La présente invention concerne un procédé de sélection ou d'obtention de plantes présentant une teneur en lignines réduite.

Les lignines sont des polymères insolubles situés dans les parois végétales et issus de la polymérisation de 3 monomères phénoliques (ou monolignols) , dérivant de la voie des phénylpropanoïdes (NEISH, Constitution and Biosynthesis of Lignin, eds New York: Springer Verlag, 1-43, 1968) . Leur voie de biosynthèse est complexe et comporte différentes étapes dont une partie est réalisée dans le cytoplasme (synthèse des monolignols) et une autre dans la paroi (polymérisation) . Les alcools p- coumarylique, coniférylique et sinapylique sont les précurseurs respectifs des unités p-hydroxyphényles (H) , guaïacyles (G) et syringyles (S) constituant les lignines. Ces précurseurs sont oxydés en radicaux phénoliques qui se couplent spontanément par diverses liaisons, ce qui conduit à la formation des lignines. Parmi les liaisons interunités, on distingue des liaisons labiles, nommées β-O-4 et des liaisons résistantes. Lors de la polymérisation, d'autres liaisons peuvent également s'établir avec d'autres composés pariétaux (polysaccharides et protéines) pour former un réseau tridimensionnel complexe. La formation des radicaux phénoliques serait catalysée par des oxydases, telles que des péroxydases, des laccases ou d'autres oxydases. Un nombre important de ces enzymes en association avec des protéines de régulation serait nécessaire à l'assemblage des unités H, G et S (BOUDET, Plant Physiol. Biochem., 38, 81-96, 2000 ; voir pour revue : RALPH et al., Lignins, Encyclopedia of Life Sciences, John Wiley & Sons, 2007). Toutefois ces enzymes sont encore mal identifiées car appartenant à des familles multigéniques (BARRIERE et al., Gènes, Génomes and Genomics ; Global Siences Books, 2007, Review) . Bien que les mécanismes impliqués in vivo dans la biosynthèse des lignines ne soient pas complètement élucidés, il est généralement considéré que les laccases pourraient intervenir dans les premières étapes de polymérisation, pour la formation de dimères ou trimères, tandis que les péroxydases permettraient d' obtenir un degré de polymérisation supérieur à partir des dimères et trimères (ROS BARCELO, International Review of Cytology, 176, 87-132, 1997) . La teneur en lignines des plantes a une influence majeure sur leurs utilisations industrielles. Par exemple, elle affecte la valeur nutritive des plantes destinées à l'alimentation animale, ainsi que les performances des procédés papetiers (rendement et qualité de la pâte à papier obtenue) et le rendement de production de biocarburant. En effet : une composante importante de la valeur nutritionnelle des plantes fourragères, telles que le maïs fourrager, est la digestibilité . Ainsi, des vaches nourries avec des variétés plus digestibles présentent une augmentation de la production de lait et une meilleure prise de poids. En outre, ces variétés plus digestibles permettent aux animaux d'atteindre leur potentiel avec un plus faible niveau de complémentation, ce qui permet en particulier de réduire les coûts de production. Un facteur important limitant la digestibilité des plantes fourragères est lié à la présence, dans les parois des cellules végétales, de lignines : les lignines établissent différents types de liaisons avec les autres constituants pariétaux (dont les polysaccharides) et gênent l'accessibilité des enzymes digestives aux polysaccharides (glucides), principales sources d'énergie pour les herbivores ;

- l'essentiel de la pâte à papier est obtenu par délignification chimique du bois, afin d'isoler les fibres végétales constituées principalement de cellulose et liées en elles par les lignines. Cependant, cette étape de délignification est très exigente en énergie et en réactifs

(acides notamment), en raison de la résistance des lignines aux dégradations chimiques. Dans le cas de la production de pâte à papier par voie thermo-mécanique, les lignines qui ne sont pas éliminées sont responsables du photojaunissement du papier. Les lignines riches en unités

S sont plus sensibles aux procédés papetiers de délignification dans la mesure où les unités S sont surtout liées par liaisons β-0-4 (liaisons cibles de ces procédés). En conséquence, dans le cas des bois de feuillus employés par les industies papetières, une plus forte teneur en unités S liées en β-0-4 est recherchée dans le secteur papetier pour améliorer le rendement de la cuisson papetière (GUERRA et al., Ind. Eng. Chem. Res., 47, 8542- 8549, 2008) ;

- les biocarburants sont formés à partir de bioéthanol (un produit miscible à l'essence) ou d'huile

(pour fabriquer un produit diesel) . La production de bioéthanol, réalisée actuellement à partir d'amidon ou de saccharose, pourrait aussi s'effectuer à partir de la cellulose du bois ou de la paille. Dans ce cas, le procédé de production comprend les étapes suivantes : prétraitement acide de la matière première pour rompre les interactions entre lignines et polysaccharides (ce prétraitement facilite l'action d'enzymes hydrolytiques qui transforment les polysaccharides de la paroi en sucres simples), suivi d'une étape de fermentation des sucres simples, conduisant à la production de bioéthanol. Cependant, le prétraitement acide initial entraîne la production de composés capables d'inhiber l'étape de fermentation. Il a donc été suggéré qu'en modifiant les lignines, les polysaccharides pariétaux seraient plus accessibles aux enzymes hydrolytiques. Cela permettrait non seulement de supprimer ou limiter le prétraitement acide et les problèmes associés d' inhibition de la fermentation, mais aussi de diminuer les impacts environnementaux liés aux résidus des traitements par 1' acide . Dans ce contexte, la modification quantitative des lignines dans les plantes fait l'objet de nombreuses recherches. La modification qualitative des lignines (modification de leur structure ou de leurs interactions avec les autres polymères des parois) est également très étudiée. Par exemple, des lignines riches en unités S et en liaisons β-0-4 sont beaucoup plus faciles à éliminer lors de la production de pâte à papier par voie chimique.

Une des voies privilégiées pour diminuer la teneur en lignines dans les plantes concerne la production par génie génétique de plantes. Il a ainsi été proposé d' agir sur les enzymes de la voie de biosynthèse des lignines, telles que les laccases (Demande Internationale WO 97/45549) , les péroxydases (Demande Internationale WO 2004/080202) la Cinnamoyl CoA réductase (CCR ; Demandes Internationales WO 97/12982 et WO 98/39454), l'acide caféique O-méthyltransférase (COMT ; Demande Internationale WO 94/23044 ; OBA et ALLEN, J. Dairy Sci . , 82, 135-142, 1999) , la Caféoyl Coenzyme A 3-0 méthyltransférase (CCoAOMT ; Demande EP 0516958 ; GUO et al., Transgenic Res. 10, 457-464, 2001), la Cinnamyl alcool déshydrogénase (CAD ; LAPIERRE et al., Plant Physiol., 119, 153-164, 1999), et la 4-coumarate : coenzyme A ligase (4CL ; HU et al., Nat. Biotech. 17, 808-812, 1999). En ce qui concerne plus particulièrement les laccases, la Demande Internationale WO 97/45549 décrit une laccase de tabac (dont la séquence est par ailleurs décrite par KIEFER-MAYER et al., Gène, 178, 205-207, 1996), et propose d'augmenter ou de réduire la quantité de lignines produite par une plante en surexprimant ladite laccase (ou une protéine présentant au moins 50% d'acides aminés homologues à ceux de ladite laccase), ou en inhibant son expression .

Chez Arabidopsis thaliana, la famille multigénique des laccases comporte 17 membres, dont 7 sont exprimés au niveau des tiges, l'organe le plus lignifié. Les gènes les plus fortement exprimés sont LAC4 (At2g38080), LACll (At5g60020) et LAC2 (At2g29130). Les gènes LAC2 et LACll appartiennent à la même sous-classe et le gène LAC4 appartient à une sous-classe proche selon les arbres phylogénétiques publiés par POURCEL et al. (Plant CeIl, 17, 2966-2980, 2005) et CAPARROS-RUIZ et al. (Plant Science, 171, 217-225, 2006). Le gène LACll code pour la protéine LAC17 (AtLAC17), dont la séquence est disponible sous le numéro d'accession NM_125395 dans la base de données GENBANK, et est également reproduite dans la liste de séquences en annexe sous l'identifiant SEQ ID NO : 2. Le gène LAC4 code pour la protéine LAC4 (AtLAC4), dont la séquence est disponible sous le numéro d'accession NM_129364 dans la base de données GENBANK, et est également reproduite dans la liste de séquences en annexe sous l'identifiant SEQ ID NO : 4. Le gène LAC2 code pour la protéine LAC2 (AtLAC2), dont la séquence est disponible sous le numéro d'accession NM_128470 (GI : 186503951) dans la base de données GENBANK. Chez Arabidopsis AtLAC17 est exprimée au niveau des fibres interfasciculaires . Les Inventeurs ont ainsi mis en évidence que les protéines orthologues de la protéine AtLAC17 présentent au moins 60% d'identité ou au moins 75% de similarité avec celle-ci et comprennent, de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale, au moins l'un des 4 domaines peptidiques consensus de séquence :

• H-W-H-G-I/V-R-Q-L (SEQ ID NO : 12 ; acides aminés correspondant aux positions 80-87 de la séquence peptidique d'AtLAC17) ou H-W-H-G-I/V-R/L-Q-L/M/V (SEQ ID NO : 38) , • I/V-N-A-A-L-N-D-E-L-F-F (SEQ ID NO : 13 ; acides aminés correspondant aux positions 223-233 de la séquence peptidique d'AtLAC17) ou I-N-A/S-A-L-N/E-D/N/E-E-L-F-F (SEQ ID NO : 39) ,

• E-S-H-P-L-H-L-H-G-F/Y-N/D-F-F-V-V-G-Q-G-F/Y-G-N-F/Y-D (SEQ ID NO : 14 ; acides aminés correspondant aux positions 476-498 de la séquence peptidique d'AtLAC17), ou E-S-H-P-L/F-H-L/M-H-G-F/Y-N/D-F/Y-F/Y-V-V/I-G-Q/T/E- G-F/V/T-G-N-F/Y-D/N (SEQ ID NO : 40) et

• A-D-N-P-G-V-W (SEQ ID NO : 15 ; acides aminés correspondant aux positions 539-546 de la séquence peptidique d'AtLAC17), ou A/V-D-N-P-G-V/0-W/0 (SEQ ID

NO : 41), où « 0 » indique qu'un acide aminé est absent, respectivement .

A titres d'exemples non-limitatifs d' orthologues de la protéine LAC17 d'Λ. thaliana , on citera notamment les laccases de :

-maïs ( Zea mays) de séquences SEQ ID NO : 5 et

6 (séquences également disponibles sous les numéros d'accession NM_001112405.1 et EU957078 dans la base de données GENBANK) et les séquences disponibles dans la base de données GENBANK sous les numéros d'accession

GI:162461426 (SEQ ID NO : 42), GI:226503958 (SEQ ID NO :

43), GI:226494660 (SEQ ID NO : 44), GI:212721074 (SEQ ID

NO : 45), GI.162463584 (SEQ ID NO : 46) et GI.162461268

(SEQ ID NO : 47) , - de la canne à sucre (Saccharum offieinarum) de séquence SEQ ID NO : 7,

- du sorgho {Sorghum bicoior) de séquences SEQ ID NO : 8, 9, 10 et 11, de Brachypodium, telles que les séquences Bradilg66720 (SEQ ID NO : 48), Bradi2g54680 (SEQ ID NO : 49), Bradilg24910 (SEQ ID NO : 50), Bradilg24880 (SEQ ID NO : 51), Bradi2g54740 (SEQ ID NO : 52), Bradi2g23370 (SEQ ID NO : 53), Bradi2g23350 (SEQ ID NO : 54) et Bradi2g54690 (SEQ ID NO : 55) , - de riz, telles que les séquences disponibles dans la base de données GENBANK sous les numéros d'accession GI:113548170 (SEQ ID NO : 56), GI.113534304

(SEQ ID NO : 57), GI:113579298 (SEQ ID NO : 58),

GI.113579297 (SEQ ID NO : 59), GI:113534303 (SEQ ID NO : 60), GI.113579295 (SEQ ID NO : 61), GI.255673866 (SEQ ID

NO : 62) (ces séquences possèdent le domaine référencée sous le numéro d'accès IPR017761 dans la base de données InterPro) , et

- de peuplier, telles que les séquences PtLACl (gène POPTR_0001sl4010.1 ; SEQ ID NO : 63), PtLAC40 (POPTR_0001s41160.1 ; SEQ ID NO : 64), PtLAC41 (POPTR_0001s41170.1 ; SEQ ID NO : 65), PtLAC6 (POPTR_0001s41170.1 ; SEQ ID NO : 66), PtLAC24 (POPTR_0011sl2090.1 ; SEQ ID NO : 67) et PtLAC25 (POPTR_0011sl2100.1 ; SEQ ID NO : 68). Le tableau représenté à la Figure 5 montre la présence (notée dans le tableau par le signe « X ») des domaines peptidiques consensus tels que définis ci-dessus dans les séquences des orthologues de la protéine AtLAC17 chez Zea mays, S. officinarum, Sorghum bicolor, Brachypodîum, le peuplier et le riz, ainsi que les pourcentages d'identité et de similarité respectifs par rapport à AtLAC17.

La protéine LAC17 présente 55,2% d'identité avec la protéine LAC4, et 67,1% d'identité avec la protéine LAC2 mais cette dernière ne comprend pas le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 14, et 54,6% d' identité avec la laccase de tabac décrite dans la Demande Internationale WO 97/45549 ; la protéine LAC4 présente 54,0% d'identité avec la protéine LAC2 et 75,8 d'identité avec la laccase de tabac décrite dans la Demande Internationale WO 97/45549 (il apparait que ladite laccase de tabac est l'orthologue de la protéine AtLAC4) , les pourcentages d' identité étant calculés sur toute la longueur des séquences à l'aide du programme needle (NEEDLEMAN et WUNSCH, J. Mol. Biol., 48, 443-453, 1970) en utilisant les paramètres par défaut : « Matrix » : EBLOSUM62, « Gap penalty » : 10,0 et « Extend penalty » : 0,5. Chez Arabidopsis, AtLAC4 est exprimée au niveau des vaisseaux du xylème et dans les fibres interfasciculaires . A titres d'exemples non-limitatifs d' orthologues de la protéine LAC4 d'A. thaliana , on citera notamment les laccases de : Brachypodium, telle que la séquence

Bradilg74320 (SEQ ID NO : 69), qui présente 67% d'identité et 83% de similarité avec la séquence SEQ ID NO : 4,

- riz, telle que la séquence disponible dans la base de données GENBANK sous le numéro d'accession

GI: 150383842 (QOIQUl ; SEQ ID NO : 70), qui présente 69% d'identité et 83% de similarité avec la séquence SEQ ID

NO : 4, et peuplier, les séquences PtLAC14 (POPTR_0006s09830.1 ; SEQ ID NO : 71, qui présente 75% d' identité et 87% de similarité avec la séquence SEQ ID NO : 4), PtLAC15 (POPTR_0006s09840.1 ; SEQ ID NO : 72, qui présente 76% d'identité et 87% de similarité avec la séquence SEQ ID NO : 4), PtLAC32 (POPTR_0016sll950.1 ; SEQ ID NO : 73, qui présente 78% d'identité et 88% de similarité avec la séquence SEQ ID NO : 4) et PtLAC33

(POPTR_0016sll960.1 ; SEQ ID NO : 74, qui présente 77% d' identité et 87% de similarité avec la séquence SEQ ID

NO : 4) . Des lignées d'A. thaliana de la collection SALK dans l'accession CoIO (Columbia) présentant des insertions d'ADN-T au niveau des gènes LACIl (lignée SALK_016748 ) , LAC4 (lignée SALK_051892 ) et LAC2 (lignée SALK_025690) ont été identifiées. Les mutants Iac4 et Iac2 ont notamment été décrits par BROWN et al. (Plant CeIl, 17, 2281-2295, 2005). Ces mutants présentent une expression du gène muté fortement réduite ou nulle mais ne présentent pas de phénotype particulier en serre.

Les Inventeurs ont recherché si ces mutations avaient un effet sur la quantité de lignines des plantes mutées, et leurs propriétés qualitatives (structurales) . Ils ont constaté que le mutant Iac2 ne présentait pas de différence notable par rapport à la lignée sauvage CoIO, mais qu'en revanche, les mutants Iac4 et lacll contenaient une quantité de lignines (déterminée sur des tiges sèches matures) réduite de 6 a 8% et présentaient un rendement en cellulolyse augmenté de 17% dans le cas de lacll et de 52% dans celui de Iac4, par rapport à la lignée sauvage CoIO (cellulolyse effectuée sans prétraitement acide) .

En outre, les Inventeurs ont obtenu par croisement, à partir des mutants Iac4 et lacll, des double- mutants Iac4/lacl7. Ils ont constaté que ces double-mutants présentaient une quantité de lignines très réduite (de 19% environ par rapport à la lignée sauvage CoIO), et un meilleur rendement en cellulolyse par rapport à la lignée sauvage CoIO (+ 25% à + 42%) et au simple mutant lacll (+ 6% à + 21%) environ.

En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé pour réduire la teneur en lignines d'une plante et augmenter la cellulolyse des parois de ladite plante, caractérisé en ce que l'on inhibe totalement ou partiellement l'expression et/ou l'activité dans ladite plante : a) d'une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 60% d'identité, et par ordre de préférence croissant au moins 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% d'identité, ou au moins 75% de similarité, et par ordre de préférence croissant au moins 78%, 79%, 80%, 83%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% et 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 2 (LAC17), et comprend, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-terminale, au moins l'un des 4, de préférence au moins 2 des 4, de préférence encore au moins 3 des 4 et plus préférentiellement les 4 domaines peptidiques consensus i) à iv) respectivement, suivants : i) le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 12 ou 38, ii) le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 13 ou 39, iii) le domaine peptidique consensus de séquence SEQ ID NO : 14 ou 40, iv) le domaine peptidique consensus de séquence

SEQ ID NO : 15 ou 41, et b) d'une laccase dont la séquence polypeptidique possède au moins 65% d'identité, et par ordre de préférence croissant au moins 70%, 75%, 80%, 85%,

90%, 95%, 97%, 98% et 99% d'identité, avec la séquence SEQ ID NO: 4 (LAC4) .

On entend par « teneur en lignines », la teneur en lignines Klason. Cette teneur peut être mesurée par le dosage de la fraction de lignine acido-insoluble (LAS) présente dans le résidu pariétal (RP) d'une plante, tel que décrit à l'Exemple 3 ci-dessous.

On entend par « laccase » une enzyme (EC 1.10.3.2) à cuivre qui catalyse l'oxydation d'un substrat phénolique en utilisant le dioxygène comme accepteur final d' électrons . Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité indiqués ici sont établis, comme indiqué ci- dessus, à l'aide du programme needle en utilisant les paramètres par défaut.

La présente invention s'applique aux plantes dicotylédones ou monocotylédones . A titre d'exemples non limitatifs, elle peut s'appliquer au maïs, blé, orge, seigle, triticale, avoine, riz, sorhgo, canne à sucre, peuplier et pin.

A titre d'exemples non limitatifs de laccases, telles que définies au paragraphe a) ci-dessus, on peut citer, chez le maïs {Zea mays) , les séquences peptidiques SEQ ID NO : 5, 6 et 42 à 47, chez la canne à sucre (Saccharum officinarum) , la séquence SEQ ID NO : 7, chez le sorgho (Sorghum bicolor) , les séquences peptidiques SEQ ID NO : 8 à 11, chez Brachypodium, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 48 à 55), chez le riz, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 56 à 62, et chez le peuplier, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 63 à 68.

A titre d'exemples non limitatifs de laccases, dont la séquence polypeptidique possède au moins 60% d'identité ou au moins 75% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 2 et comprend, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-terminale, les 4 domaines peptidiques consensus de séquence SEQ ID NO : 12, 13, 14 et 15 respectivement, on peut citer chez le maïs, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 5, 6, 42, 43, 44 et 45, chez la canne à sucre, la séquence peptidique SEQ ID NO : 7, chez le sorgho, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 8 (séquence partielle de la protéine), 9, 10 et 11, chez Brachypodium, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 50 et 51, chez le riz, la séquence peptidique SEQ ID NO : 58, et chez le peuplier, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 63, 67 et 68.

A titre d'exemples non limitatifs de laccases, dont la séquence polypeptidique possède au moins 65% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 4, on peut citer chez Brachypodium, la séquence peptidique SEQ ID NO : 69, chez le riz, la séquence peptidique SEQ ID NO : 70 et chez le peuplier, les séquences peptidiques SEQ ID NO : 71 à 74.

L' inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité d'une laccase telle que définie ci-dessus peut être obtenue de diverses manières, par des méthodes connues en elles mêmes.

De manière particulièrement avantageuse, cette inhibition peut être obtenue en intervenant en amont de la production de ladite laccase, par mutagenèse du gène codant pour cette protéine, ou bien par inhibition ou modification de la transcription ou de la traduction de cette laccase.

La mutagenèse du gène codant pour ladite laccase peut intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression, notamment du promoteur. On peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie dudit gène et/ou à l'insertion d'une séquence exogène. A titre d'exemple, pour le maïs, on citera la mutagenèse insertionnelle : on produit un grand nombre d'individus dérivant d'une plante active pour la transposition d'un élément transposable (élément AC ou Mutator) , et on sélectionne, par exemple par PCR, les plantes chez lesquelles une insertion s'est effectuée dans le gène de ladite laccase. Cette séquence exogène peut aussi être un ADN-T (fragment du plasmide Ti d' Agrobacterium tumefaciens) .

On peut également introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles avec des agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Ces mutations ont pour conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop dans la séquence et/ou de modifier le niveau de la transcription et/ou de la traduction du gène et/ou de rendre l'enzyme moins active que la protéine sauvage. Les allèles mutés du gène de ladite laccase peuvent être identifiés par exemple par PCR a l'aide d'amorces spécifiques dudit gène.

Dans ce cadre, on peut notamment utiliser des techniques de type « TILLING » (Targeting Induced Local Lésions IN Génomes ; McCALLUM et al, Plant Physiol., 123, 439-442, 2000) .

On peut aussi effectuer une mutagenèse dirigée, ciblant le gène codant pour ladite laccase. L'inhibition ou la modification de la transcription et/ou de la traduction peuvent être obtenues par l'expression d'ARN sens, antisens ou double-brin dérivés du gène de ladite laccase, ou de l'ADNc de cette protéine, ou bien par l'utilisation d'ARNs interférents (pour revue sur les techniques d' inhibition antisens voir par exemple : WATSON et GRIERSON, Transgenic Plants : Fundamentals and Applications (HIATT, A, ed) New York : Marcel DEKKER, 255-281, 1992 ; CHICAS et MACINO, EMBO reports, 21, 992-996, 2001 ; pour revue concernant plus spécifiquement l'utilisation des ARNs interférents voir HANNON, Nature, 418, 244-251, 2002).

La présente invention a également pour objet une construction d'ADN recombinant, comprenant un ou plusieurs polynucléotides capables d'inhiber l'expression des deux laccases telles que définies ci-dessus. A titre d'exemples non limitatifs, lesdits polynucléotides peuvent coder pour des ARN antisens, des ARN interférents (ARN double brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides) , des micro-ARN (ARN simple brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides) (OSSOWSKI et al., The Plant Journal, 53, 674-690, 2008 ; SCHWAB et al., Methods Mol Biol . , 592, 71-88, 2010 ; WEI et al., Funct Integr Genomics . , 9, 499-511, 2009) ou des ribozymes ciblant le gène codant pour une laccase telle gue définie ci-dessus .

De préférence, lesdits polynucléotides capables d'inhiber l'expression des laccases LAC4 et LA17 telles que définies ci-dessus, sont des micro-ARN, tels que les micro- ARN miR397 et miR408, de préférence miR397. A titre d'exemples non limitatifs de tels micro-ARN, on peut utiliser ceux de séquences suivantes :

- SEQ ID NO : 75 (AtmiR397a) ou SEQ ID NO : 76 (AtmiR397b) , obtenues chez Arabidopsis thalina (ABDEL-GHANY et PILON, J Biol Chem. , 283, 15932-15945, 2008) ;

- SEQ ID NO : 77 (ptc-miR397 ) , obtenues chez le peuplier ; ou

- SEQ ID NO : 78 (Bdi-miR397a) ou SEQ ID NO : 79 (Bdi-miR397b) , obtenues chez Brachypodium distachyon

(ZHANG et al., BMC Genomics., 23, 10:449, 2009 ; UNVER et BUDAK, Planta, 230, 659-669, 2009) .

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la construction d'ADN recombinant est choisie parmi :

- une construction d'ADN comprenant un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 20 nucléotides consécutifs de l'ADNc du gène codant pour une laccase telle que définie ci-dessus, - une construction d'ADN de 200 à 1000 pb, comprenant un fragment du l'ADNc du gène codant pour une laccase telle que définie ci-dessus, ou un polynucléotide complémentaire, qui lorsqu'elle est transcrite forme un ARN en épingle à cheveux (ARN hairpine ou ribozyme) ciblant ledit gène ; - une construction d'ADN, capable, lorsqu'elle est transcrite, de former un micro-ARN ciblant le gène codant pour une laccase telle que définie ci-dessus.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite construction d'ADN recombinant comprend un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 20, et de manière tout à fait préférée au moins 50 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 3, ou d'un polynucléotide complémentaire d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 3.

Ces constructions peuvent être notamment :

- des cassettes d'expression, comprenant une ou plusieurs constructions d'ADN recombinant telles que définies ci-dessus, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Ces cassettes d'expression peuvent également comprendre, avantageusement, d'autres éléments de régulation, en particulier des éléments de régulation de la transcription tels que terminateurs, amplificateurs, etc. ; - des vecteurs recombinants, comprenant une ou plusieurs constructions d'ADN recombinant telles que définies ci-dessus, ou avantageusement une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.

Des constructions d'ADN recombinant conformes à l'invention peuvent également comprendre d'autres éléments, par exemple un ou plusieurs marqueurs de sélection.

L'homme du métier dispose d'un très large choix d'éléments utilisables pour l'obtention de constructions d'ADN recombinant conformes à l'invention. A titre d'exemples non-limitatifs de promoteurs utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera : des promoteurs constitutifs, tels que le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) décrit par KAY et al. (Science, 236, 4805, 1987), ou ses dérivés, le promoteur du virus de la mosaïque des nervures de manioc (CsVMV) décrit dans la Demande Internationale WO 97/48819, le promoteur de l'ubiquitine du maïs ou le promoteur « Actine-Intron-actine » du riz (McELROY et al., Mol. Gen. Genêt., 231, 150-160, 1991 ; GenBank numéro d'accès S 44221) . - des promoteurs inductibles ou tissu- spécifiques, afin de ne modifier la teneur ou la composition en lignines qu'à certains stades du développement de la plante, dans certaines conditions environnementales, ou dans certains tissus-cibles, comme par exemple, les tiges, les feuilles, les graines, les spathes, le cortex ou le xylème (e.g., le promoteur de cinnamyl alcool déshydrogénase (CAD) ou de la 4 coumarate- CoA ligase (4CL) ) .

A titre d'exemples non-limitatifs d'autres éléments de régulation de la transcription utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera des terminateurs , tels que le terminateur 3'NOS de la nopaline synthase (DEPICKER et al., J. Mol. Appl. Genêt., 1, 561- 573, 1982), ou le terminateur 3'CaMV (FRANCK et al., CeIl, 21, 285-294, 1980 ; GenBank numéro d'accès V00141).

A titre d'exemples non-limitatifs de gènes marqueurs de sélection utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera notamment des gènes conférant une résistance à un antibiotique (HERRERA-ESTRELLA et al., EMBO J., 2, 987-995, 1983) tel que l' hygromycine, la kanamycine, la bléomycine ou la streptomycine, ou à un herbicide (EP 0 242 246) tels que le glufosinate, le glyphosate ou la bromoxynil, ou le gène NPTII qui confère la résistance à la kanamyine (BEVAN et al., Nucleic Acid Research, 11, 369-385, 1984).

La transformation des plantes peut s'effectuer par de nombreuses méthodes, connues en elles-mêmes de l'homme du métier.

On peut par exemple transformer des cellules végétales, des protoplastes ou des explants, et régénérer une plante entière à partir du matériel transformé. La transformation peut ainsi être réalisée, à titre d'exemples non-limitatifs : par transfert des vecteurs conformes à l'invention dans des protoplastes, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol (PEG) en présence de cations divalents

(Ca ²⁺ ) selon la méthode décrite dans l'article de KRENS et al. (Nature, 296, 72-74, 1982) ; par électroporation notamment selon la méthode décrite dans l'article de FROMM et al. (Nature, 319, 791-793, 1986) ;

- par utilisation d'un canon à gène permettant la projection, à très grande vitesse, de particules métalliques recouvertes des séquences d'ADN d'intérêt, délivrant ainsi des gènes à l'intérieur du noyau cellulaire, notamment selon la technique décrite dans l'article de FINER et al. (Plant CeIl Report, 11, 323-328, 1992) ;

- par micro-injection cytoplasmique ou nucléaire.

On peut également utiliser Agrobacterium tumefaciens, notamment selon les méthodes décrites dans les articles de BEVAN et al. (Nucleic Acid Research, 11, 369- 385, 1984) et d'AN et al. (Plant Phydiol., 81, 86-91, 1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de JOUANIN et al. (Plant Sci., 53, 53-63, 1987). Par exemple, la transformation de cellules végétales peut être effectuée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extra-chromosomique inducteur de tumeurs Ti d' Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (WATSON et al., Ed. De Boeck Université, 273-292, 1994) . On peut aussi utiliser Agrobacterium tumefaciens sur des plantes entières, par exemple par dépôt au niveau de la blessure d'une plante monocotylédone, de la bactérie hébergeant l'ADN à transférer, en présence de substances libérées au niveau de la blessure d'une plante dicotylédone . La présente invention a également pour objet une cellule végétale comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. La présente invention a également pour objet les plantes susceptibles d' être obtenues par un procédé conforme à l'invention, à l'exception des mutants d' A. thaliana SALK_016748 et SALK_051892. Lesdites plantes peuvent porter des mutations inhibant les laccases LAC4 et LA17 telles que définies ci-dessus ou exprimer un ou plusieurs polynucléotides capables d'inhiber l'expression lesdites laccases LAC4 et LA17 tels que définis ci-dessus. Bien entendu, la présente invention englobe les descendants, notamment les hybrides issus d'un croisement impliquant au moins une plante selon l'invention, obtenus par semis ou par multiplication végétative, des plantes directement obtenues par le procédé de l'invention.

Le matériel végétal, tel que protoplastes, cellules, cals, feuilles, tiges, racines, fleurs, fruits, boutures et/ou graines, obtenu a partir des plantes conformes à l'invention (à l'exception des mutants d' A. thaliana SALK_016748 et SALK_051892) fait également partie de l'objet de la présente invention.

La présente invention a également pour objet l'utilisation des plantes conformes à l'invention ou de matériel végétal obtenu à partir desdites plantes pour la production de plantes fourragères, de biocarburants ou de pâte à papier.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la réduction de la teneur en lignines et l'augmentation de la cellulolyse des parois d'une plante dont l'expression des laccases LAC17 et/ou LAC4 est inhibée, ainsi que des figures annexées :

Figure 1 : analyse par électrophorèse sur gel d' agarose 1% des produits de PCR obtenus à partir d'ADN génomique des lignées SALK_016748 (mutant lacll) (Figure

A), SALK_051892 (mutant Iac4) (Figure B) et SALK_025690

(mutant Iac2) d' A. thaliana (Figure C) . A : Puits 1 : marqueur de taille IKb+ (Invitrogen) ; Puits 2 : tubuline de la lignée sauvage CoIO ; Puits 3 : laccase 17 de la lignée sauvage ; Puits 4 et 6 : tubuline de 2 plantes de la lignée SALK_016748 {lacll) ; Puits 5 et 7 : laccase 17 de 2 plantes de la lignée SALK__016748 {lacll) . B : Puits 1 : marqueur de taille IKb+ (Invitrogen), Puits 2 : vide ; Puits 3 : tubuline la lignée sauvage CoIO ; Puits 4 : vide ; Puits 5 à 7 : tubuline de 3 plantes de la lignée SALK__051892 {lacé) ; Puits 8 : vide ; Puits 9 : laccase 4 de la lignée sauvage CoIO ; Puits 10 : vide ; Puits 11 à 13 : laccase 4 de 3 plantes de la lignée SALK_051892 {Iac4) . C : Puits 1 et 12 : marqueur de taille IKb+

(Invitrogen) ; Puits 2 à 6 et 11 : vides ; Puit 7 : laccase

2 de la lignée sauvage CoIO (ADNc) ; Puit 8 : laccase 2 d' 1 plante de la lignée sauvage CoIO (ADNg) ; Puits 9 : laccase

2 d' 1 plante de la lignée SALK_025690 ; Puits 10 : témoin, laccase 2 amplifiée sur ARN de plante de la lignée sauvage CoIO ayant subi le même traitement que les autres plantes à la différence qu'au cours de l'étape de rétro- transcription, la réverse transcriptase n' a pas été ajoutée ; Figure 2 : analyse du profil d'expression de laccases (LAC 2, 4, 5, 6, 10, 11, 12 et 17) d' A. thaliana par électrophorèse sur gel d' agarose 1% dans du tampon TAE des produits de RT-PCR obtenus à partir d'ADNc des cellules de la hampe florale de la lignée sauvage CoIO, de la lignée SALK_051892 {Iac4) et de la lignée SALK_016748 {lacll). Tub = tubuline ;

Figure 3 : observation au microscope optique (grossissement 200X) de coupes transversales de 70 microns d'épaisseur de hampe primaire de 20 cm colorées au phloroglucinol-HCl, à partir de la lignée sauvage CoIO et de la lignée SALK 016748 {lacll) ; Figure 4 : analyse par électrophorèse sur gel d' agarose 1% des produits de PCR obtenus à partir d'ADN génomique d'un double mutant d' A. thaliana Kim {Iac4/lacl7) . Puits 1 : marqueur de taille IKb+ (Invitrogen) ; Puits 2 : tubuline de la lignée sauvage ; Puits 3 : tubuline du mutant Kim ; Puits 4 : laccase 4 de la lignée sauvage ; Puits 5 : laccase 4 du mutant Kim ; Puits 6 : laccase 17 de la lignée sauvage ; Puits 7 : laccase 17 du mutant Kim. EXEMPLE 1 : SELECTION, GENOTYPAGE ET

CARACTERISATION DE MUTANTS Iacl7, Iac4 ET Iac2 O'ARABIDOPSIS THAiIANA

1) Sélection des mutants laccase d' A. thaliana Des lignées d' A. thaliana de la collection SALK dans l'accession CoIO présentant des insertions de l' ADN-T au niveau des gènes LACl 7, LAC4 et LAC2 (respectivement les lignées SALK_016748, SALK_051892 et SALK_025690) ont été identifiées et caractérisées.

Le mutant SALK_016748 [lacll) contient deux ADN-T insérés en tandem inversé dans le promoteur du gène codant pour LAC17, à 146 paires de bases du codon d' initiation ATG.

Le mutant SALK_051892 {lad) contient un ADN-T inséré dans le promoteur du gène codant pour LAC4, à 127 paires de bases du codon d'initiation ATG.

Le mutant SALK_025690 {Iac2) contient un ADN-T inséré dans sa séquence codante.

2) Génotypage des mutants lacll (SALK 016748), Iac4 (SALK 051892) et Iac2 (SALK 025690) d' A. thaliana a) Matériel et Méthodes

Des amorces pour les gènes LACIl ₁ LAC4 et LAC2 ont été définies à l'aide du logiciel OLIGO 4 (National Biosciences Inc., Plymouth, USA). Leurs séquences (5'->3') sont représentées dans le Tableau 1 ci-après : Tableau 1 :

Séquence de l' amorce Séquence de l' amorce sen∑ antisens

Amorces pour Lac 17 FST dir: Lac 17 FST rev: l' amplification TCG AAG AGG GTC AAA TCT TAG CCA TGA AAT du gène LACl 7 GAG TTT (SEQ ID NO : GTG AGC (SEQ ID NO :

16) 17)

Amorces pour irxl2 FST dir irxl2 FST

1' amplijrication ATT GTG TAA GCA AAT TGG CTT GCT TGA GCA du gène LAC4 CGG CAC (SEQ ID NO : TAA TCT (SEQ ID NO :

18) 19)

Amorces pour Lac 2 RT dir : Lac 2 RT rev _:

1' amplification GCA AGA CAA AAA CAA GAA ATC TGA GGG TGG du gène LAC2 TCG TGA (SEQ ID NO : AGG AAG (SEQ ID NO :

20) 21)

L 'ADN des plantes a été extrait selon le protocole décrit par EDWARDS et al. (Nucleic Acid Research, 19, 1349, 1991) .

Les PCR ont été réalisées dans 25 μl sur 30 ng d'ADN génomique, avec 2 mM de MgC12, 0,4 mM de chaque dNTP, 0,4 mM de chaque amorce, 1,25 unités de Taq DNA polymérase (Invitrogen) Les cycles PCR pour le génotypage des mutants lacll sont (95°C 30 sec, 50 ⁰ C 30 sec, 72°C 1 mn) 28 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C.

Les cycles PCR pour le génotypage des mutants lacé sont (95°C 30 sec, 58°C 30 sec, 72 ⁰ C 30 sec) 30 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C.

Les cycles PCR pour le génotypage des mutants Iac2 sont (95°C 30 sec, 54°C 30 sec, 72°C 1 mn 30 sec) 30 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C.

Les produits de PCR sont ensuite séparés sur des gels d' agarose 1% dans du tampon TAE. b) Résultats

2 plantes de la lignée SALK_016748, 3 plantes de la lignée SALK_051892 et 1 plante de la lignée SALK_025690 ont été testées. Les résultats du génotypage sont représentés à la Figure 1 :

- les 2 plantes de la lignée SALK_016748 testées sont homozygotes pour la mutation dans le gène LACl 7 : la présence des ADN-T sur les deux brins codant de ce gène empêche l'amplification d'un fragment du gène LACl 7 (Figure IA) ;

- les 3 plantes de la lignée SALK_051892 testées sont homozygotes pour la mutation dans le gène LAC4 : la présence de l' ADN-T sur les deux brins codant de ce gène empêche l'amplification d'un fragment du gène LAC4 (Figure IB) ;

- la plante de la lignée SALK__025690 testée est homozygote pour la mutation dans le gène LAC2 : la présence de l' ADN-T sur les deux brins codant de ce gène empêche l'amplification d'un fragment du gène LAC2 (Figure IC).

3) Expression des laccases chez les mutants lacll et Iac4

Le profil d'expression de laccases d' Arabldopsis exprimées dans la hampe florale chez la lignée sauvage (Columbia) , le mutant lacll (SALK_016748 ) et le mutant lacé (SALK_051892 ) a été déterminé par RT-PCR. a) Matériel et Méthodes

Une RT-PCR de 26 cycles a été effectuée sur des

ADNc obtenus à partir d' 1 μg d'ARN extrait à l'aide d'un kit RNeasy (Qiagen) , traités avec une DNase et rétro- transcrits avec la réverse-transcriptase SSRTII

( Invitrogen) .

Les amorces utilisées sont décrites dans le Tableau 2 ci-après : Les couples d'amorces dits « FST » (pour Flanking Séquence Tag) ont été dessinés de part et d'autre de l'ADN-T ; ils ont été utilisés pour amplifier sur de 1'1'ADNg (génomique) . Les couples d'amorces dits « RT » ont été définis dans la séquence codante et permettent d'amplifier sur des ADNc.

Les cycles RT-PCR sur les mutants lacll, Iac4 et la lignée sauvage sont (95°C 30 sec, 50 ⁰ C 30 sec, 72°C 1 mn 30) 26 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C pour les laccases 2, 4, 6, 12, 17 et les tubulines.

Les cycles RT-PCR sur les mutants lacll _r Iac4 et la lignée sauvage sont (95°C 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 1 mn 30) 26 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72°C pour les laccases 5 et 10. Les cycles RT-PCR sur les mutants lacll, Iac4 et la lignée sauvage sont (95°C 30 sec, 58°C 30 sec, 72°C 1 mn 30) 26 fois, avec une extension finale de 10 mn à 72 ⁰ C pour la laccase 11.

Les produits de RT-PCR sont ensuite séparés sur des gels d' agarose 1% dans du tampon TAE pour visualiser une différence d'intensité des fragments amplifiés. b) Résultats

Les résultats sont représentés à la Figure 2. Seul le taux des transcrits de la laccase 17 (LAC17) diminue chez le mutant lacll et celui de la laccase 4 (LAC4) chez le mutant lad. Les mutants ne sur-expriment aucune autre laccase dans le but de compenser la perte d'expression de LAC17 et LAC4.

4) Analyse cytologique du mutant lacll a) Matériel et Méthodes

Des coupes de hampe primaire de 20 cm ont été colorées au phloroglucinol-HCl selon le protocole décrit par SIBOUT et al. (Plant CeIl, 17, 2059-2076, 2005). La coloration rouge observée correspond aux parois cellulaires lignifiées. b) Résultats

Les résultats de l'observation cytologique sont représentés à la Figure 3. Un retard et/ou une diminution de la quantité de lignine déposée sur les parois cellulaires est observé chez le mutant lacll mais pas chez la lignée sauvage (Figure 3) .

EXEMPLE 2 : OBTENTION ET CARACTERISATION MOLECULAIRE D'UN DOUBLE MUTANT Iacl7/lac4 D' ARABJDOPSIS THAiIANA a) Matériel et Méthodes

Des plantes de la lignée SALK_016748 {lacll) ont été croisées avec des plantes de la lignée SALK_051892 {Iac4) pour obtenir un double mutant Iac4/lacl7 (dénommé ci-après mutant Kim) . Le double mutant Iac4/lacl7 a ensuite été caractérisé par génotypage en suivant le protocole décrit à l'Exemple l.a) et en utilisant les amorces Iac4 FST dir, Iac4 FST rev, irxl2 FST dir et irxl2 FST rev. b) Résultats Les résultats du génotypage pour le mutant Kim sont représentés à la Figure 4 : le mutant Kim est homozygote pour les mutations dans les gènes LACIl et LAC4. En effet, la présence des ADN-T sur les deux brins codant de ces gènes empêche l'amplification d'un fragment des gènes LACIl et LAC4.

La présence de deux ADN-T dans le promoteur du gène LACl 1 et d'un ADN-T dans le promoteur du gène LAC4 a été confirmée par amplification des séquences adjacentes aux ADN-T et séquençage des amplicons. EXEMPLE 3 : ANALYSE DE LA TENEUR EN LIGNINES ET

DE LA CELLULOLYSE DES SIMPLES MUTANTS Iacl7 ET Iac4 ET DU DOUBLE MUTANT Iacl7/lac4 O' ARABIDOPSIS THALIANA a) Matériel et Méthodes i) Dosage de la teneur en lignines Le dosage des lignines a été réalisé sur les tiges collectées à maturité, broyées et soumises à extraction exhaustive par les solvants éthanol/toluène (2/1, v/v) , éthanol, puis eau ; extractions réalisées dans un appareil de Soxhlet. Le matériel extrait et séché représente le « résidu pariétal » ou RP (car il est constitué des parois végétales). L'élimination des composés solubles par extraction au solvant est indispensable avant tout dosage de lignines (ces composés pouvant interférer avec les dosages gravimétriques ou spectrométriques) .

La teneur en lignines a été mesurée par le dosage de la fraction de lignine acido-insoluble présente dans le RP et dénommée lignine Klason (LK) . Cette fraction LK, dosée par gravimétrie en traitant le résidu pariétal par l'acide sulfurique concentré (ce qui permet d' hydrolyser les polysaccharides et de laisser un résidu LK rincé, séché et pesé), représente l'essentiel des lignines pariétales. Cependant, une très petite fraction des lignines peut être solubilisée lors du traitement par l'acide sulfurique : il s'agit de la fraction dénommée lignine acido-soluble (LAS) qui est évaluée par mesure de l'absorbance du surnageant sulfurique dans l'ultra-violet.

Ces mesures ont été réalisées en utilisant la méthode T222 om-83, connue de l'homme du métier, et mise au point pour le bois et ses dérivés par le TAPPI (Technical association of the pulp and paper industry) (DENCE, CW. The détermination of lignin ; dans: LIN, S. Y. and DENCE, C. W. (Eds.) . Methods in Lignin Chemistry. Springer-Verlag, pp. 33-61, 1992) . ii) Etude de la structure des lignines

La structure des lignines a été évaluée par thioacidolyse . La thioacidolyse des lignines libère des produits monomères thioéthylés H, G ou S à partir des unités p-hydroxyphényles (H) , guaïacyles (G) ou syringyles (S) liées uniquement par liaisons β-O-4 (liaisons interunités majeures dans les lignines natives) . Ces produits ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM) de leurs dérivés triméthylsilylés (TMS) . Les monomères triméthylsilylés H, G ou S ont été dosés à partir de chromatogrammes reconstruits respectivement sur les ions 239, 269 ou 299 (ions les plus intenses de leur spectre de masse obtenu en impact électronique) . Le protocole qui a été employé est similaire à celui décrit par LAPIERRE et al. (Res. Chem. Interm. , 21, 397-412, 1995) et par MIR DERIKVAND et al. (Planta 227, 943-956, 2008) . Les monomères H sont le plus souvent minoritaires (moins de 1% du total des monomères) et n'ont donc pas été considérés (sauf dans le cas de plantes mutantes affectées dans la formation des unités G et S, ou dans le cas de lignines de stress) . iii) Mesure de la dégradabilité enzymatique par cellulolyse in vitro La susceptibilité des polysaccharides pariétaux à l'hydrolyse enzymatique a été évaluée in vitro, en soumettant les parois (c'est-à-dire le résidu pariétal RP) à une préparation d'enzymes cellulasiques et hémicellulasiques . Le protocole qui a été utilisé est décrit par

HOFFMANN et al. (Plant CeIl 16, 1446-1465, 2004), qui est un protocole adapté de la méthode de REXEN (Anim. Feed Sci. Technol., 2, 205-218, 1977). Ladite préparation enzymatique employée était la préparation Cellulase Onozuka RIO extraite de Trichoderma viride, 096i/mg (SERVA ELECTROPHORESIS GmbHD, Allemagne) . b) Résultats

Les résultats sont présentés dans le Tableau 3 (présentant les valeurs moyennes entre les 2 répétitions analytiques et l'écart-moyen entre ces répétitions, sauf pour le pourcentage de RP pour lequel une seule mesure a été effectuée) ci-après, dans lequel :

% RP = pourcentage de résidu pariétal. Ce pourcentage reflète le taux de parois dans l'échantillon sec (% pondéral de l'échantillon sec) ; il est donné à titre indicatif ; % LK = taux de lignine Klason exprimé en % pondéral du RP ; e-m LK = écart moyen entre 2 répétitions analytiques indépendantes de mesure de LK ; % LAS = taux de lignine acido-soluble exprimé en % pondéral du RP et mesuré à partir de l'absorbance à 205 nm du surnageant sulfurique issu de la mesure de la lignine Klason (en utilisant un coefficient d' absorptivité de 110 l.g^.cm ^"1 ) ; e-m LAS = écart moyen entre 2 répétitions analytiques indépendantes de mesure de LAS ; rdt thio μmol/g LK = rendement en monomères (G+S) de thioacidolyse, exprimé en μmole par gramme de lignine Klason (les monomères H obtenus à l'état de traces ne sont pas considérés). Lorsqu'il est calculé sur la base de la teneur en lignine Klason, le rendement total en monomères de thioacidolyse reflète la proportion d'unités liées uniquement en β-0-4 dans les lignines. Cette information structurale est importante car elle reflète la susceptibilité des lignines aux procédés de délignification industrielle . e-m rdt thio = écart moyen du rendement de thioacidolyse entre 2 répétitions analytiques indépendantes de thioacidolyse ; S/G thio = rapport molaire des monomères G et S libérés par thioacidolyse des lignines. Ce rapport reflète la proportion des unités S et des unités G dans les lignines natives. Chez les angiospermes, l'importance des unités S varie en fonction du stade de développement (les unités S étant déposées principalement en fin de lignification) ainsi que des tissus (les fibres sont plus riches en unités S que les vaisseaux) . Par conséquent, lorsque qu'une plante mutante présente un rapport S/G différent de celui de la lignée témoin (cultivée dans les mêmes conditions), cette différence peut être imputable au fait que la mutation affecte la lignification dans le temps (en début ou en fin) ou de manière tissu-spécifique (affecte la lignification des fibres ou celle des vaisseaux) . Il est également possible que la mutation affecte plus spécifiquement une enzyme impliquée dans la biosynthèse de l'alccol coniférylique (précurseur des unités G) ou de l'alcool sinapylique (précurseur des unités S) ; e-m S/G = écart moyen du rapport molaire S/G de thioacidolyse entre 2 répétitions analytiques indépendantes de thioacidolyse ; % perte par cellulolyse = perte pondérale (en

%) du RP traitée par une préparation commerciale d'enzymes cellulasiques et hémicellulasiques ; e-m cellulolyse = écart moyen entre 2 répétitions analytiques indépendantes de cellulolyse ; les mutants Kim 1 et Kim 2 sont 2 répétitions biologiques de la même lignée. Kim 1 et Kim 2 ont été cultivés sur 2 plateaux de culture séparés, ce qui peut expliquer les variations entre ces répétitions.

Il est à remarquer que le mutant SALK 025690 (Iac2) ne présente pas de diminution du taux de lignines par rapport à la lignée sauvage (CoIO) .

Tableau 3: Etude des lignines des hampes des lignées sauvage (CoIO) et mutantes pour les laccases 4 et/ou 17.

K>

II ressort des résultats ci-dessus que : l'homogénéité des teneurs en RP (60.3 à 62.6%) indique que les mutations n'affectent pas le taux de parois lignocellulosiques des tiges matures. Comme les lignées mutantes ne présentent pas de réduction de taille, cela suggère que les plantes mutantes ont la même productivité en terme de biomasse lignocellulosique valorisable en fibres ou en biocarburant par exemple ;

- en revanche tous les mutants présentent un taux de lignine Klason significativement plus faible que celui du témoin : la diminution est modérée pour les simples mutants (diminution de 8 et 6% pour les mutants Iac4 et lacll respectivement) et plus marquée pour les doubles mutants (environ 19%). Cette diminution de teneur en lignines, qui n'affecte pas la croissance et le développement de la plante, est recherchée dans le contexte de la production de pâte à papier par voie chimique à partir de lignocelluloses d'angiospermes. Elle facilite également l'hydrolyse enzymatique, les lignines agissant comme des barrières entre les enzymes et les polysaccharides ;

- le taux de lignine acido-soluble (LAS) des lignées mutantes est inférieur au taux de LAS de la lignée sauvage. La teneur réduite en lignine Klason (ou lignine acido-insoluble) n'est donc pas compensée par une augmentation en lignine acido-soluble ;

- les rendements de thioacidolyse, calculés sur la base du taux de LK, sont proches entre la lignée sauvage et les lignées mutantes. Ce résultat indique que les lignines des lignées mutantes contiennent autant de liaisons labiles que les lignines des lignées sauvages. Les mutations n' ont donc pas accentué la fréquence des liaisons inter-unités résistantes, ce qui serait défavorable dans l'optique de la production de pâte à papier par voie chimique par exemple ;

- en revanche, le simple et les doubles mutants présentant la mutation lacll ont un rapport S/G supérieur par rapport à celui de la lignée sauvage. Ce résultat suggère que la mutation lacll pourrait affecter le début de la lignification (et donc le dépôt des unités G) et/ou la lignification des vaisseaux (plus riches en unités G que les fibres) ; le rendement de cellulolyse des lignées mutantes est augmenté par rapport à celui de la lignée sauvage. La diminution du taux de lignine Klason améliore donc l'efficacité de la cellulolyse. EXEMPLE 4 : OBTENTION DE PEUPLIERS TRANGENIQUES

SUR-EXPRIMANT UN MICRO-ARN CAPABLE D'INHIBER L'EXPRESSION DES LACCASES LAC17 ET LAC4

Deux constructions génétiques sont réalisées pour sur-exprimer un micro-ARN (dénommé miR397, SEQ ID NO : 77) capable d'inhiber l'expression des laccases LAC17 et LAC4 du peuplier {Populus) , sous le contrôle soit du promoteur constitutif 2x35S du CaMV soit du promoteur « lignine spécifique » de la cinnamyl alcool déshydrogénase 2 (CAD2) d'Eucalyptus (dénommé EuCAD). Le vecteur binaire Gateway pMDC32 (CURTIS et

GROSSNIKLAUS, Plant Physiology, 133, 462-469, 2003) est utilisé pour sur-exprimer les transgènes sous contrôle du promoteur constitutif 2x35S.

Pour l'expression sous le contrôle du promoteur EuCAD, le promoteur 2x35S est excisé du plasmide pMDC32 ci- dessus par une digestion par les enzymes HindIII-Kpnl (sites de restrictions uniques) et remplacé par le promoteur « lignine-spécifique » EuCAD.

La transformation génétique du peuplier est réalisée suivant la méthode décrite dans LEPLE et al. (Plant CeIl Rep. 11, 137-141, 1992), c'est à dire par co- culture d'expiants de tiges de peuplier avec des agrobactéries contenant un vecteur binaire pour l'expression de miR397, isolement de cals transgéniques et régénération de plantules transformées.

Des cals transgéniques sont sélectionnés pour l'étape de régénération. Des plantules sont régénérées à partir de ces cals différents, correspondant donc à des événements de transformation différents. Chaque plantule est clonée par multiplication.

Un exemplaire de chaque lignée transgénique est utilisée pour : l'étude de la structure des lignines par thioacidolyse (voir ci-dessus) sur un fragment de tige ; identifier des variations spatiales de quantité de lignines, par imagerie infra-rouge en FTIR-ATR (« Four1er Transformée! InfraRed Spectroscopy - Attenuated Total Réflectance ») et coloration histochimique au phloroglucinol .

Ces premières analyses de phénotypage permettent d' identifier les lignées présentant des réductions de la quantité de lignines dans le bois.

Des lignées sont ensuite analysées pour l'expression des transgènes et des gènes codants pour LAC17 et LAC4. Ces analyses d'expression sont réalisées par RT- PCR quantitative (qRT-PCR) . EXEMPLE 5 : OBTENTION DE BRACHYPODIUM

DISTACHYON TRANGENIQUES SUR-EXPRIMANT UN MICRO-ARN CAPABLE D'INHIBER L'EXPRESSION DES LACCASES LAC17 ET LAC4

Des vecteurs binaires Gateway compatibles et spécifiques pour la transformation des monocotylédones, contenant une séquence codant un micro-ARN de séquence SEQ

ID NO : 78 ou 79, sous le contrôle soit d'un promoteur constitutif, par exemple le promoteur de l'ubiquitine du maïs (ZmUbi) , soit d'un promoteur « lignine spécifique », et un gène de sélection tel que le gène pat (conférant une résistance au basta) , sont utilisés pour la transformation génétique de Brachypodium distachyon.

L'analyse de la structure et de la teneur en lignine des plantes transgéniques obtenues peut être effectuée en utilisant les mêmes méthodes que pour l'analyse des peupliers transgéniques ci-dessus. EXEMPLE 6 : OBTENTION DE MAÏS TRANGENIQUES SUR- EXPRIMANT UN MICRO-ARN CAPABLE D'INHIBER L'EXPRESSION DES LACCASES LACl7 ET LAC4

Un vecteur tel que décrit pour la transformation génétique de Brachypodium peut être utilisé pour la transformation génétique du maïs.

Il peut aussi être utilisé le vecteur intégratif L1038 (représenté par la séquence SEQ ID NO : 80), qui contient une cassette d'expression comprenant un gène de résistance à un herbicide (gène de résistance au Basta) , une cassette d'expression comprenant un gène codant une protéine fluorescente pour suivre le transgène sans génotypage (gène codant une GFP sous le contrôle d'un promoteur Actin) , une cassette "triple Gateway" attR4-ccdB- attR3 (où attR4 et attR3 sont des sites de recombinaison et ccdB est un gène de sélection négative), qui permet de recombiner un promoteur de choix (extrémités attL4-attRl) , un gène de choix (extrémités attLl-attL2 ) (en l'occurrence, un micro-ARN miR397) et un mock (attRl-attL3) (voir le Manuel d'Utilisation édité par Invitrogen, « MultiSite Gateway Pro », Version B, 3 octobre 2006) .