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Title:
PRODUCTION OF VESICULAR PHOSPHOLIPID GELS BY SCREW EXTRUSION
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2019/175440
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to a method for producing vesicular phospholipid gels (VPG) produced by means of screw extrusion. The invention particularly relates to a method for producing VPG comprising at least one pharmaceutical active substance, preferably a protein, a peptide, a polypeptide, a nucleotide, an antibody, an antibody derivative, a virus, virus-like particles, or low-molecular medicaments, the production comprising the following steps: (i) supplying at least one phospholipid, an aqueous liquid, optionally at least one pharmaceutical active substance, optionally at least one other lipid selected from the group consisting of fatty acids, monoglycerides, diglycerides, trigylcerides, sorbitan fatty acid esters, sphingolipids, cholesterol, waxes and salts of the fatty acids and derivatives thereof into a screw extruder, (ii) homogenising the above-mentioned constituents in a screw extruder such that a VPG is created, and (iii) extruding the VPG. Said steps can also be carried out simultaneously. The invention also relates to a method for producing VPGs, which is characterised in that a pharmaceutical active substance is released over a long time.

Inventors:
WINTER, Gerhard (Antdorfer Straße 18, Penzberg, 82377, DE)
BREITSAMER, Michaela (Karwendelstraße 3, Wolfratshausen, 82515, DE)
DEIRINGER, Natalie (Ludwig-Ganghofer-Straße 48, Kastl, 84556, DE)
Application Number:
EP2019/056724
Publication Date:
September 19, 2019
Filing Date:
March 18, 2019
Export Citation:
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Assignee:
LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITÄT MÜNCHEN (Geschwister-Scholl-Platz 1, München, 80539, DE)
International Classes:
A61K9/00; A61K9/127; A61K31/7052; A61K38/00; A61K38/18; A61K38/20; A61K38/38; A61K39/395
Foreign References:
EP2601934A12013-06-12
EP1547674A12005-06-29
US20050238721A12005-10-27
EP2280681A12011-02-09
EP1968553A22008-09-17
EP1881819A12008-01-30
Other References:
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Attorney, Agent or Firm:
MAIWALD PATENTANWALTS- UND RECHTSANWALTSGESELLSCHAFT MBH (Dr. Regina Neuefeind, Elisenhof Elisenstrasse 3, München, 80335, DE)
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Claims:
A n s p r ü c h e

1. Verfahren zur Herstellung von vesikulärem Phospholipid-Gel (VPG), wobei das VPG mittels Schnecken-Extrusion hergestellt wird.

2. Verfahren zur Herstellung von VPG gemäß Anspruch 1, wobei das VPG weiterhin mindestens ein Lipid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fettsäuren, Monoglyceriden, Diglyceriden, Triglyceriden, Sorbitanfettsäureestem,

Sphingolipiden, Cholesterol, Wachsen und Salzen der Fettsäuren und Derivaten davon umfasst.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend die folgenden Schritte:

(i) Zuführen von mindestens einem Phospholipid und einer wässrigen

Flüssigkeit, optional von mindestens einem pharmazeutischen Wirkstoff, bei dem es sich bevorzugt um ein Protein, Peptid, Polypeptid , Nukleotid, einen Antikörper, ein Antikörperderivat, Virus, virus-like particle, oder einen niedermolekularen

Arzneistoff handelt, optional von mindestens einem Lipid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fettsäuren, Monoglyceriden, Diglyceriden, Triglyceriden,

Sorbitanfettsäureestem, Sphingolipiden, Cholesterol, Wachsen und Salzen der Fettsäuren und Derivaten in einen Schnecken-Extruder,

(ii) Homogenisieren des einen oder der mehreren Phospholipide, der wässrigen Flüssigkeit und/oder des optionalen pharmazeutischen Wirkstoffs in dem

Schneckenextruder, so dass das VPG entsteht, und

(iii) Extrudieren des VPG,

wobei die Schritte auch gleichzeitig stattfinden können.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das mindestens eine Phospholipid, die wässrige Flüssigkeit, der optionale, mindestens eine pharmazeutische Wirkstoff, und/oder das optionale, mindestens eine Lipid separat dem Schnecken-Extruder zugeführt werden, wobei die Zuführung gleichzeitig oder zeitlich versetzt erfolgen kann.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das mindestens eine Phospholipid und die wässrige Flüssigkeit vor der Zuführung gemischt und als Gemisch dem

Schnecken-Extruder zugeführt werden.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die

Schnecken-Extrusion eine Doppelschnecken-Extrusion ist.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die Temperatur während des Extrudierens zwischen 4 °C und 60 °C beträgt und die

Drehgeschwindigkeit der Extrusionsschnecke(n) zwischen 5min 1 und 500 min 1, bevorzugt zwischen 20 min 1 und 360 min 1 beträgt.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, bei dem mehrere Schritte des Extrudierens durchgeführt werden. 9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei

(i) die Extrusionsschnecke(n) über eine Förderfünktion und optional zusätzlich über Knet- oder Mischsegmente oder anders gestaltete Segmente für Mischung, Transport, Temperierung, Verdichtung, oder Austragung verfügen, und/oder

(ii) die Extrusionsschnecke(n) gleich- oder gegenläufig betrieben werden, und/oder

(iii) die für die Extrusion verwendeten Düsen unterschiedliche Durchmesser, Längen und/oder Formen aufweisen, und/oder (iv) der Auslass des Extruders zur Achse der Extruder-Schnecke(n) rechtwinklig oder geradlinig angeordnet ist.

10. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Anteil an Phospholipid(en) im VPG 30-60 Gew.-% beträgt.

11. Verfahren gemäß einem Ansprüche 3 bis 10, wobei der mindestens eine pharmazeutische Wirkstoff aus dem hergestellten VPG über einen Zeitraum von mehr als 5 Tagen freigesetzt wird und die initiale Freisetzung des Wirkstoffs weniger als 20% der Gesamtwirkstoffmenge innerhalb der ersten 48 Stunden beträgt.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 11, weiterhin umfassend einen Schritt

(iv) Extrudieren durch einen RAM -Extruder,

wobei dieser Schritt nach den Schritten (i)-(iii) stattfindet.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 12, weiterhin umfassend einen Schritt

(v) ein- oder mehrfaches Extrudieren mit einem Schneckenextruder, wobei optional der Schneckenextruder der selbe wie in Schritt (i)-(iii) oder ein weiterer

Schneckenextruder ist,

wobei dieser Schritt nach den Schritten (i)-(iii) und optional vor oder nach Schritt (iv) stattfindet. 14. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei in Schritt (v) das oder die gleiche(n) und/oder ein oder mehrere weitere Phospholipid(e), die gleiche(n) und/oder eine oder mehrere weitere wässrige(n) Flüssigkeit(en), der oder die gleiche(n) und/oder ein oder mehrere weitere pharmazeutischen Wirkstoffe), und/oder das oder die gleiche(n) und/oder ein oder mehrere weitere Lipid(e) wie in Schritt (i) zugeführt werden.

Description:
Herstellung vesikulärer Phospholipid-Gele durch Schnecken-Extrusion

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von vesikulären Phospholipidgelen (VPG), die mittels Schneckenextrusion hergestellt werden. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von VPG, die einen pharmazeutischen Wirkstoff umfassen, bevorzugt ein Protein, Peptid, Polypeptid, Nukleotid, Antikörper, Antikörperderivat, Virus, virus-like particle, oder niedermolekularer Arzneistoff wobei die Herstellung folgende Schritte umfasst: (i) Zuführen von einem oder mehreren Phospholipiden, einer wässrigen Flüssigkeit sowie optional von mindestens einem pharmazeutischen Wirkstoff in einen Schnecken- Extruder, sowie weiterhin optional von mindestens einem anderen Lipid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fettsäuren, Monoglyceriden, Diglyceriden, Triglyceriden, Sorbitanfettsäureestem, Sphingolipiden, Cholesterol, Wachsen und Salzen der Fettsäuren und Derivaten davon, (ii) Homogenisieren der vorher genannten Bestandteile in einem Schneckenextruder, so dass ein VPG entsteht, und (iii) Extrudieren des VPG, wobei diese Schritte auch gleichzeitig stattfinden können. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von VPG, das dadurch ausgezeichnet ist, dass ein pharmazeutischer Wirkstoff über längere Zeit freigesetzt wird.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Vesikuläre Phospholipid Gele (VPG) sind halbfeste Arzneiformen für die verlängerte Freisetzung von Proteinen, Peptiden, Nukleotide, Antikörper, Antikörperderivate, Viren, virus-like particles, niedermolekulare Arzneistoffe und anderen Wirkstoffen. Sie bestehen aus bis zu ungefähr 70% Phospholipiden, den Rest machen hydrophile Lösungen des Wirkstoffes, üblicherweise wässrige Pufferlösungen, und eventuell andere Lipide aus. Diese einfache und günstige Zusammensetzung, ihre hohe Biokompatibilität, und ihre außerordentliche Funktionalität mit Freisetzungsraten von bis zu mehreren Wochen oder Monaten, machen VPG zu einer wertvollen Depot- Arzneiform.

Bisher wurden VPGs durch Hochdruckhomogenisierung (HPH) oder mittels einer Dualen Asymmetrischen Zentrifuge (DAC), auch Speedmixer genannt, hergestellt (Brandl et al., 1997 und Massing et al., 2008). Über die letzten Jahre hat sich dabei die DAC als Standardverfahren zur Herstellung von VPGs entwickelt. In jüngerer Zeit wurde als alternative Methode zur Herstellung von VPG ein Rührverfahren vorgeschlagen, bei dem mittels eines Magnetrührers in einem Glasgefäß die Komponenten bis zur Entstehung einer Dispersion gerührt werden (Zhong et al., 2013 und Zhang et al., 2015). Es ist dabei jedoch fraglich, ob VPGs der zuvor mit der DAC erreichten Qualität erhalten werden können.

Alle bisherigen Herstellungsprozesse für VPG haben verschiedene Nachteile wie eine lange Verfahrensdauer (DAC), schlechte Kontrollierbarkeit (Temperatur, Scherkräfte bei HPH, DAC), und die Tatsache, dass extrem hohe Scherkräfte auf das Produkt ausgeübt werden (HPH, DAC). Die Herstellung von VPG kann mit DAC -Verfahren nur in einzelnen Chargen hintereinander erfolgen, da ein kontinuierlicher Prozess mit den Geräten nicht realisierbar ist. Zusätzlich ist eine Skalierung der Chargengrößen bei der Herstellung mit der DAC nur sehr limitiert möglich. Mit Hilfe der HPH können VPGs zwar verhältnismäßig schnell und in großen Mengen produziert werden, allerdings werden so hohe Scherkräfte aufgebracht, so dass dieses Verfahren für sensitive Wirkstoffe ungeeignet ist. Proteine aggregieren dabei beispielsweise sehr leicht und können nach Herstellung mit HPH nicht mehr in nativer Form ffeigesetzt werden.

Daher wäre wünschenswert, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung solcher VPG bereitzustellen. Ein verbessertes Verfahren zu Herstellung von VPG würde über eine verkürzte V erfahrensdauer sowie minimierte Scherkräfte verfügen und einen kontinuierlichen Prozess darstellen, so dass die Herstellung idealerweise nicht in einzelnen Chargen hintereinander erfolgt.

Die Schnecken- Extrusion, oder genauer die Doppelschnecken-Extrusion (TSE = twin screw extrusion), ist eine einfache und kontinuierliche Herstellungstechnologie, die sich in der pharmazeutischen Industrie für die Herstellung von anspruchsvollen Arzneiformen etabliert hat. Sie ist an sich als Verfahren seit langem ausführlich beschrieben (White, 1990 und White, 2002) und dadurch gekennzeichnet, dass in einem zylindrisch oder anders ausgeformten Körper („Barrel“), eine oder mehrere Schnecken sich drehend Material in eine Richtung durch eine Düse austrägt. Sie hat großes Ansehen erlangt im Bereich der kontinuierlichen Nass-Granulierung und Schmelz-Granulierung („melt-extrusion“), sowie bei der Produktion von injezierbaren Implantaten (Schulze und Winter, 2009). Das schnelle Verfahren mit kontrollierbaren Parametern, wie Temperatur und Scherintensität, kann leicht auf größere oder kleine Produktionsgrößen angepasst werden und kontinuierliche Herstellung ist problemlos möglich. Flüssige, halbfeste und feste Komponenten können gleichzeitig verarbeitet werden und eine homogene Mischung kann erreicht werden. Die Schnecken-Extrusion wurde bislang noch nicht für die Herstellung von VPGs angewendet. Die Schnecken-Extrusion ist klar zu unterscheiden von anderen Extrusionsverfahren, die auch in der Herstellung von Liposomen eingesetzt werden. Die Membranextrusion stellt eine Methode dar, bei der meist wässrige Liposomendispersionen mit Druck durch einen Membranfilter gepresst werden. Dabei werden die Liposomen meist in ihrer Größe reduziert und homogenisiert. Für VPG sind diese Verfahren nicht geeignet. Weiterhin ist die Schnecken -Extrusion klar zu unterscheiden von Extrusion mittels eines sog. RAM-Extruders, bei dem ein zylindrischer Kolben in einem Zylinder den Inhalt unter hohem Druck durch eine am Ende des Zylinders angebrachte Düse presst.

Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein solches verbessertes Verfahren zur Herstellung von VPG bereitzustellen, wobei das VPG optional mindestens einen pharmazeutischen Wirkstoff in Form eines Proteins, Peptids, Polypeptids, Nukleotids, Antikörpers, Antikörperderivats, Virus, virus-like particle, oder niedermolekularen Arzneistoffs umfasst. Zusammenfassend wurden auf der Grundlage des oben dargelegten technischen Bereichs und des sich daraus ergebenden Bedarfs für ein verbessertes Herstellungsverfahren von VPG folgende Ziele festgelegt:

• kürzere Prozessdauer

• verbesserte Temperaturkontrolle

• geringere Viskosität der VPG als bei DAC

• möglichst kein Batchverfahren

• geringere Scherkräfte, damit weniger Stress, Degradation und Aggregation von empfindlichen Wirkstoffen

• bessere Dispersionsqualität als bei Magnetrührverfahren

• bessere Lagerstabilität als mit Magnetrührverfahren hergestellte VPG

• bessere Skalierbarkeit einfachere Einarbeitung von Wirkstoffen in jedweder Form (gelöst in Lipid, gelöst in wässriger Lösung, emulgiert in einer Emulsion, dispergiert in Liposomen, dispergiert in wässriger Lösung, dispergiert in Lipid, als Reinstoff in fester oder halbfester oder flüssiger Form, z.B. auch als Lyophilisatjwobei die durch das Verfahren hergestellten VPG eine langsame Freisetzung des optionalen pharmazeutischen Wirkstoffs aufweisen.

Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung, die aus der Beschreibung ersichtlich werden, werden durch das Verfahren zur Herstellung des VPG und durch die Verwendung des im Verfahren hergestellten VPG gemäß den unabhängigen Ansprüchen gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind durch die abhängigen Ansprüche definiert.

Im Folgenden sollen einige wichtige Referenzen aus dem Stand der Technik genannt und kommentiert werden. Alle vorgeschlagenen Systeme erfüllen jedoch nicht die Erwartungen an ein vergleichsweise kurzes und leicht skalierbares Verfahren zur Herstellung mit geringen Scherkräften, der in stabile VPG mit guten Langzeitfreisetzungseigenschaften von Wirkstoffen resultiert. US 2005/0238721A1 betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Produkts, das einen pharmazeutischen Bestandteil und ein polymeres Material enthält. Der pharmazeutische Bestandteil kann in das polymere Material schmelz-compoundiert werden und durch eine Düse extrudiert werden, um ein Produkt herzustellen. Bei diesem Verfahren ist eine Schmelzmischung des pharmazeutischen Bestandteils und des polymeren Materials erforderlich. Die Herstellung von anderen pharmazeutischen Darreichungsformen wie VPG mit positiven Langzeitffeisetzungseigenschaften von einem Wirkstoff wird nicht erwähnt. EP 2280681 Al beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von festen, oralen Darreichungsformen in einem Ausrüstungsstrang/Maschinenstrang, der mehrere Teile von Vorrichtungen umfasst, die zum Mischen, Extrudieren, Kühlen, Mahlen und zur Endbearbeitung ausgelegt sind Es werden keine weiteren Darreichungsformen wie VPG mit positiven Langzeitfreisetzungseigenschaften von einem Wirkstoff genannt, ferner ist dieses Verfahren dazu ausgelegt, Granulate als feste, orale Darreichungsformen herzustellen.

EP 1968553 A2 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von festen oralen Dosierungsformen, die eine schwer lösliche und/oder schlecht verdichtbare therapeutische Verbindung und ein Polymer aufweisen. Das Verfahren wird unter Verwendung eines Extruders durchgeführt. Ein flüchtiger Weichmacher, z. B. ein verflüssigtes Gas, wie überkritisches Kohlendioxid, wird zugegeben, um die Verarbeitung der Materialien zu erleichtern. Der flüchtige Weichmacher kann dazu dienen, die Viskosität der zu verarbeitenden Mischung zu senken und/oder die Löslichkeit der therapeutischen Verbindung zu erhöhen. Für dieses Verfahren sind Polymere und Weichmacher erforderlich, das vorliegende Verfahren lässt nichts über die Herstellung von anderen pharmazeutischen Darreichungsformen wie Gele und VPG mit positiven Langzeitfreisetzungseigenschaften von einem Wirkstoff verlauten.

EP 1881819 A 1 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von festen Dosierungsformen, die eine schwer komprimierbare therapeutische Verbindung enthalten. Das Verfahren sieht die Verwendung eines Extruders, insbesondere eines Doppelschneckenextruders, vor, um eine therapeutische Verbindung mit einem Granulationshilfsmittel schmelzgranulieren zu lassen. Außerdem sieht dieses Verfahren die Herstellung eines Granulats vor, ebenso ist das Kneten des Gemischs im Extruder parallel zum Erhitzen des Gemischs vorgesehen. Die Herstellung von anderen pharmazeutischen Darreichungsformen wie VPG mit positiven Langzeitfreisetzungseigenschaften von Wirkstoff wird nicht erwähnt.

Im Hinblick auf die Einschränkungen konventioneller Verfahren zur Herstellung von VPG besteht ein offensichtlicher Bedarf an einem alternativen Verfahren zur Herstellung von VPG, um die Nachteile traditioneller Verfahren zur Herstellung zu umgehen, in Hinblick auf Prozessdauer, Skalierbarkeit des Prozesses, Scherkräfte, sowie die Eigenschaften des hergestellten VPG, insbesondere in Hinblick auf die Langzeitfreisetzungseigenschaften.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ziel der Erfindung ist es, einen Weg zu finden, VPG und VPG mit pharmazeutischen Wirkstoffen herzustellen und die bekannten Nachteile alternativer Verfahren zur Herstellung zu vermeiden, wie beispielsweise den Nachteil der vergleichsweise langen Prozessdauer, der schwer zu skalierende Prozess, die hohen Scherkräfte und dass ein Batchverfahren zu nutzen ist, oder einer hohen Viskosität der VPG. Exemplarisch seien ebenfalls die hohe Viskosität der hergestellten VPG und die komplizierte Einarbeitung von sensitiven pharmazeutischen Wirkstoffen, wie beispielsweise proteinöse pharmazeutische Wirkstoffe, erwähnt.

Deshalb ist es ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von VPG bereit zu stellen, das eine Herstellung mit niedrigen Scherkräften, einer kürzeren Prozessdauer ohne Batchverfahren mit verbesserter Skalierbarkeit und eine vergleichsweise einfache Einarbeitung von pharmazeutischen Wirkstoffen beinhaltet. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung von VPG bereit zu stellen, das eine verbesserte Temperaturkontrolle der Herstellung beinhaltet, sowie zu einer geringeren Viskosität des VPG als bei DAC-Herstellung führt und zu einer besseren Dispersionsqualität und damit auch zu besserer Stabilität als bei Magnetrührverfahren. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung von VPG bereit zu stellen, wobei der pharmazeutische Wirkstoff in dem hergestellten VPG in einem Zeitraum von mehr als 5 Tagen, mehr als 10 Tagen freigesetzt wird, bevorzugt in mehr als 20 Tagen, mehr als 30 Tagen, oder noch länger, und die initiale Freisetzung des Wirkstoffs weniger als 20% der Gesamtwirkstoffmenge innerhalb der ersten 48 Stunden beträgt. Ein weiteres Ziel ist die Verwendung des VPG, das per Schnecken-Extrusion hergestellt wird, zur Behandlung oder Vorbeugung einer Erkrankung.

Diese Ziele werden erfindungsgemäß dadurch erreicht, dass ein Verfahren zur Herstellung von VPG mittels Schnecken-Extrusion zur Verfügung gestellt wird.

Überraschenderweise können durch das Verfahren zur Herstellung von VPG mittels Schnecken-Extrusion, die besagten Ziele erreicht werden. Das skalierbare Verfahren zur Herstellung des VPG und des optionalen, mindestens einen pharmazeutischen Wirkstoff wie hierin offenbart, und hat sich aufgrund der leichten Skalierbarkeit, kürzeren Prozessdauer mit geringen Scherkräften als besonders günstig herausgestellt, während gleichzeitig ein VPG hergestellt wird, das mit vorteilhaften Langzeitfreisetzungseigenschaften überzeugt. Die vorliegende Erfindung basiert auf der unerwarteten Erkenntnis, dass die Schnecken-Extrusion ideal dazu geeignet ist, VPG herzustellen, wobei das VPG auch optional mindestens einen pharmazeutischen Wirkstoff umfassen kann. Das erfinderische Verfahren zur Herstellung ist besonders zur Herstellung von VPGs mit sensitiven Substanzen wie Proteinen, Peptiden, Polypeptiden, Nukleotiden, Antikörpern, Antikörperderivaten, Viren, virus-like particles, oder niedermolekularen Arzneistoffen geeignet. Im Gegensatz zu anderen Schnecken-Extrusions-Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, kann das erfinderische Verfahren zur Herstellung nicht nur VPG, sondern auch VPG mit sensitiven Substanzen wie Proteinen, Peptiden, Polypeptiden, Antikörperderivaten, oder Antikörpern herstellen und sogar auch eben diese VPG mit vorteilhaften Langzeitfreisetzungseigenschaften und vorteilhaft niedriger Viskosität herstellen. Überraschenderweise wurde mit der Schneckenextrusion ein Misch- und Herstellverfahren gefunden, das genau zwischen den unvorteilhaften Extremen der DAC, mit hoher, zur Applikation ungünstigen Viskosität, und dem Rührverfahren, mit schlechtem Dispersionsgrad und mangelnder Homogenität, liegt, und Produkte, die ausreichend dispergiert sind, und ideale Freisetzung bei niedriger Viskosität ergibt und darüber hinaus unbegrenzt Up-Scalebar ist, da es einen kontinuierlichen Prozessbetrieb erlaubt. Besonders überraschend ist dabei, dass die Freisetzung bei niedrigerer Viskosität gleich oder sogar langsamer ist als bei DAC Verfahren, was besonders vorteilhaft ist. In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von vesikulärem Phospholipid-Gel (VPG), wobei das VPG mittels Schnecken-Extrusion hergestellt wird.

In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das VPG weiterhin mindestens ein Lipid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fettsäuren, Monoglyceriden, Diglyceriden, Triglyceriden, Sorbitanfettsäureestem, Sphingolipiden, Cholesterol, Wachsen, Salzen der Fettsäuren und Derivaten davon. In präferierten Ausführungsformen, umfasst das erfindungsgemäße Verfahren folgende Schritte:

(i) Zuführen von mindestes einem Phospholipid und einer wässrigen Flüssigkeit, optional von mindestens einem pharmazeutischen Wirkstoff, bei dem es sich bevorzugt um ein Protein, Peptid, Polypeptid, Nukleotid, einen Antikörper, ein Antikörperderivat, Virus, virus-like particle, oder niedermolekularen Arzneistoff handelt, optional von mindestens einem Lipid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fettsäuren, Monoglyceriden, Diglyceriden, Triglyceriden, Sorbitanfettsäureestem, Sphingolipiden, Cholesterol, Wachsen und Salzen der Fettsäuren und Derivaten davon, in einen Schnecken-Extruder,

(ii) Homogenisieren des einen oder der mehreren Phospholipide, der wässrigen Flüssigkeit und/oder des optionalen pharmazeutischen Wirkstoffs in dem Schneckenextruder, so dass ein VPG entsteht, und

(iii) Extrudieren des VPG,

wobei die Schritte auch gleichzeitig stattfinden können.

In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann das mindestens eine Phospholipid, die wässrige Flüssigkeit, der optionale mindestens eine pharmazeutische Wirkstoff, und/oder das mindestens eine Lipid separat dem Schnecken-Extruder zugeführt werden, wobei die Zuführung gleichzeitig oder zeitlich versetzt erfolgen kann.

In weiteren bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann das mindestens eine Phospholipid und die wässrige Flüssigkeit vor der Zuführung gemischt und als Gemisch dem Schnecken-Extruder zugeführt werden.

In präferierten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die Schnecken- Extrusion eine Doppelschnecken-Extrusion. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beträgt die Temperatur während des Extrudierens zwischen 4 °C und 60 °C. In einer präferierten Ausführungsform beträgt die Temperatur während des Extrudierens ca. 30 °C.

In einer bestimmten Ausführungsform beträgt die Drehgeschwindigkeit der Extrusionsschnecke(n) beträgt zwischen 5min 1 und 500 min 1 , bevorzugt zwischen 20 min 1 und 360 min 1 . In einer präferierten Ausführungsform beträgt die Drehgeschwindigkeit der Extrusionsschnecke(n) 300 min 1 .

In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Temperatur während des Extrudierens zwischen ca. 4 °C und ca. 60 °C und die Drehgeschwindigkeit der Extrusionsschnecke(n) beträgt zwischen ca. 5 min 1 und ca. 500 min 1 , bevorzugt zwischen 20 min 1 und 360 min 1 . In einer besonders präferierten Ausführungsform beträgt die Temperatur während des Extrudierens ca. 30 °C und die Drehgeschwindigkeit der Extrusionsschnecke(n) beträgt ca. 300 min 1 .

In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden mehrere Schritte des Extrudierens durchgeführt, d.h. die Masse wird aus einem oder mehreren Phospholipid(en), wässriger Flüssigkeit, optional mindestens einem Wirkstoff und optional mindestens einem weiteren Lipid nach dem ersten Homogenisierungsschritt im Extruder mindestens noch einmal extrudiert. Entweder sind dabei die Extruder direkt miteinander verbunden oder das Zwischenprodukt wird gesammelt und einem weiteren Extruder oder dem gleichen, zuvor verwendeten Extruder zugeführt.

In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung (i) verfügt die Extrusionsschnecke(n) über eine Förderfünktion und ggf. zusätzlich über Knet- oder Mischsegmente oder anders gestaltet Segmente für Mischung, Transport, Temperierung, Verdichtung, oder Austragung, und/oder (ii) kann die Extrusionsschnecke(n) gleich- oder gegenläufig betrieben werden, und/oder (iii) weisen die für die Extrusion verwendeten Düsen unterschiedliche Durchmesser, Längen und/oder Formen auf, und/oder (iv) ist der Auslass des Extruders zur Achse der Extruder- Schnecke(n) rechtwinklig oder geradlinig angeordnet.

In spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beträgt der Anteil an Phospholipid(en) im VPG etwa 10-70 Gew.-%, bevorzugt 20-65 Gew.-%, am bevorzugtesten 30-60 Gew.-%.

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird der mindestens eine pharmazeutische Wirkstoff aus dem hergestellten VPG über einen Zeitraum von mehr als mindestens 5, bevorzugt mehr als 10 Tagen, besonders vorzugsweise mindestens 20 Tagen, noch bevorzugter mindestens 30 Tagen, stärker bevorzugt mindestens 45 Tagen und am meisten bevorzugt 55 Tagen freigesetzt und die initiale Freisetzung des Wirkstoffs beträgt weniger als 35%, bevorzugter weniger als 25%, am bevorzugtesten weniger als 20% der Gesamtwirkstoffmenge innerhalb der ersten 48 Stunden. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin einen Schritt (iv), in dem durch einen RAM -Extruder extrudiert wird, wobei dieser Schritt nach den Schritten (i)-(iii) stattfindet.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren einen Schritt (v), ein- oder mehrfaches Extrudieren mit einem Schneckenextruder, wobei optional der Schneckenextruder der selbe wie in Schritt (i)-(iii) oder ein weiterer Schneckenextruder ist, wobei dieser Schritt nach den Schritten (i)-(iii) und optional vor oder nach Schritt (iv) stattfindet. In einer weiteren Ausführungsform wird in Schritt (v) das oder die gleiche(n) und/oder ein oder mehrere weitere Phospholipid(e), die gleiche(n) und/oder eine oder mehrere weitere wässrige(n) Flüssigkeit(en), der oder die gleiche(n) und/oder ein oder mehrere weitere pharmazeutischen Wirkstoff(e), und/oder das oder die gleiche(n) und/oder ein oder mehrere weitere Lipid(e) wie in Schritt (i) zugeführt werden.

Weitere Aufgaben, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.

BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Abbildung 1:

Makroskopische Erscheinung von VPG mit eingekapseltem Methylenblau, hergestellt durch Magnetrührverfahren, duale asymmetrische Zentrifugation oder

Doppelschnecken-Extrusion (von links nach rechts). Proben hergestellt durch Magnetrührverfahren zeigen Lipid-Ablagerungen und ein inhomogenes

Erscheinungsbild, während Proben, die durch DAC oder Extrusion hergestellt wurden, ein homogenes Erscheinungsbild ohne Lipid- Ablagerungen zeigen.

Abbildung 2:

A: Effekt des Phospholipidgehalts und des Herstellungsverfahrens (Magnetrührer: weiße Balken; ThreeTec Extruder: hellgraue Balken; HAAKE Extruder: dunkelgraue Balken; DAC: schwarze Balken) auf die Vesikelgröße der aus den VPGs hergestellten Liposomendispersion. Die Größe wurde mit Hilfe von dynamischer Lichtstreuung bestimmt. Das VPG wurde mit Lipoid E80 und 20 mM PBS (phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) pH 7,4 hergestellt ohne den Einschluss von Wirkstoffen. (Extrusionsparameter: Drehgeschwindigkeit 300 min 1 , Temperatur 30 °C,

Düsendurchmesser 0,5 mm). (n=3)

B: Effekt des Phospholipidgehalts und des Herstellungsverfahrens (Magnetrührer: weiße Balken; ThreeTec Extruder: hellgraue Balken; HAAKE Extruder: dunkelgraue Balken; DAC: schwarze Balken) auf den Polydispersitätsindex (PDI) der aus den VPGs hergestellten Liposomendispersionen. Der PDI wurde mit Hilfe von Dynamischer Lichtstreuung bestimmt. Die VPGs wurden mit Lipoid E80 und 20 mM PBS (phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) pH 7,4 hergestellt ohne den Einschluss von Wirkstoffen. (Extrusionsparameter: Drehgeschwindigkeit 300 min 1 , Temperatur 30 °C, Düsendurchmesser 0,5 mm). (n=3)

Abbildung 3:

Effekt des Phospholipidgehalts und des Herstellungsverfahrens (Magnetrührer: weiße Balken; ThreeTec Extruder: hellgraue Balken; HAAKE Extruder: dunkelgraue

Balken; DAC: schwarze Balken) auf die Viskosität (bei einer Scherrate von 32,9 s-l) der unterschiedlich hergestellten VPGs mit steigendem Phospholipidgehalt. (Extrusionsparameter: Drehgeschwindigkeit 300 min 1 , Temperatur 30 °C,

Düsendurchmesser 0,5 mm). (n=3)

Abbildung 4:

Kumulative in vitro Freisetzung von FITC-Dextran aus VPGs mit einer Phospholipid- Konzentration von 45 % (m/m) welche durch DAC (schwarze Punkte; Dauer 45 min, 3500 rpm), Magnetrührer (weiße Quadrate; Dauer 45 min) oder Extrusion (Extrusionsparameter: Drehgeschwindigkeit 300 min 1 , Temperatur 30 °C,

Düsendurchmesser 0,5 mm; ThreeTec Extruder: hellgraue Dreiecke; HAAKE

Extruder: dunkelgraue Dreiecke) hergestellt wurden. FITC-Dextran 2mg/g. (n=3) Abbildung 5:

Effekt der Variation des Parameters Drehgeschwindigkeit auf die Produktviskosität des VPG bei einer einfachen Extrusion. Steigende Drehgeschwindigkeit führt zu kleineren Vesikelgrößen und damit besserer Homogenität, bei gleichbleibender Viskosität.

Abbildung 6:

Stabilität von Erythropoetin (EPO) in VPGs nach der Herstellung mit unterschiedlichen Herstellungsverfahren. (Banden 1 und 12: Molekulargewicht - Marker; 2: Natives EPO; 3: EPO- VPG (Herstellungsmethode DAC); 4: EPO-VPG (Herstellungsmethode Magnetrührer); 5: EPO-VPG (Herstellungsmethode ThreeTec Extruder); 6: EPO-VPG (Herstellungsmethode HAAKE Extruder); 7: Natives EPO; 8: EPO-VPG (Herstellungsmethode DAC); 9: EPO-VPG (Herstellungsmethode Magnetrührer); 10: EPO-VPG (Herstellungsmethode ThreeTec Extruder); 11 : EPO- VPG (Herstellungsmethode HAAKE Extruder)Proben zeigen keine Aggregation oder Zersetzung des Proteins unabhängig vom Herstellungsverfahren.

Abbildung 7:

Stabilität eines Antikörpers (Typ IgGl) in VPGs nach der Herstellung mit unterschiedlichen Herstellungsverfahren (Banden 1 und 10: Molekulargewicht- Marker, 2: mAb-VPG (Herstellungsmethode DAC), 3: mAb-VPG (Herstellungsmethode Magnetrührverfahren), 4: mAb-VPG (Herstellungsmethode ThreeTec Extruder), 5: mAb-VPG (Herstellungsmethode Leistritz Extruder), 6: Antikörper-Stammlösung, 7: mAb-VPG (Herstellungsmethode DAC), 8: mAb-VPG (Herstellungsmethode Leistritz Extruder), 9: Antikörper-Stammlösung. Die Proben zeigen keine Aggregation oder Zersetzung des Antikörpers unabhängig vom Herstellungsverfahren. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Bevor die Erfindung im Detail in Bezug auf einige ihrer bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wird, werden die folgenden allgemeinen Definitionen erklärt.

Die vorliegende Erfindung, wie sie im Folgenden erläuternd beschrieben wird, kann in geeigneter Weise in Abwesenheit von irgendeinem Element oder Elementen, Beschränkung oder Beschränkungen, die hier nicht speziell offenbart sind, ausgeführt werden.

Die vorliegende Erfindung wird mit Bezug auf bestimmte Ausführungs formen und mit Bezug auf bestimmte Figuren beschrieben, aber die Erfindung ist nicht darauf beschränkt, sondern nur durch die Ansprüche.

Wo der Ausdruck„umfassend“ in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, schließt er andere Elemente nicht aus. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck„bestehend aus“ als eine bevorzugte Ausführungsform des Ausdrucks„umfassend“ angesehen. Wenn im Folgenden eine Gruppe als zumindest eine bestimmte Anzahl von Ausführungsformen definiert wird, so soll darunter auch eine Gruppe verstanden werden, die vorzugsweise nur aus diesen Ausführungsformen besteht.

Wo ein unbestimmter oder bestimmter Artikel verwendet wird, wenn auf ein einzelnes Substantiv Bezug genommen wird, z.B.„der/die/das“ oder„ein/eine“, dann schließt dies einen Plural dieses Substantivs ein, sofern nicht etwas Anderes ausdrücklich angegeben ist. Die Begriffe„ungefähr“ oder„circa“ bezeichnen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein Genauigkeitsintervall, das der Fachmann versteht, um die technische Wirkung des fraglichen Merkmals noch sicherzustellen. Der Ausdruck gibt typischerweise eine Abweichung von dem angezeigten numerischen Wert von ± 10% und vorzugsweise von ± 5% an.

Konzentrationen, Mengen, Löslichkeit und andere numerische Daten werden hierin in einem Intervallformat ausgedrückt oder dargestellt. Es ist zu verstehen, dass ein solches Intervallformat lediglich aus Gründen der Einfachheit und Kürze verwendet wird und daher flexibel interpretiert werden sollte, um nicht nur die explizit als Grenzen des Bereichs aufgeführten numerischen Werte zu umfassen, sondern auch alle einzelnen numerischen Werte oder Sub - Bereiche, die in diesem Bereich enthalten sind, als ob jeder numerische Wert und Unterbereich explizit angegeben würde. Zur Veranschaulichung sollte ein Zahlenbereich von "etwa 1 bis etwa 5" so interpretiert werden, dass er nicht nur die explizit genannten Werte von etwa 1 bis etwa 5 enthält, sondern auch einzelne Werte und Teilbereiche innerhalb des angegebenen Bereichs umfasst. Somit sind in diesem numerischen Bereich individuelle Werte wie 2, 3 und 4 und Unterbereiche wie von 1 bis 3, von 2 bis 4 und von 3 bis 5 etc. enthalten. Das gleiche Prinzip gilt für Bereiche, die nur einen numerischer Wert abbilden. Darüber hinaus sollte eine solche Auslegung ungeachtet der Breite des Bereichs oder der beschriebenen Merkmale gelten.

Wie hierin verwendet, können „Zubereitung“, „Formulierung“ und „Zusammensetzung“ hierin austauschbar verwendet werden und beziehen sich auf eine Kombination von zwei oder mehr Stoffen oder Substanzen.

Fachbegriffe werden im Sinne des gesunden Menschenverstands oder ihrer Bedeutung für den Fachmann verwendet. Wenn eine bestimmte Bedeutung bestimmten Begriffen vermittelt wird, werden im Folgenden Begriffe definiert, in deren Kontext die Begriffe verwendet werden.

In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines VPGs, das mittels Schnecken-Extrusion hergestellt wird.

Ein„Verfahren zur Herstellung“ ist ein Vorgang, bei welchem Stoffe hinsichtlich Zusammensetzung, Eigenschaften und Art verändert werden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren ein Vorgang, in welchem aus verschiedenen Ausgangsstoffen ein VPG entsteht, wobei die Ausgangsstoffe hinsichtlich ihrer Eigenschaften verändert werden. Bevorzugte Ausgangsstoffe sind mindestens ein Phospholipid und eine wässrige Flüssigkeit. Weiterhin bevorzugte Ausgangsstoffe sind mindestens ein Phospholipid, eine wässrige Flüssigkeit und ein pharmazeutischer Wirkstoff. Ferner bevorzugte Ausgangsstoffe sind mindestens ein Phospholipid, mindestens ein weiteres Lipid, eine wässrige Flüssigkeit und ein pharmazeutischer Wirkstoff.

Ein„vesikuläres Phospholipidgel“ (VPG) im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine liposomale Formulierung, die aufgrund eines hohen Phospholipidanteils (bevorzugt mindestens 10 Gew.-%, bevorzugter 20 Gew.-%, am bevorzugtesten mindestens 30 Gew. -%) und somit viskos, d.h. nicht mehr rieselfähig ist und verfügt über eine hohe Liposomen (Vesikel)- Dichte. Ein VPG muss von Liposomen enthaltenden Gelen unterschieden werden, bei denen die Geleigenschaften (Viskosität, Verhinderung des freien Fließens) nicht durch eine hohe Liposomendichte verursacht wird, sondern durch eine gelbildende Komponente, wie z.B. Polyacrylamid. Es soll jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass ein VPG durch die Zugabe eines gelbildenden Mittels weiter versteift werden könnte. VPG enthalten sowohl wässrige Kompartimente als auch Doppelschicht-Membranen, die zur Aufnahme von wasserlöslichen bzw. fettlöslichen Arzneimitteln geeignet sind. Ihr Potential als Depotformulierungen für die verzögerte Freisetzung von niedermolekularen Arzneimitteln wurde untersucht (Brandl et al., 1995) und verschiedene Ansätze wurden beschrieben, um VPGs mit niedermolekularen Arzneimittel zu beladen (Brandl, 2007).

Der Ausdruck„Phospholipide“ bezieht sich auf Lipidmoleküle, die eine oder mehrere Phosphatgruppen enthalten, einschließlich jene, die entweder von Glycerin (Phosphoglyceride, Glycerophospholipide) oder Sphingosin (Sphingolipide) abgeleitet sind. Sie umfassen polare Lipide und bestimmte Phospholipide, die für die Struktur und Funktion von Zellmembranen von großer Bedeutung sind und die am häufigsten vorkommenden Membranlipide sind. In bestimmten Ausführungsformen sind Phospholipide Triglyceridderivate, in denen eine Fettsäure durch eine phosphorylierte Gruppe und eines von mehreren stickstoffhaltigen Molekülen ersetzt wurde. Die Fettsäureketten sind hydrophob (wie in allen Fetten). Die Ladungen an den phosphorylierten und Aminogruppen machen diesen Teil des Moleküls jedoch hydrophil. Das Ergebnis ist ein amphiphiles Molekül.

In Bezug auf die vorliegende Erfindung ist daher ein Phospholipid eine amphiphile Substanz, die im Allgemeinen eine hydrophobe Gruppe, die wiederum eine langkettige Alkylgruppe und eine hydrophile Gruppe umfasst, und eine Phosphorsäuregruppe in einem Molekül umfasst. Beispielhafte Phospholipide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Glycerophospholipide, wie Phosphatidylcholin (= Lecithin), Phosphatidylglycerin, Phosphatidsäure, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Phosphatidylinocitol; Sphingophospholipide wie Sphingomyelin (Sphingomyelin); natürliche oder synthetische Diphosphatidylphospholipide, wie Cardiolipin und Derivate davon; sowie Phospholipide, das nach üblichen Verfahren hydriert wurden (zum Beispiel hydriertes Sojabohnen-Phosphatidylcholin), sowie Gemische solcher Phospholipide. Die vorstehend erwähnten Phospholipide werden im Folgenden gelegentlich als „Phospholipide“ bezeichnet. Die Phospholipidkomponente kann ein oder mehrere Phospholipide enthalten und liegt im Bereich von etwa 10% bis etwa 70% des Gesamtgewichts des VPG, bevorzugt 20% bis 65%, bevorzugter zwischen 30% bis 60%. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Phospholipid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphatidylcholinen, Phosphatidylethanolaminen, Phosphatidylinositen, Phosphatidylserinen, Cephalinen, Phosphatidylglycerinen und Gemischen mehrerer dieser Phospholipide. In speziellen Ausführungsformen der Erfindung kann eine Mischung von Phosphatidylcholinen und/oder Phosphatidylglycerinen als Phospholipid verwendet werden.

Geeignete Phospholipide zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen umfassen Phospholipidmischungen, wie solche, die unter den Handelsnamen Lipoid S 20 S, Lipoid S 75, Lipoid S 100, Lipoid S 100-3, Lipoid S 75-3N, Lipoid SL 80, Lipoid

E80 und Lipoid SL 80-3 (Lipoid) ; Phospholipon 85G, Phospholipon 80, Phospholipon 80H, Phospholipon 90G, Phospholipon 90H, Phospholipon 90NG, Phospholipon 100H, Phosal 35B, Phosal 50G, Phosal 50SA, Phosal 53MCT und Phosal 75 SA, (Phospholipon, Köln, Deutschland); Alcolec Z-3, (American Lectin Company, Oxford CT); Emulugluid L30, Emulfluid, Lipotin NE, Lipotin 100, Lipotin SB, Lipotin 10OJ, Lipotin H, Lipotin NA, Lipotin AH und Lipopur, (Cargill, Degussa Texturant Systems); Terradrill V 408 und Terradrill V 1075 (Cognis); Yellowthin 100, Yellowthin 200, Lecistar Sun 100 und Yellowthin Sun 200 (Stemchemie); und Lanchem PE-130K (Lambent Technologies, Gumee, IL) erhältlich sind.

Wie hierin verwendet, ist die Schnecken-Extrusion ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in einem zylindrisch oder anders ausgeformten Körper („Barrel“), eine oder mehrere Schnecken sich drehend Material in eine Richtung durch eine Düse austragen wird. Die Schnecken-Extrusion ist eine kontinuierliche Herstellungstechnologie, die sich nebst kontrollierbaren Parametern, wie Temperatur und Scherintensität, dadurch auszeichnet, dass flüssige, halbfeste und feste Komponenten gleichzeitig verarbeitet werden können und eine homogene Mischung erreicht wird. Das Ziel des Herstellungsprozesses ist es, Extrudate (lange Objekte mit einem festen oder halbfesten Querschnittsprofil) zu erzeugen, bevorzugt für die vorliegende Erfindung sind hier halbfeste Extrudate. Zu diesem Zweck sind mindestens zwei Hauptkomponenten notwendig: (1) ein Transportsystem, das eine Mischfunktion verleihen kann und (2) ein Düsensystem, das das Material bildet. Der für die Extrusion erforderliche Druck hängt von der Gestaltung der Düse, von der Extrusionsrate und insbesondere von den rheologischen Eigenschaften der Zubereitung ab. Die Extrusion kann kontinuierlich (Erzeugung eines unendlich langen Materials) oder halbkontinuierlich (Erzeugung vieler kurzer Stücke) sein. In Bezug auf das Verfahren zur Anpassung der Viskosität kann die Extrusion in geschmolzene Systeme (Heißschmelzextrusion) und halbfeste Systeme eingeteilt werden. Halbfeste Systeme werden durch Dispergieren eines hohen Anteils an festem Material in einer flüssigen Phase erzeugt (Swarbick und Boylan 1992). Diese Technik wird häufig zur Herstellung von Granulaten oder Pellets verwendet, während zur Herstellung von anderen Wirkstoff-Formen sich die (Heiß)schmelzextrusionstechnik anbietet (Kissel et al., 2002). Präferiert in der vorliegenden Erfindung wird die Doppelschnecken- Extrusion, in welcher zwei sich drehende Extrusionsschnecken in einem zylindrischen oder anders ausgeformten Körper („Barrel“) angeordnet sind. In bestimmten Ausführungsformen können mehrere Schritte des Extrudierens stattfinden, d.h. dass die Masse aus einem oder mehreren Phospholipid(en), wässriger Flüssigkeit, optional mindestens einem Wirkstoff und optional mindestens einem weiteren Lipid nach dem ersten Homogenisierungsschritt im Extruder mindestens noch einmal extrudiert wird. Entweder sind dabei die Extruder direkt miteinander verbunden oder das Zwischenprodukt wird gesammelt und einem weiteren Extruder oder dem gleichen, zuvor verwendeten Extruder zugeführt. Bevorzugterweise beträgt die Temperatur während des Extrudierens zwischen 4 °C und 60 °C, noch bevorzugter zwischen 15 °C und 40 °C, am bevorzugtesten zwischen 25 °C und 35 °C. In einer Ausführungsform der Erfindung kann das VPG eines oder mehrere zusätzliche Lipide umfassen, einschließlich neutraler, kationischer und anionischer Lipide. Daher umfasst in weiteren spezifischen Ausführungsformen die pharmazeutische Zusammensetzung ferner mindestens ein Lipid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fettsäuren, Monoglyceriden, Diglyceriden, Triglyceriden, Sorbitanfettsäureestem, Sphingolipiden, Cholesterol, Wachsen und Salzen der Fettsäuren sowie Derivaten davon. Diese zusätzlichen Lipide machen bis zu 30%, bevorzugter bis zu 10%, am bevorzugtesten bis zu 2,5% des VPG aus. Die zusätzlichen Lipide stehen zu den Phospholipiden des VPG in einem Verhältnis von Lipid/Pospholipid 1 :1, bevorzugter 1 :4, am bevorzugtesten 1 :10 oder weniger.

Kationische Lipide zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen umfassen N, N-Dioleyl-N, N-dimethylammoniumchlorid („DODAC“); N- (2,3- Dioleyloxy) propyl-N, N-N-triethylammoniumchlorid („DOTMA“); N, N-Distearyl- N, N-dimethylammoniumbromid („DD AB“); N- (2,3-Dioleoyloxy) propyl) -N, N, N- trimethylammoniumchlorid („DOTAP“); 3ß- (N- (N', N'-Dimethylaminoethan)- carbamoyl) Cholesterol („DC-Chol“), N- (1- (2,3-Dioleyloxy) propyl) -N-2- (sperincarboxamido) ethyl) -N, N-Dimethylammoniumtrifluoracetat („DOSPA“), Dioctadecylamidoglycylcarboxypermin („DOGS“), 1 ,2-Dileoyl-sn-3- phosphoethanolamin („DOPE“); und N- (l,2-Dimyristyloxyprop-3-yl) -N, N- dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid („DMRIE“). Zusätzlich kann eine Anzahl von kommerziellen Präparationen von kationischen Lipiden verwendet werden, wie LIPOFECTIN (einschließlich DOTMA und DOPE, erhältlich von GIBCO / BRL), LIPOFECT AMINE (umfassend DOSPA und DOPE, erhältlich von GIBCO / BRL) und TRANSFECTAM (umfassend DOGS, in Ethanol, von Promega Corp.).

Anionische Lipide zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen umfassen Phosphatidylglycerol, Cardio lipin, Diacylphosphatidylserin,

Diacylphosphatidsäure, N-Dodecanoylphosphatidylethanolamin, N-

Succinylphosphatidylethanolamin, N-Glutarylphosphatidylethanolamin,

Lysylphosphatidylglycerin, Dipalmitoylphosphatidsäure und andere anionische modifizierende Gruppen, die an neutrale Lipide gebunden sind.

Eine beliebige Anzahl von neutralen Lipiden kann ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die entweder in ungeladener oder neutraler zwitterionischer Form bei physiologischem pH vorliegen, einschließlich Diacylphosphatidylcholin, Diacylphosphatidylethanolamin, Ceramid, Sphingomyelin, Cephalin, Cholesterol, Cerebroside, und Diacylglycerole.

Wie hierin verwendet, ist die Schnecken-Extrusion ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in einem zylindrisch oder anders ausgeformten Körper („Barrel“), eine oder mehrere Schnecken, sich drehend, Material in eine Richtung durch eine Düse austragen. Die Schnecken-Extrusion ist eine kontinuierliche Herstellungstechnologie, die sich nebst kontrollierbaren Parametern, wie Temperatur und Scherintensität dadurch auszeichnet, dass flüssige, halbfeste und feste Komponenten gleichzeitig verarbeitet werden können und eine homogene Mischung erreicht wird. Das Ziel des Herstellungsprozesses ist es, Extrudate, lange Objekte mit einem festen oder halbfesten Querschnittsprofil, zu erzeugen, bevorzugt für die vorliegende Erfindung sind hier halbfeste Extrudate.. Zu diesem Zweck sind mindestens zwei Hauptkomponenten notwendig: (1) ein Transportsystem, das eine Mischfunktion verleihen kann und (2) ein Düsensystem, das das Material bildet. Der für die Extrusion erforderliche Druck hängt von der Gestaltung der Düse, von der Extrusionsrate und insbesondere von den rheologischen Eigenschaften der Zubereitung ab. Die Extrusion kann kontinuierlich (Erzeugung eines unendlich langen Materials) oder halbkontinuierlich (Erzeugung vieler kurzer Stücke) sein. In Bezug auf das Verfahren zur Anpassung der Viskosität kann die Extrusion in geschmolzene Systeme (Heißschmelzextrusion) und halbfeste Systeme eingeteilt werden. Halbfeste Systeme werden durch Dispergieren eines hohen Anteils an festem Material in einer flüssigen Phase erzeugt (Swarbick und Boylan 1992). Diese Technik wird häufig zur Herstellung von Granulaten oder Pellets verwendet, während zur Herstellung von anderen Wirkstoff-Formen sich die (Heiß)schmelzextrusionstechnik anbietet (Kissel et al., 2002) Präferiert in der vorliegenden Erfindung wird die Doppelschnecken- Extrusion, in welcher zwei sich drehende Extrusionsschnecken in einem zylindrischen oder anders ausgeformten Körper („Barrel“) angeordnet sind. In bestimmten Ausführungsformen können mehrere Schritte des Extrudierens stattfinden, d.h. dass die Masse aus einem oder mehreren Phospholipid(en), wässriger Flüssigkeit, optional mindestens einem Wirkstoff und optional mindestens einem weiteren Lipid nach dem ersten Homogenisierungsschritt im Extruder mindestens noch einmal extrudiert wird. Entweder sind dabei die Extruder direkt miteinander verbunden oder das Zwischenprodukt wird gesammelt und einem weiteren Extruder oder dem gleichen, zuvor verwendeten Extruder zugeführt.

In einer Ausführungsform beträgt die Temperatur während des Extrudierens bevorzugter Weise zwischen 4 °C und 60 °C, noch mehr bevorzugt zwischen 15 °C und 40 °C, am bevorzugtesten zwischen 25 °C und 35 °C. In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst: Zuführen von einem oder mehreren Phospholipiden und einer wässrigen Flüssigkeit, sowie optional von mindestens einem pharmazeutischen Wirkstoff, bei dem es sich bevorzugt um ein Protein, Peptid, Polypeptid, Nukleotid, einen Antikörper, ein Antikörperderivat, Virus, virus-like particle, oder niedermolekularer Arzneistoff handelt, in einen Schnecken-Extruder, homogenisieren des einen oder der mehreren Phospholipide, der wässrigen Flüssigkeit und optional des pharmazeutischen Wirkstoffs in dem Schneckenextruder, so dass ein VPG entsteht, und Extrudieren des VPG, wobei im ersten Schritt auch Lipide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fettsäuren, Monoglyceriden, Diglyceriden, Triglyceriden, Sorbitanfettsäureestem, Sphingolipiden, Cholesterol, Wachsen und Salzen der Fettsäuren sowie Derivaten davon hinzugefügt werden können und wobei die genannten Schritte auch gleichzeitig stattfinden können. In bestimmten, bevorzugten Ausführungsformen finden das Zuführen von einem oder mehreren Phospholipiden und einer wässrigen Flüssigkeit, sowie optional von mindestens einem pharmazeutischen Wirkstoff, bei dem es sich bevorzugt um ein Protein, Peptid, Polypeptid, Nukleotid, einen Antikörper, ein Antikörperderivat, Virus, virus-like particle, oder niedermolekularem Arzneistoff handelt, in einen Schnecken-Extruder, das Homogenisieren des einen oder der mehreren Phospholipide, der wässrigen Flüssigkeit und optional des pharmazeutischen Wirkstoffs in dem Schneckenextruder, so dass das VPG entsteht, und das Extrudieren des VPG gleichzeitig statt.

In Bezug auf die Aufgaben der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck„wässrige Flüssigkeit“ für ein wässriges Lösungsmittel (z. B. Wasser oder Pufferlösung) verwendet. Vorzugsweise umfasst die„wässrige Flüssigkeit“ hauptsächlich Wasser, das gelöste anorganische oder organische Salze, Säuren oder Basen enthalten kann, um beispielsweise einen spezifischen pH-Wert oder einen spezifischen osmotischen Druck einzustellen und zu erreichen. Das wässrige Medium kann jedoch auch wässrige Lösungen von Sacchariden, Aminosäuren oder Tensiden oder Mischungen von Wasser mit anderen Lösungsmitteln wie Alkoholen, Diolen oder Triolen umfassen. Eine gepufferte Lösung ist eine wässrige Lösung, die eine Mischung aus einer schwachen Säure und ihrer konjugierten Base oder einer schwachen Base und ihrer konjugierten Säure umfasst. Sie hat die Eigenschaft, dass sich der pH-Wert der Lösung sehr wenig ändert, wenn eine kleine Menge Säure oder Base hinzugefügt wird. Gepufferte Lösungen werden verwendet, um den pH-Wert bei einer Vielzahl von chemischen Anwendungen auf einem nahezu konstanten Wert zu halten. Geeignete Puffersysteme umfassen z.B. Phosphat, Citrat, Acetat, Succinat, Tartrat, Maleat, Histidin, Glycin, TAPS, Bicin, Tris, Tricin, HEPES, TES, und MOPS. Diese und alternative Puffersysteme sind dem durchschnittlichen Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Bevorzugt ist eine 20 mM phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) bei pH 7,4.

Wie hier verwendet können „pharmazeutischer Wirkstoff , „aktives Mittel“, „bioaktives Mittel“,„pharmazeutisch aktives Mittel“ und„pharmazeutisch aktive Verbindung“ austauschbar verwendet werden, um einen Wirkstoff, ein Mittel, eine Substanz oder Verbindung zu bezeichnen, die eine messbare spezifische oder ausgewählte physiologische Aktivität in einer signifikanten oder effektiven Menge aufweist. Es ist zu verstehen, dass der Begriff„Arzneimittel“ ausdrücklich von der vorliegenden Definition als viele Arzneimittel umfasst ist, von denen bekannt ist, dass sie spezifische physiologische Aktivitäten aufweisen. Diese Fachbegriffe sind im pharmazeutischen und medizinischen Bereich wohlbekannt. Beispiele für Arzneimittel, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Proteine, Peptide, Polypeptide, Nukleotide, Antikörper, Antikörperderivate, Viren, virus-like particles, und niedermolekularer Arzneistoffe.

In Bezug auf die Aufgaben der vorliegenden Erfindung umfasst ein„Protein“, das als pharmazeutischer Wirkstoff in der vorliegenden Erfindung enthalten sein kann, ein biologisch aktives Protein sowie Derivate und Mutationen davon und kann natürlich vorkommend, rekombinant manipuliert oder synthetisiert sein. Außerdem kann das Protein eine Vielzahl von Modifikationen besitzen, wie beispielsweise eine Addition, Substitution oder Deletion einer Aminosäure oder Domäne oder Glykosylierung und andere Modifikationen. Der hier verwendete Begriff„Proteine“ umfasst daher auch Lipoproteine und Glykoproteine. Der Ausdruck „Proteine" beinhaltet auch z.B. Proteinaggregate, Dimere, Trimere andere Oligomere.

Beispiele für „Proteine“ schließen menschliche Wachstumshormone, Wachstumshormon-ffeisetzendes Hormone, Wachstumshormon-freisetzendes Peptid, Interferone, koloniestimulierende Faktoren, Interleukine, Makrophagen- Aktivierungsfaktor, Makrophagenpeptid, B-Zellfaktor, T-Zellfaktor, Protein A, Allergieinhibitor, Zellnekrose-Glykoproteine, Immunotoxin, Lymphotoxin, Tumornekrosefaktor, Tumorsuppressoren, Metastasenwachstumsfaktor, Alpha- 1- Antitrypsin, Albumin und Fragment-Polypeptide davon, Apolipoprotein-E, Erythropoetin, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Plasminogenaktivierungsfaktor, Urokinase, Streptokinase, Protein C, C-reaktives Protein, Renininhibitor, Collagenaseinhibitor, Superoxiddismutase, Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor, epidermaler Wachstumsfaktor, osteogener Wachstumsfaktor, knochenstimulierendes Protein, Calcitonin, Insulin, Atriopeptin, Knorpel- induzierender Faktor, Gewebefaktor, follikelstimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon, luteinisierendes Hormon Releasing-Hormon, Nervenwachstums-Faktoren wie Parathormon, Relaxin, Sekretin, insulinähnliche Wachstumsfaktoren, adrenocortisches Hormon, Glucagon, Cholecystokinin, pankreatisches Polypeptid, Gastrin-freisetzendes Peptid, Corticotropin-Releasing-Faktor, Thyreoidea stimulierendes Hormon, monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen verschiedene Viren, Bakterien, Toxine usw. und Virus-abgeleitete Impfstoffantigene sowie therapeutische monoklonale oder polyklonale Antikörper , die z.B. gegen Rezeptoren von Wachstums faktoren gerichtet sind, ein. Bevorzugt sind Erythropoetin (EPO), G-CSF und INF ß-lb. Die Begriffe „Polypeptid“, „Peptid“, „Protein“ und , Antikörper“ werden hierin austauschbar verwendet, um sich auf ein Polymer oder Oligomer von aufeinanderfolgenden Aminosäureresten zu beziehen. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck„Aminosäure“ auf eine Liste von Abkürzungen, Buchstaben, Zeichen oder Wörtern, die Aminosäurereste darstellen. Aminosäuren können hierin entweder durch ihre allgemein bekannten Drei-Buchstaben-Symbole oder durch die Ein-Buchstaben-Symbole, die von der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission empfohlen werden, bezeichnet werden. Eine Konvention besteht darin, dass diejenigen Peptidketten, die kurz genug sind, um synthetisch aus den konstituierenden Aminosäuren hergestellt zu werden,„Peptid“" anstatt„Proteine“ genannt werden. Mit dem Aufkommen besserer Synthesetechniken können jedoch Peptide mit Hunderten von Aminosäuren hergestellt werden können, einschließlich vollständige Proteine wie Ubiquitin. Native chemische Ligation hat Zugang zu noch längeren Proteinen ermöglicht, daher scheint diese Konvention veraltet zu sein. Eine andere Konvention sieht eine informelle Trennungslinie bei ungefähr 50 Aminosäuren Länge (einige Leute behaupten kürzere Längen). Gemäß dieser Konvention bezeichnet der Ausdruck "Polypeptid" eine einzelne lineare Kette von Aminosäuren, der Begriff „Protein“ bezeichnet ein oder mehrere Polypeptide mit mehr als etwa 50 Aminosäuren Länge und der Begriff „Oligopeptid“ oder (einfach) „Peptid“ bezeichnet ein Polypeptid, das weniger als 30 bis 50 Aminosäuren lang ist.

Dementsprechend werden die Begriffe„Protein“,„Peptid“ und„Polypeptid“ hier austauschbar verwendet, um sich auf ein Polymer oder Oligomer aufeinanderfolgender Aminosäurereste zu beziehen. Der Ausdruck„Neuropeptid“ wird hier verwendet, um ein Peptid zu bezeichnen, das im zentralen Nervensystem aktiv ist und der Ausdruck „Peptidhormon“ wird hierin verwendet, um ein Peptid zu bezeichnen, das als Hormon wirkt. Im Kontext der vorliegenden Erfindung umfassen Proteine, die in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten sein können, monoklonale und polyklonale Antikörper, Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise Zytokine und Hormone, ein.

„Antikörper“, auch Immunoglobuline (abgekürzt lg) genannt, sind gamma Globulinproteine die im Blut und in anderen Körperflüssigkeiten von Wirbeltieren auftreten, und die vom Immunsystem zur Identifizierung und Neutralisierung von fremden Objekten, wie zum Beispiel Bakterien und Viren, genutzt werden. Sie bestehen üblicherweise aus strukturellen Grundeinheiten - je mit zwei großen schweren Ketten und zwei kleinen leichten Ketten - woraus, zum Beispiel, Monomere mit einer Einheit, Dimere mit zwei Einheiten, oder Pentamere mit fünf Einheiten gebildet werden. Antikörper werden durch weiße Blutzellen, die B-Zellen genannt werden, hergestellt. Es gibt verschiedenen Sorten von schweren Antikörperketten, und verschiedene Sorten Antikörper, die, je nach der schweren Kette die sie enthalten, in verschiedenen Isotypen gruppiert werden. Obwohl die generelle Struktur aller Antikörper recht ähnlich ist, ist eine kleine Region an der Spitze des Proteins extrem variabel, was die Existenz von Millionen von Antikörpern mit leicht unterschiedlichen Spitzenstrukturen ermöglicht. Diese Region ist als hypervariable Region bekannt. Jede dieser Varianten kann an ein anderes Ziel binden. Die enorme Vielfältigkeit der Antikörper erlaubt es dem Immunsystem, eine ebenso breite Vielfältigkeit von Antigenen zu erkennen. Der einzigartige Teil des Antigens, der durch einen Antikörper erkannt wird, wird Epitop genannt. Diese Epitope binden an ihre Antikörper in einer hochspezifischen Wechselwirkung, induced fit genannt, was den Antikörpern die Identifizierung und das alleinige Binden an ihr einzigartiges Antigen in mitten der Millionen verschiedener Moleküle eines Organismus ermöglicht. Erkennung eines Antigens durch einen Antikörper markiert es für die Attacke durch andere Teile des Immunsystems. Antikörper können Ziele auch direkt neutralisieren, zum Beispiel durch Binden an einen Teil eines Pathogens, das es zur Erzeugung einer Infektion benötigt.

Gezielte monoklonale Antikörpertherapie wird oft zur Behandlung von Krankheiten wie rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose, Psoriasis, und vieler Formen von Krebs, einschließlich non-Hodgkin's Lymphom, kolorektalen Krebs, Kopf- und Nackenkrebs, und Brustkrebs, verwendet. Einige Immundefizienzen, wie zum Beispiel X-linked Agammaglobulinemie und Hypogammaglobulinemie, resultieren in teilweisem oder gänzlichem Fehlen von Antikörpern. Diese Krankheiten werden oft durch die Erzeugung einer kurzzeitigen Form der Immunität, die passive Immunität genannt wird, behandelt. In bevorzugten Ausführungsformen ist ein (monoklonaler) Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus abciximab, adalimumab, alefacept, alemtuzumab, alirocumab, arcitumomab, atezolizumab avelumab, basiliximab, belimumab, besilesomab, bevacizumab, bezlotoxumab, brentuximab, brodalumab, canakinumab, capromab, catumaxomab, certolizumab, certolizumab pegol, cetuximab, daclizumab, daratumumab, denosumab, dinutuximab, dupilumab, durvalumab, eculizumab, efalizumab, elotuzumab, evolocumab, fanolesomab, gemtuzumab, golimumab, ibritumomab tiuxetan, idarucizumab, imiciromab, infliximab, ipilimumab, ixekizumab, mepolizumab, muromonab-CD3, natalizumab, necitumumab, nivolumab, nofetumomab, obiltoxaximab, obinutuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, olaratumab, omalizumab, ozogamicin, palivizumab, panitumumab, pembrolizumab, pertuzumab, ranibizumab, ramucirumab, raxibacumab, reslizumab, rituximab, satumomab, secukinumab, siltuximab, sulesomab, tocilizumab, tositumomab, trastuzumab, trastuzumab emtasine, ustekinumab, vedolizumab, votumumab.

Im Kontext der vorliegenden Erfindung umfassen Antikörper monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, bi- und multispezifische Antikörper und chimäre Antikörper, sowie Teile oder Fragmente davon. Bevorzugterweise behalten Fragmente oder Teile von Antikörpern ihre Kapazität, spezifisch Antigene zu erkennen und binden, bei. Antikörper können als Monomere oder Multimere vorliegen. Zytokine sind eine Kategorie von Signalmolekülen, die wie Hormone und Neurotransmitter in der zellulären Kommunikation häufig genutzt werden. Der Begriff Zytokin umfasst eine große und vielfältige Familie von Polypeptidregulatoren, die im ganzen Körper durch Zellen verschiedener embryo logischer Herkunft produziert werden. Zytokin ist ein allgemeiner Name; andere Namen umfassen Lymphokin (Zytokine, die von Lymphozyten gebildet werden), Monokin (von Monozyten hergestellte Zytokine), Chemokin (Zytokine mit chemotaktischen Aktivitäten) und Interleukin (Zytokine, die von einem Leukozyten gebildet werden und auf andere Leukozyten wirken). Zytokine können auf die Zellen wirken, die sie sekretieren (autokrine Wirkung), auf nahegelegene Zellen (parakrine Wirkung) oder in einigen Fällen auf entfernte Zellen (endokrine Wirkung). Zytokine nehmen diverseste Funktionen wahr, von der Stimulierung von Immunzellen bis zur Inhibierung der Virusreplikation von infizierten somatischen Zellen. Im Kontext der vorliegenden Erfindung umfasst die Zytokinfamilie somit G-CSF, GM-CSF, IL-la, IL-lß, IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL -8, IL-10, IL-12, IFN-a, IFN-ß, IFN-g, MIP-la, MIP-lß, TGF-ß, TNFa, TNF-ß.

In Bezug auf die vorliegende Erfindung umfasst ein „Antikörperderivat“ Fusionsproteine, bei denen ein Teil des Fusionsprotein ein Antikörper wie oben definiert ist, Antikörpermimetika, wie z.B. Antikaline, und Antikörper-Konjugate, z.B. Antikörper- Arzneistoff- Konjugate.

In Bezug auf die Aufgaben der vorliegenden Erfindung umfasst ein„Antikörper- Arzneistoff-Konjugat“, das als pharmazeutischer Wirkstoff in der vorliegenden Erfindung enthalten sein kann, einen Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein Antikörper-Mimetikum, das durch eine kovalente Bindung (Konjugation) mit einem Arzneistoff verbunden ist. Der Antikörper, das Antikörperfragment, oder das Antikörper-Mimetikum dienen hierbei dazu, den konjugierten Arzneistoff bestimmten Zielen zuzuführen, die durch den Antikörper, das Antikörperfragment, oder das Antikörper-Mimetikum spezifisch gebunden und erkannt werden.

In Bezug auf die Aufgaben der vorliegenden Erfindung umfasst ein„Nukleotid“, das als pharmazeutischer Wirkstoff in der vorliegenden Erfindung enthalten sein kann, Nukleinsäuren sowohl in Strängen der Ribonukleinsäure (RNS oder RNA) wie auch der Desoxyribonukleinsäure (DNS oder DNA). Nukleotide im Sinne der Erfindung sind auch cDNA, mRNA, siRNA, snRNA, tRNA, rRNA, shRNA, und miRNA.

In Bezug auf die Aufgaben der vorliegenden Erfindung umfasst ein„Virus“, das als pharmazeutischer Wirkstoff in der vorliegenden Erfindung enthalten sein kann, infektiöse Viren, nicht-infektiöse Viren, und virale Vektoren. Ein Virion besteht aus einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen, die oft von einer Proteinkapsel, dem Kapsid, umgeben sind. Eventuell befinden sich weitere Proteine, beispielsweise mit enzymatischen Aktivitäten, im Virion. Bei einigen Viren besteht das Virion zusätzlich aus einer äußeren Lipidmembran, der Virushülle. Viria können infektiös (Viren) oder nicht-infektiös sein. Viria besitzen keinen eigenen Stoffwechsel. Als Virale Vektoren werden gezielt veränderte Viruspartikel bezeichnet, die in der Gentechnik dafür verwendet werden, genetisches Material in Zielzellen zu schleusen. Dies können Zellen eines lebenden Organismus (in vivo) oder Zellen einer Zellkultur (in vitro) sein. Beispiele für Viren umfassen z.B. Adeno assoziierte Viren ( AAV).

In Bezug auf die Aufgaben der vorliegenden Erfindung umfasst ein„virus-like particle“ oder „VLP“, das als pharmazeutischer Wirkstoff in der vorliegenden Erfindung enthalten sein kann, Viruspartikel, die keine Nukleinsäuren. Als Partikel viralen Ursprungs ohne virale Nukleinsäuren können sie nicht in den Zielzellen vermehrt werden. Da sie im Gegensatz zu viralen Vektoren auch keine funktionalen Nukleinsäuren enthalten, sind sie auch nicht in der Lage, ein Transgen zu überbringen. Die VLPs der Erfindung können dagegen z.B. Peptide, Proteine, Antikörper, Polypeptide, niedermolekulare Arzneimittel, und nicht-virale, nicht-funktionelle Nukleotide enthalten.

In Bezug auf die Aufgaben der vorliegenden Erfindung umfasst ein „niedermolekularer Arzneistoff‘ oder„small molecule“, der als pharmazeutischer Wirkstoff in der vorliegenden Erfindung enthalten sein kann, Wirkstoffe, deren Molekülmasse etwa 800 g-moE 1 nicht übersteigt. Durch ihre geringe Größe sind viele niedermolekulare Arzneistoffe in der Lage, in Zellen einzudringen und dort ihre Wirkung zu entfalten. Niedermolekulare Arzneistoffe schließen keine Biologika mit ein, d.h. keine Proteine, Peptide, Antikörper, etc., und werden chemisch synthetisiert. Niedermolekulare Wirkstoffe könne auf allen Gebieten der Behandlung und Diagnostik von Erkrankungen eingesetzt werden, sowie zu deren Vorbeugung.

Ein Schnecken-Extruder ist eine Apparatur, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass in einem zylindrisch oder anders ausgeformten Körper („Barrel“), sich eine oder mehrere sich drehende Schnecken befinden, die Material in eine Richtung durch eine Düse austragen. Der Schneckenextruder besteht aus mindestens einer rotierenden Schnecke innerhalb eines stationären zylindrischen Körpers („Barrel“). Dementsprechend verfügt der Doppelschnecken-Extruder über zwei drehende Schnecken innerhalb eines stationären zylindrischen Körpers. Am Ende des Barrels befindet sich eine Düse, auch Auslass genannt, um das hergestellte VPG auszulassen. Der Extrusionskanal kann in drei verschiedene Abschnitte unterteilt werden. Innerhalb der ersten Zone, der Einzugszone, wird der Extruder beladen. Nach der Einzugszone folgt die Kompressionszone. Innerhalb dieser Zone erhöht sich der Druck aufgrund der Verringerung der Gewindesteigung unter Beibehaltung einer konstanten Gangtiefe oder aufgrund der Reduktion der Gangtiefe unter Beibehaltung der Gewindesteigung. Somit findet eine Kompression des Materials statt. Schließlich gelangt das Material als homogenes Gemisch, das zur Extrusion geeignet ist, in die Austragszone. In dieser letzten Zone wird die pulsierende Strömung reduziert und eine gleichmäßige Förderrate durch die Düse erreicht. Die verwendeten Düsen können unterschiedliche Durchmesser, Längen und/oder Formen aufweisen. Der Auslass des Extruders kann rechtwinklig oder geradlinig zur Achse der Extruder-Schnecke(n) angeordnet sein. Typische Schneckenextruder sind Ein- oder Doppelschneckenextruder. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Extruder mit mindestens einer, sich drehender Extruderschnecke ausgestattet. Solche Extruder umfassen unter anderem Doppelschneckenextruder. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen verfügen die Extrusionsschnecken über eine Förderfunktion. In weiteren Ausführungsformen verfügen die Extrusionsschnecken nebst der Förderfunktion zusätzlich über Knet- und Mischsegmente oder anders gestaltet Segmente für Mischung, Transport, Temperierung, Verdichtung, oder Austragung. Ferner können die Extrusionsschnecken in bestimmten Ausführungsformen gleich- oder gegenläufig betrieben werden. Die Drehgeschwindigkeit der Extrusionsschnecken kann zwischen 5min 1 und 500 min 1 betragen, bevorzugt beträgt sie 20 min 1 und 360 min 1 . Die Geometrie der Extrusionsschnecken kann zylindrisch parallel oder konisch oder anders geformt sein.

Schnecken-Extruder, die im vorliegenden Verfahren zur Herstellung von VPG verwendet worden sind, umfassen unter anderem den Mini-Extruder ZE-5 (ThreeTec GmbH, Seon, Schweiz), den MiniLab® Micro Rheology von HAAKE (ThermoFisher Scientific, Karlsruhe, Deutschland), den TSE 24 MC (ThermoFisher Scientific, Karlsruhe, Deutschland), der Process 11 (ThermoFisher Scientific, Karlsruhe, Deutschland), der EuroLab 16 X (ThermoFisher Scientific, Karlsruhe, Deutschland)L, der Nano 16 Extruder (Leistritz Extrusionstechnik GmbH, Nürnberg, Deutschland), die Extruder der ZSE Serie (Extrusionstechnik GmbH, Nürnberg, Deutschland), die Extruder der ZSE Maxx Serie (Extrusionstechnik GmbH, Nürnberg, Deutschland), sowie zahlreiche Geräte der Firmen Leistritz, Coperion, Biomation, Xplore, ZSK, Brabender, Thermo, IDE.

Unter homogenisieren versteht man die Herstellung einer homogenen, also einheitlichen Mischung verschiedener, nicht ineinander löslicher Komponenten einer Lösung. Im Sinne dieser Erfindung versteht man die Herstellung eines VPG, wobei die wässrige Flüssigkeit, die Phospholipide, der optionale, mindestens ein Wirkstoff sowie das optionale, mindestens ein weiteres Lipid, homogenisiert wird.

In einer Ausführungsform wird das eine oder die mehreren Phospholipide, die wässrige Flüssigkeit und der mindestens eine, optionale pharmazeutische Wirkstoff separat und gleichzeitig dem Schnecken-Extruder zugeführt. In einer weiteren Ausführungsform wird das eine oder die mehreren Phospholipide, die wässrige Flüssigkeit und der mindestens eine, optionale pharmazeutische Wirkstoff separat und zeitlich versetzt dem Schnecken-Extruder zugeführt In bestimmten Ausführungsformen können das eine oder mehrere Phospholipide und die wässrige Flüssigkeit vor der Zuführung in den Schnecken-Extruder gemischt werden. In weiteren bestimmten Ausführungsformen können das eine oder mehrere Phospholipide sowie mindestens ein weiteres Lipid und die wässrige Flüssigkeit vor der Zuführung in den Schnecken-Extruder gemischt werden. Zur Mischung der Bestandteile stehen verschiedene Mischverfahren zur Verfügung, wie das Magnetrührverfahren. Für das Magnetrührverfahren werden Phospholipid(e) und wässrige Flüssigkeit mit einem Magnetrührer in einem Behälter für kurze Zeit bei Raumtemperatur oder leicht erhöhter Temperatur gerührt. Der Rührer bedeckt bevorzugt den gesamten Boden des Behälters.

Unter dem Zuführen im Sinne der Erfindung versteht man das Zugeben der verschiedenen Bestandteile eines VPG in den Schneckenextruder. Das Zuführen der verschiedenen Bestandteile kann einzeln oder als Gemisch erfolgen. Die Zuführung erfolgt manuell durch eine Spritze in den laufenden Schnecken-Extruder, oder automatisch, z.B. durch eine Tropf-Vorrichtung, Kolbenpumpe oder andere Pumpe, ggf. auch unter Nutzung der Schwerkraft indem das Material selbstständig in den Extruder fließt, durch andere Fördergeräte wie Schaufelräder, Schieber, Pressen, Förderschnecken, oder durch Gießen der zusammenhängenden Masse in den Extruder.

Ein Gemisch im Sinne der Erfindung ist der Stoff aus (i) wässriger Flüssigkeit und Phospholipid(en) oder (ii) wässriger Flüssigkeit, Phospholipid(en) und mindestens einem pharmazeutischen Wirkstoff oder (iii) wässriger Flüssigkeit, Phospholipid(en) und mindestens einem weiteren Lipid oder (iv) wässriger Flüssigkeit, Phospholipid(en), mindestens einem weiteren Lipid und mindestens einem pharmazeutischen Wirkstoff vor Homogenisierung und Extrusion. In bestimmten Ausführungsformen können die von (i) bis (iv) benannten Gemische ferne weitere Stoffe beinhalten: in bestimmten Ausführungsformen umfasst das erfindungsgemäße Gemisch auch mindestens einen Hilfsstoff, der die Freisetzung des mindestens einen pharmazeutischen Wirkstoff modifiziert und/oder den biologischen Abbau des vesikulären Phospholipidgels modifiziert und/oder den mindestens einen pharmazeutischen Wirkstoff während der Herstellung, Lagerung und Freisetzung stabilisiert. Darüber hinaus könnte der Hilfsstoff die Löslichkeit des mindestens einen pharmazeutischen Wirkstoff modifizieren. Der Hilfsstoff kann z.B. ein hydrophiles Polymer, ein Zucker, ein Polyol, ein Tensid, ein Antioxidationsmittel und/oder ein wasserlösliches Salz oder irgendein anderer Hilfsstoff sein, von dem bekannt ist, dass er die oben genannten Zwecke erfüllt.

In einer Ausführungsform kann die Schnecken-Extrusion als Einzelschnecken- Extrusion oder als Doppelschnecken-Extrusion durchgeführt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Schnecken-Extrusion eine Doppelschnecken-Extrusion. Daher verfügt der Schnecken-Extruder in bestimmten Ausführungsformen über zwei Extrusionsschnecken.

Die Temperatur während des Extrudierens sowie weitere Parameter haben einen Einfluss auf die Produkteigenschaften des VPG, insbesondere auf die Viskosität. In einer präferierten Ausführungsform beträgt die Temperatur während des Extrudierens zwischen 4 °C und 60 °C und die Drehgeschwindigkeit der Extrusionsschnecke(n) beträgt zwischen 5min 1 und 500 min 1 , bevorzugt zwischen 20 min 1 und 360 min 1 . In einer besonders präferierten Ausführungsform beträgt die Temperatur während des Extrudierens 30 °C und die Drehgeschwindigkeit der Extrusionsschnecke(n) beträgt 300 min 1

In bestimmten Ausführungsformen werden eine oder mehrere Schritte des Extrudierens durchgeführt, d.h. dass die Masse aus einem oder mehreren Phospholipid(en), wässriger Flüssigkeit, optional mindestens einem Wirkstoff und optional mindestens einem weiteren Lipid nach dem ersten Homogenisierungsschritt im Extruder mindestens noch einmal extrudiert wird. Dabei sind die Extruder entweder direkt miteinander verbunden oder das Zwischenprodukt wird gesammelt und einem weiteren Extruder oder dem selben, zuvor verwendeten Extruder zugeführt.

In einer weiteren Ausführungsform wird bei einer solchen mindestens einen weiteren Extrusion das oder die gleiche(n) und/oder ein oder mehrere weitere Phospholipid(e), die gleiche(n) und/oder eine oder mehrere weitere wässrige(n) Flüssigkeit(en), der oder die gleiche(n) und/oder ein oder mehrere weitere pharmazeutischen Wirkstoff(e), und/oder das oder die gleiche(n) und/oder ein oder mehrere weitere Lipid(e) wie in der ersten Extrusion zugeführt.

In einer Ausführungsform (i) verfügen die Extrusionsschnecke(n) über eine Förderfünktion und optional zusätzlich über Knet- oder Mischsegmente oder anders gestaltet Segmente für Mischung, Transport, Temperierung, Verdichtung, oder Austragung, und/oder (ii) werden die Extrusionsschnecke(n) gleich- oder gegenläufig betrieben, und/oder (iii) weisen die für die Extrusion verwendeten Düsen unterschiedliche Durchmesser, Längen und/oder Formen auf, und/oder (iv) ist der Auslass des Extruders zur Achse der Extruder- Schnecke(n) rechtwinklig oder geradlinig angeordnet. In einer weiteren Ausführungsform verfügen die Extrusionsschnecke(n) über eine Förderfünktion. In einer Ausführungsform verfügen die Extrusionsschnecke(n) über eine Förderfünktion und zusätzlich über Knet- oder Mischsegmente oder anders gestaltet Segmente für Mischung, Transport, Temperierung, Verdichtung, oder Austragung. Die Extrusionsschnecken können gleich- oder gegenläufig betrieben werden. Gleichläufig bedeutet in diesem Kontext, dass die Extrusionsschnecken in gleicher Richtung laufend betrieben werden, während gegenläufig in diesem Zusammenhang bedeutet, dass die Extrusionsschnecken in entgegengesetzter Richtung betrieben werden. In einer Ausführungsform werden die Extrusionsschnecken gleichläufig betrieben. In einer weiteren Ausführungsform werden die Extrusionsschnecken gegenläufig betrieben. In einer Ausführungsform weisen die die für die Extrusion verwendeten Düsen eine Länge zwischen 0,1 mm und 50 mm auf, bevorzugt ist eine Länge von 2 mm. In einer anderen Ausführungsform weisen die für die Extrusion verwendeten Düsen eine Länge zwischen 10 mm und 100 mm auf, bevorzugt ist eine Länge von 20 mm In einer weiteren Ausführungsform weisen die für die Extrusion verwendeten Düsen ein Durchmesser zwischen 0,1 mm und 5 mm auf, bevorzugt ist ein Durchmesser von 2 mm. In einer anderen Ausführungsform weisen die für die Extrusion verwendeten Düsen ein Durchmesser zwischen 1 mm und 10 mm auf, bevorzugt ist ein Durchmesser von 5 mm. In einer Ausführungsform sind die für die Extrusion verwendeten Düsenformen rund, dreieckig, viereckig, fünfeckig, oder sechseckig oder anders geometrisch geformt. Besonders bevorzugt ist eine runde Düsenform.

Eine Düse, deren Form einen Drall bzw. eine seitliche Bewegung des Extrusionsgutes fördert, ist ebenfalls möglich. In einer Ausführungsform ist der Auslass des Extruders zur Achse der Extruder-Schnecke(n) rechtwinklig angeordnet. In einer weiteren Ausführungsform ist der Auslass des Extruders zur Achse der Extruder-Schnecke(n) geradlinig angeordnet. Es können bis zu 35.000 kg Extrudat pro Stunde hergestellt werden. Die Geometrie der Extrusionsschnecken kann zylindrisch parallel oder konisch oder anders geformt sein.

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hat die pharmazeutische Zusammensetzung einen Phospholipidgehalt von mindestens 30 Gew.-% (300 mg / g VPG), bevorzugter mindestens 40 Gew.-% (400 mg / g VPG), und am meisten bevorzugt mindestens 45 Gew.-% (450 mg / g VPG); ebenfalls umfasst sind ein Phospholipidgehalt von mindestens 50 Gew.-% (500 mg / g VPG), und ein Phospholipidgehalt von mindestens 60 Gew.-% (600 mg / g VPG). Umfasst sind ebenfalls ein Phospholipidgehalt unter 30 Gew.-% (300 mg / g VPG) und über 60 Gew.-% (600 mg / g VPG). In speziellen Ausführungsformen der Erfindung liegt das Gewichtsverhältnis zwischen dem Phospholipid und des mindestens einen pharmazeutischen Wirkstoff zwischen etwa 1000: 1 und 5: 1, vorzugsweise zwischen 500: 1 und 25: 1, bevorzugter zwischen 250: 1 und 40: 1 und noch bevorzugter zwischen 150: 1 und 50: 1. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt das Gewichtsverhältnis zwischen dem Phospholipid und dem mindestens einen pharmazeutischen Wirkstoffs etwa 100: 1.

Es sind Extrusionsverfahren zu beschreiben, die sich durch verschiedene Temperaturen und Temperaturzonen im Extruder auszeichnen. U.a. kann im Extruder geheizt und/oder gekühlt werden. Diese temperaturkontrollierten Schritte können in beliebiger Reihenfolge, Länge und Frequenz aufeinander folgen. Es kann sowohl durch gekühlte als auch erwärmte Düsen extrudiert werden. In einem Aspekt der Erfindung wird der pharmazeutische Wirkstoff aus dem hergestellten VPG über einen Zeitraum von mehr als 5 Tagen, mehr als 10 Tagen, mehr als 20 Tagen, mehr als 30 Tagen oder noch mehr freigesetzt und die initiale Freisetzung des Wirkstoffs beträgt weniger als 35%, bevorzugter weniger als 25%, am bevorzugtesten weniger als 20% noch bevorzugten weniger als 10% der Gesamtwirkstoffmenge innerhalb der ersten 48 Stunden.

Unter einer Freisetzung versteht man im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Freisetzung eines oder mehrerer pharmazeutischer Wirkstoffe aus seiner Formulierung, hier aus dem VPG. Die initiale Freisetzung ist jene Freisetzung, die zwischen dem Zeitpunkt der Applikation des VPG und 48 Stunden nach dieser Applikation stattfindet. Die Freisetzungsrate einer pharmazeutisch aktiven Verbindung aus VPG kann durch eine Vielzahl von Mitteln bestimmt werden, wie zum Beispiel mit Durchflusszellen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Technik bekannt sind und von diesen ohne weiteres praktiziert werden können, wenn die Fehren dieser Erfindung gegeben sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Freisetzungsrate in vitro oder in vivo bestimmt werden.

Demgemäß zeigt das von der pharmazeutischen Zusammensetzung umfasste VPG eine im wesentlichen kontinuierliche Freisetzungsgeschwindigkeit des mindestens einen pharmazeutischen Wirkstoffs, der im VPG eingeschlossen ist und über einen Zeitraum von mindestens etwa 5, vorzugsweise 10 Tagen, vorzugsweise mindestens 20 Tagen, noch bevorzugter mindestens 30 Tagen, stärker bevorzugt mindestens 45 Tagen und am meisten bevorzugt 55 Tagen abgegeben wird. Es ist besonders bevorzugt, dass eine Freisetzungsrate über einen Zeitraum von mindestens 10 Tagen, vorzugsweise mindestens 20 Tagen, bevorzugter mindestens 30 Tagen, noch bevorzugter mindestens 45 Tagen und am meisten bevorzugt von mehr als 55 Tagen erhalten wird. Die initiale Freisetzung des Wirkstoffs beträgt weniger als 35%, bevorzugt weniger als 25%, noch bevorzugtee weniger als 20%, am bevorzugtesten weniger als 10% der Gesamtwirkstoffmenge innerhalb der ersten 48 Stunden.

Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zeigt eine im wesentlichen kontinuierliche Freisetzungsrate des pharmazeutischen Wirkstoffs, der im VPG über einen bestimmten Zeitraum eingeschlossen ist. Der Begriff „kontinuierliche Freisetzungsrate“ wird im Kontext der Erfindung für eine Freisetzung des pharmazeutischen Wirkstoffs verwendet, die kontinuierlich und vorzugsweise in der Menge stabil ist. Dementsprechend bedeutet der Ausdruck„kontinuierlich“ eine Freisetzung, die ohne Unterbrechung und vorzugsweise ohne Erhöhung oder Verminderung auftritt.

Die Gesamtwirkstoffmenge im Sinne der vorliegenden Erfindung ist jene Menge eines pharmazeutischen Wirkstoffs, das sich in einer definierten Menge des VPG befindet. In einem weiteren Aspekt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin einen Schritt (iv), in dem durch einen RAM -Extruder extrudiert wird, wobei dieser Schritt nach den Schritten (i)-(iii) stattfindet.

Ein RAM-Extruder oder Kolbenextruder im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Extruder, bei dem statt einer Extrusionsschnecke ein Kolben verwendet wird. Sowohl RAM-Extruder mit vertikal als auch horizontal angeordneten Kolben können verwendet werden. Zu extrudierendes Material wird schwerkraftgetrieben in eine Kammer eingeführt und dort auf Sintertemperatur erhitzt. Der hydraulische Kolben des RAM-Extruders erzeugt dann Druck auf das zu extrudierende Material, wodurch das Material durch einen Ausgang aus der Kammer getrieben wird, und dabei eine durch den Ausgang vorgegebene Form annimmt. Die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten VPG weisen eine Viskosität zwischen 0,05 Pa*s und 90 Pa*s, bevorzugter Weise zwischenl und 40 Pa s, bevorzugter 1 bis 25 Pa s, besonders bevorzugt 1-15 Pas kleiner als 10 Pa*s am bevorzugtesten kleiner als 5 Pa*s auf

Die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestelleten VPG weisen keine Verfestiger oder Härter, auch„Solidifier“ genannt, auf, d.h. die VPGs behalten ihre niedrige Viskosität bei und sind, bzw. werden, keine Feststoffe. Speziell enthalten die erfindungsgemäß hergestelleten VPGs kein(e) härtbaren Polymere, Alginat, Zelluloseacetatphthalat, Natrium Carboxymethylzellulose, Hydroxyethylzellulose, Hydroxypropylzellulose, Methylzellulose, Methylhydroxyethylzellulose, Polyacrylsäure und deren Derivate, Pektin, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Agarose, Alginsäure, Kollagen, Xanthangummi, Carrageen, Tragacantgummi, Chitosan, Akazie, Hydroxypropylmethylzellulose, Pullulan, Hydroxypropylstärke, Agar, Agarose, oder Gelatine. Dementsprechend werden auch vor oder während des erfindungsgemäßen Verfahrens keine solchen Solidifier verwendet oder hinzugefügt. Die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten VPG können mit Hilfe von handelsübliche Nadel und Spritze, sowie mit Hilfe von nadelloser Injektion in das subkutane Gewebe eingebracht werden. Auch ein Einbringen in andere Körperhöhlen wie zum Beispiel in die Zahnfleischtasche, in das Ohr, in das Innenohr, in die Harnblase, in die Gebärmutter, in den Bindehautsack, in Gelenke oder auch intrathekal ist möglich. In einem weiteren Aspekt wird das erfindungsgemäß hergestellte und mindestens einen pharmazeutischen Wirkstoff umfassende VPG zur Behandlung oder Vorbeugung einer Erkrankung verwendet.

Eine Erkrankung oder Funktionsstörung im Sinne der vorliegenden Erfindung ist das Vorhandensein einer Störung, die eine Behandlung im Sinne einer medizinischen Therapie erfordert. Eine Verletzung fällt dementsprechend unter die vorangehende Definition. In bestimmten Ausführungsformen kann es sich um Verletzungen oder degenerative Erkrankungen der Knochen, Knorpel, Sehnen, Bändern, Gefäßen, Haut, Muskeln oder eine Kombination davon handeln. In weiteren Ausführungsformen kann es sich bei Erkrankungen oder Funktionsstörungen um AIDS, Diabetes, Muskeldystrophie oder onkologische Erkrankungen handeln.

Eine Behandlung im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung einer Erkrankung oder Funktionsstörung oder Verletzung. Eine Behandlung ist die Therapie mit dem erfindungsgemäß hergestellten VPG, bevorzugt eine topische Therapie. Denkbar sind auch weitere Therapieformen sowie eine Mischung davon, nämlich eine topische Therapie (VPG) im Rahmen einer chirurgischen Therapie, wobei das VPG verabreicht wird. Eine Behandlung schließt die Behandlung von sowohl Menschen als auch Tieren ein.

Eine Vorbeugung im Sinne der vorliegenden Erfindung, ist die Behandlung mit dem erfindungsgemäß hergestellten VPG, die eine Krankheit, Funktionsstörung oder Verletzung entweder verhindern oder verzögern kann. In einem weiteren Aspekt wird das erfindungsgemäß hergestellte und mindestens einen pharmazeutischen Wirkstoff umfassende VPG für kosmetische Zwecke verwendet. Dabei kann die kosmetische Anwendung bei Menschen oder Tieren erfolgen. In einem weiteren Aspekt wird das erfindungsgemäß hergestellte und mindestens einen pharmazeutischen Wirkstoff umfassende VPG als Nahrungsergänzungsmittel oder als Teil eines Nahrungsergänzungsmittels verwendet. Das Nahrungsergänzungsmittel kann sowohl für Menschen als auch für Tiere bestimmt sein.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung hat den vorteilhaften Effekt, dass VPG skalierbar, und vergleichsweise schnell mit geringen Scherkräften hergestellt werden und ebenfalls sensitive pharmazeutische Wirkstoffe eingeschlossen werden können, die über vorteilhafte Freisetzungseigenschaften verfügen.

Im Gegensatz zum Stand der Technik kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung für die Herstellung von VPG genutzt werden sowie vergleichsweise einfach und schnell durchgeführt werden. Aufgrund dieser Eigenschaften des Verfahrens können sensitive pharmazeutische Wirkstoffe wie beispielsweise Proteine, die vergleichsweise instabile Wirkstoffe darstellen, in VPG eingeschlossen werden.

Die vorliegende Erfindung wird weiter durch folgenden Beispiele sowie Abbildungen beschrieben, die lediglich dem Zweck der Veranschaulichung spezifischer Ausführungsformen dieser Erfindung dienen und nicht so auszulegen sind, dass sie den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise einschränken.

BEISPIELE

Beispiel 1: Herstellung von Vesikulären Phospholipid Gelen mittels Zwei Schnecken Extrusion

Als Lipid-Komponente wurde Ei-Lecithin (Lipoid E80, Lipoid GmbH, Deutschland), in einem Konzentrationsbereich zwischen 30 % (m/m) und 60 % (m/m) verwendet Die Komponenten zur Herstellung der VPGs (Phospholipide und wässrige Komponente) wurden exakt abgewogen und drei Minuten durch langsames Rühren mit einem Magnetrührer vorgemischt. Dann wurde die entstandene Vor-Mischung dem laufenden Extruder zugeführt. Zwei unterschiedliche Labor-Maßstab Extruder wurden verwendet. Ein Mini-Extruder ZE-5 (ThreeTec GmbH, Seon, Schweiz) und ein MiniLab® Micro Rheology Compounder von HAAKE (ThermoFisher Scientific, Karlsruhe, Deutschland) wurde zur Herstellung verwendet. Verschiedene Parameter wie die Drehgeschwindigkeit der Schnecken, die Recycling-Dauer des integrierten Bypasses (HAAKE Extruder), der Düsendurchmesser und die Düsenlänge, sowie Temperatur und Lipid-Gehalt wurden variiert.

In allen Fällen wurden VPG mit homogenem Aussehen und Konsistenz erhalten. Es wurden keine Phasentrennung beobachtet, auch nach längerem Stehen (3 Monaten) der VPG bei Raumtemperatur.

Tabelle 1 : Makroskopische Beurteilung der VPGs nach Herstellung mit unterschiedlichen Verfahren während einer Lagerung über 3 Monate bei Raumtemperatur. Als „homogen“ werden VPGs ohne sichtbare Trennung von Lipidphase und wässriger Phase bezeichnet. Als„nicht homogen“ werden VPGs mit sichtbaren Lipidansammlungen oder sichtbarer Trennung der wässrigen Phase vom Lipid bezeichnet.

Beispiel 2:

Temperaturübertragung während des Herstellungsverfahrens Die Temperatur während der Herstellung wurde mit Hilfe eines Thermometers (Data Logger Thermometer HH147U, OMEGA, Deckenpffonn, Deutschland) direkt nach Beendigung des Herstellungsprozesses bestimmt. Dazu wurde der Sensor des Thermometers direkt nach der Herstellung in die VPG-Masse gesteckt.

Die Temperaturmessungen ergaben folgende Temperaturen.

Tabelle 1 : Übersicht der Temperaturmessungen nach Herstellung durch Extrusion.

Für die extrudierten Proben sind die gemessenen Produkttemperaturen nahezu gleich mit den eingestellten Temperaturen für Schnecken und Zylinder/Barrel. Bei der Herstellung mit Hilfe des Extruders sind die Produkttemperaturen durch Kontrolle von Schnecken- und Zylinder/Barrel-Temperatur leicht kontrollierbar. Es ist einfach möglich VPG bei Temperaturen im Bereich von 13 °C bis 30 °C herzustellen, eine Erwärmung im Laufe des Prozesses findet nicht statt. Es ist weiterhin möglich VPG bei erhöhten, wohl definierten, konstanten Temperaturen herzustellen.

Beispiel 3:

Qualität der VPGs

VPG wurde mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unter der Verwendung folgender Parametern hergestellt. Es wurde eine Drehgeschwindigkeit von 300 min 1 mit einer Temperatur von 30 °C und einem Düsendurchmesser von 0,5 mm verwendet. Dabei wurde VPG mit einem Phospholipidgehalt zwischen 35 % und 50 % hergestellt. Zur Kontrolle wurden außerdem Proben mit Hilfe der DAC (3500rpm, 45 min) und des Magnetrührverfahrens (45 min) hergestellt. Die VPG-Qualität nach Herstellung durch Extrusion wurde untersucht mit Hilfe von Viskositätsmessungen und durch Bestimmung der Vesikelgrößen nach Verdünnung zu Liposomendispersionen. Des Weiteren wurden die VPGs nach Herstellung makroskopisch beurteilt.

Makroskopische Homogenität

Zur Beurteilung der makroskopischen Homogenität der hergestellten VPGs wurden die Gele direkt nach der Herstellung begutachtet und fotografiert.

Makroskopische Aufnahmen der beiden Kontrollen zeigen eine inhomogene Mischung mit großen Lipid-Tropfen nach Herstellung mit dem Magnetrührer, während die DAC-Proben ein sehr homogenes Aussehen aufweisen. Makroskopischen Aufnahmen der Proben die durch Extrusion hergestellt wurden, zeigen eine homogene Mischung. Es sind keine Lipidtropfen erkennbar. (Siehe Abbildung 1).

Teilchengröße

Zur Bestimmung der Vesikelgröße, nach der Herstellung der VPGs wurden 10 mg VPG in 1 ml hochgereinigtem Wasser verdünnt. Diese Dispersion wurde dann ein weiteres Mal im Verhältnis 1 :10 verdünnt und mit Hilfe von Dynamischer Lichtstreuung (DLS) charakterisiert. Dazu wurde ein Zetasizer Nano ZS (Malvem Instruments, UK) verwendet.

Durch DLS-Messungen konnten Unterschiede in der Homogenität erkannt werden. Dabei wurden bei den mit Magnetrührer hergestellten VPGs der homogene Bereich beprobt. Es ist festzuhalten, dass die mit Magnetrührer hergestellten VPGs in ihrer Gesamtheit NICHT diesem Dispersitätsgrad aufweisen, sondern als inhomogen zu bewerten sind. VPGs welche mit Hilfe eines Magnetrührers hergestellt wurden zeigen große Vesikelgrößen mit hoher Polydispersität nach dem Verdünnen im Vergleich zu VPGs welche mit Hilfe der DAC hergestellt wurden. Bei den DAC-Proben wurden im Verhältnis kleinere Vesikelgrößen und eine geringere Polydispersität beobachtet. Mittels Extrusion hergestellte VPGs zeigen Vesikelgrößen und Polydispersität im Bereich zwischen den beiden anderen Herstellungsverfahren und sind damit deutlich besser einzuordnen als die Proben welche durch das Magnetrührverfahren hergesteht wurden. (Siehe Abbildung 2A und Abbildung 2B).

Viskosität

Zur Bestimmung der Viskosität wurden die VPGs mit einem Rotationsviskosimeter (Physica MCR 100, Anton Paar GmbH, Ostfildern, Deutschland) mit einer Platte- Platte-Geometrie (PP-25) vermessen. 0,3 g VPG wurden in einem Scherbereich von 10 s 1 bis 100 s 1 bei 25 °C untersucht. Die Viskosität wurde zur Vergleichbarkeit bei einer Scherrate von 32,9 s 1 angegeben. Die Ergebnisse der Viskositätsmessungen der extrudierten VPGs zeigen eine steigende Viskosität mit steigendem Phospholipidgehalt. Dabei liegen die Werte der VPGs die durch Extrusion hergestellt wurden zwischen der Viskosität der Kontrollgruppen die mit Hilfe eines Magnetrührers bzw. einer DAC hergestellt wurden. Die Injektabilität der VPGs ist direkt mit der Viskosität korreliert. Mittels normaler Nadelinjektion ist ab einer Viskosität von ca. 0,5 Pa*s keine korrekte Injektion (Injektionsgeschwindigkeit 0,1 ml/sec, 27 G Kanüle) mehr möglich. Mittels vorteilhafter nadelfreier Injektion ist bis zu einer Viskosität von ca. 10 Pa*s eine Injektion möglich, darüber hinaus nicht mehr.

Mittels Extrusion hergestellte VPGS können somit gegen über mit der DAC-Methode hergestellten VPGs vorteilhaft injiziert werden. Dazu müssen die Lipidart und Lipidmengen so gewählt werden, dass die zur Injektion maximal mögliche Viskosität unterschritten wird (Siehe Abbildung 3).

Beispiel 4:

Effekt verschiedener Extrusionsparameter auf die Viskosität Alle VPGs wurden in einem einfachen Extrusionsprozess mit einem Phospholipidgehalt von 45 % (m/m) hergestellt. Für die Extrusion wurden verschiedene Extruder genutzt, als repräsentatives Beispiel werden an dieser Stelle die Resultate aus dem MiniLab® Rheology Compounder von HAAKE genutzt. Vor der Extrusion wurden jeweils Ei-Lecithin und Puffer (20 mM PBS pH 7,4) durch drei- minütiges Rühren vorgemischt.

Die Rotationsgeschwindigkeit der Schnecken wurde variiert zwischen 40 min 1 , 100 min 1 , 200 min 1 und 300 min 1 . Dabei konnten mit steigender Rotationsgeschwindigkeit kleinere Vesikel und somit eine bessere Homogenität erzielt werden, ohne eine Viskositätserhöhung zu beobachtet. (Siehe Abbildung 5).

Des Weiteren wurde der Effekt verschiedener Schnecken- und Barreltemperaturen auf die Viskosität bestimmt. Dazu wurden folgende Temperaturen eingestellt: 10 °C, 20 °C, 30 °C und 60 °C. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Viskosität festgestellt.

Beispiel 5:

In vitro Freisetzung

Eine wichtige Eigenschaft von VPG ist ihre verzögerte Freisetzung. Es wurde überprüft, ob diese Eigenschaft durch die Herstellungstechnik beeinflusst wird.

Um die in vitro Freisetzung zu untersuchen wurde ca. 0,5 g der unterschiedlich hergestellten VPGs (Phospholipidgehalt 45 % (m/m), beladen mit 2mg/g FITC- Dextran, Molekulargewicht 70 kDa) in speziell gefertigte Durchflusszellen aus Teflon eingewogen. Die Freisetzungszellen bestehen aus einem untenliegenden Donor- Kompartment in welchem sich die VPGs befinden und einem obenliegenden Akzeptor-Bereich durch welchen das Freisetzungsmedium (20 mM PBS pH 7,4) mit einem konstanten Fluss (0,5 ml/h) gepumpt wird. Für die Freisetzungsversuche wurden die Zellen bei 37 °C in einem Wasserbad inkubiert. Die freigesetzte Menge FITC-Dextran (lec = 492 nm; kcm = 518 nm) wurde mit Hilfe eines Fluoreszenzspektrophotometers (Varian Cary Eclipse, Agilent Technologies, Oberhaching, Deutschland) bestimmt.

VPG, welche mit Hilfe der DAC oder des Magnetrührers hergestellt werden, zeigen eine verlängerte Freisetzung von FITC-Dextran über mehrere Wochen. Überraschend konnte eine langsamere Freisetzungsrate festgestellt werden für VPG, welche durch Extrusion hergestellt wurden, im Vergleich zu den beiden Kontrollen. Die Freisetzung zeichnet sich insbesondre durch eine lange Dauer und das Fehlen eines nennenswerten Bursts aus (Burst = rasche Freisetzung zu Beginn (innerhalb 48 h) von mehr als 20 %). (Siehe Abbildung 4).

Beispiel 6:

Einschluss von Proteinen und deren Stabilität

Erythropoetin (ΈRO)

Erythropoetin (EPO) wurde durch direkten Einschluss mit Hilfe der Extrusion in VPGs

(bestehende aus 40% Lipoid E80 und 20mM PBS pH 7,4 mit 3mg/g EPO) eingeschlossen. Die Proteinintegrität und die Tendenz zur Aggregation der Proteine wurden mit Hilfe von SDS-PAGE untersucht. Nach der VPG-Herstellung wurde das Protein beinhaltende VPG mit dem entsprechenden Puffer auf eine Proteinkonzentration von 0,05 mg/ml verdünnt. Tris-Puffer pH 6,8 mit 2 % SDS und 2 % Glycin wurde zugegeben und die Proben wurden bei 90 °C für 10 Minuten denaturiert. Ein NuPAGE® 4-12 % Bis-Tris-Gel (NOVEX high performance pre-cast gels, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) und NuPAGE® MES SDS Laufpuffer (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) wurden in einem XCall II Mini cell System (Novex, San Diego, CA, USA). Jedes Well wurde mit 12 mΐ Probenvolumen beladen. Als Molekulargewicht-Marker Markl2TM von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande) verwendet. Die Elektrophorese wurde mit einer gleichbleibenden Spannung von 200 V für ca. 25 Minuten durchgeführt. Anschließend wurden die Gele sofort mit SimplyBlue™ SafeStain (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) angefärbt.

Anakinra

Anakinra wurde durch direkten Einschluss mit Hilfe der Extrusion in VPGs (bestehend aus 40% Lipoid E80 und Citratpuffer pH 6.5 mit 5mg/g Anakinra) eingeschlossen. Es wurde makroskopisch homogenes VPG erhalten. Die Proteinintegrität und die Tendenz zur Aggregation der Proteine wurden mit Hilfe von SDS-PAGE untersucht. Nach der VPG-Herstellung wurde das Protein beinhaltende VPG mit dem entsprechenden Puffer auf eine Proteinkonzentration von 0,05 mg/ml verdünnt. Tris- Puffer pH 6,8 mit 2 % SDS und 2 % Glycin wurde zugegeben und die Proben wurden bei 90 °C für 10 Minuten denaturiert. Ein NuPAGE® 4-12 % Bis-Tris-Gel (NOVEX high performance pre-cast gels, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) und NuPAGE® MES SDS Laufpuffer (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) wurden in einem XCall II Mini cell System (Novex, San Diego, CA, USA). Jedes Well wurde mit 12 mΐ Probenvolumen beladen. Als Molekulargewicht-Marker Markl2TM von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande) verwendet. Die Elektrophorese wurde mit einer gleichbleibenden Spannung von 200 V für ca. 25 Minuten durchgeführt. Anschließend wurden die Gele sofort mit SimplyBlue™ SafeStain (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) angefärbt.

Humanes Serum Albumin

HSA wurde durch direkten Einschluss mit Hilfe der Extrusion in VPG (bestehend aus 40% Lipoid E80 und 20mM PBS pH 7.4 mit 5mg/g HSA) eingeschlossen. Es wurde makroskopisch homogenes VPG erhalten. Die Proteinintegrität und die Tendenz zur Aggregation der Proteine wurden mit Hilfe von SDS-PAGE untersucht. Nach der VPG-Herstellung wurde das Protein beinhaltende VPG mit dem entsprechenden Puffer auf eine Proteinkonzentration von 0,05 mg/ml verdünnt. Tris-Puffer pH 6,8 mit 2 % SDS und 2 % Glycin wurde zugegeben und die Proben wurden bei 90 °C für 10 Minuten denaturiert. Ein NuPAGE® 4-12 % Bis-Tris-Gel (NOVEX high performance pre-cast gels, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) und NuPAGE® MES SDS Laufpuffer (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) wurden in einem XCall II Mini cell System (Novex, San Diego, CA, USA). Jedes Well wurde mit 12 mΐ Probenvolumen beladen. Als Molekulargewicht-Marker Markl2TM von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande) verwendet. Die Elektrophorese wurde mit einer gleichbleibenden Spannung von 200 V für ca. 25 Minuten durchgeführt. Anschließend wurden die Gele sofort mit SimplyBlue™ SafeStain (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) angefärbt.

Monoklonaler Antikörper (Typ IgGl)

Ein monoklonaler Antikörper wurde durch direkten Einschluss mit Hilfe der Extrusion in VPGs (bestehend aus 40% Lipoid E80 und 20mM PBS pH 7.4 mit l0mg/g Antikörper) eingeschlossen. Die Proteinintegrität und die Tendenz zur Aggregation der Proteine wurden mit Hilfe von SDS-PAGE untersucht. Nach der VPG-Herstellung wurde das Protein beinhaltende VPG mit dem entsprechenden Puffer auf eine Proteinkonzentration von 0,05 mg/ml verdünnt. Tris-Puffer pH 6,8 mit 2 % SDS und 2 % Glycin wurde zugegeben und die Proben wurden bei 90 °C für 10 Minuten denaturiert. Ein NuPAGE® 3-8% Tris- Acetate Gel (NOVEX high performance pre- cast gels, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) und NuPAGE® Tris- Acetate SDS Laufpuffer (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) wurden in einem XCall II Mini cell System (Novex, San Diego, CA, USA). Jedes Well wurde mit 12 mΐ Probenvolumen beladen. Als Molekulargewicht-Marker HiMarkl2TM Pre-stained Protein Standard von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande) verwendet. Die Elektrophorese wurde mit einer gleichbleibenden Spannung von 200 V für ca. 25 Minuten durchgeführt. Anschließend wurden die Gele sofort mit SilverXPress® Silver Staining Kit (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) angefärbt.

Beriglobin

Beriglobin wurde durch direkten Einschluss mit Hilfe der Extrusion in VPGs (bestehend aus 40% Lipoid E80 und 20mM PBS pH 7.4 mit 5mg/g Beriglobin) eingeschlossen. Es wurde makroskopisch homogenes VPG erhalten. Die Proteinintegrität und die Tendenz zur Aggregation der Proteine wurden mit Hilfe von SDS-PAGE untersucht. Nach der VPG-Herstellung wurde das Protein beinhaltende VPG mit dem entsprechenden Puffer auf eine Proteinkonzentration von 0,05 mg/ml verdünnt. Tris-Puffer pH 6,8 mit 2 % SDS und 2 % Glycin wurde zugegeben und die Proben wurden bei 90 °C für 10 Minuten denaturiert. Ein NuPAGE® 3-8% Tris- Acetate Gel (NOVEX high performance pre-cast gels, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) und NuPAGE® Tris-Acetate SDS Laufpuffer (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) wurden in einem XCall II Mini cell System (Novex, San Diego, CA, USA). Jedes Well wurde mit 12 mΐ Probenvolumen beladen. Als Molekulargewicht- Marker HiMarkl2TM Pre-stained Protein Standard von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande) verwendet. Die Elektrophorese wurde mit einer gleichbleibenden Spannung von 200 V für ca. 25 Minuten durchgeführt. Anschließend wurden die Gele sofort mit SilverXPress® Silver Staining Kit (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) angefärbt. Abhängig von der Sensitivität der Proteine gegen Scherstress, zeigten alle Kandidaten eine vergleichbare oder sogar leicht verbesserte Stabilität im Vergleich zur DAC und dem Magnetrührer. (Siehe Abbildung 6 für EPO, Abbildung 7 für mAb).

Beispiel 7:

Lagerstabilität der VPGs

Mittels Magnetrührverfahren hergestellte VPGs, mittels DAC hergestellte VPGs und mittels TSE hergestellte VPGs wurden bei Raumtemperatur über 3 Monate gelagert. Für diese Studie wurden VPGs mit einem Phospholipidgehalt von 40 % (m/m), bestehend aus Ei-Lecithin (Lipoid E80, Lipoid GmbH, Deutschland) und 20 mM PBS pH 7,4, verwendet. Dabei wurde festgestellt, dass die mittels Magnetrührverfahren hergestellten VPGs nach drei Monaten insgesamt keine homogene Dispersion mehr zeigten. Deutliche Lipidabscheidungen sind hier sichtbar. VPGs welche mittels DAC oder TSE hergestellt wurden, waren beide makroskopisch und mikroskopisch stabil. In vitro Freisetzungsversuch mit VPG, die mit monoklonalem Antikörpers beladen waren zeigte, dass das freigesetzte Protein monomer, d.h. nicht aggregiert, war.

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