualitatif (acide caprique plus abondant dans le profil lipidique) et quantitatif (les lipides contiennent une proportion plus élevée d'acide caprique).

Les microalgues peuvent être sélectionnées dans un fermenteur à partir d'une population hétérogène et dont on cherche à sélectionner les variants avantagés par le mode de sélection selon l'invention, alliant lumière discontinue et/ou variable, présentant une gamme d'intensité lumineuse et une fréquence spécifiques, avec des conditions de culture mixotrophe. Dans ce cas, la culture est pratiquée en maintenant les microalgues en cultures sur de nombreuses générations, puis un isolement des composantes devenues majoritaires dans le milieu de culture est effectué au terme de la culture.

Le procédé de culture selon l'invention permet également de produire des lipides.

Dans ce cas, le procédé selon l'invention comporte en outre les étapes suivantes :

d) une étape de récupération des lipides des microalgues, et éventuellement e) l'extraction d'acide caprique des lipides récupérés.

Le procédé de culture selon l'invention peut s'appliquer également à toute espèce du genre Botryococcus, capable de croître dans les conditions mixotrophes selon l'invention, et capable de produire de l'acide caprique.

Le procédé de culture selon l'invention permet d'optimiser la production de la biomasse obtenue de la culture. Il permet également d'enrichir les microalgues ainsi cultivées en acides gras, plus particulièrement en acide caprique.

L'invention a donc également pour but l'optimisation de la production de biomasse, ainsi que la production de lipides, notamment d'acides gras, via la culture de microalgues du genre Botryococcus à caractère mixotrophe, de préférence cultivées ou sélectionnées selon les procédés visés précédemment, puis la récupération des microalgues ainsi cultivées pour en extraire le contenu lipidique, en particulier l'acide caprique. Les souches des espèces Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus sont spécialement concernées.

Les méthodes d'extraction sélective des lipides, dont l'acide caprique, sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par [Bligh, E.G. et Dyer, W.J. (1959); A rapid method of total lipid extraction and purification, Carj. J. Biochem. Physiol., 37:911-917].

L'invention porte également sur les microalgues du genre Botryococcus braunii et du genre Botryococcus sudeticus, susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention tel que précédemment décrit. Ces microalgues sont enrichies en acide caprique. Les lipides totaux de telles microalgues comprennent généralement plus de 30 %, plus de 45 %, plus de 60 % ou plus de 75 % des lipides totaux contenus dans les microalgues.

Exemple 1

Culture des souches de Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus en mode mixotrophe classique et autotrophe : Les cultures de Botryococcus braunii ont été réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 2L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 1 N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture est fixée à 22°C. L'agitation est réalisée grâce à 3 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration de Rushton (hélices tripales à pompage descendant). La vitesse d'agitation et le débit d'aération sont régulés au minimum = 100 rpm et au maximum = 250 rpm et Qmini =0,5 vvm / Qmaxi = 2 vvm respectivement. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente.

Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table agitante (140 rpm) en enceinte thermostatée (22°C) et éclairée entre 80 et 100 uE. Les pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu 3NBBM+ V (CCAP-Culture Collection of Algae and Protozoa), Dans le cas de la mixotrophie, le carbone organique sous forme d'acétate de sodium (100 et 150 mM) a été rajouté dans le milieu de culture.

Suivi des cultures :

La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GFC, Whatman, puis séchage à l'étuve sous vide, 65°C et -0,8 bar, pendant 24h minimum avant pesée).

Concernant la quantification des lipides totaux, 7.10 ⁸ cellules/mL ont été extraites. Les méthodes d'extraction des lipides sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par Bligh, E.G. et Dyer, W.J. (1959).

Analyses des Acides gras

L'analyse des acides gras est réalisée par chromatographie en phase gazeuse après trans-estérification des lipides, selon des méthodes connues de l'homme de métier.

Les résultats sont montrés dans la Figure 1.