L'invention se rapporte à un procédé de culture en mode mixotrophe, notamment en présence d'un éclairement discontinu et/ou variable de lumière, d'une cyanobactérie, en particulier du genre Nostoc. Le procédé permet d'obtenir un haut rendement en biomasse et un enrichissement des cyanobactéries ainsi cultivées en polysaccharides. Le procédé permet ainsi de sélectionner des souches de cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc, à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en polysaccharides. L'invention se rapporte aussi à de nouvelles souches de cyanobactéries, en particulier appartenant à Nostoc sp., particulièrement adaptées à la production des polysaccharides. Ces nouvelles souches sont utiles pour produire des polysaccharides en mode mixotrophe.

Préambule

Les cyanobactéries sont des microorganismes photosynthétiques à caractère autotrophe. Elles sont des procaryotes ne présentant ni noyau véritable, ni plaste, ni reproduction sexuée. Elles sont dépourvues de membrane nucléaire, de mitochondries, de réticulum endoplasmique, de chromosomes et de flagelle. Au microscope électronique, on distingue deux zones différenciées, principalement par leur couleur :

- le chromoplasma (zone périphérique contenant les thylakoïdes, sortes de sacs écrasés contenant les organites photosynthétiques). Cet organite, outre la photosynthèse, assure deux autres fonctions : la respiration et la fixation de l'azote (chez certaines espèces) ;

- le centroplasma, situé au centre de la cellule, qui assure des fonctions semblables à celles d'un noyau. Il contient l'ADN, qui se présente généralement sous formes d'aiguilles. Les cyanobactéries possèdent de la chlorophylle et d'autres pigments, d'où leurs couleurs variées. Elles sont bleues, dans près de 50 % des cas, et, dans les autres cas, elles ont une couleur extérieure autre (dorée, jaune, brune, rouge, orangée, vert émeraude, violette, ou bleu foncé presque noire).

Des cyanobactéries représentatives ont été trouvées, fréquemment en abondance, dans la plupart des environnements naturellement illuminés, à la fois aquatiques et terrestres, incluant plusieurs environnements extrêmes. Cette répartition reflète une grande variété d'espèces présentant des propriétés physiologiques diverses et une tolérance au stress environnemental.

Grâce à leur diversité écologique et biochimique, des cyanobactéries ont été considérées avec intérêt pour des applications biotechnologiques et leur potentiel en terme de conversion d'énergie lumineuse en des formes renouvelables des molécules pour des produits alimentaires et pharmaceutiques [De Philippis, R. et Vincenzini, M. (1998); Exocellular polysaccharides from cyanobacteria and their possible applications, FEMS Microbiology Reviews, 22 : 151 -175].

Plusieurs souches cyanobactériennes possèdent à l'extérieur de leur membrane externe des structures de surface additionnelle de nature polysaccharidique. Pendant la culture de cellules en mode batch, de la matière polysaccharidique peut être libérée en tant que matière soluble dans l'eau dans le milieu environnant, provoquant une augmentation progressive de sa viscosité. Ces polysaccharides libérés sont ainsi récupérables de ces cultures liquides et présentent un intérêt pour des applications industrielles, notamment pour les industries papetières, les produits cosmétiques et alimentaires. Des polysaccharides issus des cyanobactéries sont aussi connus pour leurs propriétés médicales, telles que anti-virales [Hayashasi, T. and Hayashi, K. ; (1996) ; Calcium spirulan, an inhibitor of enveloped virus replication, from a blue-green alga Spirulina platensis, J. Nat. Prod. (Lloydia) 59, 83-87]. Des cyanobactéries peuvent être considérées en tant que source abondante de polysaccharides structurellement divers, et ayant des propriétés uniques pour des applications spécifiques, et non présentes dans les polymères disponibles actuellement.

Pour mettre en œuvre la production des polysaccharides par des cyanobactéries à l'échelle industrielle, plusieurs facteurs doivent être pris en compte, par exemple la température, les conditions de lumière et la taille des fermenteurs. Par exemple, les cultures peuvent également être réalisées dans des conteneurs d'un litre, dans un laboratoire, dans des photobioréacteurs, et dans des conteneurs de 100 000 litres ou bien dans des bassins ouverts (plusieurs hectares). Toutefois, les dépenses énergétiques et autres ressources, telles que la main d'œuvre et la facilité de poursuivre la culture, doivent être prises en compte en développant des conditions de culture idéales.

Des exemples des souches de cyanobactéries produisant des polysaccharides sont, entre autres, Nostoc, Gloeocapsa, Chroococcidiopsis, Phormidium, Microcyctis et Lyngbya.

Les cyanobactéries du genre Nostoc sont connues pour leur capacité à produire des polysaccharides. Les Nostocs ont la capacité de fixer l'azote atmosphérique par l'intermédiaire des cellules particulières : les hétérocystes, qui sont des cellules différenciées à paroi plus épaisse, nettement visibles au microscope. Les hétérocystes apparaissent habituellement aux extrémités des chaînes de cellules sphériques, ovoïdes ou cylindriques. Ces chaînes sont plus ou moins longues.

Les Nostocs se trouvent là où elles ne sont pas concurrencées par d'autres espèces, c'est-à-dire sur des milieux très pauvres (ou neufs) et exposés à un fort ensoleillement, par exemple sur certains chemins, sur des cailloutis de talus, dans des carrières, voire sur le bitume, milieux a priori peu favorables à leur développement en ce qui concerne l'approvisionnement en matière azotée d'origine minérale.

La demande internationale WO 201 1/140 839 divulgue une méthode pour la production des cellules Nostoc flagelliforme et des polysaccharides extracellulaires. La méthode inclut deux étapes, l'une portant sur l'inoculation d'une solution de cellules dans une culture comprenant « BGI médium » et une culture pendant 8 à 10 jours, suivie par la deuxième étape portant sur l'adjonction de glucose à 1 à 20 grammes/litre au médium et la culture pendant 2 à 8 jours et l'extraction des polysaccharides extracellulaires de la solution de culture. La biomasse (3,0-5 g/L) obtenue par cette méthode est de 5 à 8 fois plus élevée par rapport aux méthodes autotrophiques classiques. Le rendement en polysaccharides extracellulaires (1 ,0-2,3 g/L) est également amélioré (15 à 31 fois plus élevé).

De nouvelles sources de polysaccharides doivent donc être recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché pour ce type de molécule. Il sera souhaitable de pouvoir obtenir des rendements en polysaccharides plus importants que ce qui est décrit dans l'art antérieur pour une exploitation industrielle plus efficace et rentable. En tout état de cause, il est souhaitable que les cyanobactéries soient cultivées dans des conditions optimales pour augmenter le rendement de polysaccharides à produire. Ainsi, il est préférable d'avoir un rendement le plus élevé possible (par exemple au-delà de 20 g/L de matière sèche ou plus de 60% en poids par rapport au poids total de la matière sèche).

Ainsi, c'est au terme de nombreuses expérimentations dans des conditions de lumière inhabituelles et par l'adjonction de différents substrats que le demandeur est parvenu à isoler des souches de cyanobactéries de l'espèce Nostoc sp., cultivables en mode mixotrophe permettant, dans les conditions de la présente invention, une production à haut rendement de polysaccharides.

Une souche (FCC 1051 ) représentative des nouvelles souches de Nostoc sp., ainsi isolées et sélectionnées, a été déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371 QA, Ecosse, Royaume-Uni) selon les dispositions du Traité de Budapest, sous le numéro d'accession CCAP 1453/37.

Le procédé de culture et de sélection a consisté plus particulièrement à cultiver les cyanobactéries en conditions de mixotrophie, en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, avec une gamme de variations d'intensité lumineuse et une fréquence spécifiques.

L'alternance rapprochée de phases éclairées et de phases obscures ou de moindre intensité lumineuse, perçue généralement comme stressante par les cyanobactéries, a permis, de façon surprenante, d'obtenir des souches de Nostoc sp. une production élevée de biomasse et de polysaccharides. Cette mise en œuvre des souches selon l'invention ouvre la perspective d'une production industrielle des polysaccharides, dans des fermenteurs bénéficiant d'un apport lumineux réduit, et devrait donc permettre de réaliser des économies d'énergie par rapport aux modes de culture autotrophes.

Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci- après. Description détaillée

La présente invention a donc pour objet un procédé de culture de cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc, en mode mixotrophe. Le procédé selon l'invention permet un enrichissement des cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc en polysaccharides. Par cyanobactérie, on entend plus particulièrement les souches des genres Nostoc, Gloeocapsa, Chroococcidiopsis, Phormidium, Microcyctis et Lyngbya.

Elle concerne également un procédé de culture en mode mixotrophe dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps. L'éclairement présente des variations d'intensité dont l'amplitude est généralement comprise entre 5 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 et 1000 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , de préférence entre 30 et 400 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 . Ces variations peuvent généralement avoir lieu entre 2 et 3600 fois par heure, de préférence entre 2 et 200 fois par heure. Ces conditions de culture permettent d'apporter une quantité définie de lumière. Cet apport lumineux peut comporter des phases d'éclairement discontinu et/ou variable, avec des variations d'intensité pouvant avoir des amplitudes identiques ou différentes. L'éclairement peut être notamment sous forme de flashs.

Ce procédé a pour avantage d'augmenter le rendement en biomasse obtenu de la culture. Il a aussi pour avantage d'enrichir les cyanobactéries ainsi cultivées en polysaccharides. Ce procédé peut être également utilisé, pour sélectionner des souches de cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc, à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en polysaccharides.

La culture en mode mixotrophe de cette cyanobactérie s'effectue préférentiellement en présence de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500mM d'un substrat carboné organique. L'apport du substrat est assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de polysaccharides. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration constante. Ce substrat carboné comprend préférentiellement, sous forme pure ou en mélange : du glucose, des dérivés de cellulose, de lactate, de l'amidon, du lactose, du saccharose, de l'acétate et/ou du glycérol.

Le substrat carboné organique contenu dans le milieu de culture peut consister en des molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés adaptés à la culture en mixotrophie des cyanobactéries selon l'invention.

Ce procédé est plus particulièrement destiné à la mise en œuvre de nouvelles souches de cyanobactéries du genre Nostoc (Division : Cyanobactérie, Ordre : Nostocales, Famille : Nostocaceae) [ITIS Catalogue of Life, 2010] sélectionnées pour leur caractère mixotrophe, notamment pour leur capacité à être cultivées avec un apport lumineux supérieur à 10 μΕ, dans un milieu minéral, par exemple le milieu BG1 1 [R., Rippka, R., J. Deruelles, J. Waterbury, M. Herdman and R. Stanier (1979) ; Generic assignments, strain historiés and properties of pure cultures of cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 1 1 1 : 1 -61], dans lequel est ajouté un substrat carboné organique. De préférence, le substrat carboné organique comprend du glucose, du lactate, dans une concentration équivalente ou supérieure à 5 mM.

Ces nouvelles souches de Nostoc peuvent être isolées et sélectionnées selon le procédé de sélection et de culture selon l'invention décrit plus loin.

Une souche représentative des souches de Nostoc sp. selon l'invention est la souche FCC 1051 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP, sous le numéro CCAP 1453/37. De telles souches sont capables de produire des quantités significatives de polysaccharides quand elles sont cultivées en mode mixotrophe avec un apport en lumière variable ou discontinu, selon l'invention.

Selon les analyses taxonomiques en cours, la souche CCAP 1453/37 appartient au genre Nostoc. L'invention porte sur toute souche du genre Nostoc, capable de croître en conditions de culture mixotrophe telles que décrites dans la présente demande, et capable de produire des polysaccharides.

Les souches de Nostoc isolées selon l'invention permettent de produire, en condition de mixotrophie, des quantités significatives de polysaccharides, lesdits polysaccharides pouvant représenter plus de 60% ou plus de 70% en poids par rapport au poids total de la matière sèche.

Dans la présente invention, la biomasse obtenue avec la souche

FCC 1051 , isolée par le demandeur, d'une culture en conditions mixotrophes en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, est de 10 à 60 %, plus généralement de 20 à 50 %, supérieure à celle d'une culture avec la même souche effectuée en mode mixotrophe classique. Par mode mixotrophe classique, on entend des conditions de culture avec un milieu de culture identique, mais avec un apport de lumière naturelle (culture en extérieur) ou un apport de lumière continu et constant.

L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture de cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc, notamment de l'espèce Nostoc sp. en mode mixotrophe, en présence d'un éclairement variable ou discontinu au cours du temps, par exemple sous forme de flashs, notamment en vue de produire des polysaccharides.

L'invention a ainsi pour objet un procédé de sélection des cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc, à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en polysaccharides, en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu au cours du temps.

Il est apparu qu'un éclairement variable et/ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en œuvre d'une culture en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des cyanobactéries et permettait d'accroître la productivité de celles-ci, notamment en ce qui concerne leur production de polysaccharides. Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu et/ou variable de lumière aux cyanobactéries a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la croissance et à la synthèse des polysaccharides. Ce phénomène pourrait s'expliquer, en partie, par le fait que dans la nature, les cyanobactéries ont tendance à accumuler des réserves polysaccharides pour résister aux contraintes de leur environnement.

Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées.

Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs. Un flash, au sens de l'invention, est un éclairement lumineux de courte durée, c'est-à-dire de moins de 30 minutes. La durée du flash peut être de moins de 15 minutes, de préférence de moins de 5 minutes ou plus préférentiellement encore de moins de 1 minute. Selon certains modes de réalisation de l'invention, la durée du flash peut être de moins d'une seconde. Par exemple, le durée du flash peut être de 1/10 d'une seconde, ou de 2/10 d'une seconde, ou de 3/10 d'une seconde, ou de 4/10 d'une seconde ou de 5/10 d'une seconde, ou de 6/10 d'une seconde, ou de 7/10 d'une seconde, ou de 8/10 d'une seconde, ou de 9/10 d'une seconde. L'éclairement lumineux, ou le flash, est généralement d'une durée supérieure à 15 secondes. La durée du flash est généralement comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.

En général, le nombre de flashs est compris entre environ 2 et 3600 par heure. Il peut être, par exemple, compris entre 100 et 3600 flashs par heure. Il peut être également compris entre 120 et 3000, ou entre 400 et 2500, ou entre 600 et 2000, ou entre 800 et 1500 flashs par heure. Il peut être également compris entre 2 et 200, préférentiellement entre 10 et 150, plus préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement encore entre 20 et 50 par heure. Les flashs peuvent être émis à intervalle régulier ou non dans le temps. En cas d'émission à intervalle régulier, le nombre de flashs par heure correspond alors à une fréquence (F) ayant une période temporelle (T), étant considéré que F = 1/T. Cette période temporelle peut être comprise entre 1 seconde et 30 minutes, ou entre 1 seconde et 36 secondes, ou encore entre 1 ,2 seconde et 30 secondes, ou entre 1 ,44 seconde et 9 secondes, ou entre 1 ,8 seconde et 6 secondes, ou entre 2,4 secondes et 4,5 secondes. Cette fréquence peut être également comprise entre 18 secondes et 30 minutes, préférentiellement entre 24 secondes et 6 minutes, plus préférentiellement entre 36 secondes et 4 minutes, et plus préférentiellement encore entre 72 secondes et 3 minutes. Le nombre de flashs par heure est choisi en fonction de l'intensité et la durée des flashs (voir ci-dessous). En général, l'intensité de la lumière apportée sous forme de flashs est comprise entre 5 et 1000 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , de préférence entre 5 et 500 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ou 50 et 400 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , et plus préférentiellement entre 150 et 300 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 . Par définition, 1 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 correspond à 1 μΕ m ^"2 , s ^"1 (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature. Selon un mode particulier de l'invention, l'intensité de la lumière est comprise entre 50 et 200 μιτιοΙ. m ^-2 , s ^-1 , la période temporelle de la fréquence des flashs est comprise entre 10 secondes et 60 minutes pour une durée de flash comprise entre 1 seconde et 1 minute.

Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, mais que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de l'intensité de lumière est régulière et peut être périodique ou cyclique. Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues.

Selon l'invention, quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 ), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement comprise entre 5 et 1000, ou entre 50 et 800, ou entre 100 et 600 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 . L'intensité de la lumière peut également varier entre 5 et 400 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 . De préférence, l'amplitude de la variation d'intensité de lumière est entre 70 et 300 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 et plus préférentiellement entre 100 et 200 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 .

Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, en conditions d'éclairement variable, par exemple, les valeurs 50 μηηοΙ.ηη ^"2 .5 ^"1 et 100 μηηοΙ. m ^"2 s ^"1 , ou 5 et 400 μηηοΙ. m ^"2 s ^"1 , ou 50 et 800 μηηοΙ. m ^"2 , s ^"1 plusieurs fois chaque heure. Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, de préférence les valeurs 50 et 200 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 . Alternativement, en conditions d'éclairement discontinu, ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 50 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , les valeurs 0 et 100 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 ou préférentiellement encore les valeurs 0 et 200 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 . Elle peut également atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 300 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , les valeurs 0 et 600 mol.m ^"2 .s ^"1 , les valeurs 0 et 800 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 ou encore les valeurs 0 et 1000 mol.m ^"2 .s ^"1 . Selon un mode de l'invention et quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité de la lumière apportée à la culture varie en fonction de la densité cellulaire. Plus la culture devient dense, plus la lumière peut être intense. La densité cellulaire est le nombre de cellules par ml et elle est mesurée selon les techniques connues de l'homme de l'art.

Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est entre environ 10 ⁵ et 5 x10 ⁵ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 15 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , de préférence entre 5 et 10 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 . Quand la culture atteint une densité entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 15 et 200 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , par exemple, de préférence entre 20 et 50 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 . Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 50 et 400 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 par exemple, de préférence entre 50 et 150 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 .

Selon certains modes de réalisation, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou de moins d'une seconde, l'intensité de la lumière peut être plus importante par rapport aux valeurs citées ci-dessus. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est entre environ 10 ⁵ et 5 x 10 ⁵ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 200 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , de préférence entre 5 et 100 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 . Quand la culture atteint une densité entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 30 et 500 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , par exemple, de préférence entre 50 et 400 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 . Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 100 et 1000 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 par exemple, de préférence entre 200 et 500 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 .

Selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture dans l'heure reste entre certaines valeurs. Elle est comprise entre environ 2000 et 600 000, de préférence entre 2000 et 300 000 μηηοΙ. m ^"2 . Elle peut être comprise entre environ 4000 et 200 000 μιτιοΙ. m ^"2 , par heure.

Selon un mode de l'invention, la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 10 μηηοΙ. m ^-2 , s ^-1 . Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 9000 μιτιοΙ. m ^"2 . Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 20 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 20 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 . Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 12 000 μιτιοΙ. m ^"2 . Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 45 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 15 secondes et une intensité de 5 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 3375 μιτιοΙ. m ^"2 . Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité de 200 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 240 000 μηηοΙ. m ^"2 .

Comme décrit pour l'intensité lumineuse ci-dessus, et selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture par heure peut varier en fonction de la densité cellulaire. Au stade initial de la culture quand la densité cellulaire est 10 ⁵ et 5 x10 ⁵ cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure est généralement compris entre environ 1500 et 8000, de préférence 1500 et 6000 μιτιοΙ. m ^"2 , de préférence encore entre 2000 et 5000 μηηοΙ. m ^"2 . Quand la culture atteint une densité entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 6000 et 67 000 μηηοΙ. m ^"2 , de préférence entre 6000 et 50 000, et de préférence encore entre 12 000 et 45 000 μιτιοΙ. m ^"2 , par exemple. Au stade final de la culture, à une densité cellulaire entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 45 000 et 300 000, par exemple de préférence entre 45 000 et 200 000 μιτιοΙ. m ^"2 , et par exemple, de préférence encore, entre 50 000 et 150 000 μηηοΙ. m ^"2 .

Selon un mode de l'invention, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 10 ⁵ et 5 x10 ⁵ cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 5 et 10 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 2250 μιτιοΙ. m ^"2 à 4500 μιτιοΙ. m ^"2 . Puis, au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 15 et 50 μmol. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 13 500 à 45 000 μιτιοΙ. m ^"2 . Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 50 et 150 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 45 000 à 135 000 μηηοΙ. m ^"2 .

Selon un mode de l'invention, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou de moins d'une seconde, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 10 ⁵ et 5 x10 ⁵ cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 50 et 100 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 15 000 μιτιοΙ. m ^"2 à 30 000 μιτιοΙ. m ^"2 . Puis, au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 10 ⁶ et 10 ⁷ cellules par ml), la culture est illuminée avec 50 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 200 et 300 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 100 000 à 150 000 μιτιοΙ. m ^"2 . Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre 10 ⁷ et 10 ⁸ cellules par ml), la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 350 et 450 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ce qui donne un apport total de lumière par heure de 420 000 à 540 000 μιτιοΙ. m ^"2 .

L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante.

Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi sélectionnées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue et/ou variable, prédispose lesdites souches à une production plus élevée de polysaccharides.

Le procédé de culture selon l'invention permet ainsi de sélectionner des souches du genre Nostoc, similaires à celle isolée par le demandeur et déposée à la CCAP sous le numéro CCAP 1453/37, et ayant un haut rendement en polysaccharides. Ce procédé de culture est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :

a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches de cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 et 1000, de préférence entre 5 et 400 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ces variations ayant lieu entre 2 et 3600, de préférence 5-400 fois par heure, b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations, en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement

c) une étape de récupération des cyanobactéries ainsi cultivées.

Par étape de récupération, on entend plus particulièrement l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations.

Avantageusement, la culture en mode mixotrophe s'effectue dans des conditions d'éclairement discontinu ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 et 400 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 , ces variations ayant lieu entre 2 et 200 fois par heure.

Pour réaliser la sélection des souches, différentes souches de cyanobactéries, en particulier du genre Nostoc, peuvent être cultivées, en parallèle, sur des microplaques dans une même enceinte, avec un suivi précis des conditions et de l'évolution des différentes cultures. Il est ainsi aisé de connaître la réponse des différentes souches à l'éclairement discontinu et/ou variable et, le cas échéant, à l'adjonction d'un ou plusieurs substrats carbonés dans le milieu de culture. Les souches qui répondent favorablement à l'éclairement discontinu et/ou variable et aux substrats carbonés offrent généralement un meilleur rendement pour la production de polysaccharides.

Les cyanobactéries peuvent être sélectionnées dans un fermenteur à partir d'une population hétérogène et dont on cherche à sélectionner les variants avantagés par le mode de sélection selon l'invention alliant lumière discontinue et/ou variable, présentant une gamme d'intensité lumineuse et une fréquence spécifiques, avec des conditions de culture mixotrophes. Dans ce cas, la culture est pratiquée en maintenant les cyanobactéries en cultures sur de nombreuses générations, puis un isolement des composantes devenues majoritaires dans le milieu de culture est effectué au terme de la culture.

Le procédé de culture selon l'invention permet également de produire des polysaccharides.

Dans ce cas, le procédé selon l'invention comporte en outre les étapes suivantes :

d) une étape d'extraction des polysaccharides des cyanobactéries ainsi récupérées et/ou éventuellement,

e) une étape de récupération des polysaccharides sécrétés dans ledit milieu de culture des cyanobactéries.

Ainsi, selon un mode de l'invention, les polysaccharides sont sécrétés par les cyanobactéries dans leur milieu de culture, d'où ils sont récupérés selon des méthodes connues à l'homme de l'art. Selon un autre mode de l'invention, les polysaccharides qui sont localisés dans des structures additionnelles attachées à la surface de la membrane cellulaire de la cyanobactérie, sont récupérés selon des méthodes connues de l'homme de l'art. Selon un autre mode de l'invention, les polysaccharides qui sont localisés à la surface extérieure de la membrane cellulaire de la cyanobactérie sont récupérés selon des méthodes connues à l'homme de l'art. Selon un autre mode de l'invention, les polysaccharides qui sont localisés à l'intérieur de la membrane cellulaire de la cyanobactérie sont récupérés selon des méthodes connues de l'homme de l'art. Le procédé de culture selon l'invention peut s'appliquer également à toute espèce de cyanobactéries, en particulier du genre Noctoc, capable de croître dans les conditions mixotrophes selon l'invention, et capable de produire des polysaccharides.

Le procédé de culture selon l'invention permet d'optimiser la production de la biomasse obtenue de la culture. Il permet également d'enrichir les cyanobactéries ainsi cultivées en polysaccharides.

L'invention a donc également pour but l'optimisation de la production de biomasse, ainsi que la production des polysaccharides, via la culture de cyanobactéries, en particulier du genre Noctoc à caractère mixotrophe, de préférence cultivées ou sélectionnées selon les procédés visés précédemment, puis la récupération des cyanobactéries ainsi cultivées pour en extraire le contenu polysaccharidique, et/ou la récupération des polysaccharides sécrétés dans ledit milieu de culture des cyanobactéries.

Les méthodes de récupération et d'extraction des polysaccharides sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par [Smith, I. H. et Pace, G. W. (1982) Recovery of microbial polysaccharides, J. Chem. Tech. Biotechnol., 32 :1 19-121 ].

L'invention porte également sur les cyanobactéries, en particulier du genre Noctoc, susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention tel que précédemment décrit. Ces cyanobactéries sont enrichies en polysaccharides. Elles ont généralement un rendement en polysaccharides de plus de 60% ou plus de 70% en poids par rapport au poids total de la matière sèche.

Exemple 1

Les cultures de Nostoc FCC 1051 ont été réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 1 ,5L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 1 N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture est fixée à 22°C. L'agitation est réalisée grâce à 2 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration suivante : hélice de Rushton et hélices tripales à pompage descendant. La vitesse d'agitation et le débit d'aération sont régulés au mini = 100 rpm et au maxi = 250 rpm et Qmini =0,5 vvm / Qmaxi = 2 vvm respectivement. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente.

Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table agitante (140 rpm) en enceinte thermo statée (23°C) et éclairée entre 80 et 100 uE. Les pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu BG1 1 (R., Rippka, R., J. Deruelles, J. Waterbury, M. Herdman and R. Stanier (1979))

Le substrat carboné organique utilisé pour la culture en mixotrophie en bioréacteur est le glucose à des concentrations entre 50 mM et 150 mM. Suivi des cultures :

La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GFB, Whatman, puis séchage à l'étuve à 100°C pendant 24h minimum avant pesée).

Concernant la quantification des polysaccharides externes en fin de culture, 100mL de suspension cellulaire sont utilisés pour réaliser l'extraction. Les méthodes de dosage des polysaccharides sont connues de l'homme du métier.

Eclairement :

La culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 80 μιτιοΙ. m ^"2 , s ^"1 .

L'apport de la lumière dans les cultures en bioréacteur a été obtenu par des lampes LED (Diodes Electro Luminescentes) réparties autour de la paroi externe du fermenteur. Un pilotage informatique déclenche l'alimentation des LED pour des temps d'éclairement ou des flashs.