DISPOSITIF POUR GREFFER LE GROUPE PROTECTEUR

SUR LE COMPOSE A PROTEGER

La présente invention se rapporte à un nouveau groupe protecteur et à son utilisation, en particulier dans la synthèse des peptides. Elle se rapporte plus particulièrement à un groupe protecteur qui facilite la purification des composés, surtout les peptides, pendant ou à la fin d'une synthèse.

En synthèse organique, en particulier multi-étapes, la purification des produits obtenus peut poser plus de problèmes que la synthèse elle-même. Ceci est particulièrement vrai dans le cas de la synthèse des peptides, une synthèse qui utilise systématiquement les groupes protecteurs et qui peut également jouer des rôles supplémentaires.

Ainsi, le besoin de protéger, ou d'activer une certaine fonction dans les acides aminés a été utilisé pour réaliser des synthèses de peptides en biphasé afin de faciliter les stades de purification. Cependant, le problème de la purification dans la synthèse des peptides, implicite dans les techniques telles que la technique Merrifield (J. Amer Chem. Soc. 1986, 108, 5242), n'a pas été complètement résolu. Une des solutions les plus élégantes à ce problème serait de modifier le peptide, ou toute autre molécule nécessitant une protection, en le liant à un solide d'une façon physiquement réversible, au cours de l'élaboration et de la purification. A ce jour, aucun groupe protecteur n'a été révélé comme étant capable d'exercer une telle propriété. C'est pour cette raison qu'un des objectifs principaux de la présente invention est de fournir un groupe protecteur correspondant aux critères ci-dessus. Les Figures 1 et 2 montrent la structure radiographique du cristal d'un des composés de la présente invention, conformément aux descriptions dans les Exemples. Figure 1 : structure de cristal radiographique, (a) vue "latérale" de (31) montrant la cellule de l'unité. Figure 2 : structure de cπstal radiographique, (b) vue "de dessus" de (31) ; La présente invention fournit le groupe protecteur ayant la formule suivante (I) : Ar-L- où Ar représente un système d'anneaux fusionnés substantiellement plane contenant au moins quatre anneaux aromatiques, et L représente un groupe contenant au moins un atome de carbone qui est capable de se lier à un groupe à protéger. Le groupe Ar contient de préférence au moins 6 anneaux aromatiques et les anneaux aromatiques sont de préférence hexagonaux. De préférence, Ar ne contient pas d'hétéro-atome.

Le groupe L peut être, par exemple, un groupe d'alcoyl ou, en particulier, un groupe de peptide. En général, le groupe L peut être composé de tout anneau, ou branche, dont les spécialistes savent qu'il ou elle forme un lien entre le groupe protecteur et la molécule à Drotéαer. Le orouDe L est de Dréfrence relié au αrouDβ Ar Dar un atonie

FEUILLE DE REMPLACEMENT JSÀ/EP

carbone. Le groupe L est choisi de façon à ce qu'il n'y ait pas de conjugaison entre le groupe Ar et ie groupe partant. De préférence, le groupe L comprend ie groupe - CR'-L'-, où L' est défini comme ci-dessous et R' est un groupe aicoyl, ayant de préférence jusqu'à 4 atomes de carbone, ou d'hydrogène.

Le groupe idéal de la présente invention a la formule (11) :

R2- C - (CH)n - C — R3

CH2-U-

où n est égal à 0 ou i;

O signifie que l'anneau environnant est aromatique quand n est égal à 1 et non- aromatique quand n est égal à 0 ;

R1 et R2, d'une part, et R3 et R4, d'autre part, sont choisis de façon à ce que chacun forme un système de anneau aromatique fusionné ensemble avec les atomes de carbone auxquels ils sont rattachés ;

R ¹ est un groupe alcoyie ou hydrogène ; et U représente un lien direct ou un groupe capable de se lier à un groupe à protéger.

Pour rigidifier ie groupe protecteur, il est possible de prévoir un groupe R5 dioisi de façon à former un ou plusieurs anneaux aromatiques, les anneaux étant de préférence de structure hexagonale ne contenant avantageusement aucun hétéro- atome, pour donner une formule de groupe (III)

FEUILLE DE REMPLACEMENT ISA/EP

R2- C (CH)n R3

CR'

CH2 L-

Quand n est égal à 0, il n' y a aucun lien entre l'anneau central et R5 et quand n est égal à un ie lien entre R5 et R3 est optionnel mais préférable.

Le nombre total d'anneaux aromatiques se situe avantageusement de 4 à . Les apogées libres peuvent être remplacées par des groupes aicoyl "lato sensu", ayant avantageusement une chaîne courte (de 1 à 5 atomes de carbone). Le nombre total d'atomes de carbone (sans tenir compte de l'anneau L) est généralement de 20 à 60, de préf .ence de 25 à 50.

Pour des raisons de facilité d'accès à ia synthèse, R1 et R2, d'une part, R3 et R4, d'autre part, et R5 sont choisis avantageusement pour former un système qui est symétrique par rapport à l'anneau central (par rapport à ia bissectrice de l'angle intra- anneau du carbone transportant le méthylène rattaché à l'anneau L).

La présente invention est basée sur le fait que l'on a découvert que les molécules protégées par le groupe défini ci-dessus absorbent très fortement le graphite ou les surfaces graphitiεéθs y compris le charbon activé. De plus, comme nous l'expliquerons dans la partie suivante de cette description, cette absorption est réversible).

Plus il y a d'anneaux aromatiques transportés par le groupe, meilleure est l'absorption et plus l'éiution est difficile, et vice-versa. L'optimum peut être défini cas par cas par les spécialistes. Cependant, un nombre de 4 à 8 anneaux aromatiques ajoutés à l'anneau central constitue en général un compromis satisfaisant à la fois d'un point de vue économique et d'un point de vue des critères d'absorption et d'éiution.Les groupes où n est égal à zéro, en particulier ceux sans radical R5, sont plus facilement accessible FEUILLE DE REMPLACEMENT

La chimie des groupes selon l'invention est la même que pour ie groupe fmoc quand n est égal à zéro et la même que pour le groupe benzyle dans les autres cas, par exemple quand n est égal à un.

La chimie du groupe fmoc est bien connue et on peut se référer aux articles suivants ainsi qu'aux publications générales sur les groupes protecteurs :

CARPINO - J. Amer. Chem. Soc. 1970, 32, 5748, J. Org. Chem. 1972, 37, 3404, Synthèse 1983, p. 671, F. Org. Chem. 1983, 4S, 77, Int. J. Peptide Protein Res.1983, 22, 125, Biopolymères 1983, 2, 2157.

Les groupes ci-dessus sont faciles à obtenir par la séquence de réactions suivantes ou équivalents :

R2 -CH R2 -CH

1) Buϋ

R1- C Br R1 _ C — CO-CO-O — Et

2) diéthyi oxalate

(D

R3 -CH R2 -CH HC-R3

1) BuLi H+

COH

COOEt

FEUILLE DE REMPLACEMENT ISA/EP

COOEt CH2OH

La chimie du groupe benzyl est aussi bien connue et il est approprié de se reporter aux publications spécialisées et destinées à l'enseignement sur le sujet. On peut également se référer aux articles suivants qui ont ouvert de nouvelles voies : Int. J. Peptide Protein, Res. 1986, 2Z, 358 ; Synthèse, p.303 ; J. Org. Chem. 1983, 4a, 661 et 666. Les groupes de la présente invention peuvent être préparés selon les méthodes décrites dans les articles ci-dessus et par des techniques bien connues comme les réactions de Freidel-Crafts. Les articles ci-dessus indiquent aux spécialistes comment greffer les groupes spécifiés ci-dessus sur les fonctions à protéger. Ces groupes modifient ainsi les molécules ayant, par exemple, une fonction acide, alcool, thiol, aminée ou amidée, dont les molécules protégées sont aussi soumises à la présente application. Les molécules protégées de cette façon peuvent être des molécules de tout type, mais sont plus généralement des acides aminés ou des peptides. Les acides aminés consituants des peptides peuvent être naturels ou obtenus par synthèse ; les peptides et/ou les acides aminés peuvent être protégés ou substitués sur leurs diverses fonctions.

Selon la présente invention, il a été démontré de façon surprenante que les molécules modifiées conformément aux groupes protecteurs ci-dessus avaient la caractéristique d'être remarquablement bien retenues sur les colonnes de graphite ou sur les colonnes de matériaux graphitisés y compris le charbon activé.Ces molécules modifiées présentent également une bonne aptitude à ia séparation c irale. il est opportun d'inclure sous le terme matériaux graphitisés ceux qui sont carbonacés totalement ou en surface et ont subi un traitement de graphitisation, en

FEU ^. LLE DE REMPLACEMENT

général par pyrolyse.

La forte affinité du groupe protecteur de la présente invention signifie qu'il est particulièrement adapté à ia purification des peptides. L'utilisation de charbon activé offre une liaison équivalente à celle du graphite et est préférable, puisque le charbon activé est moins cher que ie carbone graphitisé (PGC).

La présente invention prévoit également un composé protecteur comportant un groupe comme défini ci-dessus rattaché, par le groupe L ou L', à un groupe partant, comme un groupe qui contient un atome de azote, d'oxygène, de soufre, de sélénium, de tellure, de silicium ou d'halogène. Les exemples de groupes partants sont les groupes à atomes d'halogène (par exemple F, C1 , Br ou I) ou -OH, -COOH, - NH2, -CONH2, -S03C6H4-pCH3, -SH, -CN ou -Si(CH3)3.

Les groupes d'après l'invention disposent d'une autre caractéristique particulièrement avantageuse, c'est-à-dire que la grande majorité d'entre-eux absorbe les radiations visibles ou ultraviolet en longueurs d'onde qui diffèrent de celles des acides aminés naturels. Certains de ces groupes sont fluorescents à des longueurs d'onde différentes de celles des acides aminés naturels.

Cette propriété permet de développer des appareils comprenant, pour une utilisation successive ou simultanée :

a) une chambre, par exempte une colonne, remplie d'un matériau graphite, de préférence du graphite ou du charbon activé, et b) un jeu pour greffer un groupe protecteur comme défini ci-dessus sur une molécule.

Le graphite ou le matériau graphitisé a été défini ci-dessus, alors que le jeu pour le greffage du groupe protecteur comprend les divers réactifs connus des spécialistes comme pouvant greffer un groupe protecteur sur une molécule à protéger. Cet appareil est avantageusement complété par (c) un système de collection de fraction équipé d'un détecteur d'ultraviolets (UV), spectroscopique visible ou spectroscopiquefluorescent. Par exemple le groupe Tbfmoc peut agir comme un label fluorescent ; longueur d'onde d'excitation : 383 nm ; longueur d'onde d'émission : 424 nm. Ceci est particulièrement avantageux en immunologie, où ia détection des composés présents dans les concentrations très faibles requiert des techniques à haute sensibilité.

Ainsi, il a été possible de développer un nouveau procédé pour la synthèse et/ou la séparation des molécules, en particulier les fragments de peptides, qui comprend ^,es FEUI LE DE REMPLACEMENT

étapes suivantes :

- protection d'au moins un groupe dans au moins un composé dans un mélange de composés à séparer avec un groupe comme défini ci-dessus, et

- passage du mélange de composés par une chambre remplie d'un matériau graphite.

La présente invention prévoit également l'utilisation d'un groupe comme défini ci-dessus pour protéger au moins un groupe fonctionnel d'une molécule.

La présente invention est maintenant plus amplement illustrée dans les Exemples suivants:

Les dérivés d'acides aminés ont été achetés soit chez Fluka, soit chez Aldrich ou Sigma. Les points de fusion ont été pris dans des capillaires ouverts sur un appareil de point de fusion Bϋchi 510 chauffé électriquement, ou sur des préparations de microscope en étape à chaud Reichert 7905 chauffée électriquement et ne sont pas corrigés. La chromatographie en fine couche (t.l.c.) a été effectuée en utilisant des feuilles de plastique revêtues de gel de silicium 60 GF- 254 (Merck 5735) dans les systèmes suivants :

(A) éthyl acétate/pétrole (b.p.40-60 ^* C) (1 : 4)

(B) méthanol/chloroforme (1:9)

(C) toluène

(D) chloroforme

(E) éthyie acétate

(F) benzène

(G) dichtorométhane

(H) méthanol/chloroforme/acide acétique (1:9:0,5) (I) n-butanol/acide acétique/eau (3:1:1)

La visualisation des composés a été réalisée par une combinaison appropriée des méthodes suivantes : vapeur d'iode, absorption d'ultraviolets à 254 nm ou 352 nm, aspersions de bleu de permanganate de potassium neutre et de bromophénol, réactif de Mary (diphényl carbinol (diméthytaminé) 4,4'-bis) pour les fonctions acides et ninhydrine pour les composés avec groupes aminés libres. Les rotations optiques ont été mesurées sur un polarimètre AA 1000 en utilisant une cellule de 1 dm dans les solvants cités dans le texte. Une chromatographie liquide haute performance (HPLC) a été effectuée en utilisant soit un système Waters, c'est-à-dire des pompes 2 x 600, un injecteur U6K, un contrôleur de gradiant automatique 680, un détecteur d'ultraviolet modèle 441; ou un système Applied Biossystems (Biosystèmes Appliqués), c'est-à-dire

FEUILLE DE REMPLACEMENT ISA/EP

un système d'alimentation en solvant 2 x 1406 A, un injecteur/mixeur 1480 A et un contrôleur/détecteur 1783 A. Les séparations analytiques ont été exécutées sur un Whatman-Partisil-5 ODS-3 (4,6 mmDI x 250 mm) et sur un aquapore DE-300 ABI (RP18), taille de pore 300 A, colonne (4,6 mm Dl x 220 mm) de silicium sphérique 7 μm dans les conditions indiquées dans le texte, la chromatographie éclair a été réalisée en utilisant du gel de silicium 60 (230-240 prise (Fiuka) ; 60-100 g de silicium par gramme de matériau brut ; longueur active 15-20 cm). Les spectres infrarouges ont été enregistrés sur un spectrophotomètre Perkin Elmer 781 dans te solvant indiqué ou par la technique du disque KBr, en utilisant ie polystyrène comme norme (1603 cm-1). Les spectres ultraviolets ont été enregistrés sur un spectrophotomètre à luminescence Perkin Elmer LS-5. Les spectres de masse ont été mesurés sur une machine Kratos MS 50 TC. Les spectres de résonnance magnétique nucléaire des protons (NMR) ont été enregistrés soit sur machines Brϋker WP 80 (80 MHz), WP 200 (200 MHz) ou WH 360 (360 MHz) dans ie solvant indiqué en utilisant du tétraméthylsilane comme norme (δ = 0,00) Les spectres au Carbone-13 NMR ont été enregistrés sur une machine Bruker WP 200 (50 MHz) ou W H 360 (90 MHz) dans le solvant indiqué, en utilisant ie tétraméthylsilane comme norme. Les analyses élόmentales ont été effectuées sur un analyseur élémenta! Carlo Erba modèle 1106. La détermination de la structure radiographique à cristal unique a été réalisée sur un diffractomètre à quatre cycles Stoë Stadi-4 graphite- monochrome (radiation CU-Kδ; lambda = 1.54184 A). Tous les solvants ont été distillés avant utilisation et tes suivants ont été séchés en utilisant ies réactifs indiqués entre parenthèses quand besoin était: benzène (fil de sodium), chloroforme (pentoxyde de phosphore), dichlorométhane (hydrure de calcium), diéthyl éther (fil de sodium), dioxane (alumines neutres et fil de sodium), méthanol (magnésium- iode), toluène (fil de sodium). Le pétrole (p.i. 40-60 ^* C) se rapporte à la fraction qui entre en ébullition entre 40 ^* C et 60 ^* C.

FEUILLE DE REMPLACEMENT ISA/EP

EXEMPLE 1

Synthèse de 13-hvdroxyméthyldibenzo(a.c.fluorène

(23)

(26) (21)

Méthyl fphénanthrén-9-yl. phénynhvdroxaxétale (25)

La synthèse du méthyl (phénanthrén-9-yl, phényl) 5 hydroxyacétate (25) a été effectuée dans l'éther par réaction du lithium 9-phénanthrényl (23) avec méthyl benzoyi-formiate.

Une solution de n-butyllithium dans de l'hexane (8 ml, 11 mmol ; 1.1 équiv; titré 1.38M) a été ajoutée goutte à goutte pendant 10 mn à une solution à froid (O'C) de 9-bromophénanthrène (2,57 g, 10 mmol) dans de l'éther sec (10 ml) sous azote. Le mélange de réaction a été remué oendant une heure à température ambiante. On a

FIUILLË DE REMPLACEMENT

laissé reposer la suspension en résultant puis on a retiré le surnageant à la seringue. Le résidu a été resuspendu dans de l'éther (5 ml). Cette solution a été ajoutée, sous azote, à une solution à froid (O'C) de méthyl benzoyiformiate (1 ,64 g, 1 ,4 ml, 10 mmol) dans 50 ml de diéthyléther. Le mélange résultant a été chauffé sous reflux pendant 2 heures et est resté à remuer pendant une nuit. Après addition de HCL (50 ml; pH=1) dilué (10 % VA), la couche organique a été séparée, combinée avec des lavages d'éther (2 x 50 ml) de la couche aqueuse, lavée à l'eau (2 x 50 ml) et séché avec MgSO4. Le solvant a été retiré sous vide pour obtenir une huile jaune. Après purification par chromatographie éclair (éluant : (A)), une huile jaune a été obtenue qui a été filtrée et séchée dans un dessiccateur sous vide pour obtenir le composé requis (1,75 g, 51 %) ; p.f. 143-145 ^* C (Trouvé : C, 79,7 ; H, 5,24 C23H1803 nécessite : C, 80,7 ; H, 5,26 %) ; U.c. Rf(A) 0,32 ; Rf(B) 0,76 ; μmax CH2CL2 3690 (OH libre), 3510 (OH lié H), 3025 (CH extension, aryl), 2960, 2880, 2860 (CH extension, aicoyl), 1730 (CO, ester), 1600, 1500 (anneaux aromatiques), 1225, 1185, 1170, 1110, 1100, 1070 (CO extension) cm-1 ; lambda max 296 (9832), 284 (9200), 276 (11981), 254 (48450), 248 (37620) nm ; δH (CDCI3, 200 MHz) 8,72 (1H, d, 3J = 8 Hz, aromatique), 8,16 (1H, d, 3J = 8 Hz, aromatique), 7,75-7,25 (11 H, m, aromatique), 4,32 (1H, s, OH), 3,85 (3H, s, CH3) ; δC (CDCI3, 50 MHz) 175,7 (CO, ester), 141,1, 135,6, 131,3, 130,6, 130,3, 129,8 (C quaternaires aromatiques), 129,1, 122,9, 122,2 (CH aromatiques), 82,1 (CI, quaternaire), 53,4 (CH3); m z (El) 342, 283, 105.

13-Carboxyméthydibenzo.a.c.f luorène (26)

Le traitement de (25) dans des conditions acides (conc. H2S04, CH3COOH à

10 ^* C) a mené à la formation de (26) en mauvais rendement.

De façon surprenante, le traitement de (25) avec PPA à 110' C a mené à la formation de l'ester souhaité (26) avec rendement de 42 %.

L'acide poiyphosphorique (60 g) a été chauffé à 11 O'C et remué avec une palette mécanique. A cela a été ajouté du méthyi(phénanthrén-9-yi, phényl)hydroxyacétate

(5 g, 14,6 mmol). Le mélange a été remué pendant 1 heure à 110 ^* C. La réaction a ensuite été refroidie à la température ambiante, diluée avec de l'eau (150 ml) et extraite avec de l'éthyi acétate (4 x 250 ml). Les couches organiques ont été combinées, lavées avec NaHCO3, (10% v/v ; 200 ml), de l'eau (100 mi) et séché sur MgS04. Le solvant a été retiré in ________ pour donner un solide jaune. Ce solide brut a été solidifié par chromatographie éclair en utilisant du toluène comme éluant. Après la chromatographie, ie composé requis (2,82 g, 60 %) a pu être isolé. Ce solide a été recristallisé à partir de CH2CI2/pétrole (b.p.40-60 ^* C) pour permettre un solide blanc, (1 ,96 g, 42%) ->-m.p..190-191 ^* C ; (Trouvé : C, 85,2 ; H, 4,93 C23H1602 n ^é cess ⁱ te : c.

85,2 ; H, 4,94%) ; U.c. Rf(C) 0,50 ; Rf(D) 0,56 ; μmax (CH2C12), 3040, 3020 (CH extension, aryl), 2970 (CH extension, aicoyl), 1730 (CO, ester), 1610, 1600, 1580 (anneaux aromatiques) cm-1; lambda max 364 (540), 346 (16200), 322 (18360), 268 (64800) nm ; δH (CDCI3, 200 MHz), 8,84-8,67 (3H, m, aromatique), 8,36 (1H, d, 3J = 7,8 Hz, aromatique), 7,98-7,90 (1H, m, aromatique), 7,80-7,35 (7H, m, aromatique), 5,16 (1H, s, CH), 3,63 (3H, s, CH3) ; δ C(CDCI3, 50 MHz), 172,0 (CO, ester), 142,7, 141,9, 137,4, 135,6, 131,1, 130,0, 128,7, 128,4 (C aromatiques quaternaires), 128,1 , 127,0, 126,7, 126,3, 126,2, 124,3, 124,1, 123,8, 123,3, 123,2, 122,9 (CH aromatiques), 53,4 (CH3), 52,4 (CH) ; m/z (El) 324, 265, 262, 132.

13-Hydrométhyldibenzo.a.c.fluorène .21.

La réduction de l'ester (26) a été réalisée en rendement de 48% en utilisant trois équivalents de Phydrure de diisobutylaluminium (DIBAL-H) dans du dichiorométhane à -50' C.

Le hydrure de diisobutyialuminium(4,6 ml, 4,62 mmol; 1 M dans CH2CI2) a été ajouté à -65 ^* C à une solution de 13-carboxyméthytdibenzo(a,c)fiuorène (0,5 g,

1,54 mmol) dans du dichiorométhane (10 ml). Le mélange de réaction a été remué pendant 3 heures et la température maintenue entre -50 ^* C et -40 ^* C. Un précipité blanc a été obtenu. Le mélange de réaction a été traité avec un mélange d'acide acétique et d'eau (1:1; 30 ml) et extrait avec du dichiorométhane (3 x 60 ml). La couche organique a été lavée avec du bicarbonate saturé (50 ml), de l'eau (30 ml) et séché sur MgSO4. ce solide brut a été purifié par chromatographie éclair en utilisant du chloroforme comme éluant. Le composé titre a été obtenu comme un solide blanc qui a été lavé avec du pétrole (0,217 g, 48%) ; m.p. 167-168 ^* C ; (Trouvé : C, 89,0 ; H, 5,39 ; C22H16O nécessite : C, 89,2 ; H, 5,41%) ; t.l.c. Rf(D) 0,26 ; Rf(E) 0,64 ; μmax (CH2CI2) 3610 (OH libre), 3490 (OH Lié H), 3060 (CH extension), 2940, 2890 (CH extension, aicoyl), 1610, 1600, 1580 (anneaux aromatiques) cm-1; lambda max 366 (888), 338 (12728), 322 (14504), 266 (27232), 246 (31968) nm ; δH (CDCI3, 200 MHz), 8,88-8,68 (3H, m, aromatique), 8,38 (1H, d, 3J = 7,9 Hz, aromatique), 8,14-8,08 (1H, m, aromatique), 7,81-7,33 (7H, m, aromatique), 4,45 (2H, m, HaCH2 et Hc), 3,85 (1H, m, Hb, CH2), 1,64 (1H, s, OH), δC (CDCI3, 50 MHz), 146,7, 142,5, 139,4, 134,9, 130,9, 130,1, 128,7 (C aromatiques quaternaires), 127,5, 126,8, 126,1, 125,9, 125,8, 124,7, 124,2, 124,1, 123,8, 123,4, 122,9 (CH aromatiques), 65,7 (CH2), 50,0 (CH); m z (El) 296, 265.

Cette voie fournit une synthèse de 13-hydroxyméthyldibenzo(a,c)fluorène (21) en quatre étapes avec un rendement total de 10%.

Les acétates à ia fois de l'alcool (21) et du 9-fluorèneméthanol (préparations montrées ci-dessous) ont ensuite été préparés afin de comparer leur comportement sur une colonne HPLC remplie de PGC.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

L'acétate de 9-Fluorènylméthyt (29) a donné un délai de rétention de 3.3 mn (élue avec CHCI3). alors que celui de l3-acétoxyméthytdibenzo(a.c)fluorène (30) dans les mêmes conditions n'a pas été complètement retenu sur la colonne, mais a été lentement élue.

(29) (30)

Préparation de 13-Ar*t"yγ éthyld'h ^p n-7n{a πMlυorène (30)

-13-Hydroxyméthyldibenzo(a,c)fluorène (215,2 mg, 0,727 mmol) a été dissous dans de l'anhydride acétique (5 ml). Une goutte d'acide sulfurique (2M) a été a ^j outée à cette solution. Le mélange de réaction a été remué pendant 30 mn. Un préc ⁱ p ⁱ té blanc a été obtenu, qui a été filtré et lavé avec de l'eau (150 ml). Le solide a enf ⁱ n ét ^é séché à un poids constant sur P2O5 dans un dessiccateur sous vide pour donner 13- acétoxyméthyldibenzo(a,c)fluorène sous forme d'un solide blanc, (206,3 mg, 84%) ; m.p. 135-136*C ; rouvé: C, 84,9 ; H, 5,33 C24H1802 nécessite : C, 85,2 ; H. 5,33%; U.c. Rf(D) 0.57 ; Rf(E) 0,68 ; μmax (CH2CI2) 3030 (CH extension, aryl) 2980, 2920 (CH extension, aicoyl) 1735 (CO, ester), 1610, 1600, 1570 (anneaux aromatiques) cm-1; lambda max 366 (1184).338 (25160). 322 (27528).265 (52688). 246 (53020) nm ; δH (CDCI3, 200 MHz), 8,86-8,69 (3H, m. aromatique), 9,38 (1H, d, 3J = 7.9 Hz. aromatique), 8-30-8,25 (1H. m. aromatique), 7,78-7,35 (7H, m, aromatique), 5,16 (1H, dxd, 3Ja,c = 4,1 Hz, 2Ja,b = 10,8 Hz, Ha, CH2). 4.56 (1H, dxd, 3Jc.a = 4.1 Hz.3Jc,b = 9,3 Hz. Hc). 3.76 (1H, dxd, 2Jb,a = 10,8 Hz, 3Jb,c = 9,3 Hz, Hb, CH2), 2,17 (3H, s. CH3) ; δC (CDCI3. 50 MHz) 171,0 (CO, ester), 146.7, 142 1 138.7, 134,8. 131.1. 130.1, 128,7, 128,6 (C aromatiques quaternaires), 127,6, 127A 126.8. 126.2. 126,1, 125,7, 124,9, 124,8, 124,3. -123.4, 123.3, 122,9 (CH aromatiques), 67,3 (CH2), 46,5 (CH), 20,9 (CHS) ; m/z (El) 338, 277, 265, 139, 43.

HPLC : colonne (ODS3-PL5-393. solvants : A(H20), B(CH3CN), conditions : B(50%)

^{2 mn} FEUILLE DE REMPLACEMENT

ISA EP

30 mn. B (50%) > B (95%)

lambda = 254 nm, taux de débit : 1 ml/ mn, injection : 5 μl, c = 1 ,42 mg/ml, AUFS = 2, délai de rétention : 21,6 mn.

Préparation de 9-Fluorénylméthyacétate (29)

9-Fluorénylméthanol (0,215 g, 1,1 mmol) a été dissous dans de l'anhydride acétique (5 ml). Deux gouttes d'acide sulfurique (2M) ont été ajoutées à cette solution. Celle-ci a été remuée pendant 30 mn. La solution claire a été versée sur de l'eau froide (20 ml). Le précipité obtenu a été récupéré sur un filtre Bϋchner et séché à un poids constant sur P205 dans un dessiccateur sous vide pour donner 9- fluorényiméthylacétate sous forme d'un solide blanc, (0,175 g, 67%) ; m.p. 83-84 ^* C ; (Trouvé : C, 80,5 ; H, 5,98 C16H14O2 nécessite : C, 80,7; H, 5,88%) ; U.c. Rf(D) 0,50 ; Rf (E) 0,68 ; μmax (CHCI2) 3030 (CH extension), 2960, 2910 (CH extension, aicoyl), 1735 (CO, ester), 1610 (anneaux aromatiques) cm-1; lambda max 300 (2476), 290 (2063), 268 (7634) nm; δH (CDCI3, 80 MHz), 7,83-7,29 (8H, m, aromatique), 4-46-4,28 (3H, m, CH, CH2), 2,14 (3H, s, CH3) ; δC (CDCI3, 50 MHz), 170,8 (CO, ester), 143, 6, 141,1, (C aromatiques quaternaires), 127,6, 126,9, 124,9, 119,9 (CH aromatiques), 66,2 (CH2), 46,5 (CH), 20,8 (CH3) ; m/z (El) 238, 178, 165, 149, 60, 43.

HPLC : colonne (ODS3-PL5-393, solvants A(H20), B(CH3CN) Conditions : B(50%) 2mn.

30 mn. B (50%) > B (95%)

lambda = 254 nm, taux de débit : 1 ml/ mn, injection : 5 μl, C = 1,46 mg/ml, AUFS = 2, délai de rétention : 8,4 mn.

FEUILLE DE REMPLACEMENT JSA/EP

EXEMPLE 2

Synthèse de 17-Hvdroxvméthyltétrabenzo(a.c.ç i.fluorène (31.

Le tétrabenzofluorényl alcool (31) a été préparé comme suit :

(a) BuLi, Et2O, d.r., 30 mn ; EtOOCCOOEt, Et2O, 0 ^* C-5 ^* C, 2h, 63%; (b) 9- Bromophénanthrène, BuU, Et2O, d.r., 30 mn ; (32), Et20, 0 ^* -5 ^* C. 2h. 46%; (c) PPA, 140 ^* C, 4h, 49%; (d) DIBAL-H (3 équiv.), CH2CI2, -65 ^* C, 1h, 73%.

Etf.yf.2 oχo-2-(phénaηthréη-9'-yl)açétate (32)

L'ester D-céto (32) a été synthétisé en ajoutant du 9-phénanthrényl lithium à une solution de diéthyi oxalate (20% excès) dans de l'éther à O'C. Le mélange de réaction a été ensuite chauffé sous reflux pendant 2 heures. Après purification par chromatographie éclair, ie produit a été isolé en rendement à 23%. L'ester D-céto (32) peut aussi être avantageusement préparé dans l'éther, en ajoutant avec précaution du 9-phénanthrényl lithium à une solution de diéthyi oxalate (20% excès), entre O'C et 5 ^* C, et en remuant ensuite ia réaction à la température amb ⁱ ante. FEUILLE DE REMPLACEMENT

On a ajouté à O'C sous azote une solution de n-butyllithium dans de l'hexane (16 ml, 22 mmol ; 1,1 équiv ; 1.38M titré) goutte à goutte à une solution remuée de 9- bromophénanthrène (5,14 g, 20 mmol) dans de l'éther sec pendant 10 mn. la réaction a été remuée pendant 1 heure à température ambiante. On a laissé reposer la suspension en résultant et le surnageant a été retiré à la seringue. Le résidu a été suspendu de nouveau dans de l'éther (10 ml). Cette suspension a été ajoutée sous azote à une solution à froid (O'C) de diéthyi oxalate (3,4 ml, 25 mmol) dans de l'éther (100 ml). La température a été maintenue entre O'C et 5 ^* C pendant l'addition. Le mélange de réaction a ensuite été remué pendant 2h entre 0 ^* et 5 ^* C et finalement à température ambiante pendant 2h. Après addition d'HCI dilué (100 ml ; 10% v/v), la couche organique a été séparée, combinée avec des lavages d'éthyl acétate (3 x 100 ml) de ia couche aqueuse, neutralisée avec une solution de NaHCO3 (100 ml ; 1 M), lavée avec de l'eau ((50 ml) et séchée sur MgSO4. Le solvant a été retiré in vacuo pour donner une huile orange qui a été homogénéisée avec du pétrole (p.i. 40' C-60 ^* C). Le composé titre a été obtenu sous la forme d'un solide jaune qui a été filtré et séché, (3,53 g, 63%) ; p.f. 67-68'C ; (Trouvé : C, 77,5 ; H, 5,02 C18H14O3 nécessite : C, 77,7 ; H, 5,04%) ; U.c. Rf(A) 0,56, Rf(D) 0,52 ; μmax (CH2CI2) 3070 (CH extension, aromatique), 2990, 2940, 2910, 2880 (CH extension, aicoyl), 1735 (CO, ester), 1680 (CO, cétone), 1620, 1575 (anneaux aromatiques) cm-1; lambda max 328 (9822), 286 (7784), 252 (34842) nm ; δH (CDCI3, 200 MHz) 9,04 (1H, m, aromatique), 8,62 (2H, m, aromatique), 8,23 (1H, s, H10 aromatique), 7,92 (1H, d, 3J = 7,6 Hz, aromatique), 7,78-7,59 (4H, m, aromatique), 4,51 (2H, 9, 3J = 7,1 Hz, CH2), 1,48 (3H, t, 3J = 7,1 Hz, CH3), δC (CDCI3, 50 MHz) 188,5 (CO, cétone), 164,4 (CO, ester), 137,2 (CH aromatique), 132,8 (aromatique quaternaire), 130,5, 130,2 (CH aromatiques), 129,2, 128,1 (C aromatiques quaternaires), 128,0, 127,4, 127,1, 126,3, 122,7, 122,6 (CH aromatiques), 62,3 (CH2), 14,0 (CH3) ; m/z (El) 278, 205, 177, 176.

EthvKbis-Phénantrèn-9'-yl.hvdroxv acétate

L'alcool tertiaire (33) a été synthétisé en rendement approprié dans des conditions similaires en utilisant (32) comme composant céto ester.

On a ajouté une solution de n-butyllithium dans de l'hexane 127 (8 ml, 11 mmol; 1,1 équiv. ; 1,38 M titré) à une solution de 9-bromoρhénanthrène (2,57 g, 10 mmol) dans de l'éther sec (10 ml), à O'C sous azote goutte à goutte pendant 10 mn. Le mélange de réaction a été remué pendant une heure à température ambiante. Cette solution a été ajoutée sous azote à une solution à froid (O'C) d'éthyl,2-oxo- 2(phénanthrèn-9'-yl)acétate (2,78 g, 10 mmol) dans de l'éther (50 ml). La température a été maintenue entre O'C et 5'C pendant l'addition. Le mélange de réaction a finalement été r_Mmà.à .temDératι_fe. arelàante estât _f cieux heures.

Aorès addition de FEUILLE DE REMPLACEMENT

HCI dilué (50 ml; 10% v/v) la couche organique a été séparée, combinée avec des lavages d'éthyl acétate (3 x 250 ml) de la couche aqueuse, neutralisée avec une solution de NaHCOS (1 M; 200 ml), lavée avec de l'eau (200 ml) et finalement séchée sur MgSO4. Le solvant a été retiré in vacuo pour obtenir un résidu. Après purification par chromatography éclair utilisant du chloroforme/pétrole (p.i.40 ^* C-60 ^* C) (4 : 1), te produit attendu a été obtenu à partir des fractions contenant du matériau de Rf = 0,23. Après recristallisation du dichiorométhane/pétrole (p.i. 40 ^* C-60 ^* C), un solide blanc a été obtenu qui a été filtré et séché pour donner le composé titre (2,11 g, 46%) ; p.f. 188-189 ^* C ; (Trouvé : C, 83,1; H, 5,23 C32H24O3 nécessite : C, 84,2 ; H, 5,26%) ; tl.c. Rf (E) 0,71; Rf (D) 0,48 ; μmax (CH2C12) 3680 (OH libre), 3510 (OH lié H), 3060 (CH extension, aromatique), 2990, 2940 (CH extension, aicoyl), 1735 (CO, ester), 1600 (anneau aromatique) cm-1; lambda max 332 (629), 300 (25080), 288 (23560), 256 (123120) nm; δH (CDCI3, 200 MHz), 8,80-8,69 (4H, m, aromatique), 8,51 (1H, s, H10, aromatique). 8,47 (1H, s, H10, aromatique), 7,72-7,41 (12H, m, aromatique), 4,46 (1H, s, OH).4,41 (2H, 9, 3J = 7,1 Hz, CH2), 1.17 (3H, t, 3J = 7,1 Hz, CH3), δC (CDCI3, 50 MHz) 1 /5,7 (CO, ester), 135,0, 131,4, 130,6, 130,5, 130,1 (C aromatiques quaternaires), 129,2, 128,2, 127,3, 126,6, 126,2, 126,1, 122,9, 122,3 (CH aromatiques), 84,3 (C1, quaternaire), 62,9 (CH2), 13,8 (CH3); m/z (El) 383, 206, 177, 176.

17-Carboxγéthvltétr-_Denzo(a.c.g.miuorène (34_

Le traitement de (33) avec de l'acide polyphosphorique à 140 ^* C a mené à la formation d'ester cyclique (34) en rendement à 49% γj__ 4-électrocyciisation du cation D-éthoxycarbonyi diaryl.

FEUILLE DE REMPLACEMENT __ ISA/EP

(34)

La purification de (34) est difficile du fait de la formation de produits latéraux. La recristaliisation du matériau brut à la suite de ia chromatographie éclair peut être réalisée. De l'acide poiyphosphorique (20 g) a été placé dans un récipient à fond rond de 100 ml à trois goulots équipé d'une palette mécanique pour remuer. De l'éthyl C__S-phénanthrèn-9'-yl) hydroxy acétate (0,402 mg, 0,881 mmol) a ensuite été ajouté et ia réaction a été remuée à 140 ^* C pendant quatre heures puis à température ambiante jusqu'au lendemain. Le mélange de réaction a été dilué avec de Seau (50 ml) et extrait avec de l'éthyl acétate (4 x 50 ml). La couche organique a été neutralisée avec NaHC03 (1 M ; 2 x 30 ml), lavée avec de l'eau (30 ml).

Après la chromatographie éclair et la recristallisation de DCM, des cristaux de (31) ont été obtenus et se sont avérés appropriés à une analyse radiographique.De I'hydrure de diisobutyialuminium (12,3 ml, 12,3 mmol ; 3 équiv. ; solution de 1 dans CH2CI2) a été ajouté goutte à goutte à -65 ^* C à une solution de 17- carboxyόthyltόtrabθnzo(a,c _l g,i)fluorène (1,795 g, 4,098 mmol) dans du dichiorométhane distillé à sec (25 ml). La température a été maintenue entre -65 ^* C et -60'C pendant l'addition. Le mélange de .action a été remué pendant une heure à -65 ^* C et à la température ambiante pendant encore une heure. Le mélange de réaction a été refroidi à -30 ^* C. Une solution aqueuse d'acide acétique (50 ml ; 10% v/v) a ensuite été ajoutée goutte à goutte. Après séparation des deux couches, la phase aqueuse a été extraite avec du dichiorométhane (3 x 100 ml). Les phases organiques combinées ont été lavées avec de l'eau (70 ml) et neutralisées avec du NaHC03. Enfin, la phase organique a été séchée sur du MgS04 et évaporée pour donner une huile brute (1,7 g). Après purification par chromatographie éclair utilisant du benzène comme éiuant, les fractions contenant du matériau de Rf = 0,14 ont été évaporées pour donner un solide jaune. Celui-ci a été recristallisé à partir de CH2CI2/pétrole (p.i.40 ^* C-60 ^* C) pour donner le com ^p osé titre sous forme d'un solide jaune (1 ,18 g, 73%) ; p.f. FEUILLE DE REMPLACEMENT

ISA/EP

202-203 ^* C ; (Trouvé : C, 91,2 ; H, 4,96 C30H20O nécessite : C, 90,9; H, 5,05%) ; U.c. Rf (F) 0,15, Rf (A) 0,18, Rf (B) 0,75 ; μmax (CH2CI2) 3600 (OH libre), 3060 (CH extension, aromatique), 2940, 2900 (CH extension, aicoyl), 1610, 1500 (anneaux aromatiques), 1045 (CO extension) cm-1; lambda max 380 (10692), 368 (11484), 302 (27324), 290 (21780), 254 (43560) nm ; δH (CDCI3, 200 MHz), 8,80-8,63 (6H, m, aromatique), 8,27-8,22 (2H, m, aromatique), 7,73-7,56 (8H, m, aromatique), 5,05 (1H, t, 3J = 4,3 Hz, CH), 4,49 (2H, d, 3J = 4,3 Hz, CH2), 1,31 (1H, s, OH) ; δC (CDCI3, 50 MHz), 141,6, 137,3, 131,4, 130,4, 128,5, 127,9 (C aromatiques quaternaires), 127,4, 126,9, 126,1, 125,9, 125,0, 124,5, 123.4 (CH aromatiques), 66,5 (CH2), 50,8 (CH) ; m/z (El) 396 (M+), 366.

La structure des cristaux de l'alcool (31) indique qu'il y a deux molécules maintenues ensembles par une liaison d'hydrogène entre les deux groupe hydroxyl. Les Figures 1 et 2 montrent la structure des cristaux de l'alcool (31). Le groupe hydroxyméthyl exocyclique a deux conformations différentes, probablement parce que c'est nécessaire à ta formation du dimère lié par hydrogène. L'interaction entre H8 et H9 (d = 2,03 A, rayon de Van der Waal pour l'hydrogène = 1,2 A) est responsable d'un degré de non-planarité dans la molécule. Cependant, la molécule est suffisamment planaire pour tes besoins de l'invention. Cette molécule est chirale si elle adopte une orientation fixe, comme dans la structure des cristaux. Donc, il est possible que dans une solution à basse température, la molécule puisse également adopter une orientation fixe et qu'elle soit chirale. 1 H R.M.N. à température ambiante dans CDCI3 a montré un triplet (δ = 5,05 ppm) ainsi qu'un doublet (δ = 4,5 ppm), correspondant à H(17) et les deux protons du groupe méthylène respectivement. Une explication probable est que les anneaux de phénanthrène peuvent osciller rapidement pendant ia période d'acquisition et par conséquent les protons du groupe CH2 sont magnétiquement équivalents (comme le sont les paires correspondantes de protons aromatiques, par exemple H(2) et H(15).

Les expériences nucléaires d'Overhauser effectuées sur ce composé ont démontré les interactions étroites dans t'espace entre le groupe méthylène et les deux protons aromatiques H(1 ) ET H(16).

EXEMPLE 3

Synthèse de 17-acétoxyméthyltétrabenzo(a.c.α.i.fluorène (35.

17-acétoxyméthyltétrabenzo(a,c,g,i)fluorène (35) a été facilement préparé dans un rendement à 80% d'alcool (31) en utilisant un grand excès d'anhydride acétique et une quantité catalytique d'acide sulfurique.

FEUILLE DE REMPLACEMENT ISA/EP

O

Comme prévu, l'acétate (35) a été totalement retenu une fois passé par une colonne HPLC remplie de PGC (éluant CHCI3). Du 17-Hydroxyméthyitétrabenzo(a,c,g,i)fluorène (0,207 g, 0,522 mmol) a été dissous dans de l'anhydride acétique (4 ml). 2 gouttes de H2SO4 (2M) ont été ajoutées à cette solution. Le mélange de réaction a été remué pendant 1 heure. Le composé titre a été obtenu sous la forme d'un solide jaune qui a été lavé avec de l'eau (80 ml) et séché à poids constant sur du P205 dans un dessiccateur sous vide (183,8 mg, 80%) ; p.m.209-210' C, (Trouvé : C, 87,0 ; H, 5,08 C32H2202 nécessite : C, 87,7 ; H, 5,02%) ; U.c. Rf (A) 0,32, Rf (F) 0,22 ; μmax (CH2CI2) 3060 (CH extension, aromatique), 1740 (CO, ester), 1610, 1500 (anneaux aromatiques), 1230, 1045 (CO, extension) cm-1; lambda max 380 (17885), 368 (19345), 302 (45260), 290 (35865), 254 (72271) nm ; δH (CDCI3, 80 MHz), 8,83-8,57 (6H, m, aromatique), 8,29-8,17 (2H, m, aromatique), 7,78-7,54 (8H, m, aromatique), 5,12 (1H, t, 3J = 5,5 Hz, CH), 4.6C (2H, d, 3J ≈ 5,5 Hz, CH2), 1,84 (3H, s, CH3) ; δC (CDCI3, 50 MHz) 170,7 (CO, ester), 141,8, 137,0, 131,5, 130,4, 128,6, 128,0 (C aromatiques quaternaires), 127,4, 126,8, 126,1, 126,0, 125,0, 124,9, 123,5, 123,3 (CH aromatiques), 67,9 (CH2), 47,1 (CH), 20,7 (CH3) ; m/z (El) 438 (M+), 378, 364.

EXEMPLE 4

Conversion de 17-hydroxyméthvttétrabenzo (a.c.α.i. ftuorène en chtoroformiate

Le chloroformiate ((37) est synthétisé par la séquence de réactions suivante : traitement de l'alcool (31) avec de l'urée N, N'-feis-triméthylsilyt (2,5 équiv) pour donner l'éther triméthylsilyl (39) correspondant, suivi par la réaction de ce dernier avec du phosgène. Après la recristallisation, le produit pur peut être obtenu en rendement de 21%. PEU1LLE DE REMPLACEMENT

ISA/EP

(31) (39) (37)

(a) Urée N.N'-fejs-triméthylsilyl (2,5 équiv), CH2CI2, reflux, 3h, 81%; (b) phosgène (7,5 équiv), CH2CI2, reflux, 2h, 21%.

17-fTriméthvteilγnoχvméthyltétrabenzofc.c.Q.i .f luorène (39.

Une solution de 17-hydroxyméthyttétrabenzo(a,c,g,i) f luorène (0,05 g,

0,126 mmol) et d'urée N.N'-bis-triméthyisilyl (32,3 mg, 0,158 mmol ; 2,6 équiv.) dans du dichiorométhane (2 ml) a été chauffée sous reflux pendant trois heures. L'urée précipitée a été filtrée et iavée avec du dichiorométhane (2 x 1 ml). Le solvant a été retiré ]n vacuo pour donner un résidu. Une purification par chromatographie éclair humide (benzène/pétrole (p.i.40-60' C) (75:25)) a donné le composé titre (47,8 mg, 81%) ; p.f. 130-131 'C ; (Trouvé: C, 84,2 ; H, 6,06 C33H280 Si nécessite : C, 84,6 ; H, 5,98%) ; U.c. Rf (F) 0,58, Rf (A) 0,51, Rf (G) 0,76 ; δH (CDCI3, 80 MHz) 8,86-8,62 (6H, m, aromatique), 8,49-8,37 (2H, m, aromatique), 7,79-7,51 (8H, m, aromatique), 5,11 (1H, t, 3J ≈ 5,3 Hz, CH), 4,13 (2H, d, 3J = 5,3 Hz, CH2), 0,4 (9H, s, 3xCH3) ; δC (CDCI3, 67 MHz) 143,4, 136,5, 131,4, 130,3, 129,0, 128,1 (C aromatiques quaternaires), 127,4, 126,5, 125,9, 125,8, 125,6, 124,9, 123,5, 123,0 (CH aromatiques), 67,2 (CH2), 51 ,4 (CH), -1 ,0 (3xCH3); m/z (El) 468 (M+), 378, 364.

17-Tétrabenzo(a.c.g.i.fluorénylméthyl chloroformiate (37)

Du phosgène (1,5 ml, 2,9 mmol; 7,5 équiv; 1,93 M dans le toluène) a été ajouté à une solution de 17-(triméthyisilyl)oxyméthyltétrabenzo(a,c,g,i)f luorène (0,177 g, 0,38 mmol) dans du dichiorométhane (5 ml). Le mélange de réaction a été chauffé sous reflux pendant 2 heures puis remué à la température ambiante pendant 48 heures, sous azote. Le solvant a été retiré in vacuo pour donner le composé titre sous forme d'un solide jaune qui a été recristallisé à partir de dichlorométhane/n- hexane FEUILLE DE REMPLACEMENT

(36,9 mg, 21%) ; p.f. 188-189'C ; (Trouvé : C, 80,9 ; H, 4,29 ; N, 0,45 C31H19O2CI nécessite : C, 81 ,1; H, 4,14%) ; μmax (CH2CI2) 3060 (CH extension, aromatique), 1775 (CO, chloroformiate), 1610, 1500 (anneaux aromatiques), 1 .60, 1140 (CO, extension) cm-1; δH (CDCI3, 200 MHz) 8,79-8,60 (6H, m, aromatique), 8,20-8,15 (2H, m, aromatique), 7,76-7,57 (8H, m, aromatique), 5,17 (1H, t, 3J = 5,7 Hz, CH), 4,77 (2H, d, 3J = 5,7 Hz, CH2) ; δC (CDCI3, 50 MHz) 150,5 (CO, chloroformiate), 140,3, 137,2, 131,6, 130,5, 128,2, 127,7 (C aromatiques quaternaires), 127,5, 127,0, 126,3, 126,2, 125,1, 124,5, 123,5, 123,4 (CH aromatiques), 74,6 (CH2), 46,5 (CH).

EXEMPLE 5

Préparation de N-17-tétrabenzo(a.c.g.i.fluorénylméthoxycart_ onylplvcine rrhfmoc Glv OH.

Tbfmoc Gly OH a été synthétisé en trois étapes de à partir de l'acool (31) via le carbonate p-nitrophényl (41).

( ² )^_ _ Tbfmoc Gly OH (36)

FEUILLE DE REMPLACEMENT ISA/EP

(a) cars-Nitrophényl chloroformiate (2 équiv), N.N'-diméfhylaniline (1 équiv), CH2CI2. d.r., 72h, 80%; (b) CH3COOH. NH2CH2COOC(Me)3, N.N'-diméthylaniline (2 équiv), CH2CI2, d.r., 24h, 79%; (c) acide pâTâ-toluènesulfonique (0,3 équiv), CH2CCI2, reflux, 5h, 90%. La réaction du chloroformiate βâ_â-nitrophényl (2 équiv) avec de l'alcool (31) et

N.N'-diméthyianiiine a donné ie carbone mélangé (41) en rendement de 80%. Ce matériau a à son tour réagi avec ie sel d'acétate de glycine tgrt-butyl ester en présence de deux équivalents de N.N'-diméthylaniline pour donner la glycine tert- butyl ester protégée (42) (79%). Une simple hydrolise de cette dernière en utilisant de l'acide p-toiuènesuifonique dans le DCM en reflux a donné l'acide souhaité (36) en rendement de 90%. Ceci est un synthèse facile de Tbfmoc Gly OH utilisant des conditions légèrement basiques dans un rendement total à 57% basé sur l'alcool (31).

17-Tétrabenzo(a.c.g.i.fluorénvtméthyl-p-nitrophényt carbonate (41.

De la N.N'-diméthyianiline (16 μl, 0,126 mmol) a été ajoutée à une solution de 17-hydroxyméthyl tétrabenzo(a,c,g,i)f luorène et de chioroformiate p-nitrophényl (35,5 mg, 0,175 mmol ; 1,4 équiv.) dans du dichiorométhane (2 ml). La réaction a été remuée à la température ambiante sous azote pendant 24h. La réaction a été complétée en ajoutant plus de chioroformiate p-nitrophényl (45 mg, 0,233 mmol ; 1,7 équiv.) et en ta remuant à la température ambiante pendant 48 heures de plus. Après purification par chromatographie éclair en utilisant du toluène comme étuant, tes fractions contenant le matériau de Rf=0,29 ont été évaporées pour donner une huile jaune. L'homogénéisation dans du pétrole (p.. 40-60 ^* C) a donné le com ^p osé titre sous la forme d'un solide jaune (56,5 mg, 80%) ; p.f. 139-140 ^* C ; (Trouvé : C, 77,7 ; H, 3,94 ; N, 2,29 C37H23NO5 nécessite : C, 79,1; H, 4,10 ; N, 2,49%); U.c. Rf (C) 0,29. Rf (A) 0,16 ; μmax (CH2CI2) 3060 (CH extension, aromatique), 2960, 2930, 2880 (CH extension, aicoyl), 1770 (CO, carbonate), 1620, 1600, 1495 (anneaux aromatiques), 1530, 1350 (nitro-NO2 conjugués), 1215 (CO extension), 860 (CH courbure, p-disubstitué) cm-1; lambda max 366 (20035) 301 (52092), 289 (48085), 260 (85751), 252 (88957) nm; δH (CDCI3, 200 MHz) 8,79-8,76 (4H, m, aromatique), 8,61-8,57 (2H, m, aromatique), 8,33-8,16 (2H, m, aromatique), 7,91 (2H, d, JAB __ 8,9 Hz, β-nitrophényi), 7,76-7,56 (8H, m, aromatique), 6,64 (2H, d, JAB = 8,9 Hz, p- nitrophényl), 5,14 (1H, t, 3J ≈ 4,7 Hz, CH), 4,96 (2H, d, 3J = 4,7 Hz, CH2); δC (CDCI3, 50 MHz) 154,9 (CO, carbonate), 151,6 (CI ^* aromatique quaternaire), 144,9 ((^.'aromatique quaternaire), 140,3, 137,4, 131,5, 130,4, 128,3, 127,7 (c aromatiques quaternaires), 127,4, 127,0, 126,2, 125,1, 124,7, 124,1, 123,5, 121,2 (CH aromatiques), 125,3 (CH2', 6' aromatique), 121,4 (CH3'5' aromatique), 71,2 (CH2), 46,8 (CH) ; m/z (El) 378, 139, FEUILLE DE REMPLACEMENT

44 ; (FAB) 561 (M+), 379. HRMS 561.15759, C37H23NO5 nécessite : 561.15761 ( ) <1 ppm.

N-17-Tétrabenzo(a.c.q.i.fluorénylméthoxycarbonylqtycin e tert-butv ester (42.

De l'aniline N.N'-diméthyl (18 μl, 0,14 mmol ; 2 équiv) a été ajoutée à une solution de 17-tétrabenzo(a,c,g,i) fluorénylméthyl-p-nitrophényl carbonate (39,2 mg, 0,07 mmol) et de sel d'acétate glycine îsjj-butyl ester (14,7 mg, 0,077 mmol ; 1,1 équiv.). Le mélange de réaction a été remué à ia température ambiante, sous azote, pendant 72 heures. Après addition d'eau (10 ml) et acidification avec KHS04 (2M ; pH=1), ie mélange de réaction a été extrait avec du dichiorométhane (3 x 15 ml), lavé avec de l'eau (3 x 20 ml) et séché sur du MgSO4. Le solvant a été retiré in vacuo pour donner une huile orange qui a été homogénéisée dans de l'éther. Un solide jaune a été obtenu qui a été filtré, lavé avec du pétrole (p.i.40-60 ^* C) et séché pour donner le composé titre (30,6 mg, 79%) ; p.f. 170-171 ^* C ; (Trouvé : C, 79,7 ; H, 5,51; N, 2,33 C32H3NO4 nécessite : C, 80,3 ; H, 5,60 ; N, 2,53%) ; U.c. Rf (H) 0,79, Rf (I) 0,95 ; μmax (CH2CI2) 3440 (NH amidé secondaire), 3060 (CH extension, aromatique), 2940 (CH extension, aicoyl), 1725 (CO, uréthane, ester et amidé I), 1660, 1500 (anneaux aromatiques), 1520 (amidé II), 1340 (lien OH) cm-1, 1220, 1160, 1110 (CO extension), 865, 850 (lien CH hors plan); lambda max 384 (16323), 367 (17656), 302 (42641), 290 (34313), 262 (62296) nm ; δH (CDCI3, 80 MHz) 8,85- 8,60 (6H, m, aromatique), 8,39-8,28 (2H, m, aromatique), 7,81-7,56 (8H, m, aromatique), 5,27 (1H, t, 3J = 6 Hz, CH), 4,98 (1H, s, large, NH), 4,61 (2H, d, 3J = 6 Hz, CH2), 3,74 (2H, d, 3J = 6 Hz, CH2 glycine), 1,44 (9H, s, CH3x3) ; δC (CDCI3, 50 MHz), 168,7 (CO, ester), 156,1 (CO, uréthane), 141,9, 136,7, 131,5, 130,3, 128,7, 127,9 (C aromatiques quaternaires), 127,4, 126,8, 126,0, 125,8, 125,3, 124,9, 123,5, 123,1 (CH aromatiques), 82,0 (C quaternaire, CMe3), 69,0 (CH2), 47,5 (CH), 43,2 (CH2, glycine), 27,9 (CH3x3) ; m/z (FAB) 553,379. HRMS 553.22527, C32H31NO4 nécessite 553.225529 ( ) < 1 ppm.

N-17-Tétrabenzo(a.c.g.i.fluorénylméthoxycarbonvl glvcine. Tbfmoc GLYOH (36)

Une solution de N-17-tétrabenzo(a,c,g,i)fluorényl méthoxycarbonyl glycine îeû- butyl ester (0,392 g, 0,708 mmol) et d'acide p-toluènesulfonique (39,2 mg, 0,206 mmol) dans du dichiorométhane (15 ml) a été chauffé sous reflux pendant 4,5 heures, au cours desquelles un précipité s'est formé. Ce précipité a été filtré, lavé avec du dichlorométhane(2 x 15 ml) et séché pour donner le composé titre (319 mg, 90%) ; p.f. 240-241 'C ; (Trouvé : C, 77,7 ; H, 4,5 ; N, 2,0 C33H23NO4 nécessite : C, 79,7 ; H, 4,63 N, 2,82%) : . Le fîf (H_ 0_56. Ri (il .0,80 ; μmax (disque KBr) 3320 (NH extension..3060 FEUILLE DE REMPLACEMENT

(CH extension, aromatique), 1735 (CO, acide), 1710 (CO, uréthane), 1680 (amidé I), 1540 (amidé II), 1610, 1500 (anneaux aromatiques), 1435 (CH déformations, aicoyl), 1310 (OH courbure), 1260, 1240, 1175, 1160, 1040 (CO extension), 1000, 745, 720 (courbure CH hors plan) cm-1; lambda max 382 (21744), 368 (23297), 303 (55913), 291 (45041), 264 (82005), 255 (88839) nm; δH (d-dioxane, 200 MHz), 9,05-8,97 (4H, 2xd, aromatique), 8,83 (2H, d, 3J = 7,8 Hz, aromatique), 8,64 (2H, d, 3J = 7,8 Hz, aromatique), 7,95-7,74 (8H, m, aromatique), 6,53 (1H, t, 3J = 5,8 Hz, NH), 5,61 (1H, t, 3J = 5,8 Hz, CH2 glycine) ; δC (d-dioxane, 50 MHz) 170,6 (CO, acide), 156,2 (CO, uréthane), 142,5, 136,2, 131,3, 130,0, 128,7, 127,7 (C aromatiques quaternaires), 127,0, 126,5, 125,6, 125,4, 124,5. 123.3, 122,8 (CH aromatiques), 68,3 (CH2), 47,6 (CH), 41,5 (CH2, glycine) ; m/z (FAB) 497, 397. HRMS 498.17053, C33H24NO4 nécessite 498.17052 ( ) < 1 ppm.

HPLC : colonne (RP 18), solvants : A (H2O/TFA(0,1%)), B(CH3CN TFA(0,1%); conditions : B (75%), A (25%) ; iambda=229 nm, AUFS=2 ou iambda=368 nm, AUFS=1; taux de débit : 1 ml/mn ; injection ; 25 μl, C=1,3 mg ml (dioxane/eau (1:1)), délai de rétention : 5,4 mn.

Synthèse en phase solide

Tous les dérivés des acides aminés protégés ont été achetés chez Novahiochem et ont une stéréochimie-L. La synthèse des peptides en phase solide a été effectuée . sur. un synthétiseur à peptides 430 A de Appiied Biosystems (Biosystèmes Appliqués). Le DMF utilisé a été fournie par Rathbum Chemicals Ltd. (grade de synthèse des peptides). Le premier résidu de chaque séquence (c'est-à- dire le résidu terminal-C) a été couplé à la résine d'alcool p-aikoxbenzyi à l'extérieur du synthétiseur. L'étendu de l'accouplement a été déterminée par la déprotection d'un échantillon-réduit de la résine chargée et par un contrôle quantitatif de i'oléfine produite par UV à 300 nm dans le cas des peptides-Fmoc et à 364 nm dans ie cas des peptide Tbfmoc. Chaque résidu a été couplé deux fois (2 équiv.), d'abord par la méthode d'anhydride symétrique et ensuite par la méthode d'ester actif HOBt ("double accouplement") (sauf Arg, Asn, Gin couplés en double via ester HOBt et Gly couplé une fois iâ anhydride symétrique (4 équiv.). Des anhydrides symétriques préformés ont été préparés à partir d'acides Fmoc-aminés (1 mmol) et DICI (0,5 mmol) avec un délai d'activation de 15 minutes, et des esters HOBt à partir d'acides Fmoc-aminés (0,5 mmol), DICI (0,5 mmol) et HOBt (0,5 mmol) avec un délai d'activation de 30 minutes. Les réactions d'accouplement ont été effectuées sur une période de 30-60 minutes. L'amorçage des fonctions aminées non réagies a été exécuté pendant 6 minutes en FEUILLE DE REMPLACEMENT

ISA/EP

utilisant de l'anhydride acétique et de ia pyridine dans la DMF. La déprotection de résine-peptide-Fmoc a été réalisée sur une période de 12 minutes (5+3+3+1 minutes) en utilisant une solution de piperidine à 20% dans la DMF. La résine a été complètement lavée avec de la DMF à la fin de chaque cycle. En tant qu'élément de surveillance brut des accouplements, la solution du produit des étapes de déprotection a été alimentée à travers un détecteur d'ultraviolets (313 nm) et son absorption a été enregistrée pour donner une série de crêtes. Le retrait des peptides de la résine et le clivage simultané des groupes protecteurs de la chaîne latérale ont été effectués en utilisant un mélange de acide trifluoroacétique/eau/égoutier (95:5:5) pendant 2-3 heures. La chromatographie des peptides protégés-Nδ a été réalisée en utilisant du carbone graphitisé (PGC 220-224 ; 150-180 pm, 100 m g) dans une colonne de verre. HPLC a été effectué sur un système Waters en utilisant une colonne Prep aquapore ABI 10 C-18 taille de pore 300 A silicium sphérique 20 μm (10 mmDI x 250 mm) pour les séparations de préparation et une colonne ABI RP 18 aquapore DE 300 silicium sphérique 7 μm (4,6 mmDI x 220 mm) pour les séparations analytiques. On a utilisé un gradiant, comme spécifié entre parenthèses, entre le solvant A (0,1% TFA dans l'eau) et le solvant B (0,1% dans de l'acétonitrile). Le taux de débit était de 1 ml/mn pour le HPLC analytique et de 5 ml/ mn pour ie HPLC de préparation. L'éiution des échantillons a été surveillé par absorption d'ultraviolets à 214 nm. Les analyses d'acides aminés ont été effectués sur un analyseur d'acides aminés LKB 4150 alpha après une hydrolyse en tube étanche dans de l'acide hydrochlorique en ébullition constante à 11 O'C pendant 18-36 heures.

Synthèse de Fmoc Glv Ser Met Val Leu Ser OH et Tbfmoc Gly Ser Met Val Leu

Ser OH et comparaison de ses propriétés

a. Synthèse de Fmoc Glv Ser Met Val Leu Ser OH

Le peptide lié à la résine protégé Fmoc Ser (OtBu) Met Val Leu Ser (OtBu) (43) a été préparé sur un synthétiseur à peptides en utilisant une stratégie orthogonale. Fmoc a été utilisé pour la protection temporaire de la fonction aminée de chaque acide aminé et a été retiré avant chaque accouplement avec une solution de piperidine à 20% dans du DMF. La fonction de chaîne latérale de la serine a été protégée avec le groupe t-butyl. Les procédures d'accouplement ont impliqué un anhydride symétrique suivi d'un accouplement d'ester HOBt. De l'anhydride acétique et de la pyridine ont été utilisés pour acétyler toute fonction aminée non réagie. La résine Meπifield a été employée avec le groupe p-alkoxybenzylalcool comme lien.

Fmoc Gly Ser Met Val Leu Ser OH (44) a été synthétisé à partir du peptide lié à ia résine (43) via les séries de (éactior&souiigné s G! qsspu*

FEUILLE DE REMPLACEMENT

t-Bu t-Bu

Fmoc - Ser - Met - Val - Leu - Ser •

Déprotection 20%/DMF

NH2 - R

Fmoc Gly OH (6 équiv)/

Accouplement DIC (3 équiv), dioxane, 5h, d.r. t-Bu t-Bu

Fmoc,Gly - Ser- Met -Val - Leu - Ser- R

Déprotection TFA/dismutases

Fmoc - Gly - Ser - Met - Val - Leu - Ser - OH (44)

Après déprotection du groupe Fmoc dans des conditions basiques le terminus- aminé du peptide a été accouplé dans du dioxane à Fmoc Gly OH yjs son anhydride symétrique (3 équiv) avec une efficacité d'accouplement de 88%. Le clivage de l'hexapeptide de la résine et le retrait des groupes t-butyl ont été exécutés en utilisant du TFA, et en présence de sulfure d'éthyle et de méthyie et d'anis oie comme dismutases de cation. Après ie retrait du solvant in vacuo le peptide a finalement été précipité avec de l'éther, filtré et séché. La purification en utilisant le HPLC a été effectuée en utilisant du dioxane où ie peptide était soluble à environ 1,5 mg/I. Le HPLC de préparation a donné le peptide (44) en même temps qu'une trace de dérivé de sulfoxyde, comme indiqué par ia spectrométrie de masse (MH+16+). L'identité du peptide a été confirmé par ia spectrométrie de masse et l'analyse des acides aminés.

FEUILLE DE REMPLACEMENT A EP

N-9-Fluorénylméthoxycarbonylqlvcylsérylméthionyl-valylle ucylsérine. Fmoic Gly Ser Met Val Leu Ser OH (44.

Le peptide lié à la résine Fmoc Ser (OtBu) Met Val Leu Ser (OtBu) (130,5 mg, 0,05 mmol) a été homogénéisé par ultrasons dans une solution de piperidine à 20% dans du N,N-diméthyiformamide (5 ml) pendant 20 mn, puis filtré et enfin bien lavé avec du N,N-diméthyl-formamide, du dichiorométhane et du dioxane. Fmoc Gly OH (89,2 mg, 0,3 mmol; 6 équiv.) a été dissous dans du dioxane (2 ml) ; du 1,3- diisopropytcarbodiimide (47 μl, 0,3 mmol ; 6 équiv.) a ensuite été ajouté et le mélange de réaction a été homogénéisé par ultrasons pendant 5 mn. Cette solution a ensuite été ajoutée au peptide lié à la résine gonflé au préalable dans du dioxane (1 ml). Le mélange de réaction a été homogénéisé par ultrasons pendant 4,5 heures. Le peptide lié à la résine a été filtré, lavé avec du dichiorométhane, de l'éther et séché (129,8 mg) fonctionnalité de la résine du produit en mmol/g : 0,334, pourcentage chargement accouplement de la résine: 88 ; 4A300 nm = 0,76 (peptide-résine : 2,52 mg). On a ajouté de l'acide trifiuoroacétique (10 ml) à un mélange de peptide-résine (126,1 mg, 0,042 mmol) anisole (0,25 ml), sulfure d'éthyie et de méthyie(0,25 ml) et eau (0,25 ml). Le mélange de réaction a été homogénéisé par ultrasons pendant 2 heures. La résine a été filtrée, lavée avec de l'acide trofiuoroacétique (2 x 1 ml) et du chloroforme (4 ml). Le solvant a été retiré in vacuo pour donner un résidu. Le peptide a été précipité sur addition d'éther, filtré, lavé avec de l'éther et séché (42,7 mg) ; (Trouvé : Ser2 1,90, Gly, 1,05, Val, 0,99. Met, 1,02, Leu1, 1,01) ; m/z (FAB) 853, 837, 815 (MM*). HRMS 815.36488, C39H55N6011S1 nécessite : 815.36942 ( ) < 1 ppm.

HPLC : colonne RP 18, solvants : A (H2O/TFA (0,1%)), B

25 mn

(CH3CN TFA (0,1%)) ; conditions: A (90%) > A (10%) ; lambda = 229 nm ; AUFS

= 0,2 ; taux de débit : 1 ml/ mn ; injection : 25 μl (C = 0,4 mg/ 0,5 ml (dioxane)) ; délai de rétention : 14,2 mn.

b. Synthèse de Tbfmoc Gly Ser Met Val Leu Ser OH

Tbfmoc Gly Ser Met Val Leu Ser OH (45) a ensuite été préparé à partir du peptide lié à la résine (43) vis une méthode similaire.

Tbfmoc Gly OH a été couplé dans du dioxane avec une efficacité d'accouplement de 80%. Le retrait du peptide de ia résine et le clivage de t-butyl ont été effectués avec du TFA en présence des mêmes dismutases. le peptide a finalement été précipité avec de l'éther, filtré et séché (rendement à 69%). Le peptide a été purifie omtne avant 4Jne.βel_j_ .n ira îβfce ___. peptide brut dans

FEUILLE DE REMPLACEMENT

du dioxane a donné une crête sur le HPLC, mais en attente (30 mn) la même solution a donné deux crêtes correspondant au peptide souhaité et au dérivé de suifoxyde. L'oxydation facile de méthionine au sulfoxyde peut être due à la présence de peroxydes dans le dioxane. Après isolation de ces deux peptides par le HPLC de préparation, ces assignations ont été confirmées par la spectrométrie de masse (MH+ et MH+16+) et l'analyse des acides aminés.

N-17-Tétrabenzo(a.c.g.i.fluorénylméthoxycarbonyl- αlucvIséryméthionvivalvUeucylsérine. Tbfmoc Gly Ser Met Val Leu Ser OH (45.

Le peptide lié à la résine Fmoc Ser (OtBu) Met Val Leu Ser (OBUt) (65,3 mg, 0,025 mmol) a été homogénéisé par ultrasons dans une solution de piperidine à 20% dans du DMF (5 ml) pendant 20 mn. Le peptide lié à la résine a ensuite été filtré et bien tavé avec du DMF, du dichiorométhane et du dioxane. Tbfmoc Gly OH (74,5 mg,

0,15 mmol ; 6 équiv.) a été homogénéisé par ultrasons pendant 30 mn dans du dioxane (2 ml). Du 1,3-Diisopropylcarbodiimide (23,5 μl, 0,15 mmol; 6 équiv.) a ensuite été ajouté et le mélange de réaction a été homogénéisé par ultrasons pendant 5 mn. Cette solution a ensuite été ajoutée au peptide lié à la résine gonflé au préalable dans du dioxane (1 ml). Le mélange de réaction a été homogénéisé par ultrasons pendant 5 heures. La résine a été filtrée, bien lavée avec du dichiorométhane, du dioxane et de l'éther, puis séchée (58,3 mg) ; fonctionnalité de la résine du produit en mmol. g : 0,28 ; pourcentage de chargement/accouplement de la résine : 80 ; A364 nm = 0,43 (peptide lié à la résine : 0,85 mg). On a ajouté de l'acide trifluoroacétique (5 ml) à un mélange de peptide lié à ia résine (57,3 mg, 0,016 mmol), d'anisole (0,25 ml), de sulfure d'éthyie et de méthyle (0,25 ml) et d'eau (0,25 ml). Le mélange de réaction a été filtré et lavé avec de l'acide trifluoroacétique (1 ml) et du chloroforme (4 ml) et le solvant a été retiré in asilfi. L'homogénéisation du résidu dans de l'éther a donné le peptide souhaité sous la forme d'un solide jaune qui a été filtré, bien lavé avec de l'éther et séché (17,2 mg, 69%) ; (Trouvé : Ser2 1 ,8, Gly, 0,08, Val, 1,00, Met, 0,96, Leu, 1,00 ; m/z (FAB) 1053, 1037, 1015 (MH+). HRMS 1015.42761, C55H63N6O11S nécessite : 1015.42752 ( ) < 1 ppm.

HPLC : colonne RP 18, solvants : A (H2O/TFA (0,1%)) ; B 22 mn.

(CH3CN/TFA (0,1%)) ; conditions: A (75%) > A (5%) ; lambda = 229 nm ;

AUFS = 1; taux de débit : 1 ml/mn. ; injetion : 25 μl (C = 0,2 mg/0,2 ml (dioxane)) ; délai de rétention : 16,1 mn.

c. Comportement des dérivés de Tbfmoc et de Fmoc sur le PGC

La rétention à la fois de Fmoc Gly OH et de Tbfmoc Gly OH a été comparée à une colonne remplie de carbone graphitisé.

Une solution de Fmoc Gly OH (10,2 mg, 34,3 μmole) dans du dioxane a été chargée sur une colonne de 6 mm de diamètre remplie de PGC (1,5 g). 15 ml de 5 dioxane ont suffi à éluer complètement le composé (sous la surveillance de U.c.). En contraste, quand Tbfmoc Gly OH (10,2 mg, 20,5 μmole) a été chargé dans les mêmes conditions, aucune partie de ce matériau n'a été éluée dans les premiers 35 ml. En fait, le volume total de dioxane nécessaire pour éluer ie composé a été de 300 ml.

10 Le comportement sur une colonne de carbone graphitisé de Fmoc Gly Ser Met

Val Leu Ser OH (44) a ensuite été comparé au dérivé de Tbfmoc (45). Pour augmenter le délai total de rétention, un mélange de dioxane/eau (2 : 1) a été utilisé pour éluer les deux peptides. Après chargement d'une solution d'hexapeptide de Fmoc (9,2 mg, 11,3 μmole) dans un mélange de dioxane/eau (2 : 1) sur la colonne,

15 le peptide a été élue complètement avec 75 ml de mélange de solvant. En contraste, le dérivé de Tbfmoc (10,5 mg, 10,3 μmole) n'a pas été élue du tout dans les premiers 80 ml de solvant et n'a été par conséquent que très lentement élue de la colonne.

d. Déprotection du groupe Tbfmoc

20

La déprotection du groupe Tbfmoc du peptide a été effectuée alors qu'il était encore retenu sur ia colonne de carbone graphitisé. La déprotection a été effectuée en utilisant de la piperidine à 20% dans un mélange de dioxane/eau (2 : 1). Dans ces conditions l'hexapeptide de Tbfmoc a été totalement déprotégé. Le peptide libre

25 (HGIy Ser Met Val Leu Ser OH (46)) a été élue et a été surveillé par t.l.c. en utilisant de la ninhydrine pour révéler la fonction aminée. L'isolation du produit qui en a découlé a été simple ; ia piperidine et les solvants ont été retirés in vacuo et le peptide a été précipité avec de l'éther, filtré et séché (85%). La spectrométrie de masse a montré à ia fois la présence du peptide (MH+) et celle du dérivé de 30 sulfoxyde (MH+16+). L'analyse des acides aminés a confirmé la composition du peptide.

Giycylsérvtméthionylvalylleucylsérine. H Gly ser Met Val Leu Ser OH (46)

35 Une solution de Tbfmoc Gly Ser Met Val Leu ser OH (29,2 mg, 28,8 μmol) dans

LU un mélange de dioxane et d'eau (2 : 1; 15 ml) a été chargée sur une colonne de 9

_ mm de diamètre remplie de carbone graphitisé (4 g). La colonne a ensuite été éluée

^" O avec un mélange de dioxane et d'eau (2 : 1 ; 60 ml). La déprotection a été effectuée L en éluant la colonne avec de la piperidine à 20% dans un mélange de dioxane et

40 d'eau (2 : 1; 20 ml). Les fractions contenant le peptide (surveillées par U.c., Rf = 0

(MeOH/CHCI3/CH3COOH (1 : 9 : 0.5. (en utilisant de la ninhvdrine. ont été

et évaporées pour donner un résidu. Le peptide a été précipité avec de l'éther, filtré et séché (14,5 mg, 85%) ; (Trouvé : Ser2 1,92, Gly1 0,98, Val1 1,03, Met1 0,87, Leu1 1,02 ; m/z (FAB) 609, 593 (MH+). HRMS 593.29689, C24H45O9N6S nécessite : 593.29685 ( ) < 1 ppm.

Enfin, le tétrabenzofiuorène oléfine ou son adduct de piperidine, les sous- produits de l'étape de déprotection, ont été retirés de ia colonne par élution avec du dioxane chaud.

EXEMPLE 7

Synthèse de Fmoc Ubiquitine (54-76.OH et Tbfmoc Ubiαuitine (53-76.OH et comparaison de leurs propriétés

a. Synthèse de Fmoc Ubiquitine (54-76. OH

Le peptide lié à la résine Fmoc ubiquitine (54-76) (47) a été préparé sur un synthétiseur de peptides dans les conditions décrites dans l'Exemple (a). La plupart des procédures d'accouplement ont impliqué un anhydride symétrique suivi d'un accouplement d'ester HOBt dans un mélange de DMF/dioxane (1 : 1) comme solvant.

b. Synthèse de Tbfmoc Ubiquitine (53-76) OH

Le Tbfmoc Ubiquitine (53-76) OH (48) a été synthétisé à partir du peptide lié à ia résine (47) comme décrit ci-dessous.

FEUILLE DE REMPLACEMENT ISA/EP

31

Fmoc ubiquitine ^* (54-76)- R (47)

Déprotection piperidine 20%/DMF

NH2 ubiquitine* (54-76)- R

Accouplement Tbfmoc Gly OH/DIC/HOBt

Tbfmoc ubiquitine* (53-76) OH R

Déprotection TFA/dismutases

Tbfmoc ubiquitine* (53-76) OH (48)

^* : chaînes latérales d'acide aminé protégées.

Le peptide lié à la résine Fmoc ubiquitine (54-76 a été initialement traité avec un mélange d'anhydride acétique/pyridine (1 : 1) afin d'amorcer toute fonction aminée. Après déprotection dans des conditions basiques, le peptide a été couplé dans du dioxane à Tbfmoc Gly OBt ester (4 équiv), généré in situ à partir de DIC et de HOBt, avec une efficacité d'accouplement de 88%. Après un clivage final utilisant le TFA en présence d'anisole et de thioanisoie comme dismutases de cation, le peptide Tbfmoc ubiquitine (48) a été précipité avec de l'éther (rendement à 96%).

N-(17-Tétrabenzo(a.c.g.i.fluorénylméthoxycarbonyl) glycvlarginylthréonvlleucylséryllaspartyityrosyl- asparaqylisoleucylglutaminyllysylglutamylsérylthréonvlleυ cvlhistidvlleucvlvalylleucyla rginvileucylarginyt-glycviqtycine. Tbfmoc-ubiquitine (53-76. OH (48.

De l'anhydride acétique (21,4 él, 226, μmol ; 10 équiv.) et de la pyridine (18,2 μl, 226 μmol ; 10 équiv.) ont été ajoutés au peptide lié à la résine (150 mg, 22,65 μmol) Fmoc-ubiquitine (54-76) dans du DMF (1 ml). Le mélange de réaction a été homogénéisé par ultrasons pendant 30 mn. Après filtration et lavage avec du DMF et de l'éther, le peptide lié à la résine a été homogénéisé par ultrasons pendant 15 mn dans une solution de piperidine à 20% dans j_4_,Dlt1ft,<9-.'eφ -i_e peptide lié à la rés ⁱ ne FEUILLE DE REMPLACEMENT

a ensuite été filtré et bien lavé avec du DMF et de l'éther. Tbfmoc Gly OH (45 mg, 0,09 mmol ; 4 équiv.) a été homogénéisé par ultrasons pendant 30 mn. dans du dioxane (1,5 ml) jusqu'à dissolution complète. Du 1 ,3-diisopropylcarbodiimide (14 μl, 0,09 mmol 4 équiv.) et du 1-hydroxybenzotriazole (12,2 mg, 0,09 mmol ; 4 équiv.) ont été ajoutés à cette solution. Le mélange de réaction a été homogénéisé par ultrasons pendant 2 mn. cette solution a ensuite été ajoutée au peptide lié à la résine gonflé au préalable pendant 30 mn. dans du dioxane (1,5 ml). Après sonication pendant 3,5 heures, le peptide lié à la résine a été filtré, lavé avec du dioxane et de l'éther et séché jusqu'au lendemain dans un dessiccateursous vide (148,1 mg). Efficacité de substitution : le peptide lié à la résine Tbfmoc (2,1 mg) a été homogénéisé par ultrasons pendant 30 mn. dans une solution de triéthylamnie à 20% dans du DMF (10 ml). L'absorption spécifique à 364 nm a été enregistrée et les résultats suivants en ont été dérivés : fonctionnalité de la résine du produit en mmol/g : 0,133 ; pourcentage de chargement/accouplement de la résine : 88 ; A364 nm = 0,505 (peptide lié à ia résine : 2,1 mg).

De l'eau (75 μl), du thioanisole (75 μl), de l'anisole (75 μl) et de l'acide trifluoroacétique (3 ml) ont été ajoutés au peptide-Tbfmoc lié à la résine (146 mg). Le mélange de réaction a été homogénéisé par ultrasons pendant 2,5 heures. La résine a été filtrée, lavée avec du TFA ( 2 x 0,5 ml) et du chloroforme (2 x 1 ml), et séchée (24 mg). Le filtrat a été évaporé sous pression réduite pour donner un résidu. L'homogénéisation dans l'éther a donné le peptide brut sous la forme d'un solide jaune qui a été refroidi jusqu'au lendemain, filtré et séché (68,5 mg). Une suspension de Tbfmoc-ubiquitine (53-76) brut (12 mg) dans CH3CN/H2O (1 : 1; 0,1% TFA ; 12 ml) a ensuite été homogénéisée par ultrasons pendant 2 heures jusqu'à ce que la dissolution complète se soit produite. La purification de ce produit a finalement été réalisée par un HPLC de préparation en utilisant une colonne C-18 à phase inversée (10 x 250- mm) avec un gradiant de A : B, 20 à 80% B pendant 25 mn et détection d'ultraviolets à 214 nm, pour rendre du Tbfmoc ubiquitine (53-76) pure après lyophilisation sous forme de poudre blanche (4,5 mg) ; analyse des acides aminés : Asx2 2,14, Thr2 1,94, Ser2 1,87, Glx2 2,38, Gly3 2,73, Val1 1,14, Ile1 0,94, Leuδ 5,02, Tyr1 0,94, His1 1,01, Lys1 0,94, Arg3 2,94 ; m z (FAB) 3147,4 (MH+), HRMS 3149.64063, C149H219N38O38 nécessite : 3149.64048 ( ) <

25 mn. 1 ppm ; HPLC (A:B, A (90%) > A (10%) ; 214 nm ; C = 0,2 mg/0,2 mi (A), injection : 25 μl) Rt = 18,2 mn.

c. Comportement de N-Acétyl-Ubiquitine (54-76. OH et de Tbfmoc Ubiquitine (53-76. OH sur le PGC

FEUILLE DE REMPLACEMENT ISA EP

N-Acétyl-Ubiquitine (54-76) OH (49) a été préparé à partir du peptide lié à la résine (47) par les réactions suivantes. La déprotection du groupe Fmoc à partir du peptide en utilisant de la piperidine à 20% dans du DMF a donné le peptide avec un groupe aminé N-terminal libre, qui a été ensuite acétylé avec un mélange d'anhydride acétique/pyridine (1 : 1) (100 équiv). Le retrait du peptide de la résine et le clivage des groupes protecteurs des chaînes latérales ont été effectués en utilisant du TFA en présence d'anisole et thioanisole comme dismutases. Une précipitation consécutive avec de l'éther a donné N-acétyl -ubiquitine (54-76) OH (49) brut.

N-(Acétyl.arqinylthréonylleucvlsérvlaspartyltyrosvl- asparaqvlisoleucylglutaminyllysylglutamylsérylthréonvl- histidvlleucvlvalvlleucylarqinyHeucvlarqinvlqlvcvlαlvcine. ND-acétyl-ubiαuitine (54-761 OH (491

Le peptide lié à la résine Fmoc-ubiquitine (54-76) (100 mg, 0,0151 mol) a été homogénéisé par ultrasons pendant 30 mn dans une solution de piperidine à 20% dans du DMF (25 ml) puis filtré, et enfin bien lavé avec du DMF et de l'éther. De l'anhydride acétique (143 μl, 1,51 mmol ; 100 équiv.) et de la pyridine (122 μl, 1,51 mmol ; 100 équiv.) ont été ajoutés au peptide lié à la résine gonflé au préalable pendant 30 mn dans du DMF (1 ml). Le mélange de réaction a été homogénéisé par ultrasons pendant 1 heure. Le peptide lié à ia résine a été filtré et lavé avec du DMF et de l'éther. de l'eau (50 μl), du thioanisole (50 μl), de l'anisole (50 μl) et de l'acide trifluoroacétique (2 ml) ont été ajoutés au peptide-acétyl-N lié à la résine. Le mélange de réaction a été homogénéisé par ultrasons pendant 2,5 heures. La résine a été filtrée, lavée avec du TFA ( 2 x 0,5 ml) et du chloroforme (2 x 0,5 ml). Le solvant a été retiré in vacuo. L'homogénéisation dans l'éther a donné le produit sous forme d'un précipité blanc qui a été refroidi jusqu'au lendemain, filtré et séché (43,6 mg). La purification de ce peptide (23,4 mg) a été réalisée par HPLC de préparation en utilisant ia même colonne C-18 à phase inversée avec un gradiant de A : B, 10 à 60% B pendant 16 mn. et la détection d'ultraviolets à 214 nm, pour donner un N- acétyl-ubiquitine (54-76) OH pur sous forme d'un solide blanc après lyophilisation (9,7 mg) ; analyse des acides aminés : Asx2 1,98, Thr2 1,82, Ser2 1,69, Glx2 2,33, Gly22,36, Val1 1,14, Ile1 0,91, Leu55,06, Tyr1 0,85, His1 1,01, Lys1 0,98, Arg32,87 ; m/z (FAB) 2712,1 (MH+), HRMS 2712.49903, C118H200N37O36 nécessite : 2712.49891 ( ) <

25 mn.

1 ppm ; HPLC (A : B, A (90%) > A (10%) ; 214 nm ; C = 0,2 mg/0,2 ml (A), injection : 25 μl) Rt = 13,2 mn.

Le comportement à ta .ois des peptides ^cé^.eUWffo ^β ____n«nine sur une

FEUILLE DE REMPLACEMENT

colonne de PGC a ensuite été examiné.

Une solution contenant 5 mg de chaque peptide a été chargée sur la colonne qui a ensuite été éluée en utilisant différents mélanges de solvants. Après avoir regroupé les fractions, le soivant a été retiré in vacuo et le résidu obtenu a été de nouveau dissous dans du soivant frais avant analyse au HPLC.

Les meilleurs résultats ont été obtenus quand un mélange de CH3CN/H2O (1 : 1) a été utilisé. Dans ces conditions, le peptide-acétyi-N a été complètement élue par 30 ml du mélange, alors que le peptide Tbfmoc était retenu. La séparation chromatographique totale de ces peptides très proches l'un de l'autre a clairement démontré l'efficacité de la méthode et son potentiel pour la purification des peptides synthétisés par méthodologie de phase solide, dans la mesure où l'on apporte une attention toute particulière au choix des solvants.

d. Purification de l'Ubiquitine (53-76) OH

Une simple élution chromatographique sur une colonne remplie de carbone graphitisé a été utilisée comme première étape de purification (comme décrit en (c) ci-dessus). De l'ubiquitine Tbfmoc (53-76) OH (48) brute dissoute dans un mélange de CH3CN/H20 (1 :1 ; 0,5% TFA) a été chargée sur une colonne remplie de PGC (50 x masse du peptide).50 ml d'un mélange du même solvant ont été nécessaires pour éluer complètement les principales impuretés (probablement N-acétyl ubiquitine (55- 76) et de l'ubiquitine (54-76) non réagie). Aucun des peptides Tbfmoc n'a été élue même après rinçage de la colonne avec 50 mi supplémentaires de CH3CN/H2O (1 :1). La Déprotection du groupe Tbfmoc a été effectuée en utilisant de ia piperidine à 20% dans un mélange de CH3CN H2O (1 : 1) et seul le peptide souhaité, l'ubiquitine (53-76) OH, a été élue. Après le retrait du solvant jn vacuo. le peptide a finalement été précipité avec de l'éther. Une purification consécutive par HPLC de préparation a donné de l'ubiquitine (53-76) OH pure (50) en rendement total de 15%.

Glycyiarginvlthréonylleucvlséryiaspartyltyrosylasparagv l- isoleucylglutaminyllysylglutamylsérylthréonylleucylhistidy l- leucylvalylleucylarginylleucylarginylglycylglycine. ubiquitine (53-76) QH (50)

Une solution de Tbfmoc-ubiquitine (53-76 OH (30 mg ; peptide brut) dans un mélange de CH3CN/H20 (1 : 1; 0,5% TFA ; 30 ml) a été homogénéisée par ultrasons pendant 30 minutes jusqu'à dissolution complète et chargée sur une colonne de verre de 5 mm de diamètre remplie de carbone graphitisée (1 ,4 g ; PGC 220-224; 150-180 μm ;

FEUILLE DE REMPLACEMENT

100 m≈/g; longueur après remplissage : 140 mm). La colonne a été d'abord éluée avec un mélange de CH3CN H2O (1 : 1 ; 0,5% TFA ; 50 ml). Après lyophilisation un résidu (6,1 mg) a été obtenu, qui a donné une crête importante sur HPLC (Rt = 13 mn., N_-acétyl-ubiquitine (55-76) ou ubiquitine (54-76)). La colonne a ensuite été éiuée avec un mélange de CH3CN/H20 (1 : 1 ; 50 ml). Un résidu (0,4 mg) a été obtenu après lyophilisation; on a découvert par HPLC qu'il contenait des impuretés. La déprotection a été effectuée en utilisant une solution de piperidine à 20% dans un mélange de CH3CN/H2O (1 : 1; 50 ml). Le solvant a été retiré in yasuo. pour donner un résidu qui a été homogénéisé dans l'éther, filtré et séché (11 mg). Ce peptide brut (11 mg) a finalement été purifié par HPLC de préparation (colonne C-18 à phase inversée (10 x 250 mm); gradiant (A : B), 10 à 60% B pendant 25 mn; détection à 214 nm pour donner de l'ubiquitine (53-76) OH sous la forme d'un solide blanc après lyophilisation (4,5 mg, 15%); analyse des acides aminés : Asx2 2,04, Thr2 1 ,88, Ser2 1,67, Glx2 2,27, Gly3 3,37, Vah 1,01 , Ile1 0,90, Leu5 4,99, Tyr1 0,93, His1 1 ,01 , Lys1 0,96, Arg3 2,95; m/z (FAB) 2727,8 (MH+), HRMS 2727.50986, C118H201N38O36 nécessite : 2227.50981 ( ) <

25 mn. 1 ppm ; HPLC (A : B, A (90%) > A (10%) ; 214 nm ; C = 0,4 mg/0,4 ml (A), injection : 25 μl) Rt = 12,6 mn.

Les identités à la fois du peptide Tbfmoc ubiquitine (53-76) OH et du peptide ubiquitine (53-76) OH ont été établies par spectrométrie de masse à haute résolution et analyse des acides aminés.

EXEMPLE 8

Synthèse et purification de rUbiαuitine (35-76.

La purification de ce peptide n'a pas posé de problème et a été effectuée comme pour le plus petit fragment d'ubiquitine (50) ; Tbfmoc ubiquitine (35-76) OH

(52) a été préparé en couplant in situ Tbfmoc Gly OBt à l'ubiquitine du peptide lié à la résine (36-76) (rendement à 75%). Après chromatographie sur une colonne de PGC et HPLC de prépartion, le peptide souhaité (51) a pu être obtenu.

L'authenticité de (51) a également été confirmée par la spectrométrie de masse et l'analyse des acides aminés, et sa pureté par HPLC analytique.

FEUILLE DE REMPLACEMENT ISA EP

N-(17Tétrabenzo(a.c.g.i.fluorénylméthoxvcarbonul. αlvcylisoleucylprolyiprolylaspartylαlutaminylαlutaminvl- arαlny leucylisoleucylphénylalanylalanylqlycyllysyl- αlutaminvlleucyqlutamylaspartylqlycylarginvlthréonvlleucvl - sérvIaspartyltyroasparaqylisoleucylαlutaminvUvsylαlutamvI - sérvlthréonylleucylhistidylleucylvalylleucvtarginvlleucvl- arαinvlqlucvlglycine. Tbfmoc ubiquitine (35-76. OH (52)

De l'anhydride acétique (14,8 μl, 157,6 μmol ; 20 équiv) et de la pyridine (12,8 μl, 157,6 μmol ; 20 équiv) ont été ajoutés au peptide lié à la résine Fmoc ubiquitine (36-76) (109,3 mg, 7,88 μmol) dans du DMF (1 ml). Le mélange de réaction a été homogénéisé par ultrasons pendant 1 heure. Après filtration et lavage avec du DMF et de l'éther, le peptide lié à la résine a été homogénéisé par ultrasons pendant 15 minutes dans une solution de piperidine à 20% dans du DMF (25 ml). Le peptide lié à ia résine a ensuite été filtré et bien lavé avec du DMF et de l'éther. Tbfmoc GiyOH (19,6 mg, 39,4 μmol ; 5 équiv) a été homogénéisé par ultrasons pendant 30 Minutes dans du dioxane (1 ml). On a ajouté à cette solution du 1,3-diisopropylcarbodiimide (6,2 μl, 39,4 μmol ; 5 équiv) et du 1-hydroxybenzotriazole (5,3 mg, 39,4 μmol ; 5 équiv). Le mélange de réaction a été homogénéisé par ultrasons pendant 5 minutes. Cette solution a ensuite été ajoutée au peptide lié à ia résine gonflé au préalable dans du dioxane (1 ml) pendant 1 heure. Le mélange de réaction a été homogénéisé par ultrasons pendant 19 heures. Le peptide lié à la résine a été filtré, lavé avec du dioxane, du dichiorométhane et de l'éther et finalement séché pendant 48 heures dans un dessiccateur sous vide (102 mg).

Efficacité de substitution : le peptide lié à la résine Tbfmoc (2,9 mg) a été homogénéisé par ultrasons pendant 30 minutes dans une solution de triéthyiaminé à 20% dans du DMF (10 ml). L'absorption spécifique à 364 nm a été enregistrée et les résultats suivants en ont été dérivés: A = 0,265 ; fonctionnalité de la résine du produit en μmol/g: 50,51; pourcentage de chargementaccouplement de la résine : 70. L'accouplement a ensuite été répété dans les mêmes conditions (4 équivalents de chaque Tbfmoc GlyOH, 1 ,3-diisopropylcarbodiimide et 1-hydroxybenzotriazole ; délai de réaction : 3,5 heures). Le peptide lié à la résine a été filtré, lavé avec du dioxane, du dichiorométhane et de l'éther et enfin séché jusqu'au lendemain dans un dessiccateur sous vide (99,5 mg).

Efficacité de substitution : A = 0,265 (peptide lié à la résine : 2,7 mg) ; fonctionnalité de la résine du produit en μmol/g : 54,26 ; pourcentage de chargement accouplement de la résine : 75. FEUILLE DE REMPLACEMENT

De l'eau (75 μl), du thioanisole (50 μl) et du TFA (2,1 ml) ont été ajoutés au peptide-Tbfmoc lié à la résine (96,9 mg). Le mélange de réaction a été homogénéisé par ultrasons pendant 2,5 heures. La résine a été filtrée, lavée avec du TFA (2 x 0,5 ml) et du CHCI3 (2 x 1 ml), et séchée (19,1 mg). Le solvant a été retiré in vacuo pour donner un résidu. L'homogénéisation dans de l'éther d'éthyie a donné le peptide brut sous forme d'un solide jaune qui a été refroidi jusqu'au lendemain, bien lavé avec de l'éther et finalement séché (49,2 mg). HPLC 25 mn.

(A : B ; A (90%) > A '10%; 214 nm ; C = 0,5 mg/0,5 ml (A/B (1 : 1)) ; injection 30 μl) Rt = 19,2 mn.

Glvcylisoleucylprolviprolylaspartylolutaminylolutaminyl- arαinylleucylisoleucyiphénylalanylalanylαlvcyllysyl- αlutaminvlleucylαlutamylaspartvlqlvcvlarαinvlthréonvl- leucvlsérvlaspartyltyrosviasparaαylisoleucylαlutaminvl-

Ivsylglutamylsérylthréonylleucylhistidylieucylvalyl- leucviarαinylleucylarαinylglycylαiycine. ubiquitine (35-76. OH (51.

Une suspension de Tbfmoc-ubiquitine (53-76) brut OH (30 mg) dans un mélange de CH3CN/H20 (1 : 1 ; 0,5% TFA, 25 ml) a été homogénéisée par ultrasons pendant 20 minutes (jusqu'à dissolution complète) et chargée sur une colonne en verre de 5 mm de diamètre remplie de carbonne graphitisé (1 ,5 g ; PGC 220-224 ; 150-180 μm ; 100 m ² /g; longueur active : 15 cm). La colonne a d'abord été éluée avec un mélange de CH3CN/H20 (1 : 1; 0,5% TFA ; 50 ml). Après lyophilisation de l'éiuant, un résidu (2 mg) a été obtenu qui a donné une crête large sur HLPC (Rt = 13,8 mn (impuretés)). La colonne a ensuite été éluée avec un mélange de CH3CN/H2O (1 : 1 ; 50 ml). Un solide blanc (4,5 mg) a été obtenu après lyophilisation ; on a découvert par HPLC qu'il contenait également des impuretés (crête large, Rt = 14,1 mn). La colonne a été de nouveau éluée avec 50 ml d'une mixture de CH3CN/H20 (1 : 1) et un résidu (0,3 mg) a été obtenu après lyophilisation (Rt = 14,2 mn). La déprotection a été effectuée en utilisant une solution de piperidine à 20% dans un mélange de CH3CN H20 (1 : 1; 50 ml) et a été suivie d'un élution de la colonne avec CH3CN/H20 (1 : 1 ; 50 ml). Le solvant a été retiré in vacuo pour donner un résidu marron. Du diéthyi éther a été ajouté et le précipité obtenu a été refroidi jusqu'au lendemain, filtré et bien lavé avec de l'éther, et enfin séché (11 ,7 mg). Le peptide brut (24,8 mg) a finalement été purifié par HPLC de préparation (colonne C-18 à phase inversée (10 x 250 nm) ; gradiant (A : B), 20 à 60% B pendant 22 mn ; détection à 214 nm) pour donner de l'ubiquitine (35-76) OH pure sous la forme d'un solide blanc après lyophilisation (4,4 mg) ; analvse des acides aminés : Asx4 3.98. Thr2 1.83. Ser2 1.75. Glx6 6.67. Pro2 1.91.

FEUILLE DE REMPLACEMENT ISA EP

0,96, Val1 1,01, Ile3 2,99, Leu7 7,00. Tyr1 0.94, Phe1 1,04, His1 1,11, Lys2 1,91, Arg43,81 ; m z (FAB) 4734,2 (MH+),

HRMS 4734.57186, C208H344N63O63 nécessite: 4734.57161 ( ) <

25 mn. 1 ppm ; HPLC (A : B, A (90%) > A (10%) ; 214 nm ; C ≈ 0,1 mg/0,1 ml (A), injection : 25 μl) Rt = 13,8 mn.

EXEMPLE 9

Synthèse de Tbfmoc-L-Phe OH

La fonction aminée libre de l'hydrochlorure ester tert-butyl L-phénylalanine a été initialement libérée avec du triéthylaminé. L'aminé en excès de 20% a ensuite réagi avec le carbonate mélangé (41) en présence de N,N'-diméthyianiiine, Après le retrait du groupe t-butyl avec ie TFA, le composé (53) a été obtenu.

La formation de (53) peut être rationalisée par l'élimination β du carbonate mélangé (41), l'addition 1,2 de l'ester aminé sur l'oléfine en résultant (38) et enfin le clivage de l'ester t-butyl.

N- .7-Tétrabenzo(a.c.q.flfluoréπylméthyl-L-phénylalanine. Tbfm-L-Pne QH (53.

Une solution de N-17-tétrabenzo(a,c,g,i) fluorénylméthyl-L-phénytalanine tert- butyi ester (421,1 mg, 0,702 mmol) dans de l'acide trifluoroacétique (3,6 ml) et de l'eau (0,2 ml) a été homogénéisé par ultrasons pendant 3,5 heures à température ambiante. Le soivant a été retiré in vacuo pour donner un résidu marron. L'homogénéisation dans du diéthyléther a donné le com ^p osé titre sous ia forme d'un solide jaune qui a été refroidi jusqu'au lendemain, filtré, lavé avec de l'éther et finalement séché (352,7 mg, FEUILLE DE REMPLACEMENT

ISA/EP

92%) ; p.f. 178-180C ; (Trouvé: C, 85,2 ; H, 5,47 ; N, 2,57 C39H29N02 nécessite 86,2 ; H, 5,37 ; N, 2,59%) ; ( D20 -40,4 ^* (C = 1, TFA) ; U.c. Rf (H) 0,36, Rf (T) 0,62 ; μmax (KBr) 3090, 3060, 3030 (CH extension, aryl), 1620 (COO-), 1500 (anneaux aromatiques), 1240, 1190, 1040 (CO extension), 750, 725, 700 (CH déformation hors plan) cm-1; lambda max 384 (18868), 369 (21267), 304 (52447), 292 (41894), 264 (78991), 255 (86346) nm ; δC (TFA, 50 MHz) 169,5 (CO, acide), 137,9, 136,9, 136,1, 134,2, 131,8, 131,4, 130,5, 129,8, 126,3, 126,1, 125,8 (C aromatiques quaternaires) 128,7, 127,9, 127,2, 127,0, 126,8, 124,8, 123,44, 123,34, 123,29, 122,2 (CH aromatiques), 62,2 (_CH), 50,9 (CH2), 43,2 (CH), 34,2 (β CH2) ; m/z (FAB) 544 (MH+), 379. HRMS 544.22762, C39H30NO2 nécessite : 544.22764 ( ) < 1 ppm.

Comme l'acétate de la glycine a eu du succès dans la synthèse de Tbfmoc Gly OH, cette méthode est également utilisée dans ce cas ; ainsi le sel d'acétate d'ester îert-buytl L-phényialanine a été préparé.

Le sel d'hydrochlorure de l'ester d'acide aminé a été neutralisé avec de la triéthyiamine et l'Et3N.HCI précipité engendré a été filtré. Suite au retrait du solvant, le résidu obtenu a été de nouveau dissous dans de l'acide acétique avant lyophilisation. La réaction consécutive avec le carbonate mélangé (41) en présence de deux équivalents de N.N'-diméthylaniline a donné Tbfmoc-L-Phe OtBu (54) en rendement à 46% après purification par chromatographie flash et recristallisation. Le clivage final de l'ester t-butyl en utilisant un mélange de TFA/H20 (95:5) a donné gTbfmoc-L-Phe OH (55) en excellent rendement.

N-17-tétrabenzo(a.c.g.i)f luor ényiméthoxycarbonyl-L- phénylalanine tert-butyl Ester, TbfmPC Phe QtPu (54)

On a ajouté de la triéthyiamine (68,5 μl, 0,491 mmol) à une suspension d'hydrochlorure d'ester îgβ-butyl L-phénytaianine (126,7 mg, 0,491 mmol) dans de l'acétate d'éthyi (6 ml). Le mélange de réaction a été remué pendant 2,5 heures à ia température ambiante. L'hydrochlorure de triéthyiamine précipité a été filtré, lavé avec de l'acétate d'éthyi (2 x 0,5 ml) et séché (65,3 mg, 97%). Le filtrat a été évaporé pour donner un résidu qui a été de nouveau dissous dans de l'acide acétique. Après lyophilisation, le sel d'acétate a été obtenu sous forme d'un solide blanc (83,9 mg, 61%).

On a ajouté du N.N'-diméthyianiline (63 μl, 0,497 mmol ; 2 équiv) à une solution de 17-tétrabenzo(a,c,g,i) fluorénylméthy-para-nltrophénvl carbonate (139,4 mg, 0,248 mmol) et d'acétate d'ester de ___ -butyl L-phényialanine (83,9 mg, 0,298 mmol ; 1,2 équiv). Le mélange de réaction a été remué à température ambiante sous azote pendant 120 heures. Après addition d'eau (10 ml) et acidification avec KHS04 (2M) à pH=1, le mélange de réaction a été extrait avec du dichiorométhane (3 x 20 ml). Les

FEUILLE DE REMPLACEMENT ISA EP

phases organiques combinées ont été lavées avec de l'eau (2 x 15 ml) à pH 6-7 et séchées sur MgSO4. Après filtration, le soivant a été évaporé sous pression réduite pour donner une huile orange. Après purification par chromatographie éclair en utilisant du toluène comme éluant, les fractions contenant ie matériau de Rf=0,04 ont été évaporées pour donner un solide jaune. La recristallisation de l'éther/pétrole (p.i ; 40-60 ^* C) a donné le composé titre sous forme d'un solide jaune pâle qui a été filtré, lavé avec du pétrole et finalement séché (73,9 mg, 46%) ; p.f. 158-162 ^* C (dec) ; t.l.c. Rf (C) 0,04, Rf (H) 0,84 ; μmax (KBr) 3280 (NH extension), 3060, 3030 (CH extension, aryl), 2980, 2930 (CH extension, aicoyl), 1735 (CO, ester), 1715 (CO, uréthane), 1680 (amidé I), 1610 (anneaux aromatiques), 1545 (amidé II), 1500 (anneaux aromatiques) 1440 (déformations CH, aicoyl), 1390, 1370 (CH3, déformations symétriques), 1290, 1255, 1220, 1155, 1050 (CO extension), 850, 750, 720, 700 (déformation CH hors plan) cm-1; m/z (FAB) 643 (M+), 379. HRMS 643.27225, C44H37NO4 nécessite : 643.27224 ( ) < 1 ppm.

N-17-Tétrabenzo(a.c.q.i.fluor nvlméthoxycarbonyl-L-phényialanine.Tbfmoc-L- Phe OH (55)

Une solution de N-17-tétrabenzo(a,c,g,i)fluorényl-méthoxycarbonyI-L- phénylalanine tgrt-butyl ester (68,2 mg, 0,106 mmol) dans de l'acide trifluoroacétique (950 μl) et de l'eau (50 μ!) a été homogénéisé par ultrasons pendant 2,5 heures. Le soivant a été retiré in vacuo pour donner un résidu violet. Un mélange de diéthyi éther et de pétrole p.i.40-60 ^* C (1 : 1) a été ajouté. Le précipité obtenu a été refroidi jusqu'au lendemain, filtré, lavé avec du pétrole et enfin séché dans un dessiccateur sous vide sur P205 pour donner ie composé titre (57,6 mg, 93%) ; p.f. 137-140' C ; (d)D20 -50,8 (C ≈ 0,25, CH2CI2) ; U.c. : Rf (H) 0,43, Rf (I) 0,89; μmax (KBr) 3410 (NH extension), 3060, 3030 (CH extension, aryl), 2960, 2860 (CH extension, aicoyl), 1715 (CO, acide et uréthane), 1610, 1500 (chaînons aromatiques), 1435, 1420 (déformations CH, aicoyl), 1340 (courbure OH), 1215, 1050 (CO extension), 750, 730, 700 (déformation CH hors-plan) cm-1; lambda max 384 (15794), 368 (16896), 302 (39670), 290 (32324), 262 (59505), 254 (64647) nm ; δH (CDCI3, 200 MHz) 8,80-8,58 (6H, m, aromatique), 8,30-8,19 (2H, m, aromatique), 7,65-7,54 (8H, m, aromatique), 7,19-7,07 (5H, m, aromatique (Phe)), 5,13 (1H, t apparent, CH), 4,98 (1H, d, 3J = 8,4 Hz, NH), 4,79-4,64 (2H, m, Ha (CH2) et_CH (Phe)), 4,30-4,24 (1H, m, Hb (CH2)), 3,08 (2H, m, β CH2 (Phe)); δC (CDCI3, 90 MHz), 175,8 (CO, ACIDE), 155,8 (CO, uréthane), 142,6, 141,0, 136,8, 136,5, 135,3, 131,5, 130,3, 130,1 (C aromatiques quaternaires), 129,0, 128,6, 127,4, 127,3, 127,1, 126,8, 126,6, 125,9, 125,7, 125,5, 125,1, 124,9, 124,8, 123,4, 123,1, 123,0 (CH aromatiques), 69,2 (CH2), 54,4 (_CH), 47,4 (CH), 37,4 (β CH2) ; m/z (FAB) 587 (M+). 379. HR 588_2* t _. C40H30NO4 nécessite: 588.21747 ( ) < 1 ppm.

FEUILLE DE REMPLACEMENT