Proteasen mit verbesserter Wasserhärtetoleranz

Die Erfindung betrifft Proteasen mit verbesserter Wasserhärtetoleranz und proteasehaltige Waschoder Reinigungsmittel.

Wasch- oder Reinigungsmittel, insbesondere Wasch- oder Reinigungsmittel für das maschinelle Geschirrspülen und die Textilreinigung, enthalten in der Regel neben den Gerüststoffen und Tensi- den als weiteren reinigungsaktiven Wirkstoff ein oder mehrere Enzyme.

Die am längsten etablierten und in praktisch allen modernen, leistungsfähigen Wasch- oder Reinigungsmitteln enthaltenen Enzyme sind Proteasen und hierunter insbesondere Serin-Proteasen, zu denen auch die Subtilasen zählen. Sie bewirken den Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Hierunter sind wiederum Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen, Subti- lopeptidasen, EC 3.4.21.62) besonders wichtig, welche aufgrund der katalytisch wirksamen Aminosäuren den Serin-Proteasen zugerechnet werden. Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen, das heißt, sie hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. Ihr pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen Bereich. Einen Überblick über diese Familie bietet beispielsweise der Artikel„Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in„Subtilisin enzymes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996. Subtilasen werden natürlicherweise von Mikroorganismen gebildet; hierunter sind insbesondere die von Bacillus-Spezies gebildeten und sekretierten Subtilisine als bedeutendste Gruppe innerhalb der Subtilasen zu erwähnen.

Beispiele für die in Wasch- oder Reinigungsmitteln bevorzugt eingesetzten Proteasen vom Subtilisin-Typ sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die alkalische Protease aus Bacillus lentus, insbesondere aus Bacillus lentus DSM 5483, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP® geführten Protease-Vari- anten ab. Weitere verwendbare Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® und Ovozyme® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime und Pro- perase® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme.

Mit zunehmender Wasserhärte sinkt im Allgemeinen die Waschleistung eines Waschmittels. So ist auch bei Waschmittelproteasen ein Leistungsverlust mit zunehmender Wasserhärte beobachtbar. Der Leistungsverlust kann durch Einarbeitung von Wasserhärte mindernden Substanzen, z.B. Phosphonate, Zitrate, etc., gemindert werden, was jedoch einen zusätzlichen Formulierungsaufwand bedeutet.

Für diverse polyanionische Substanzen wie z.B. Polyacrylate, poly-g-Glutamat etc., ist eine leis- tungssteigernde Wirkung auf Waschmittelproteasen beschrieben. Allerdings muss das entsprechende Polymer zusätzlich zur Protease einformuliert werden, was besonderen Aufwand und Kosten verursacht.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein einfach formulierbares System bereitzustellen, das den mit zunehmender Wasserhärte verbundenen Leistungsverlust bei Waschmittelproteasen verhindert oder zumindest verringert.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung einer durch kovalente Anknüpfung eines Polyanions modifizierten Waschmittelprotease, ein Protease-Polyanion-Fusions- protein.

Die erfindungsgemäße Modifikation verbessert die Wasserhärtetoleranz gegenüber dem Ausgangsmolekül, ohne dass zusätzlich zur Protease ein weiter Inhaltsstoff verändert werden muss.

Erfindungsgemäß modifizierbare Proteasen sind grundsätzlich alle in Wasch- oder Reinigungsmitteln einsetzbaren proteolytischen Enzyme, insbesondere Subtilasen, vorzugsweise Subtilasen, deren Wasch- bzw. Reinigungsleistung mindestens der von Savinase (SEQ ID NO. 2) oder BPN' (SEQ ID NO. 3) entspricht, wobei die Reinigungsleistung in einem Waschsystem bestimmt wird, das ein Waschmittel in einer Dosierung zwischen 4,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte sowie die Protease enthält, wobei die zu vergleichenden Proteasen konzentrationsgleich (bezogen auf aktives Protein) eingesetzt sind und die Reinigungsleistung gegenüber einer Blut-Anschmutzung auf Baumwolle, insbesondere gegenüber der Anschmutzung Blut auf Baumwolle: Produkt Nr. 1 1 1 erhältlich von der Firma Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St. Gallen, Schweiz, bestimmt wird durch Messung des Weißheitsgrades der gewaschenen Textilien, der Waschvorgang für 70 Minuten bei einer Temperatur von 40°C erfolgt und das Wasser eine Wasserhärte zwischen 15,5 und 16,5° (deutsche Härte) aufweist. Die Konzentration der Protease in dem für dieses Waschsystem bestimmten Waschmittel beträgt von 0,001-0, 15 Gew.-%, vorzugsweise von 0,0015-0,1 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,01 bis 0,075 Gew.-%, bezogen auf aktives Protein.

Ein bevorzugtes flüssiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3-0,5% Xanthan, 0,2-0,4% Anti-Schaummittel, 6-7% Glyce- rin, 0,3-0,5% Ethanol, 4-7% FAEOS (Fettalkoholethersulfat), 24-28% nichtionische Tenside, 1 % Borsäure, 1-2% Natriumeitrat (Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP (1 -Hydroxyethan-(1 ,1-di-phosphonsäure)), 0-0,4% PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0-0,05% optischer Aufheller, 0-0,001 % Farbstoff, Rest demineralisiertes Wasser. Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen Waschmittels zwischen 4,5 und 6,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 4,7, 4,9 oder 5,9 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 8 und pH 10,5, bevorzugt zwischen pH 8 und pH 9.

Ein bevorzugtes pulverförmiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 10% lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz), 1 ,5% C12-C18-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 2,0% C12-C18-Fettalkohol mit 7 EO, 20% Natri- umearbonat, 6,5% Natriumhydrogencarbonat, 4,0% amorphes Natriumdisilikat, 17% Natriumcarbo- nat-peroxohydrat, 4,0% TAED, 3,0% Polyacrylat, 1 ,0% Carboxymethylcellulose, 1 ,0% Phosphonat, 27% Natriumsulfat, Rest: Schauminhibitoren, optischer Aufheller, Duftstoffe. Bevorzugt beträgt die Dosierung des pulverförmigen Waschmittels zwischen 4,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise und besonders bevorzugt 4,7 Gramm pro Liter Waschflotte, oder 5,5, 5,9 oder 6,7 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 9 und pH 1 1 .

Im Rahmen der Erfindung erfolgt die Bestimmung der Reinigungsleistung bei 40°C unter Verwendung eines flüssigen Waschmittels wie vorstehend angegeben, wobei der Waschvorgang vorzugsweise für 70 Minuten erfolgt.

Der Weißheitsgrad, d.h. die Aufhellung der Anschmutzungen, als Maß für die Reinigungsleistung wird bevorzugt mit optischen Messverfahren bestimmt, bevorzugt photometrisch. Ein hierfür geeignetes Gerät ist beispielsweise das Spektrometer Minolta CM508d. Üblicherweise werden die für die Messung eingesetzten Geräte zuvor mit einem Weißstandard, bevorzugt einem mitgelieferten Weißstandard, kalibriert.

Eine besonders bevorzugte erfindungsgemäß modifizierbare Protease umfasst eine Aminosäuresequenz, die zu einer der in SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 5 angegebenen Aminosäuresequenzen über deren Gesamtlänge zu mindestens 80% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% und 99% identisch ist.

SEQ ID NO. 1 ist die Sequenz einer reifen (maturen) alkalischen Protease aus Bacillus lentus, die in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 an Position 99 die Aminosäure Glutaminsäure (E) aufweist.

Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Dieser Sequenzvergleich basiert auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. beispielsweise Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, DJ. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403- 410, und Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new genera- tion of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S.3389-3402) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie (vgl. beispielsweise Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31 , 3497-3500), T-Coffee (vgl. beispielsweise Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) oder Programme, die auf diesen Programmen beziehungsweise Algorithmen basieren. In der vorliegenden Patentanmeldung wurden alle Sequenzvergleiche (A- lignments) mit dem Computer-Programm Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Fa- raday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Standardparametern erstellt, dessen AlignX-Modul für die Sequenzvergleiche auf ClustalW basiert.

Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben oder in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Homologe oder identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide oder Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Proteins essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben beziehen sich Identitäts- oder Homologieangaben in der vorliegenden Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresäuresequenz.

Das erfindungsgemäß zur Modifikation der Protease einsetzbare Polyanion (mehrfach anionisches Polymer) ist bevorzugtermaßen ein aus poly-Aminosäuren aufgebautes Biopolymer, insbesondere ein vollständig oder überwiegend aus sauren Aminosäuren (Asp, Glu) aufgebautes Biopolymer mit einer negativen Nettoladung (Formalladung), vorzugsweise im Bereich um pH 7,5. Man bestimmt die Formalladung, indem man die sauren (negativ geladenen) Aminosäuren des Biopolymers zählt und davon die Zahl der basischen (positiv geladenen) Aminosäuren abzieht. Ein erfindungsgemäß einsetzbares Polyanion kann also ausschließlich aus sauren Aminosäuren bestehen, aber auch neutrale oder basische Aminosäuren umfassen, solange die Nettoladung negativ bleibt. Bevorzugtermaßen besteht das einsetzbare Polyanion zu mindestens 70%, mehr bevorzugt zu mindestens 80% und besonders bevorzugt zu mindestens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, oder 100% aus sauren Aminosäuren.

Das Polyanion kann N- oder C-terminal mit der Protease verknüpft oder an Stelle eines Loops des Proteasemoleküls in dieses inseriert sein, wobei die C-terminale Verknüpfung ganz besonders bevorzugt ist. Bevorzugt ist die kovalente Anknüpfung durch eine Peptidbindung. Das Polyanion weist vorzugsweise eine Länge von 10 bis 1000, insbesondere 10 bis 500, bevorzugt 10 bis 100, besonders bevorzugt 20 bis 50, ganz besonders bevorzugt 25 bis 40 und am meisten bevorzugt etwa 30 Aminosäureresten, insbesondere Aspartat- und / oder Glutamat-Resten auf.

Das Polyanion kann erfindungsgemäß zusammen mit der Protease coexprimiert, oder nach der Expression der Protease an diese angehängt werden. Bevorzugt ist die Coexpression von Protease und Polyanion, wie weiter unten beschrieben, da ein nachträgliches Anhängen einen zusätzlichen Arbeitsschritt erfordert.

Ein Protease-Polyanion-Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung ist somit eine durch kovalente Anknüpfung eines Polyanions modifizierte Protease.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäße modifizierte Protease codiert, sowie ein Vektor enthaltend eine solche Nukleinsäure, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.

Hierbei kann es sich DNA- oder RNA-Moleküle handeln. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Insbesondere bei DNA-Molekülen sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codons, also Basentriplets, für die gleichen Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Aminosäuresequenz von mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren codiert werden kann. Auf Grund dieser Degeneriertheit des genetischen Codes sind sämtliche Nukleinsäuresequenzen in diesen Erfindungsgegenstand mit eingeschlossen, die eine der vorstehend beschriebenen Proteasen codieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleinsäuresequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer Aminosäuresequenz für diese Aminosäuresequenz codierende Nukleinsäuren problemlos ermitteln. Weiterhin können bei erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ein oder mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt sein. Dieser Aspekt bezieht sich insbesondere auf die heterologe Expression der erfindungsgemäßen Enzyme. So besitzt jeder Organismus, beispielsweise eine Wirtszelle eines Produktionsstammes, eine bestimmte Codon-Verwendung. Unter Codon-Verwendung wird die Übersetzung des genetischen Codes in Aminosäuren durch den jeweiligen Organismus verstanden. Es kann zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der Nukleinsäure liegenden Codons in dem Organismus einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNA-Molekülen gegenüberstehen. Obwohl für die gleiche Aminosäure codierend führt das dazu, dass in dem Organismus ein Codon weniger effizient translatiert wird als ein synonymes Codon, das für dieselbe Aminosäure codiert. Auf Grund des Vorliegens einer höheren Anzahl von tRNA-Molekülen für das synonyme Codon kann dieses in dem Organismus effizienter translatiert werden.

Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3. Edition Cold Spring Laboratory Press, bekannt.

Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten. Sie vermögen diese in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkuläre genetische Elemente. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen Vektor kloniert. Zu den Vektoren zählen beispielsweise solche, deren Ursprung bakterielle Plasmide, Viren oder Bacteriophagen sind, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Sie können extrachromosomal als eigene Einheiten vorliegen oder in ein Chromosom oder chromosomale DNA integrieren.

Expressionsvektoren umfassen Nukleinsäuresequenzen, die sie dazu befähigen, in den sie enthaltenden Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen, besonders bevorzugt Bakterien, zu replizieren und dort eine enthaltene Nukleinsäure zur Expression zu bringen. Die Expression wird insbesondere von dem oder den Promotoren beeinflusst, welche die Transkription regulieren. Prinzipiell kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor der zu exprimierenden Nukleinsäure lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle oder auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle. Im vorliegenden Fall wird zumindest ein Promotor für die Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Verfügung gestellt und für deren Expression genutzt. Expressionsvektoren können ferner regulierbar sein, beispielsweise durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte der sie enthaltenen Wirtszellen oder durch Zugabe von bestimmten Substanzen, insbesondere Aktivatoren der Genexpression. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist das Galactose-Derivat Isopro- pyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG), welches als Aktivator des bakteriellen Lactose-Operons (lac- Operons) verwendet wird. Im Gegensatz zu Expressionsvektoren wird die enthaltene Nukleinsäure in Klonierungsvektoren nicht exprimiert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht menschliche Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor beinhaltet, oder die eine erfindungsgemäße modifizierte Protease beinhaltet, insbesondere eine, die die Protease in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert. Bevorzugt wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßer Vektor in einen Mikroorganismus transformiert, der dann eine erfindungsgemäße Wirtszelle darstellt. Alternativ können auch einzelne Komponenten, d.h. Nukleinsäure-Teile o- der -Fragmente einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure derart in eine Wirtszelle eingebracht werden, dass die dann resultierende Wirtszelle eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Dieses Vorgehen eignet sich besonders dann, wenn die Wirtszelle bereits einen oder mehrere Bestandteile einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Vektors enthält und die weiteren Bestandteile dann entsprechend ergänzt werden. Verfahren zur Transformation von Zellen sind im Stand der Technik etabliert und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische o- der eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit der Nukleinsäure oder dem Vektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Ferner zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbar- keit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sezernieren das (transgen) exprimierte Protein in das die Wirtszellen umgebende Medium. Ferner können die Proteasen von den sie produzierenden Zellen nach deren Herstellung modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche posttranslationale Modifikationen können die Protease funktionell beeinflussen.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Vektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine wirtschaftliche Produktion der erfindungsgemäßen Proteine. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist IPTG wie vorstehend beschrieben.

Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Kultivierungsverfahren oder Herstellungsverfahren etabliert werden. Zudem verfügt der Fachmann bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf usw., gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein.

Bei gramnegativen Bakterien wie beispielsweise Escherichia coli wird eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sezerniert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Ferner können auch gramnegative Bakterien so ausgestaltet werden, dass sie die exprimierten Proteine nicht nur in den periplasmatischen Raum, sondern in das das Bakterium umgebende Medium ausschleusen. Grampositive Bakterien wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sezernierte Proteine sogleich in das die Bakterien umgebende Medium, in der Regel das Nährmedium, abgegeben werden, aus welchem sich die exprimierten Proteine aufreinigen lassen. Sie können aus dem Medium direkt isoliert oder weiter prozessiert werden. Zudem sind grampositive Bakterien mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Enzyme, so dass sie über eine ähnliche Codon-Verwendung verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist. Erfindungsgemäße Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder noch andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere auch um solche Wirtszellen handeln, die mehrere Proteine oder Enzyme transgen exprimieren.

Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen, insbesondere auf alle fermentierbaren Mikroorganismen, besonders bevorzugt auf solche der Gattung Bacillus, anwendbar und führt dazu, dass sich durch den Einsatz solcher Mikroorganismen erfindungsgemäße Proteine herstellen lassen. Solche Mikroorganismen stellen dann Wirtszellen im Sinne der Erfindung dar.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von E- scherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloli- quefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clau- sii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas mal- tophilia.

Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryontische Zelle sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Im Gegensatz zu proka- ryontischen Zellen sind eukaryontische Zellen in der Lage, das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität eines exprimierten Proteins wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen oder Lipasen, kann vorteilhaft sein. Ferner können sich beispielsweise thermophile pilzliche Expressionssysteme besonders zur Expression temperaturbeständiger Proteine oder Varianten eignen.

Die erfindungsgemäßen Wirtszellen werden in üblicher weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig aus dem Medium das gebildete Protein entnommen werden kann.

Erfindungsgemäße Wirtszellen werden bevorzugt verwendet, um erfindungsgemäße modifizierte Proteasen herzustellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer Protease umfassend

a) Kultivieren einer erfindungsgemäßen Wirtszelle

b) Isolieren der Protease aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.

Dieser Erfindungsgegenstand umfasst bevorzugt Fermentationsverfahren. Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, beispielsweise der erfindungsgemäßen Protease. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem entsprechenden Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Protease beruhen, stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.

Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen insbesondere in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte als auch in der Zellmasse beziehungsweise Trockenmasse und/oder insbesondere in der Aktivität der interessierenden Protease erreicht werden. Ferner kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden.

Die hergestellte Protease kann aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Ein solches Fermentationsverfahren ist gegenüber einer Isolation der Protease aus der Wirtszelle, d.h. einer Produktaufbereitung aus der Zellmasse (Trockenmasse) bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung von geeigneten Wirtszellen oder von einem oder mehreren geeigneten Sekretionsmarkern oder -mechanismen und/oder Transportsystemen, damit die Wirtszellen die Protease in das Fermentationsmedium sezernieren. Ohne Sekretion kann alternativ die Isolation der Protease aus der Wirtszelle, d.h. eine Aufreinigung derselben aus der Zellmasse, erfolgen, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder durch chromatographische Reinigung.

Alle vorstehend ausgeführten Sachverhalte können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße modifizierte Proteasen herzustellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine erfindungsgemäße modifizierte Protease wie vorstehend beschrieben enthält. Bevorzugt ist das Mittel ein Wasch- oder Reinigungsmittel. Da erfindungsgemäße modifizierte Proteasen vorteilhafte Reinigungsleistungen insbesondere an Blut-haltigen Anschmutzungen aufweisen, sind die Mittel insbesondere zur Entfernung von solchen Anschmutzungen geeignet und vorteilhaft.

Zu diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Handwäsche beziehungsweise -reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder, für die die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet wird, also neben manuellen und maschinellen Geschirrspülmitteln beispielsweise auch Scheuermittel, Glasreiniger, WC-Duftspüler, usw. Zu den Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung zählen ferner Waschhilfsmittel, die bei der manuellen oder maschinellen Textilwäsche zum eigentlichen Waschmittel hinzudosiert werden, um eine weitere Wirkung zu erzielen. Ferner zählen zu Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung auch Textilvor- und Nachbehandlungsmittel, also solche Mittel, mit denen das Wäschestück vor der eigentlichen Wäsche in Kontakt gebracht wird, beispielsweise zum Anlösen hartnäckiger Verschmutzungen, und auch solche Mittel, die in einem der eigentlichen Textilwäsche nachgeschalteten Schritt dem Waschgut weitere wünschenswerte Eigenschaften wie angenehmen Griff, Knitterfreiheit oder geringe statische Aufladung verleihen. Zu letztgenannten Mittel werden u.a. die Weichspüler gerechnet.

Der auf aktives Protein bezogene Gewichtsanteil der erfindungsgemäßen Protease am Gesamtgewicht erfindungsgemäßer Wasch- oder Reinigungsmittel beträgt vorzugsweise 0,005 bis 1 ,0 Gew.- %, bevorzugt 0,01 bis 0,5 Gew.-% und insbesondere 0,02 bis 0,2 Gew.-%. Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'- Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751-766) bestimmt werden. Die Bestimmung der Aktivproteinkonzentration erfolgt diesbezüglich über eine Titration der aktiven Zentren unter Verwendung eines geeigneten irreversiblen Inhibitors (für Proteasen beispielsweise Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) und Bestimmung der Restaktivität (vgl. M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966), S. 5890-5913).

Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel können weitere Enzyme enthalten. Als weitere Enzyme einsetzbar sind beispielsweise Lipasen oder Cutinasen, insbesondere wegen ihrer Triglycerid-spaltenden Aktivitäten, aber auch, um aus geeigneten Vorstufen in situ Persäuren zu erzeugen. Hierzu gehören beispielsweise die ursprünglich aus Humicola lanuginosa (Thermomy- ces lanuginosus) erhältlichen, beziehungsweise weiterentwickelten Lipasen, insbesondere solche mit dem Aminosäureaustausch D96L. Hierzu gehören beispielsweise die ursprünglich aus Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) erhältlichen, beziehungsweise weiterentwickelten Lipasen, insbesondere solche mit einem oder mehreren der folgenden Aminosäureaustausche ausgehend von der genannten Lipase in den Positionen D96L, T213R und/oder N233R., besonders bevorzugt T213R und N233R. Des weiteren sind beispielsweise die Cutinasen einsetzbar, die ursprünglich aus Fusarium solani pisi und Humicola insolens isoliert worden sind. Einsetzbar sind weiterhin Lipasen, beziehungsweise Cutinasen, deren Ausgangsenzyme ursprünglich aus Pseudomonas mendocina und Fusarium solanii isoliert worden sind.

Die erfindungsgemäßen Mittel können auch Cellulasen oder Hemicellulasen wie Mannanasen, Xanthanlyasen, Pektinlyasen (=Pektinasen), Pektinesterasen, Pektatlyasen, Xyloglucanasen (=Xylanasen), Pullulanasen oder ß-Glucanasen enthalten.

Zur Erhöhung der bleichenden Wirkung können erfindungsgemäß Oxidoreduktasen, beispielsweise Oxidasen, Oxygenasen, Katalasen, Peroxidasen, wie Halo-, Chloro-, Bromo-, Lignin-, Glucose- o- der Mangan-peroxidasen, Dioxygenasen oder Laccasen (Phenoloxidasen, Polyphenoloxidasen) eingesetzt werden. Vorteilhafterweise werden zusätzlich vorzugsweise organische, besonders bevorzugt aromatische, mit den Enzymen wechselwirkende Verbindungen zugegeben, um die Aktivität der betreffenden Oxidoreduktasen zu verstärken (Enhancer) oder um bei stark unterschiedlichen Redoxpotentialen zwischen den oxidierenden Enzymen und den Anschmutzungen den Elekt- ronenfluss zu gewährleisten (Mediatoren).

Als weitere Enzyme einsetzbar sind auch Amylasen. Für Amylasen können synonyme Begriffe verwendet werden, beispielsweise 1 ,4-alpha-D-Glucan-Glucanohydrolase oder Glycogenase. Erfindungsgemäß bevorzugte Amylasen sind a-Amylasen. Entscheidend dafür, ob ein Enzym eine o Amylase im Sinne der Erfindung ist, ist deren Fähigkeit zur Hydrolyse von a(1-4)-Glykosidbindun- gen in der Amylose der Stärke.

Beispielhafte Amylasen sind die α-Amylasen aus Bacillus licheniformis, aus Bacillus amyloliquefa- ciens oder aus Bacillus stearothermophilus sowie insbesondere auch deren für den Einsatz in Wasch- oder Reinigungsmitteln verbesserte Weiterentwicklungen. Das Enzym aus Bacillus licheniformis ist von dem Unternehmen Novozymes unter dem Namen Termamyl® und von dem Unternehmen Danisco/Genencor unter dem Namen Purasta DST erhältlich. Weiterentwicklungsprodukte dieser a-Amylase sind von dem Unternehmen Novozymes unter den Handelsnamen Du- ramyl® und Termamy Dultra, von dem Unternehmen Danisco/Genencor unter dem Namen Purastar®OxAm und von dem Unternehmen Daiwa Seiko Inc., Tokyo, Japan, als Keistase® erhältlich. Die α-Amylase von Bacillus amyloliquefaciens wird von dem Unternehmen Novozymes unter dem Namen BAN® vertrieben, und abgeleitete Varianten von der α-Amylase aus Bacillus stea- rothermophilus unter den Namen BSG® und Novamyl®, ebenfalls von dem Unternehmen Novozymes. Desweiteren sind für diesen Zweck die α-Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) und die Cyclodextrin-Glucanotransferase (CGTase) aus Bacillus agaradherens (DSM 9948) hervorzuheben. Ebenso sind Fusionsprodukte aller genannten Moleküle einsetzbar. Darüber hinaus sind die unter den Handelsnamen Fungamyl® von dem Unternehmen Novozymes erhältlichen Weiterentwicklungen der α-Amylase aus Aspergillus niger und A. oryzae geeignet. Weitere vorteilhaft einsetzbare Handelsprodukte sind beispielsweise die Amylase-LT® und Stainzyme® oder Stainzyme ultra® bzw. Stainzyme plus®, letztere ebenfalls von dem Unternehmen Novozymes. Auch durch Punktmutationen erhältliche Varianten dieser Enzyme können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Besonders bevorzugte Amylasen sind offenbart in den internationalen Offenlegungsschriften WO 00/60060, WO 03/00271 1 , WO 03/054177 und WO07/079938, auf deren Offenbarung daher ausdrücklich verwiesen wird bzw. deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt daher ausdrücklich in die vorliegende Patentanmeldung mit einbezogen wird.

Der auf aktives Protein bezogene Gewichtsanteil der weiteren Enzyme am Gesamtgewicht bevorzugter Wasch- oder Reinigungsmittels beträgt vorzugsweise 0,0005 bis 1 ,0 Gew.-%, bevorzugt 0,001 bis 0,5 Gew.-% und insbesondere 0,002 bis 0,2 Gew.-%.

Die Wasch- oder Reinigungsmittel können neben den zuvor beschriebenen Inhaltsstoffen reinigungsaktive Substanzen enthalten, wobei Substanzen aus der Gruppe der Tenside, Gerüststoffe, Polymere, Glaskorrosionsinhibitoren, Korrosionsinhibitoren, Duftstoffe und Parfümträger bevorzugt werden. Diese bevorzugten Inhaltsstoffe werden in der Folge näher beschrieben.

Ein bevorzugter Bestandteil der erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel sind die nichtionischen Tenside, wobei nichtionische Tenside der allgemeinen Formel R -CH(OH)CH20- (AO)w-(AO)x-(A"0) _y -(A'"0)z-R ² , in der

R für einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ein- bzw. mehrfach ungesättigten C6-24-Alkyl- oder -Alkenylrest steht;

R ² für einen linearen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 2 bis 26 Kohlenstoffatomen steht;

A, Α', A" und A'" unabhängig voneinander für einen Rest aus der Gruppe

-CH2CH2, -CH2CH2-CH2, -CH ₂ -CH(CH ₃ ), -CH2-CH2-CH2-CH2, -CH ₂ -CH(CH ₃ )-CH ₂ -, -CH2-

CH(CH ₂ -CH ₃ ) stehen,

w, x, y und z für Werte zwischen 0,5 und 120 stehen, wobei x, y und/oder z auch 0 sein können bevorzugt sind. Durch den Zusatz der vorgenannten nichtionischen Tenside der allgemeinen Formel R - CH(OH)CH20-(AO)w-(AO)x-(A"0)y-(A'"0)z-R ² , nachfolgend auch als„Hydroxymischether" bezeichnet, kann die Reinigungsleistung erfindungsgemäßer Enzym-haltiger Zubereitungen deutlich verbessert werden und zwar sowohl im Vergleich zu Tensid-freien Systemen wie auch im Vergleich zu Systemen, die alternative nichtionischen Tenside, beispielsweise aus der Gruppe der polyalkoxy- lierten Fettalkohole enthalten.

Durch den Einsatz dieser nichtionischen Tenside mit einer oder mehreren freien Hydroxylgruppe an einem oder beiden endständigen Alkylreste kann die Stabilität der in den erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittelzubereitungen enthaltenen Enzyme deutlich verbessert werden.

Bevorzugt werden insbesondere solche endgruppenverschlossene poly(oxyalkylierten) Niotenside, die, gemäß der Formel R 0[CH2CH20]xCH ₂ CH(OI-l)R ² , neben einem Rest R , welcher für lineare oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte, aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffreste mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 4 bis 22 Kohlenstoffatomen steht, weiterhin einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffrest R ² mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen aufweisen, wobei x für Werte zwischen 1 und 90, vorzugsweise für Werte zwischen 30 und 80 und insbesondere für Werte zwischen 30 und 60 steht.

Besonders bevorzugt sind Tenside der Formel R 0[CH2CH(CH3)0]x[CH2CH20]yCH2CH(OH)R ² , in der R für einen linearen oder verzweigten aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit 4 bis 18 Kohlenstoffatomen oder Mischungen hieraus steht, R ² einen linearen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 2 bis 26 Kohlenstoffatomen oder Mischungen hieraus bezeichnet und x für Werte zwischen 0,5 und 1 ,5 sowie y für einen Wert von mindestens 15 steht.

Zur Gruppe dieser nichtionischen Tenside zählen beispielsweise die C2-26 Fettalkohol-(PO)i-(EO)is- 4o-2-hydroxyalkylether, insbesondere auch die Ce-io Fettalkohol-(PO)i-(EO)22-2-hydroxydecylether.

Besonders bevorzugt werden weiterhin solche endgruppenverschlossene poly(oxyalkylierten) Niotenside der Formel R 0[CH2CH20]x[CH2CH(R ³ )0] _y CH ₂ CH(OH)R ² , in der R und R ² unabhängig voneinander für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ein- bzw. mehrfach ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit 2 bis 26 Kohlenstoffatomen steht, R ³ unabhängig voneinander ausgewählt ist aus -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2-CH3, -CH(CH ₃ )2, vorzugsweise jedoch für -CH ₃ steht, und x und y unabhängig voneinander für Werte zwischen 1 und 32 stehen, wobei Niotenside mit R ³ = -CH3 und Werten für x von 15 bis 32 und y von 0,5 und 1 ,5 ganz besonders bevorzugt sind.

Weitere bevorzugt einsetzbare Niotenside sind die endgruppenverschlossenen poly(oxyalkylierten) Niotenside der Formel R 0[CH ₂ CH(R ³ )0]x[CH2]kCH(OH)[CH2]jOR ² , in der R und R ² für lineare o- der verzweigte, gesättigte oder ungesättigte, aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffreste mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen stehen, R ³ für H oder einen Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl, n- Butyl-, 2-Butyl- oder 2-Methyl-2-Butylrest steht, x für Werte zwischen 1 und 30, k und j für Werte zwischen 1 und 12, vorzugsweise zwischen 1 und 5 stehen. Wenn der Wert x > 2 ist, kann jedes R ³ in der oben stehenden Formel RO[CH ₂ CH(R ³ )0]x[CH2]kCH(OH)[CH2]jOR ² unterschiedlich sein. R und R ² sind vorzugsweise lineare oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte, aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffreste mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, wobei Reste mit 8 bis 18 C- Atomen besonders bevorzugt sind. Für den Rest R ³ sind H, -Chta oder -CH ₂ CH3 besonders bevorzugt. Besonders bevorzugte Werte für x liegen im Bereich von 1 bis 20, insbesondere von 6 bis 15.

Wie vorstehend beschrieben, kann jedes R ³ in der oben stehenden Formel unterschiedlich sein, falls x > 2 ist. Hierdurch kann die Alkylenoxideinheit in der eckigen Klammer variiert werden. Steht x beispielsweise für 3, kann der Rest R ³ ausgewählt werden, um Ethylenoxid- (R ³ = H) oder Propy- lenoxid- (R ³ = Ch ) Einheiten zu bilden, die in jedweder Reihenfolge aneinandergefügt sein können, beispielsweise (EO)(PO)(EO), (EO)(EO)(PO), (EO)(EO)(EO), (PO)(EO)(PO), (PO)(PO)(EO) und (PO)(PO)(PO). Der Wert 3 für x ist hierbei beispielhaft gewählt worden und kann durchaus größer sein, wobei die Variationsbreite mit steigenden x-Werten zunimmt und beispielsweise eine große Anzahl (EO)-Gruppen, kombiniert mit einer geringen Anzahl (PO)-Gruppen einschließt, oder umgekehrt.

Besonders bevorzugte endgruppenverschlossene poly(oxyalkylierte) Alkohole der oben stehenden Formel weisen Werte von k = 1 und j = 1 auf, so dass sich die vorstehende Formel zu

R 0[CH2CH(R ³ )0]xCH ₂ CH(OH)CH ₂ OR ² vereinfacht. In der letztgenannten Formel sind R\ R ² und R ³ wie oben definiert und x steht für Zahlen von 1 bis 30, vorzugsweise von 1 bis 20 und insbesondere von 6 bis 18. Besonders bevorzugt sind Tenside, bei denen die Reste R und R ² 9 bis 14 C- Atome aufweisen, R ³ für H steht und x Werte von 6 bis 15 annimmt.

Als besonders wirkungsvoll haben sich schließlich die nichtionischen Tenside der allgemeine Formel R -CH(OH)CH ₂ 0-(AO)w-R ² erwiesen, in der

R für einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ein- bzw. mehrfach ungesättigten C6- ₂ 4-Alkyl- oder -Alkenylrest steht;

R ² für einen linearen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 2 bis 26 Kohlenstoffatomen steht;

- A für einen Rest aus der Gruppe CH ₂ CH ₂ , -CH ₂ CH ₂ -CH ₂ , -CH ₂ -CH(CH ₃ ) steht, und

w für Werte zwischen 1 und 120, vorzugsweise 10 bis 80, insbesondere 20 bis 40 steht Zur Gruppe dieser nichtionischen Tenside zählen beispielsweise die C4- ₂₂ Fettalkohol-(EO)io-so-2- hydroxyalkylether, insbesondere auch die Cs-i ₂ Fettalkohol-(EO) ₂₂ -2-hydroxydecylether und die C4- ₂₂ Fettalkohol-(EO)4o-8o-2-hydroxyalkylether Bevorzugte Wasch- oder Reinigungsmittel sind dadurch gekennzeichnet, dass das Wasch- oder Reinigungsmittel mindestens ein nichtionisches Tensid, vorzugsweise ein nichtionisches Tensid aus der Gruppe der Hydroxymischether, enthält, wobei der Gewichtsanteil des nichtionischen Ten- sids am Gesamtgewicht des Wasch- oder Reinigungsmittels vorzugsweise 0,2 bis 10 Gew.-%, bevorzugt 0,4 bis 7,0 Gew.-% und insbesondere 0,6 bis 6,0 Gew.-% beträgt.

Bevorzugte erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel zur Verwendung in maschinellen Geschirrspülverfahren enthalten neben den zuvor beschriebenen nichtionischen Tensiden weitere Tenside, insbesondere amphotere Tenside. Der Anteil anionischer Tenside am Gesamtgewicht dieser Wasch- oder Reinigungsmittel ist jedoch vorzugsweise begrenzt. So sind bevorzugte maschinelle Geschirrspülmittel dadurch gekennzeichnet, dass diese bezogen auf ihr Gesamtgewicht weniger als 5, 0 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 3,0 Gew.-%, besonders bevorzugt weniger als 2,0 Gew.-% Aniontensid enthalten. Auf den Einsatz von anionischen Tensiden in größerer Menge wird dabei insbesondere zur Vermeidung einer übermäßigen Schaumentwicklung verzichtet.

Ein weiterer bevorzugter Bestandteil erfindungsgemäßer Wasch- oder Reinigungsmittel sind Komplexbildner. Besonders bevorzugte Komplexbildner sind die Phosphonate. Die komplexbildenden Phosphonate umfassen neben der 1-Hydroxyethan-1 , 1-diphosphonsäure eine Reihe unterschiedlicher Verbindungen wie beispielsweise Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure) (DTPMP). In dieser Anmeldung bevorzugt sind insbesondere Hydroxyalkan- bzw. Aminoalkanphosphonate. Unter den Hydroxyalkanphosphonaten ist das 1-Hydroxyethan-1 ,1-diphosphonat (HEDP) von besonderer Bedeutung als Cobuilder. Es wird vorzugsweise als Natriumsalz eingesetzt, wobei das Dinatriumsalz neutral und das Tetranatriumsalz alkalisch (pH 9) reagiert. Als Aminoalkanphosphonate kommen vorzugsweise Ethylendiamintetramethylenphosphonat (EDTMP), Diethylentriamin- pentamethylenphosphonat (DTPMP) sowie deren höhere Homologe in Frage. Sie werden vorzugsweise in Form der neutral reagierenden Natriumsalze, z. B. als Hexanatriumsalz der EDTMP bzw. als Hepta- und Octa-Natriumsalz der DTPMP, eingesetzt. Als Builder wird dabei aus der Klasse der Phosphonate bevorzugt HEDP verwendet. Die Aminoalkanphosphonate besitzen zudem ein ausgeprägtes Schwermetallbindevermogen. Dementsprechend kann es, insbesondere wenn die Mittel auch Bleiche enthalten, bevorzugt sein, Aminoalkanphosphonate, insbesondere DTPMP, einzusetzen, oder Mischungen aus den genannten Phosphonaten zu verwenden.

Ein im Rahmen dieser Anmeldung bevorzugtes Wasch- oder Reinigungsmittel enthält ein oder mehrere Phosphonat(e) aus der Gruppe

a) Aminotrimethylenphosphonsäure (ATMP) und/oder deren Salze;

b) Ethylendiamintetra(methylenphosphonsäure) (EDTMP) und/oder deren Salze;

c) Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure) (DTPMP) und/oder deren Salze;

d) 1-Hydroxyethan-1 , 1-diphosphonsäure (HEDP) und/oder deren Salze;

e) 2-Phosphonobutan-1 ,2,4-tricarbonsäure (PBTC) und/oder deren Salze; f) Hexamethylendiamintetra(methylenphosphonsäure) (HDTMP) und/oder deren Salze; g) Nitrilotri(methylenphosphonsäure) (NTMP) und/oder deren Salze.

Besonders bevorzugt werden Wasch- oder Reinigungsmittel, welche als Phosphonate 1 -Hydro- xyethan-1 ,1-diphosphonsäure (HEDP) oder Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure) (DTPMP) enthalten. Selbstverständlich können die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel zwei oder mehr unterschiedliche Phosphonate enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel sind dadurch gekennzeichnet, dass das Wasch- oder Reinigungsmittel mindestens einen Komplexbildner aus der Gruppe der Phosphonate, vorzugsweise 1-Hydro- xyethan-1 ,1-diphosphonat, enthält, wobei der Gewichtsanteil des Phosphonat am Gesamtgewicht des Wasch- oder Reinigungsmittels vorzugsweise 0, 1 und 8,0 Gew.-%, bevorzugt 0,2 und 5,0 Gew.-% und insbesondere 0,5 und 3,0 Gew.-% beträgt.

Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel enthalten weiterhin vorzugsweise Gerüststoff. Zu den Gerüststoffen zählen dabei insbesondere die Silikate, Carbonate, organische Cobuilder und -wo keine ökologischen Vorurteile gegen ihren Einsatz bestehen- auch die Phosphate.

Unter der Vielzahl der kommerziell erhältlichen Phosphate haben die Alkalimetallphosphate unter besonderer Bevorzugung von Pentanatriumtriphosphat, NasPsO-io (Natriumtripolyphosphat) bzw. Pentakaliumtriphosphat, K5P3O10 (Kaliumtripolyphosphat) für die erfindungsgemäßen Mittel die größte Bedeutung. Werden im Rahmen der vorliegenden Anmeldung Phosphate als reinigungsaktive Substanzen in dem Wasch- oder Reinigungsmittel eingesetzt, so enthalten bevorzugte Mittel diese(s) Phosphat(e), vorzugsweise Pentakaliumtriphosphat, wobei der Gewichtsanteil des Phosphats am Gesamtgewicht des Wasch- oder Reinigungsmittels vorzugsweise 5,0 und 40 Gew.-%, bevorzugt 10 und 30 Gew.-% und insbesondere 12 und 25 Gew.-% beträgt.

Als organische Cobuilder sind insbesondere Polycarboxylate / Polycarbonsäuren, polymere Poly- carboxylate, Asparaginsäure, Polyacetale, Dextrine, weitere organische Cobuilder sowie Phosphonate zu nennen. Diese Stoffklassen werden nachfolgend beschrieben.

Brauchbare organische Gerüstsubstanzen sind beispielsweise die in Form der freien Säure und/oder ihrer Natriumsalze einsetzbaren Polycarbonsäuren, wobei unter Polycarbonsäuren solche Carbonsäuren verstanden werden, die mehr als eine Säurefunktion tragen. Beispielsweise sind dies Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Zuckersäuren, Aminocarbonsäuren, Nitrilotriessigsäure (NTA), sofern ein derartiger Einsatz aus ökologischen Gründen nicht zu beanstanden ist, sowie Mischungen aus diesen. Die freien Säuren besitzen neben ihrer Builderwirkung typischerweise auch die Eigenschaft einer Säuerungskomponente und dienen somit auch zur Einstellung eines niedrigeren und milderen pH-Wertes von Wasch- oder Reinigungsmitteln. Insbesondere sind hierbei Citronensäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Gluconsäure und beliebige Mischungen aus diesen zu nennen. Mit besonderem Vorzug wird als Gerüstsubstanz die Citronensäure oder Salze der Citronensäure eingesetzt. Weitere besonders bevorzugte Gerüstsubstanzen sind ausgewählt aus Methylglycin- diessidsäure (MGDA), Glutaminsäurediacetat (GLDA), Asparaginsäurediacetat (ASDA), Hydro- xyethyliminodiacetat (HEIDA), Iminodisuccinat (IDS) und Ethylendiamindisuccinat (EDDS), Car- boxymethylinulin und Polyaspartat.

Als Gerüststoffe sind weiter polymere Polycarboxylate geeignet, dies sind beispielsweise die Alkalimetallsalze der Polyacrylsäure oder der Polymethacrylsäure, beispielsweise solche mit einer relativen Molekülmasse von 500 bis 70000 g/mol.

Bei den für polymere Polycarboxylate angegebenen Molmassen handelt es sich im Sinne dieser Schrift um gewichtsmittlere Molmassen M _w der jeweiligen Säureform, die grundsätzlich mittels Gel- permeationschromatographie (GPC) bestimmt wurden, wobei ein UV-Detektor eingesetzt wurde. Die Messung erfolgte dabei gegen einen externen Polyacrylsäure-Standard, der aufgrund seiner strukturellen Verwandtschaft mit den untersuchten Polymeren realistische Molgewichtswerte liefert. Diese Angaben weichen deutlich von den Molgewichtsangaben ab, bei denen Polystyrolsulfonsäu- ren als Standard eingesetzt werden. Die gegen Polystyrolsulfonsäuren gemessenen Molmassen sind in der Regel deutlich höher als die in dieser Schrift angegebenen Molmassen.

Geeignete Polymere sind insbesondere Polyacrylate, die bevorzugt eine Molekülmasse von 2000 bis 20000 g/mol aufweisen. Aufgrund ihrer überlegenen Löslichkeit können aus dieser Gruppe wiederum die kurzkettigen Polyacrylate, die Molmassen von 2000 bis 10000 g/mol, und besonders bevorzugt von 3000 bis 5000 g/mol, aufweisen, bevorzugt sein.

Geeignet sind weiterhin copolymere Polycarboxylate, insbesondere solche der Acrylsäure mit Me- thacrylsäure und der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Maleinsäure. Als besonders geeignet haben sich Copolymere der Acrylsäure mit Maleinsäure erwiesen, die 50 bis 90 Gew.-% Acrylsäure und 50 bis 10 Gew.-% Maleinsäure enthalten. Ihre relative Molekülmasse, bezogen auf freie Säuren, beträgt im allgemeinen 2000 bis 70000 g/mol, vorzugsweise 20000 bis 50000 g/mol und insbesondere 30000 bis 40000 g/mol.

Auch Oxydisuccinate und andere Derivate von Disuccinaten, vorzugsweise Ethylendiamindisuccinat, sind weitere geeignete Cobuilder. Dabei wird Ethylendiamin-N,N ^' -disuccinat (EDDS) bevorzugt in Form seiner Natrium- oder Magnesiumsalze verwendet. Weiterhin bevorzugt sind in diesem Zusammenhang auch Glycerindisuccinate und Glycerintrisuccinate. Zur Verbesserung der Reinigungsleistung und/oder zur Einstellung der Viskosität enthalten bevorzugte Wasch- oder Reinigungsmittel mindestens ein hydrophob modifiziertes Polymer, vorzugsweise ein hydrophob modifziertes Carbonsäuregruppen-haltiges Polymer, wobei der Gewichtsanteil des hydrophob modifizierten Polymers am Gesamtgewicht des Wasch- oder Reinigungsmittels vorzugsweise 0, 1 bis 10 Gew.-%, bevorzugt zwischen 0,2 und 8,0 Gew.-% und insbesondere 0,4 bis 6,0 Gew.-% beträgt.

In Ergänzung zu den zuvor beschriebenen Gerüststoffen können in dem Wasch- oder Reinigungsmittel reinigungsaktive Polymere enthalten sein. Der Gewichtsanteil der reinigungsaktiven Polymere am Gesamtgewicht erfindungsgemäßer maschineller Wasch- oder Reinigungsmittel beträgt vorzugsweise 0,1 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,0 bis 15 Gew.-% und insbesondere 2,0 bis 12 Gew.-%.

Als reinigungsaktive Polymere werden vorzugsweise Sulfonsäuregruppen-haltige Polymere, insbesondere aus der Gruppe der copolymeren Polysulfonate, eingesetzt. Diese copolymeren Polysulfo- nate enthalten neben Sulfonsäuregruppen-haltigem(n) Monomer(en) wenigstens ein Monomer aus der Gruppe der ungesättigten Carbonsäuren.

Als ungesättigte Carbonsäure(n) wird/werden mit besonderem Vorzug ungesättigte Carbonsäuren der Formel R (R ² )C=C(R ³ )COOH eingesetzt, in der R bis R ³ unabhängig voneinander für -H, - CH3, einen geradkettigen oder verzweigten gesättigten Alkylrest mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, einen geradkettigen oder verzweigten, ein- oder mehrfach ungesättigten Alkenylrest mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, mit -NH2, -OH oder -COOH substituierte Alkyl- oder Alkenylreste wie vorstehend definiert oder für -COOH oder -COOR ⁴ steht, wobei R ⁴ ein gesättigter oder ungesättigter, ge- radkettigter oder verzweigter Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen ist.

Besonders bevorzugte ungesättigte Carbonsäuren sind Acrylsäure, Methacrylsäure, Ethacrylsäure, a-Chloroacrylsäure, α-Cyanoacrylsäure, Crotonsäure, α-Phenyl-Acrylsäure, Maleinsäure, Maleinsäureanhydrid, Fumarsäure, Itaconsäure, Citraconsäure, Methylenmalonsäure, Sorbinsäure, Zimtsäure oder deren Mischungen. Einsetzbar sind selbstverständlich auch die ungesättigten Dicarbon- säuren.

Bei den Sulfonsäuregruppen-haltigen Monomeren sind solche der Formel

bevorzugt, in der R ⁵ bis R ⁷ unabhängig voneinander für -H, -CH3, einen geradkettigen oder verzweigten gesättigten Alkylrest mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, einen geradkettigen oder verzweigten, ein- oder mehrfach ungesättigten Alkenylrest mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, mit -NH2, -OH oder -COOH substituierte Alkyl- oder Alkenylreste oder für -COOH oder -COOR ⁴ steht, wobei R ⁴ ein gesättigter oder ungesättigter, geradkettigter oder verzweigter Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen ist, und X für eine optional vorhandene Spacergruppe steht, die ausgewählt ist aus -(CH ₂ ) _n - mit n = 0 bis 4, -COO-(CH ₂ ) _k - mit k = 1 bis 6, -C(0)-NH-C(CH ₃ ) ₂ -, -C(0)-NH- C(CH ₃ )2-CH ₂ - und -C(0)-NH-CH(CH ₂ CH ₃ )-.

Unter diesen Monomeren bevorzugt sind solche der Formeln H ₂ C=CH-X-S03H, H ₂ C=C(CH3)-X- SOsH und in denen R ⁶ und R ⁷ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus -H, -CH ₃ , -CH ₂ CH ₃ , -CH ₂ CH ₂ CH ₃ , -CH(CH ₃ ) ₂ und X für eine optional vorhandene Spa- cergruppe steht, die ausgewählt ist aus -(CH ₂ ) _n - mit n = 0 bis 4, -COO-(CH ₂ )k- mit k = 1 bis 6, -C(0)-NH-C(CH ₃ ) ₂ -,-C(0)-NH-C(CH ₃ ) ₂ -CH ₂ - und -C(0)-NH-CH(CH ₂ CH ₃ )-.

Besonders bevorzugte Sulfonsäuregruppen-haltige Monomere sind dabei 1-Acrylamido-1-propan- sulfonsäure, 2-Acrylamido-2-propansulfonsäure, 2-Acrylamido-2-methyl-1-propansulfonsäure, 2- Methacrylamido-2-methyl-1-propansulfonsäure, 3-Methacrylamido-2-hydroxy-propansulfonsäure, Allylsulfonsäure, Methallylsulfonsäure, Allyloxybenzolsulfonsäure, Methallyloxybenzolsulfonsäure, 2-Hydroxy-3-(2-propenyloxy)propansulfonsäure, 2-Methyl-2-propen1 -sulfonsäure, Styrolsulfon- säure, Vinylsulfonsäure, 3-Sulfopropylacrylat, 3-Sulfopropylmethacrylat, Sulfomethacrylamid, Sulfo- methylmethacrylamid sowie Mischungen der genannten Säuren oder deren wasserlösliche Salze.

In den Polymeren können die Sulfonsäuregruppen ganz oder teilweise in neutralisierter Form vorliegen. Der Einsatz von teil- oder vollneutralisierten sulfonsäuregruppenhaltigen Copolymeren ist erfindungsgemäß bevorzugt.

Die Molmasse der erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzten Sulfo-Copolymere kann variiert werden, um die Eigenschaften der Polymere dem gewünschten Verwendungszweck anzupassen. Bevorzugte maschinelle Geschirrspülmittel sind dadurch gekennzeichnet, dass die Copolymere Molmassen von 2000 bis 200.000 gmol \ vorzugsweise von 4000 bis 25.000 gmor und insbesondere von 5000 bis 15.000 gmol ^-1 aufweisen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Copolymere neben Carboxylgrup- pen-haltigem Monomer und Sulfonsäuregruppen-haltigen Monomer weiterhin wenigstens ein nichtionisches, vorzugsweise hydrophobes Monomer. Durch den Einsatz dieser hydrophob modifizierten Polymere konnte insbesondere die Klarspülleistung erfindungsgemäßer maschineller Geschirrspülmittel verbessert werden.

Wasch- oder Reinigungsmittel, enthaltend ein Copolymer, umfassend

i) Carbonsäuregruppen-haltige Monomer(e)

ii) Sulfonsäuregruppen-haltige Monomer(e)

iii) nichtionische Monomer(e). werden erfindungsgemäß bevorzugt. Durch den Einsatz dieser Terpolymere konnte die Klarspülleistung erfindungsgemäßer maschineller Geschirrspülmittel gegenüber vergleichbaren Geschirrspülmitteln, die Sulfopolymere ohne Zusatz nichtionischer Monomere enthalten, verbessert werden.

Als nichtionische Monomere werden vorzugsweise Monomere der allgemeinen Formel

R (R ² )C=C(R ³ )-X-R ⁴ eingesetzt, in der R bis R ³ unabhängig voneinander für -H, -CH ₃ oder -C2H5 steht, X für eine optional vorhandene Spacergruppe steht, die ausgewählt ist aus -CH2-, -C(0)0- und -C(0)-NH-, und R ⁴ für einen geradkettigen oder verzweigten gesättigten Alkylrest mit 2 bis 22 Kohlenstoffatomen oder für einen ungesättigten, vorzugsweise aromatischen Rest mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen steht.

Besonders bevorzugte nichtionische Monomere sind Buten, Isobuten, Penten, 3-Methylbuten, 2- Methylbuten, Cyclopenten, Hexen, Hexen-1 , 2-Methlypenten-1 , 3-Methlypenten-1 , Cyclohexen, Methylcyclopenten, Cyclohepten, Methylcyclohexen, 2,4,4-Trimethylpenten-1 , 2,4,4-Trimethylpen- ten-2, 2,3-Dimethylhexen-1 , 2,4-Diemthylhexen-1 , 2,5-Dimethlyhexen-1 , 3,5-Dimethylhexen-1 , 4,4- Dimehtylhexan-1 , Ethylcyclohexyn, 1-Octen, α-Olefine mit 10 oder mehr Kohlenstoffatomen wie beispielsweise 1-Decen, 1 -Dodecen, 1-Hexadecen, 1-Oktadecen und C22-a-Olefin, 2-Styrol, α-Methylstyrol, 3-Methylstyrol, 4-Propylstryol, 4-Cyclohexylstyrol, 4-Dodecylstyrol, 2-Ethyl-4- Benzylstyrol, 1 -Vinylnaphthalin, 2,Vinylnaphthalin, Acrylsäuremethylester, Acrylsäureethylester, Ac- rylsäurepropylester, Acrylsäurebutylester, Acrylsäurepentylester, Acrylsäurehexylester, Methacryl- säuremethylester, N-(Methyl)acrylamid, Acrylsäure-2-Ethylhexylester, Methacrylsäure-2-Ethylhe- xylester, N-(2-Ethylhexyl)acrylamid, Acrylsäureoctylester, Methacrylsäureoctylester, N-(Octyl)ac- rylamid, Acrylsäurelaurylester, Methacrylsäurelaurylester, N-(Lauryl)acrylamid, Acrylsäurestea- rylester, Methacrylsäurestearylester, N-(Stearyl)acrylamid, Acrylsäurebehenylester, Methacrylsäu- rebehenylester und N-(Behenyl)acrylamid oder deren Mischungen.

Der Gewichtsanteil der Sulfonsäuregruppen-haltigen Copolymere am Gesamtgewicht erfindungsgemäßer Wasch- oder Reinigungsmittel beträgt vorzugsweise 0,1 bis 15 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,0 bis 12 Gew.-% und insbesondere 2,0 bis 10 Gew.-%.

Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel können in den dem Fachmann bekannten Konfektionsformen, also beispielsweise in fester oder flüssiger Form aber auch als Kombination fester und flüssiger Angebotsformen vorliegen. Als feste Angebotsformen eignen sich insbesondere Pulver, Granulate, Extrudate oder Kompaktate, insbesondere Tabletten. Die flüssigen Angebotsformen auf Basis von Wasser und/oder organischen Lösungsmitteln können verdickt, in Form von Gelen vorliegen.

Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel liegen vorzugsweise in flüssiger Form vor. Bevorzugte Wasch- oder Reinigungsmittel enthalten bezogen auf ihr Gesamtgewicht mehr als 40 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 50 und 90 Gew.-% und insbesondere zwischen 60 und 80 Gew.- % Wasser.

Als einen weiteren Bestandteil können die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel ein organisches Lösungsmittel enthalten. Der Zusatz organischer Lösungsmittel wirkt sich vorteilhaft auf die Enzymstabilität und die Reinigungsleistung dieser Mittel aus. Bevorzugte organische Lösungsmittel stammen aus der Gruppe ein- oder mehrwertigen Alkohole, Alkanolamine oder Glyko- lether. Vorzugsweise werden die Lösungsmittel ausgewählt aus Ethanol, n- oder i-Propanol, Buta- nol, Glykol, Propan- oder Butandiol, Glycerin, Diglykol, Propyl- oder Butyldiglykol, Hexylenglycol, Ethylenglykolmethylether, Ethylenglykolethylether, Ethylenglykolpropylether, Etheylenglykolmono- n-butylether, Diethylenglykolmethylether, Di-ethylenglykolethylether, Propylenglykolmethyl-, -ethyl- oder -propylether, Dipropylenglykolmethyl-, oder -ethylether, Methoxy-, Ethoxy- oder Butoxytrigly- kol, 1-Butoxyethoxy-2-propanol, 3-Methyl-3-methoxybutanol, Propylen-glykol-t-butylether sowie Mischungen dieser Lösungsmittel. Der Gewichtsanteil dieser organischen Lösungsmittel am Gesamtgewicht erfindungsgemäßer Wasch- oder Reinigungsmittel beträgt vorzugsweise 0,1 bis 10 Gew.- %, bevorzugt 0,2 bis 8,0 Gew.-% und insbesondere 0,5 bis 5,0 Gew.-%. Ein besonders bevorzugtes und in Bezug auf die Stabilisierung der Wasch- oder Reinigungsmittel besonders wirksames organisches Lösungsmittel ist das Glycerin sowie das 1 ,2 Propylenglykol. Flüssige Wasch- oder Reinigungsmittel die mindestens ein Polyol, vorzugsweise aus der Gruppe Glycerin und 1 ,2-Propy- lenglycol enthalten, wobei der Gewichtsanteil des Polyols am Gesamtgewicht des Wasch- oder Reinigungsmittels vorzugsweise 0, 1 und 10 Gew.-%, bevorzugt 0,2 und 8,0 Gew.-% und insbesondere 0,5 und 5,0 Gew.-% beträgt, werden erfindungsgemäß bevorzugt.

Weitere bevorzugte organische Lösungsmittel sind die organischen Amine und Alkanolamine. Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel enthalten diese Amine vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 10 Gew.-%, bevorzugt von 0,2 bis 8,0 Gew.-% und insbesondere von 0,5 bis 5,0 Gew.-%, jeweils bezogen auf ihr Gesamtgewicht. Ein besonders bevorzugtes Alkanolamin ist das Ethanolamin.

Ein weiterer bevorzugter Bestandteil der erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel ist ein Zuckeralkohol (Alditol). Die Gruppe der Alditole umfasst nichtcyclische Polyole der Formel HOCH2[CH(OH)]nCH20H. Zu den Alditolen zählen beispielsweisee Mannit (Mannitol), Isomalt, Lac- tit, Sorbit (Sorbitol) und Xylit (Xylitol), Threit, Erythrit und Arabit. Als in Bezug auf die Enzymstabilität besonders vorteilhaft hat sich das Sorbitol erwiesen. Der Gewichtsanteil des Zuckeralkohols am Gesamtgewicht des Wasch- oder Reinigungsmittels beträgt vorzugsweise 1 ,0 bis 10 Gew.-%, bevorzugt 2,0 bis 8,0 Gew.-% und insbesondere 3,0 bis 6,0 Gew.-%.

Erfindungsgemäße flüssige Wasch- oder Reinigungsmittel werden vorzugsweise in mehrphasiger Form, das heißt durch Kombination von zwei oder mehr voneinander getrennten unterschiedlichen flüssigen Wasch- oder Reinigungsmitteln konfektioniert. Diese Art der Konfektionierung erhöht die Stabilität des Wasch- oder Reinigungsmittels und verbessert dessen Reinigungsleistung. Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Wasch- oder Reinigungsmittel ist dadurch gekennzeichnet, dass es ein Verpackungsmittel und zwei in diesem Verpackungsmittel befindlichen voneinander getrennte flüssige Wasch- oder Reinigungsmittel A und B umfasst, wobei die Zusammensetzung A

a) mindestens eine erfindungsgemäße modifizierte Protease;

b) mindestens ein weiteres, von der erfindungsgemäßen Protease verschiedenes Enzym, c) 10 bis 84,9 Gew.-% Gerüststoff(e);

d) 15 bis 89,9 Gew.-% Wasser; enthält und

die Zusammensetzung B

e) 10 bis 75 Gew.% Gerüststoff(e);

f) 25 bis 90 Gew.-% Wasser;

enthält.

Beispiele:

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken: Beispiel 1 : Bereitstellung einer Protease mit poly-Asp-Glu-Tag

Ausgehend von einer Referenzprotease, die eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 aufwies, wurde eine erfindungsgemäße Protease-Variante mit einer C-terminalen poly-Asp-Glu- Elongation hergestellt, indem in einem geeigneten Bacillus-Produktionsplasmid, mit dessen Hilfe auch die Referenzprotease in guter Ausbeute darstellbar ist, am 3'-Ende der codierenden Region, zwischen dem Codon für die letzte Aminosäure der Protease und dem Stopcodon, eine Sequenz von Codons eingefügt wurde, die für abwechselnde Glu- und Asp-reste codiert, z.B. GAAGAT für Asp-Glu. Nach Transformation von Bacillus subtilis DB 104 wurde das Plasmid zur Kontrolle präpariert und der betreffende Bereich sequenziert. Die für die nachfolgenden Beispiele verwendete Protease hatte eine C-terminale Elongation von (Asp-Glu)32, es wurden jedoch auch solche mit (Asp- Glu)^, (Asp-Glu)ie, (Asp-Glu) ₂ 8, (Asp-Glu) ₃ 4, (Asp-Glu) ₄ 6, (Asp-Glu) ₆ 8, (Asp-Glu)94, (Asp-Glu)so, (Asp-Glu)ioo erzeugt.

Die Expression der Protease-Variante erfolgte in fachüblicher Art- und Weise durch Transformation von Bacillus subtilis DB 104 (Kawamura und Doi (1984), J. Bacteriol., Band 160 (1 ), S. 442-444) mit einem entsprechenden Expressionsvektor und nachfolgender Kultur der die Protease-Variante exprimierenden Transformanden. Die proteasehaltigen Kulturüberstände wurden zur weiteren Verwendung, z.B. für Bsp. 2, herangezogen.

Beispiel 2: Herstellung einer flüssigen Enzympräparation:

Der Überstand einer Kultivierung des Expressionssystems, z.B. aus Bsp. 1 , enthaltend die erfindungsgemäße Protease in einer Aktivität von mindestens 200 HPE/mL, wird mit 0,1 Gewichtsanteilen 1 ,2-Propandiol versetzt und bei 4°C gelagert. Die in HPE angegebene Protease-Aktivität (Hen- kel-Protease-Einheiten) wurde nach van Raay, Saran und Verbeek, gemäß der Veröffenlichung „Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Spül- und Reinigungsmitteln" in Tenside (1970), Band 7, S. 125-132, bestimmt. Bei Lagerung über mehrere Tage wird vor Verwendung die Aktivität erneut bestimmt.

Beispiel 3: Mini-Waschversuch zur Bestimmung der Reinigungsleistung:

Die Waschleistung der zu testenden Protease wird im Vergleich zu einem parallel unter gleichen Bedingungen erzeugten, bekannten Referenzprotease untersucht. Hierzu wird eine (enzymfreie) Flüssigwaschmittelformulierung (s. Bsp. 5, für diesen Test ohne Enzyme vorbereitet) in typischer Konzentration (78g/17L) in Wässern unterschiedlicher Härtegrade (0-56°d) gelöst und mit aktivitätsgleichen Mengen der Test- bzw. Referenzprotease (10HPE/ml_) versetzt. In dieser Waschlauge erfolgt im miniaturisiertem Waschversuch (1 ml_ Waschlauge, 48well-Platte mit Deckel, Anschmutzung 01 cm) die Inkubation standardisierter käuflicher Anschmutzungen (EMPA164, CFT PC10, CFT 10N, CFT C03, EMPA1 12, CFT C05) auf (Polyester-) Baumwollgewebe für 60 Minuten bei 40°C unter Schwenken. Nach Spülung (Leitungswasser), Trocknung und Fixierung der Anschmutzungen werden diese mit einem Spektrophotometer (Konica Minolta Cm700d) vermessen und die Helligkeitsdifferenzen ΔΙ_ ^* zwischen der jeweiligen Probe und einen enzymfrei analog mitgewaschenen Nullwert entsprechender Wasserhärte, summiert über alle 6 Anschmutzungen, als Maß für die Waschleistung bewertet.

Beispiel 4: Bewertung der Wasserhärtetoleranz:

Die Wasserhärtetoleranz der beispielhaften Protease aus Bsp. 2 wird im Vergleich zur Referenzprotease im Miniwaschtest (Bsp. 3) bestimmt. Die Referenzprotease ist die im Bsp. 1 genannte Referenzprotease.

Für die Beispielprotease wird die Waschleistung bei den in der nachfolgenden Tabelle angeführten Wasserhärten gem. Bsp. 3 bestimmt. Die Summe der Helligkeitsdifferenzen (d.i. die Waschleistung) bei einer Wasserhärte von 0°d wird auf 100° gesetzt und die Waschleistung bei den höheren Wasserhärten wird hierzu in Prozent in Bezug gesetzt.

Für die Referenzprotease wird genauso die Waschleistung bei den in der nachfolgenden Tabelle angeführten Wasserhärten gem. Bsp. 3 bestimmt. Die Summe der Helligkeitsdifferenzen (d.i. die Waschleistung) bei einer Wasserhärte von 0°d wird auf 100% gesetzt und die Waschleistung bei den höheren Wasserhärten wird hierzu in Prozent in Bezug gesetzt.

Aus der Tabelle und Figur 1 ist ersichtlich, dass die Abnahme der Waschleistung der erfindungsge- mässen Beispielprotease mit zunehmender Wasserhärte weniger stark ausfällt als bei der Referenzprotease, dass also ihre Wasserhärtetoleranz größer ist.

Vergleichsenzym ohne Erweiterung (SEQ Beispiel-Enzym mit C-terminaler poly-Asp-Glu- ID NO. 1 ) Erweiterung (Asp-Glu)32

°d % (bez. auf 0°d) % (bez. auf 0°d)

0 100% 100%

8 108% 125%

16 79% 102%

24 63% 98%

32 38% 78%

40 30% 41 % 48 16% 27%

56 18% 22%

Beispiel 5: Waschmittelformulierung mit härtetoleranter Protease:

Die Zusammensetzung einiger bevorzugter Wasch- oder Reinigungsmittel kann den folgenden Tabellen entnommen werden (Angaben in Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht des Wasch- o- der Reinigungsmittels sofern nicht anders angegeben).

Formel 1 Formel 2 Formel 3 Formel 4 Formel 5

Erfindungsgemäße 0,005 bis 1 ,0 0,01 bis 0,5 0,02 bis 0,2 0,06 0,17 modifizierte Protease

Enzym ^** 0,0005 bis 1 ,0 0,001 bis 0,5 0,002 bis 0,2 0,004 0,012

Mise add 100 add 100 add 100 add 100 add 100 von der erfindungsgemäßen Protease verschiedenes Enzym

Formel 6 Formel 7 Formel 8 Formel 9 Formel 10

Erfindungsgemäße 0,005 bis 1 ,0 0,01 bis 0,5 0,02 bis 0,2 0,06 0,17 modifizierte Protease

Amylase 0,0005 bis 1 ,0 0,001 bis 0,5 0,002 bis 0,2 0,004 0,012 Mise add 100 add 100 add 100 add 100 add 100

Formel 1 1 Formel12 Formel 13 Formel 14 Formel 15

Erfindungsgemäße 0,005 bis 1 ,0 0,01 bis 0,5 0,02 bis 0,2 0,06 0,17 modifizierte Protease

Amylase 0,0005 bis 1 ,0 0,001 bis 0,5 0,002 bis 0,2 0,004 0,012 Wasser > 40 50 bis 85 60 bis 80 64 71 Mise add 100 add 100 add 100 add 100 add 100 Formel 16 Formel 17 Formel 18 Formel 19 Formel : 20

Erfindungsgemäße 0,005 bis 1 ,0 0,01 bis 0,5 0,02 bis 0,2 0,06 0,17 modifizierte Protease

Amylase 0,0005 bis 1 ,0 0,001 bis 0,5 0,002 bis 0,2 0,004 0,012

Gerüststoff 5,0 bis 40 10 bis 30 12 bis 25 26 18

Wasser > 40 50 bis 85 60 bis 80 64 71

Mise add 100 add 100 add 100 add 100 add 10C

Formel 21 Formel 22 Formel 23 Formel 24 Formel : 25

Erfindungsgemäße 0,005 bis 1 ,0 0,01 bis 0,5 0,02 bis 0,2 0,06 0,17 modifizierte Protease

Amylase 0,0005 bis 1 ,0 0,001 bis 0,5 0,002 bis 0,2 0,004 0,012

Niotensid 0,2 bis 10 0,4 bis 7,0 0,6 bis 6,0 4,0 2,0

Wasser > 40 50 bis 85 60 bis 80 64 71

Mise add 100 add 100 add 100 add 100 add 10C

Formel 26 Formel 27 Formel 28 Formel 29 Formel 30

Erfindungsgemäße 0,005 bis 1 ,0 0,01 bis 0,5 0,02 bis 0,2 0,06 0,17 modifizierte Protease

Amylase 0,0005 bis 1 ,0 0,001 bis 0,5 0,002 bis 0,2 0,004 0,012

Gerüststoff 5,0 bis 40 10 bis 30 12 bis 25 26 18

Niotensid 0,2 bis 10 0,4 bis 7,0 0,6 bis 6,0 4,0 2,0

Wasser > 40 50 bis 85 60 bis 80 64 71

Mise add 100 add 100 add 100 add 100 add 10C

Formel 31 Formel 32 Formel 33 Formel 34 Formel 35

Erfindungsgemäße 0,005 bis 1 ,0 0,01 bis 0,5 0,02 bis 0,2 0,06 0, 17 modifizierte Protease

Amylase 0,0005 bis 1 ,0 0,001 bis 0,5 0,002 bis 0,2 0,004 0,012

Pentakalium- 5,0 bis 40 10 bis 30 12 bis 25 18 12 triphosphat

HEDP 0,1 bis 8,0 0,2 bis 5,0 0,5 bis 3,0 3,0 2,0

Sulfo-Copolymer 0, 1 bis 15 1 ,0 bis 12 2,0 bis 10 4,0 6,0

Hydroxymischether 0,2 bis 10 0,4 bis 7,0 0,6 bis 6,0 4,0 2,0 Wasser > 40 50 bis 85 60 bis 80 64 71

Mise add 100 add 100 add 100 add 100 add 100

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen modifizierten Protease zur Verbesserung der Wasserhärtetoleranz von Wasch- oder

Reinigungsmitteln.